تغییرات محتوای آلکالوئید تام، آتروپین و اسکوپولامین در برگ گیاه شاهبیزک (Atropa belladonna L.) از رویشگاه واز- شمال ایران، در ارتباط با برخی عوامل فنولوژیکی و محیطی

نویسندگان

1 دانشکده علوم پایه، دانشگاه شاهد، تهران، ایران

2 مرکز تحقیقات منابع طبیعی و امور دام مازندران، نوشهر، ایران

3 پژوهشکده علوم پایه کاربردی، جهاد دانشگاهی، تهران

چکیده

آلکالوئیدها موادی بسیار متنوع هستند و برحسب خصوصیات بیوشیمیایی و شیمیایی در گروه‌های مختلفی قرار می‌گیرند. از میان آلکالوئیدهایی که از مشتقات اورنیتین هستند می‌توان از آلکالوئیدهای گروه تروپان، مانند آتروپین و اسکوپولامین نام برد که از آلکالوئیدهای عمده در گیاه شاهبیزک هستند. در این پژوهش گیاه A. belladonna از سه ایستگاه مختلف از منطقه واز- چمستان جمع‌آوری شد و عصاره متانولی آلکالوئید از پودر برگ این نمونه‌ها با سه تکرار تهیه گردید. مقدار آلکالوئید تام برحسب میلی گرم بر گرم وزن خشک برگ اندازه‌گیری شد. به منظور سنجش تغییرات محتوای آتروپین و اسکوپولامین موجود در عصاره‌های آلکالوئیدی در فصول و ارتفاعات مختلف، بررسی HPLC روی نمونه‌های جمع‌آوری شده با سه تکرار صورت گرفت. مطالعه نمونه‌های خاک ایستگاه‌ها بیشترین تخلخل و نفوذپذیری خاک و بیشترین نسبت کربن به نیتروژن را در ایستگاه سوم و کمترین آنها را در ایستگاه اول نشان داد. خاک هر سه ایستگاه فاقد شوری و از نظر pH، قلیایی ضعیف تشخیص داده شد. تأثیر ارتفاع بر محتوای آلکالوئید تام زیر سطح احتمال 1/0 معنی‌دار و همچنین تأثیر مشترک عوامل ارتفاع و فصل نیز زیر سطح احتمال 001/0 کاملاً معنی‌دار بود. محتوای آتروپین همواره بیش از اسکوپولامین بوده، بین برخی عوامل خاک و حضور این مواد رابطه‌ای معنی‌دار مشاهده شد. رابطه بین محتوای آلکالوئید تام و هر یک از آلکالوئیدهای آتروپین و اسکوپولامین در تمام موارد معنی‌دار بود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Differences of total alkaloid, atropine and scopolamine contents in leaves of Atropa belladonna L. from Vaz area - north of Iran in relation to some environmental and phenological factors

نویسندگان [English]

  • Farah Karimi 1
  • Tayebeh Amini Eshkevari 2
  • Amineh Zeinali 3
1 Department of Biology, Faculty of Science, Shahed University, Tehran, Iran
2 Academy Staff Botanical Garden of Noshahr
3 Department of Biology, Research Institute of Applied Science (ACECR), Tehran
چکیده [English]

Alkaloids are variable substances and are classified according to their chemical and biochemical properties. Tropane alkaloids such as atropine and scopolamine which are ornitine derivatives are the most important alkaloids of Atropa belladonna. In this study the plant leaves was gathered from three stations of Vaz-Chamestan area in north of Iran in different seasons. Alkaloids were extracted from leaves’ powders three times from every sample. Total alkaloid of extracts was determined by UV spectrophotometer (258 nm). HPLC analysis was performed to determine atropine and scopolamine content of samples three times a sample. Soil samples were studied also for texture, pH, EC, etc. The most soil porosity and C/N ratio were observed in 3rd station and the least one in the first station. All of soils were mildly alkaline without salinity. Height of station had significant influence on total alkaloid contents and the common influence of height – season of sampling also was significant. Atropine content always was higher than scopolamine. There was also seen significant correlation between some soil properties and alkaloid content in some cases. Total alkaloid contents had always significant correlation with atropine and scopolamine contents.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Atropa belladon
  • Atropine
  • scopolamine
  • tropane alkaloid

 

شاهبیزک گیاهی‌است علفی‌، چند ساله‌، با ریشه‌های‌ ضخیم‌، به‌ ارتفاع‌ 1 تا 2 متربا شاخة زاویه‌دار و از قاعده‌ منشعب که در حاشیه جنگل‌ها و زیر درختان‌ می‌روید (خاتم‌ساز،1377). این گیاه از تیره سیب‌زمینی و مانند سایر گیاهان این تیره حاوی تروپان آلکالوئیدهاست. آلکالوئیدها در انسان واکنش‌های فیزیولوژیک قوی همراه اثرات مخصوص ایجاد می‌کنند و به ویژه برسیستم عصبی اثر دارند. این مواد بسیار متنوع بوده، بر حسب خصوصیات بیوشیمیایی و شیمیایی در گروه‌های مختلفی قرار می‌گیرند. در میان آلکالوئیدهایی که از اورنیتین مشتق می‌شوند، می‌توان از آلکالوئیدهای گروه تروپان مانند آتروپین و اسکوپولامین نام برد (امید بیگی،1374).

