بررسی تأثیر غلظت‌های میکرومولاری کلرات بر روی جذب نیترات توسط HATS، در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان

چکیده

تأثیر غلظت‌های میکرومولاری کلرات بین 0 تا 100 میکرومولار به عنوان یک ماده آنالوگ نیترات، بر روی فعالیت سیستم با تمایل بالای نیترات در شرایط بدون نیترات در دو اسیدیته 6 و 5/6 یا همراه با سه غلظت نیترات شامل 0، 25 و 50 میکرومولار در اسیدیته 6 در طی دو بخش تحقیقی و با استفاده از لاین‌های آرابیدوپسیس تالیانای (Arabidopsis thaliana) جهش‌یافته atnrt2.1، atnrt2.4 و chl1-5 و جهش‌یافته atnrt2.1 تراریخت شده با ژن NRT2.1 مطالعه گردید. به دنبال کشت بذرهای متعلق به این ژنوتیپ‌ها بر روی محیط‌کشت جامد حاوی مواد غذایی و انتقال آنها به شرایط رشدی کنترل شده، برای درک بهتر نقش سیستم با تمایل بالا در جذب نیترات، پس از هفت روز درصد برگچه‌های کاملاً باز به عنوان شاخص عملکرد این سیستم بررسی گردید. بر اساس نتایج حاصل از این تحقیق، بالاترین میزان مقاومت در برابر غلظت‌های بالای کلرات هم در محیط فاقد و هم در محیط دارای نیترات در جهش‌یافته atnrt2.1 مشاهده شد. اختلال در بیان ژن‌های AtNRT2.4 و AtCHL1 به افزایش مقاومت گیاهچه‌ها در برابر کلرات منجر نگردید. از طرف دیگر، تشدید بیان ژن NRT2.1 در جهش‌یافته atnrt2.1 به کاهش معنی‌دار درصد برگچه‌های کاملاً باز در این ژنوتیپ منجر شد. با تکیه بر این نتایج، به نظر می‌رسد که ژن AtNRT2.1 نقش اصلی و کلیدی را در جذب نیترات از محیط توسط سیستم با تمایل بالا دارد و این نتایج، تحقیقات فیزیولوژیک و مولکولی قبلی در رابطه با عملکرد این ژن را تأیید می‌کند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The effect of cholorate micromolar concentrations on HATS nitrate uptake in Arabidopsis thalina

نویسندگان [English]

  • Parzhak Zoufan 1
  • Mansour Shariati 2
1 Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University, Ahwaz
2 Department of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan
چکیده [English]

The effect of cholorate different concentrations between 0 to 100 µM on high affinity transport system activity using Arabidopsis thaliana mutants atnrt2.1, atnrt2.4 and chl1-5 and transformants in NRT2.1 gene in two research sections was studied. In the first section, two pH 6 and 6.5 were used in a medium of free nitrate. 3 different nitrate and cholorate concentrations including 0, 25 and 50 µM with pH 6.5 were selected during second section. All seeds were cultured on solid medium and maintained in a controlled-environment condition. After 7 days, in order to gain further insight into the role of nitrate high affinity transport system, percentage of full expanded leaflets as indicator of high affinity transport system activity was investigated. The results showed the superiority of atnrt2.1 mutant in comparison with the other genotypes, especially on higher concentrations of cholorate, either with nitrate or without nitrate. Deregulation of AtNRT2.4 and AtCHL1 genes was not conducive to significant resistance. On the other hand, upregulation of NpNRT2.1 gene in atnrt2.1 mutant decreased percentage of full expanded leaflets. Based on these results, it was confirmed that AtNRT2.1 gene had key and important role in nitrate uptake by high affinity transport system.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Arabidopsis
  • High affinity transport system
  • Cholorate
  • Nitrate

 