به طور کلی، اثرات مهم این گیاه، ‌ضد اسپاسم عضلات صاف، تخدیرکننده، کاهش عرق و مسکن است و در طب سنتی به عنوان آرام بخش معده و روده به کار می‌رود. در بیماری پارکینسون برای کاهش لرزش و سختی اعضا و افزایش قدرت تکلم و حرکت، همچنین به عنوان داروی بیهوشی تجویز می‌شود. خواص شل کنندگی عضلات صاف، ‌این گیاه را در طب سنتی مفید کرده است (میرحیدر،1375).

از این گیاه برای کاهش تعرق شبانه در افراد مسـلول استفـاده می‌شـود و از اثر گشادکنندگی مردمک چشم (میـتری داتیسم) آتروپین در آزمایش‌های چشم پزشکی استفاده می‌گردد (زمان،1373).

هیوسیامین (آتروپین) یکی از ترکیبات اساسی آلکالوئید شاهبیزک با اثر قوی آنتی‌کولینرژیک است و به همین علت، در درمان قولنج کودکان (دردهای حاد شکمی) به کار می‌رودChevalier,1996) ). ماهیچه‌های صاف مسیر تنفسی در پاسخ به تحریک الکتریکی منقبض می‌شوند و این انقباض توسط گیاه شاهبیزک بر طرف می‌شود (Lotvall, 1994).

این گیاه همچنین از دیرباز در درمان افسردگی‌ها کاربرد داشته است. به علاوه، از آن در درمان زیـادی بـزاق و تهوع در دوران بارداری اسـتفاده شده است(Freeman et al., 1994). شاهبیزک دارای خاصیت تخدیرکنندگی نیز هست (Perlik, 1997). تأثیر عصاره آبی گیاه شاهبیزک در التیام و رفع التهاب زخم‌ها نشان داده شده است (Gal et al., 2009).

سه آنزیم مهم در مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدها شامل هیوسیامین- 6- بتا هیدروکسیلاز (H6H) تروپینون ردوکتاز I (TRI) و پوترسین N- متیل ترانسفراز (PMT) هستند. انتقال ژن هیوسیامین - 6- بتا- هیدروکسیلاز از هیوسیاموس نیجر (بنگ دانه) تحت کنترل پروموتور s35 ویروس موزائیک کلم به گیاه شاهبیزک که غنی از هیوسیامین است، موجب می‌شود که در گیاه تراریخت شدة مزبور محتوای آلکالوئیدی تقریباً به طور کامل متشکل از اسکوپولامین باشد (Yun et al., 1992). فرابیان (over expression) هر یک از آنزیم‌های تروپینون ردوکتاز I و II می‌تواند به ترتیب موجب افزایش آلکالوئید گروه‌های تروپان و نیکوتین در کشت ریشه گیاه شاهبیزک شود (Richter et al., 2005).

با اینکه PMT اولین آنزیم در مسیر بیوسنتز آلکالوئیدهای گروه تروپان و نیکوتین در گیاهان تیره سیب‌زمینی (Solanaceae) است، انتقال ژن آن، پس از تاگسازی از تنباکو به شاهبیزک و به عبارت دیگر، فرابیان آن در این گیاه موجب تغییر در محتوای آلکالوئیدی گیاه نمی‌شود. بنابراین، به نظر می‌رسد این آنزیم در گیاه شاهبیزک، محدودکننده سرعت بیوسنتز آلکالوئیدهای تروپان نباشد (Rothe et al., 2003).

با توجه به ارزش دارویی آلکالوئیدهای گیاه شاهبیزک، در این پژوهش، به منظور بررسی کمی و کیفی آلکالوئید نمونه‌هایی از این گیاه که در رویشگاه‌های طبیعی ایران می‌رویند و همچنین مطالعه اثرعوامل محیطی و فنولوژیکی بر کمیت و کیفیت این مواد، نمونه‌هایی از گیاه در مراحل مختلف دوره رویش، از ایستگاه‌های مختلف و در ارتفاعات مختلف مطالعه و بررسی شده است.

 

مواد و روش‌ها

ماده گیاهی

ماده گیاهی مورد مطالعه برگ‌های گیاهAtropa belladonna L. بوده است که طی سه فصل بهار، تابستان و پاییز از ارتفاعات 500 ، 1000 و 1500 متر جنگل واز در بخش چمستان از توابع نوشهر جمع‌آوری و تحت شرایط سایه و در دمای اتاق خشک شد و پس از آسیاب شدن مورد استخراج آلکالوئید تام (Total alkaloid) قرار گرفت.

مشخصات ایستگاه‌های نمونه‌برداری

جنگل واز در طول َ35 و ْ 52 شرقی و عرض َ20 و ْ 36 شمالی قرار دارد. این منطقه در جنوب شهرستان نور و بخش چمستان واقع شده است. سه ایستگاه با مشخصات زیر در این منطقه انتخاب گردید:

ایستگاه1 : در فاصله بین روستاهای جوربند و وازتنگه در کناره جادة جنگلی با ارتفاع 500 متر، جهت دامنه شرقی، خاک دانه درشت برنگ قهوه‌ای روشن تا خاکستری با سنگ مادر آهکی؛

ایستگاه 2: با ارتفاع 1000 متر در داخل جنگل، جهت دامنه غربی، خاک آن به رنگ زرد مایل به قهوه‌ای و سنگ مادر آهکی؛

ایستگاه 3 : با ارتفاع 1500 متر در کنار جادة جنگلی، جهت دامنه غربی با خاکی به رنگ زرد تا قهوه‌ای بسیار روشن.

تهیه اطلاعات هواشناسی منطقه

اطلاعات مربوط به دما، رطوبت و بارندگی محدوده ایستگاه‌های فوق‌الذکر با استفاده از نرم‌افزار ایستگاه‌یابی سازمان هواشناسی کشور مربوط به ایستگاه‌های کلیماتولوژی، سینوپتیک و باران‌سنجی به دست آمد (آمار نامه‌های هواشناسی سال‌های 1986 تا 1998 سازمان هواشناسی کشور). شایان ذکر است از آنجایی که ایستگاه‌های سازمان هواشناسی دقیقاً در طول و عرض جغرافیایی مربوط به منطقه نمونه‌برداری مورد نظر وجود نداشت، اطلاعات مربوط به ایستگاه‌های هواشناسی اطراف آن استخراج شد و برای ترسیم منحنی آمبروترمیک استفاده گردید.

نمونه‌برداری

نمونه‌برداری به صورت فصلی از برگ‌های گیاه صورت گرفت. همچنین در مراجعات انجام شده خاک ریزوسفر گیاه برای انجام بررسی‌های خاک‌شناسی جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شد. اطلاعات فنولوژی گیاه نیز در مراجعات ماهانه یادداشت گردید.

تهیه عصارة تام آلکالوئیدی

آلکالوئیدها از نمونه‌های آسیاب شدة برگ گیاه با تلفیقی از روش‌های Kaufman et al., 1999; Ashek et al., 1997; DeAlbuquerque et al., 1997  عصاره‌گیری شد. در روش به کار گرفته شده، نمونه‌ها ابتدا 24 ساعت در اتانول 50% رفلاکس شدند. سپس الکل توسط دستگاه روتاری اواپوراتور تبخیر شد. عصاره حاصل در اسیدسولفوریک w/v 5% حل شد و توسط دی اتیل اتر بیرنگ گردید. سپس pH عصاره توسط سدیم هیدروکسید N 10 تا حدود 10 افزایش یافت. در نهایت، عصارة حاصل در سه مرحله درون دکانتور با کلروفرم شستشو داده شد. فاز کلروفرمی حاوی آلکالوئیدها جمع‌آوری و توسط روتاری اواپوراتور کاملاً خشک شد. ته مانده عصاره توسط متانول حل شد و به حجم نهایی mL10 رسید. شایان ذکر است که استخراج آلکالوئید از هر نمونه سه بار تکرار گردید.

 

تعیین محتوای آلکالوئید تام در واحد وزن خشک برگ

برای تعیین محتوای آلکالوئید تام عصاره های گیاهی از روش اسپکتروفتومتری استفاده شد. به این منظور، از آلکالوئید آتروپین با مشخصات Fluka Art. 11320 به عنوان استاندارد استفاده شد و منحنی استاندارد با استفاده از غلظت‌های مختلف این ماده در طول موج nm 258 ترسیم گردید. با استفاده از منحنی استاندارد غلظت عصاره‌ها در طول موج nm 258 به دست آمد (هاربون، 1358 ). به منظور محاسبة دقیق مقدار آلکالوئید نسبت به وزن خشک برگ، میزان رطوبت بافت برگ نیز به دست آمد و از وزن بافت مورد آزمایش کسر گردید. به این منظور، مقدار معینی از پودر برگ خشک شده در دمای اتاق به دقت توزین شد و به مدت 48 ساعت درون دستگاه آون با دمای 50 درجه سانتی‌گراد حرارت دید و مجدداً توزین گردید. کاهش وزن حاصل مربوط به رطوبت بافت است که از وزن اولیه کسر شد.

روش سنجش کیفی HPLC

آنالیز HPLC به منظور سنجش تغییرات محتوای آتروپین و اسکوپولامین موجود در عصاره‌های آلکالوئیدی در فصول و ارتفاعات مختلف در مورد نمونه‌های جمع‌آوری شده با سه تکرار صورت گرفت. به این منظور، ابتدا محلول‌های استاندارد متانولی از آتروپین و اسکوپولامین با غلظـت‌های 2/0 , 5/0 و 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر تهیه و طیف آنها توسط دستگاه ترسیم گردید. با استفاده از سطح زیر منحنی به دسـت آمده برای غلظت‌های فوق ‌الذکر منحنی استـاندارد سطح/غلظت توسط نرم‌افزارExcel  رسم شد. منحنی‌‌های به دست آمده خطی بود و از فرمول خط به دست آمده برای محاسبة غلظت آتروپین و اسکوپولامین عصاره‌های آلکالوئیدی تزریق شده به دستگاه با استفاده از سطح زیر منحنی حاصل استفاده شد. آنالیز HPLC به روش‌ Roos و همکاران (1986) انجام گرفت. ستون مورد استفاده C18 با طول nm 250 و قطر داخلی nm 4 بود. سرعت جریان حلال mL/min 1 تنظیم شد و از فاز متحرک شامل متانول، اسیداستیک، تری اتیل آمین و آب به نسبت‌های 15 : 5/1 : 5/0 : 83 استفاده گردید.

 

نتایج

اطلاعات هواشناسی

پراکندگی نزولات آسمانی در طول سال و تغییرات دما دو عنصر ویژة غیرقابل تفکیک را در زندگی گیاهان تشکیل می‌دهند و بسیاری از کارشناسان سعی کرده‌اند تا به کمک ضرایب و نمودارهایی روابط موجود بین گیاه و عوامل مختلف اقلیمی را مشخص سازند. سیستم نمودارهای باران ـ گرما (منحنی‌های آمبروترمیک) که به وسیلة گوسن پیشنهاد شده، بسیار ساده و قابل استفاده در کلیة مناطق جهان است. بر روی این نمودارها میانگین ماهانة دما و میانگین ماهانة‌ نزولات آسمانی به گونه‌ای نشان داده می‌شوند که مقیاس نزولات آسمانی دوبرابر مقیاس دما باشد. در هر ماه که نزولات آسمانی کمتر از دوبرابر دما باشد، آن ماه خشک محسوب می‌شود. به عبارت دیگر، وقتی منحنی بارندگی در زیر منحنی دما قرار گیرد، آن ماه خشک است (بیرنگ و همکاران، 1368).

بر اساس اطلاعات سازمان هواشناسی، ایستگاه کلیماتولوژی چمستان با مشخصات َ 9 ، ْ 52 : E و َ 29 ، ْ 36 : N و ایستگاه سینوپتیک نوشهر با مشخصات َ 30 ، ْ 51 : E و َ 39 ، ْ 36 : N در اطراف جنگل واز به دست آمد. بررسی منحنی‌های آمبروترمیک ایستگاه‌های فوق‌الذکر نشان می‌دهد که منطقه نمونه‌برداری بین نیمه اردیبهشت تا نیمة مرداد نسبتاً کم باران بوده، ولی در سایر ماه‌های سال (به خصوص در فصل پاییز) از بارندگی در خور توجهی برخوردار است (شکل 1).


 


الف


 


ب


شکل 1-الف) منحنی آمبروترمیک ایستگاه کلیماتولوژی چمستان؛ ب) منحنی آمبروترمیک ایستگاه سینوپتیک نوشهر ( بر اساس اطلاعات سال‌های 1986-  1998)


 

 


‌آنالیز خاک

آنالیز نمونه‌های خاک توسط آزمایشگاه آب و خاک مرکز تحقیقات منابع طبیعی و امور دام مازندران ـ ایستگاه تحقیقات جنگل و مرتع نوشهر انجام شد. این نتایج نشان می‌دهد که در ایستگاه 1 (ارتفاع 500 متر) بافت خاک لومی بوده، در ایستگاه 2 (ارتفاع 1000 متر) لوم رسی سیلتی و در ایستگاه 3 (ارتفاع 1500 متر) ماسه‌ای است. بنابراین، بیشترین تخلخل و نفوذپذیری خاک در ایستگاه سوم مشاهده می‌شود. بیشترین نسبت C/N در ایستگاه 3 و کمترین در ایستگاه 1 مشاهده می‌شود. خاک هر سه ایستگاه فاقد شوری با pH قلیایی ضعیف است (جدول 1).

 

 

 

 

جدول 1- برخی ویژگی‌های خاک ایستگاه‌های نمونه‌برداری

 

ایستگاه

(EC)

ms/m

pH

C

(%)

N

(%)

C/N

ماسه

(%)

سیلت

(%)

رس

بافت

1

440/0

40/7

64/1

12/0

67/13

33

58

9

لوم

2

614/0

34/7

45/1

12/0

08/12

14

68

18

لوم رسی/سیلیتی

3

390/0

74/7

19/0

01/0

19

95

3

2

ماسه‌ای


 


سنجش کمی آلکالوئید تام (اسپکتروفتومتری)

سنجش عصاره‌های آلکالوئیدی برگ شاهبیزک در طول موج 258 نانومتر در مقایسه با منحنی استاندارد آتروپین برای تکرارهای مختلف نمونه‌های جمع‌آوری شده از هر ایستگاه صورت گرفت و میانگین مقادیر حاصل در جدول 2 نشان داده شده است.

نتایج آنالیز واریانس (جدول 3) نشان داد که تأثیر ارتفاع بر میزان آلکالوئید تام زیر سطح احتمال 1/0 ≥ α معنی‌دار است. به علاوه، تأثیر عامل فصل ( به عبارت دیگر، مراحل دوره رویش) و همچنین تأثیر مشترک عوامل ارتفاع و فصل (AB) زیر سطح احتمال 001/0 ≥ α کاملا معنی‌دار بود.


جدول 2- مقدار آلکالوئید تام برگ شاهبیزک

مشخصات نمونه

میانگین آلکالوئید تام

(total alkaloid )

(mg بر گرم وزن خشک برگ )

گرم درصد آلکالوئید تام

(% total alkaloid) (w/w)

فصل

ارتفاع(متر)

نام ایستگاه

بهار

500

1

014/31

102/3

1000

2

887/24

489/2

1500

3

785/23

379/2

تابستان

500

1

924/13

392/1

1000

2

081/25

508/2

1500

3

996/20

100/2

پاییز

500

1

811/16

681/1

1000

2

742/9

974/0

1500

3

717/7

772/0

 

 

جدول 3- آنالیز واریانس (ANOVA) مربوط به مقادیر آلکالوئیدتام برگ بلادون جمع‌آوری شده از ارتفاعات و فصول مختلف

منبع

درجه آزادی

جمع مربع‌ها

میانگین مربع‌ها

مقدار F

احتمال

تکرار

2

165/10

083/5

7646/0

-

فاکتور  A (ارتفاع)

2

246/47

623/23

5537/3

0000/0

فاکتور B  (فصل )

2

450/1037

725/518

0333/78

0000/0

AB

4

734/371

934/92

9803/13

-

خطا

16

360/106

647/6

-

-

جمع

26

956/1572

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌های آلکالوئید تام برگ بلادون زیر سطح احتمال 05/0 ≥ a در نمونه‌های جمع‌آوری شده از ارتفاعات و فصول مختلف نشان می‌دهد که در فصل بهار بین مقدار کل آلکالوئید برگ بلادون مربوط به ارتفاع 500 متر نسبت به ارتفاعات 1000 و 1500 متر تفاوت معنی‌دار بوده، ولی بین مقادیر میانگین مربوط به ارتفاعات 1000 و 1500 متر اختلاف معنی‌داری وجود ندارد. همچنین، این نتیجه در مورد فصل‌های تابستان و پاییز نیز به چشم می‌خورد. به علاوه، بین مقادیر میانگین حاصل از ارتفاعات 500 و1500 متر بین فصول بهار، تابستان و پاییز اختلاف معنی‌داری وجود دارد، ولی در مورد مقادیر میانگین حاصل از ارتفاع 1000 متر فقط بین دو فصل بهار و پاییز اختلاف معنی‌دار است.

سنجش کیفی آلکالوئیدها (آنالیز HPLC)

با استفاده از مواد استاندارد، زمان باز داری به دست آمده برای آتروپین 5/21 دقیقه و برای اسکوپولامین 5/8 دقیقه به دست آمد. جدول 3- 5 مقادیر آتروپین و اسکوپولامین به دست آمده از برگ شاهبیزک را در ارتفاعات و فصول مختلف جنگل واز نشان می‌دهد. شایان ذکر است که از هر یک از نمونه‌ها سه بار عصاره‌گیری شد و هر یک از تکرارها به طور مجزا مورد آنالیز HPLC قرار گرفت و سطح زیر منحنی و غلظت مربوطه محاسبه گردید. مقادیر مندرج در جدول 4 میانگین غلظت تکرارهای مذکور است.

 


 

جدول 4- میانگین محتوای آتروپین و اسکوپولامین در برگ شاهبیزک

(مقادیر بر اساس میلی‌گرم آلکالوئید بر گرم وزن خشک برگ)


فصل

بهار

تابستان

پاییز

ارتفاع(متر)

آتروپین

اسکوپولامین

آتروپین

اسکوپولامین

آتروپین

اسکوپولامین

500

trace*

trace

000/1

380/0

840/0

425/0

1000

410/1

380/0

863/3

640/1

trace

470/0

1500

785/2

555/0

100/2

820/0

trace

Trace

 

 * سطح زیر منحنی مربوط به قدری کم بوده که توسط دستگاه قابل اغماض در نظر گرفته شده است.

 

آنالیز واریانس داده‌های مربوط به مقادیر آتروپین نشان داد که تأثیر فاکتورهای فصل، ارتفاع و اثر متقابل این دو فاکتور (AB) زیر سطح احتمال 001/0 ≥ α کاملاً معنی‌دار است ( جدول 5 ).  همچنین مقایسه میانگین‌های مربوط در دو فصل بهار و تابستان اختلاف معنی‌داری بیـن مقدار آتروپـین در سه ارتفاع 500، 1000 و 1500 متر زیر سطح احتمال 05/0 ≥ a نشان داد. در فصل پاییز اختلاف بین ارتفاع 500 متر با دو ارتفاع 1000 و 1500 متر معنی‌دار بود، ولی بین دو ارتفاع اخیر اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد. همچنین، مقایسه مقادیر آتروپین هر یک از ارتفاعات در سه فصل بین مقدار آتروپین حاصل در ارتفاع 500 متر در فصل بهار با پاییز اختلاف معنی‌داری نشان نداد، ولی این اختلاف بین دو فصل بهار و پاییز با فصل تابستان معنی‌دار بود.  در مورد ارتفاعات 1000 و 1500 متر بین هر سه فصل بهار، تابستان و پاییز اختلاف معنی‌دار بود.

 

 

 

 


جدول 5- آنالیز واریانس مقادیر آتروپین حاصل از برگ شاهبیزک در فصول و ارتفاعات مختلف


منبع

درجه آزادی

جمع مربع‌ها

میانگین مربع‌ها

مقدار F

احتمال

تکرار

2

036/0

018/0

1853/0

-

فاکتور A(فصل)

2

628/18

314/9

5687/96

0000/0

فاکتورB (ارتفاع)

2

200/7

600/3

3277/37

0000/0

AB

4

603/18

651/14

2213/48

0000/0

خطا

16

543/1

096/0

-

-

جمع

26

010/46

 

 

 

 

 

 

آنالیز واریانس داده‌های مربوط به اسکوپولامین تولید شده توسط برگ بلادون در فصول و ارتفاعات مختلف نشان داد که عوامل فصل، ارتفاع و اثر متقابل این دو فاکتور ( AB) زیر سطح احتمال 05/0 ≥ α تأثیر معنی‌داری بر تغییرات مقدار اسکوپولامین برگ داشتند ( جدول 6 ). با مقایسه میانگین‌های مربوط مشاهده شد که در فصل بهار بین مقدار اسکوپولامین حاصل از برگ نمـونه 500 متری و 1500 مـتری اخـتلاف معـنی‌داری زیر سـطح احتمال 05/0 ≥ α مشاهده وجود داشت، ولی بین مقادیر مربوط به این دو ارتفاع با ارتفاع 1000 متر اختلاف معنی‌دار نبود. در فصل تابستان این حالت مشاهده می‌شد؛ یعنی بین مقادیر حاصل از ارتفاع 500 متر و 1500 متر اختلاف معنی‌داری مشاهده نگردید، ولی اختلاف این دو ارتفاع با ارتفاع 1000 متر معنی‌دار بود. در فصل پاییز هیچ گونه اختلاف معنی‌داری بین سه ارتفاع فوق‌الذکر مشاهده نشد. بین مقادیر به دست آمده در ارتفاع 500 متر در سه فصل مذکور اختلاف معنی‌داری وجود نداشت. در ارتفاع 1000 متر بین مقادیر به دست آمده در فصل تابستان با دو فصل بهار و پاییز اختلاف معنی‌دار بود، ولی بین مقادیر حاصل از 1000 متر در دو فصل بهار و پاییز اختلاف معنی‌داری به چشم نخورد. در مورد مقادیر اسکوپولامین نمونه‌های ارتفاع 1500 متری بین دو فصل بهار و تابستان اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد، ولی بین این دو فصل با فصل پاییز اختلاف معنی‌دار بود.


 

جدول 6- آنالیز واریانس مقادیر اسکوپولامین حاصل از برگ شاهبیزک در فصول و ارتفاعات مختلف


منبع

درجه آزادی

جمع مربع‌ها

میانگین مربع‌ها

مقدار F

احتمال

تکرار

2

121/0

061/0

8199/0

-

فاکتورA(فصل)

2

488/2

244/1

8457/16

0001/0

فاکتورB (ارتفاع)

2

474/1

737/0

9796/9

0015/0

AB

4

877/1

469/0

3549/6

0029/0

خطا

16

182/1

074/0

-

-

جمع

26

142/7

 

 

 


 


همبستگی بین عوامل محیطی و آلکالوئید

همبستگی بین pH ، هدایت الکتریکی خاک (EC )، کربن آلی، نیتروژن، نسبت C/N و بافت خاک با مقدار آلکالوئید تام، آتروپین و اسکوپولامین برگ گیاه توسط نرم‌افزار Excel محاسبه گردید. نتایج نشان ‌داد در فصل بهار بین میزان آتروپین از یک سو با pH خاک و از سوی دیگر، با کربن آلی خاک رابطه منفی و معنی‌داری وجود داشت. همچنین pH خاک در فصل پاییز با اسکوپولامین برگ گیاه رابطه منفی معنی‌دار نشان داد. بین میزان اسکوپولامین در همین فصل، با میزان کربن آلی و ازت خاک رابطه مثبت و معنی‌داری مشاهده ‌شد. رابطه بین میزان آلکالوئید تام با هر یک از آلکالوئیدهای آتروپین واسکوپولامین در هر سه فصل بهار، تابستان و پاییز معنی‌دار است، به طوری که در فصل بهار این همبستگی منفی و در دو فصل تابستان و پاییز مثبت است. این پدیده می‌تواند در اثر افزایش فعالیت آنزیم TR2نسبت به TR1 حاصل شود. بین میزان آلکالوئید تام، آتروپین و اسکوپولامین در فصول مختلف و نسبت کربن به نیتروژن خاک (C/N) در یک مورد رابطه معنی‌دار منفی دیده می‌شود (جدول 7). بین مقدار آتروپین و  اسکوپولامین با آلکالوئید تام به استثنای یک مورد  همبستگی معنی‌دار است (جدول 8).


 

جدول 7-ضریب همبستگی بین مقادیر آلکالوئید تام، آتروپین و اسکوپولامین با عوامل خاک در فصول مختلف رویشگاه واز


 

فصول

Clay

Silt

Sand

C/N

N

C

Ec

pH

آلکالوئید تام

بهار

068477/0

497597/0

42411/0-

42869/0-

616409/0

706837/0

16797/0-

50091/0-

تابستان

428006/0

01001/0-

07277/0-

06773/0-

15276/0-

27078/0-

62847/0

013833/0

پاییز

141172/0

559631/0

48913/0-

49354/0-

672282/0

756622/0

09551/0-

5628/0-

آتروپین

بهار

42983/0-

78121/0-

726866/0

73033/0

86237/0-

*91712/0-

20552/0-

*93023/0-

تابستان

665792/0

272759/0

35144/0-

34670/0-

171541/0

012068/0

822535/0

26908/0-

پاییز

07198/0-

371154/0

29304/0-

29787/0-

5/0

600753/0

30443/0-

3747/0-

اسکوپولامین

بهار

23911/0-

63942/0-

573601/0

577737/0

7427/0-

818/0-

00415/0-

642354/0

تابستان

694724/0

310521/0

38812/0-

383450/0-

171541/0

844342/0

844342/0

30688/0-

پاییز

873342/0

***99031/0

***99031/0

99100/0-***

***996229/0

**978506/0

734358/0

***99861/0-

 

***  همبستگی معنی‌دار است (1/0 £.  a)**  همبستگی معنی‌دار است (05/0 £.  a)*  همبستگی معنی‌دار است (02/0 £.  a)


جدول 8-ضریب همبستگی بین اجزای آلکالوئیدی با آلکالوئید تام


آلکالوئید تام

آتروپین

بهار

93023/0-*

تابستان

959304/0**

پاییز

977255/0**

اسکوپولامین

بهار

98504/0-***

تابستان

947411/0*

پاییز

605521/0

 

*** همبستگی معنی‌دار است (1/0 £.  a)**  همبستگی معنی‌دار است (05/0 £.  a)*  همبستگی معنی‌دار است (02/0 £.  a)


بحث

از بررسی‌های میدانی انجام گرفته در این پژوهش مشخص شد که نور از عوامل بسیار مهم مؤثر بر پراکنش گیاه شاهبیزک است. این گونه هرگز در داخل توده‌های انبوه و بستة جنگل دیده نمی‌شود و در داخل توده‌های جنگلی فقط در مناطقی که به عللی، از قبیل عملیات بهره‌برداری، جنگل از حالت توده‌ای و انبوه بیرون آمده و از حالت تعادل خارج شده باشد، گیاه شاهبیزک قادر به رشد و نمو خواهد بود. همچنین در بخش‌هایی از جنگل که درختان به صورت انفرادی و لکه‌ای و یا گروهی در اثر عوامل طبیعی نظیر باد سقوط کرده باشند و شرایط نوری مناسب فراهم آمده باشد، این گونه می‌تواند رشد و نمو یابد.

به طوری که از نقشه پراکنش گونه بر می‌آید (خاتم‌ساز 1377 )، این گیاه در ایران در مناطق شمالی ارتفاعات البرز از غرب در گیلان تا شرق گرگان انتشار دارد. بررسی‌های انجام شده در مشاهدات میدانی حضور این گیاه را در ارتفاعات مختلف جنگل‌های شمال ایران که از رویشگاه‌های اصلی این‌گونه به شمار می‌رود، نشان داده است، ولی این حضور به گونه‌ای است که به ندرت در ارتفاع کمتر از 500 متر مشاهده می‌شود. در صورت مشاهده گونه مذکور در ارتفاعات پائین‌تر، علت را می‌توان به شرایط خاص برخی از رویشگاه‌ها نسبت داد. بنابراین، پراکنش و انتشار طبیعی این‌گونه نشان می‌دهد که این گیاه یک عنصر کلیماتیک و وابسته به اقلیم و شرایط آب و هوایی خاص است، چرا که حضور آن در دامنه وسیعی از شرایط خاکی و استقرار آن در انواع خاک‌ها حاکی از دامنه وسیع بردباری و انعطاف‌پذیری و در نتیجه سازش اکولوژیک آن نسبت به تغییرات خاک است، به طوری که این گیاه در انواع خاک‌ها و اراضی سنگلاخی، آهکی، سیلیسی، واریزه‌ای، ... یافت می‌شود (Brower et al., (1997;Mueller-Dombois,1974.

به علاوه، عکس‌العمل این گیاه نسبت به خصوصیات اقلیمی رویشگاه‌های مناطق مرتفع و کوهستانی نیز در خور توجه است و انتشار آن وابسته به یک دامنه ارتفاعی ما بین 500 تا 2000 متری است که از شرایط اقلیمی متفاوتی نسبت به ارتفاعات پائین‌تر برخوردار است. به طور کلی، حضور و انتشار جغرافیایی این گونه، رابطة نزدیکی با رطوبت بالا و بارندگی قابل ملاحظه دارد. همچنین، در مناطقی که دارای تابستان‌های خنک و باران‌گیر و زمستان‌های سرد و برفی است، به خوبی می‌روید.

بررسی مقدار آلکالوئید تام در فصول و ارتفاعات مختلف ایستگاه‌های نمونه‌برداری نشان داد که مقادیر به دست آمده با نتایج Zarate و همکاران (1997) همخوانی دارد. ارتفاع، فصل و تأثیر متقابل این دو تأثیر معنی‌داری بر تغییرات میزان آلکالوئید برگ گیاه دارد و در فصل بهار با افزایش ارتفاع مقدار آلکالوئید کاهش یافته، در فصل تابستان با افزایش ارتفاع مقدار آلکالوئید افزایش می‌یابد. در فصل پاییز نیز افزایش ارتفاع موجب کاهش میزان آلکالوئید می‌گردد. این مشاهده می‌تواند نشان دهنده ارتباط بین دمای محیط با محتوای آلکالوئیدی برگ گیاه باشد که نیازمند مطالعه و بررسی بیشتر است. با مطالعه فنولوژی گیاه شاهبیزک و مطابقت آن با نتایج به دست آمده از نظر میزان آلکالوئید در فصول و ارتفاعات مختلف می‌توان به این نتیجه رسید که در طی یک دورة رویش مقدار آلکالوئید ابتدا کم بوده، سپس بتدریج افزایش می‌یابد و پس از رسیدن به یک مقدار ماکزیمم مجدداً شروع به کاهش می‌نماید و زمان رسیدن مقدار آلکالوئید به ماکزیمم درست با ابتدای گلدهی و ظهور اولین گل همزمان است. این تغییرات با تغییراتی که به طور عمومی در محتوای متابولیت‌های ثانوی در ارتباط با دوره رویش و مراحل نموی و انتقال از مرحله رویشی به زایشی صورت می پذیرد، مطابقت دارد.

نتایج مربوط به آنالیز HPLC نشان می‌دهد که مقدار آتروپین همواره 2 تا 5 برابر اسکوپولامین است. بیشترین درصد آتروپین و اسکوپولامین نسبت به آلکالوئید تام در نمونه تابستان در ارتفاع 1000 متر مشاهده می‌شود که از نظر دوره رویش مقارن با اوج گلدهی است. روند تغییرات اجزای آلکالوئیدی آتروپین و اسکوپولامین مطابقت نسبتاً کاملی با تغییرات میزان آلکالوئید تام دارد ولی این رابطه همواره در یک جهت نیست (جدول 8). این امر نشان می‌دهد که نسبت بین اجزای آلکالوئیدی کاملاً تابع متابولیسم گیاه است و هر گونه تغییری در مقدار این اجزا نیازمند دستکاری‌های ژنتیکی گیاه است؛ به این معنی که در مسیر بیوسنتز ‌تروپان آلکالوئیدها در بعضی نقاط مسیر دوشاخه می شود و فعالیت نسبی هر یک از آنزیم‌های ابتدای این دو راهی‌ها بر این که ترکیب نهایی آلکالوئید تام متشکل از چه اجزای آلکالوئیدی باشد، مؤثر است. برای مثال، تروپینون توسط دو آنزیم تروپینون ردوکتاز 1 و 2 به ترتیب به سمت تولید آلکالوئیدهای گروه تروپان و نیکوتین هدایت می‌شود که اثبات شده سرعت نسبی فعالیت آنها در ترکیب نهایی آلکالوئید تام اثر دارد (Roth et al., 2003, Richter et al., 2005). مطالعات متعددی با هدف دست‌ورزی ژنتیکی گیاه شاهبیزک در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها صورت گرفته و موفقیت‌هایی در این زمینه کسب شده است(Sato et al., (2001, Roth et al., 2003, Richter et al., 2005.

مقدار ازت خاک در این مطالعه فقط در یک مورد با مقدار اسکوپولامین، ارتباط معنی‌دار نشان داده است (جدول 7). در بررسی انجام شده توسط Bensaddek و همکاران (2000) با توجه به اینکه منبع ازت به صورت نیترات آمونیوم و نسبت‌های مختلف آنها بررسی شده است، اهمیت این ماده در بیوسنتز آلکالوئیدها با وضوح بیشتری به چشم می‌خورد. قضاوت در مورد نقش تغییرات غلظت عناصر بر محتوای آلکالوئیدی این گیاه نیازمند بررسی دقیق‌تر در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی است.

 

 

 

بیرنگ، ن.، جوانشیر، ع. و مجتهدی، ی. (1368) پوشش گیاهی زمین، مرکز نشر دانشگاهی، تهران.

خاتم‌ساز، م. (1377) فلورایران شماره 24 تیره سیب‌زمینی، مؤسسه تحقیقات جنگل‌‌ها و مراتع، تهران.

امیدبیگی، ر. (1374) رهیافت‌های تولید و فراوری گیاهان دارویی، انتشارات فکر روز، تهران.

زمان، ‌س .(1370) گیاهان دارویی، انتشارات ققنوس، تهران.

میرحیدر، ح. (1375) گیاهان دارویی، جلد 8 ، دفتر نشر فرهنگی ، تهران.

Bensaddek, L., Gillet, F., Edmundo, J., Saucedeo, N. and Fliniaux, M. A. (2001) The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots; Journal of Biotechnology 85: 35 – 40.

Brower, J. E., Zar, J. H., Von Ende, C. (1997) General Ecology, Mc Graw Hill Publications, pp.63-76.

Chevallier, M. A. (1996) The encyclopedia of medicinal plants; Dorling kindersly; pp. 336.

De Albuquerque Lucio, R., Maria E., Viana, C., Luiz, C., De Andrade, F. ,Jose, F., Marcello, B., Giber to, B. (1997) Process for the extraction and purification of alkaloid; U. S. Patent No. 5, 684, 155.

Freeman, J. J., Altieri, R. H., Babtiste, H. J., Kuo, T., Crittenden, S., Fogarty, K., Moultrie, M., Goney, E., Kanegis, K. (1994) Evolution and management of sialorrhea of pregnancy with concomitant hypermesis; Journal of National Medicine Association 86: 704-708.

Gal, P., Toporecer, T., Grendle, T., Vidova, Z., Smetana, K., Dvorankova, B., Gal, T., Mozes, S., Lenhardt, L., Longauer, F., Sabol, M., Sabo, J. and Backor, M. (2009) Effect of Atropa belladonna L. on skin wound healing, Wound Repair and Regeneration 17: 378- 386.

Kaufman, B., Cseke, L. J., Warber, S., Duke, J. A. and Brielmann, H. L. (1999) Natural Products from Plants; CRC Press, London, pp. 30-35.

Lotvall, J. (1994) contractility of lung and air-tubes: experiments performed in 1840 by charles J. B. Williums; Europian Respiration Journal 7: 592-595.

Mueller-Dombois, D., Ellenberg, H. (1974) Aims and methods of vegetation ecology, John Wiley, New York, 547p.

Perlik Gattner, I. (1997) Atropa belladonna poisoning Suggesting severe post – traumatic brain damage; Przegl Lek, pp. 464-465.

Richter,U., Rothe, G., Fabian, A. K., Rahfeld B. and Drager, B. (2005) overexpression of tropinone reductases alters alkaloid composition in Atropa belladonna root cultures, Journal of Experimental Botany 56: 645- 652

Rothe, G., Hachiya, A., Yamada, Y., Hashimoto, T. and Drager, B. (2003) Alkaloids in plants and root cultures of Atropa belladonna overexpressing putrescine N-methyltransferase, Journal of Experimental Botany 54: 2065- 2070.

Roos, R. W., Lau - Cam, C. (1986) General reversed phase HPLC method for the separation of drugs using triethylamine as a competing base, Journal of Chromatography 370: 403-418.

Sato, F., Hashimoto, T., Hachiya, A., Tamura, K. I., Choi, K. B., Morishige, T., Fujimoto, H., Yamada, Y. (2001) Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 98: 367-372.

Yun, D. J., Hashimoto, T., Yamada, Y. (1992) Metabolic engineering of medicinal plants: Transgenic Atropa belladonna with an improved alkaloid composition, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 89: 11799- 11803.

Zarate, R., Hermosin, B., Cantos, M. and Troncosa, A. (1997) Tropane alkaloid distribution in Atropa baetica plants, Journal of Chemical Ecology 23: 2059-2066.