نیترات یکی از مهمترین منابع نیتروژن معدنی برای رشد و نمو گیاهان است. جذب نیترات در گیاهان از طریق غشای پلاسمایی سلول‌های اپیدرمی و پوست ریشه انجام می‌شود (Glass et al., 1992). به نظر می‌رسد که انتقال نیترات حتی در غلظت‌های بالا نیز به شیب الکتروشیمیایی یون‌های پروتون و عملکرد پمپ H+-ATPase غشای پلاسمایی وابسته است (Miller and Smith, 1992). این انتقال همراه با دو پروتون انجام می‌شود. تحقیقات فیزیولوژیک روند جذب نیترات در گیاهان (Crawford and Glass, 1998; Forde and Clarkson, 1999) نشان داده است که حداقل سه سیستم مجزا برای جذب نیترات در ریشه‌ها توسعه یافته است: یک سیستم که تمایل بالایی نسبت به نیترات دارد، در غلظت‌های بسیار کم نیترات در محیط (در حد میکرومولار) عمل می‌کند و روندی اشباع‌پذیر را از خود نشان می‌دهد. به این سیستم
HATS (High affinity transport system) گفته می‌شود که خود به دو نوع مجزا تقسیم می‌گردد؛ یک سیستم که قویاً در برابر حضور نیترات القایی است و به عنوان سیستم iHATS (inducible HATS) شناخته شده است، در حالی که سیستم cHATS (constitutive HATS) به صورت ساختاری بیان می‌شود و حتی در غیاب نیترات نیز فعال است. سومین سیستم ناقل با عنوان
LATS (Low affinity transport system) از تمایل پایینی نسبت به تغییرات برخوردار است و به نظر می‌رسد که وقتی غلظت نیترات در محیط بیش از یک میلی‌مولار باشد، این سیستم نقش مهمی را در جذب نیترات ایفاء می‌نماید .(Kronzucker et al., 1995; Seddiqi et al., 1990).

در گیاهان عالی حضور دو نوع از ناقلان نیترات با عنوان NRT1(Nitrate transporter1) وNRT2  به اثبات رسیده است. ناقلان NRT2 به عنوان نماینده سیستم‌های HATS شناخته شده‌اند (Filleur and Daniel-Vedele, 1999). ناقل CHL1 (AtNRT1.1) بهترین نمونه مطالعه شده از ناقلان نیترات متعلق به خانواده NRT1 در گیاهان عالی است که با استفاده از جهش‌یافته‌های T-DNA مقاوم به کلرات (chl1) در آرابیدوپسیس جداسازی و کلون شد (Tsay et al., 1993). جهش‌یافته‌های فیزیولوژیک این ژن که دارای نقص در جذب نیترات وکلرات بودند، برای نخستین بار در سال 1978 شناسایی شدند (Doddema et al., 1978).

مطالعات بعدی بیانگر آن بود که این جهش‌یافته علاوه بر نقص در عملکرد LATS قادر به جذب نیترات توسط HATS نیز نیست (Liu et al., 1999; Wang et al., 1998). بنابراین، پیشنهاد شد که CHL1 یک ناقل با تمایل دوگانه نسبت به نیترات است که عمدتاً در بخش‌های جوان ریشه بیان می‌شود (Huang et al., 1999). تصور می‌شود که شرایط غذایی و غلظت نیترات، از مهمترین عوامل کنترل‌کننده تغییر فعالیت ناقل AtNRT1.1 است. بیشتر مطالعات فیزیولوژیک و مولکولی مرتبط با جذب نیترات توسط HATS در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا و با هدف درک نقش و نحوه کنترل ژن‌های خانواده NRT2 انجام شده است و این مطالعات نشان می‌دهد که هفت ژن از این خانواده در ژنوم این گیاه حضور دارند (Filleur and Daniel-Vedele, 1999; Zhuo et al., 1999).

 در میان خانواده ژنی AtNRT2 در آرابیدوپسیس، ژن AtNRT2.1 در سطح وسیعی مطالعه شده است و بر اساس این شواهد، پیشنهاد شده است که احتمالاً ژن NRT2.1 نقش غالب و مهمی در قیاس با دیگر ژن‌های NRT2 در جذب نیترات توسط HATS دارد.(Cerezo et al., 2001; Filleur et al., 2001) به استثنای ژن‌ AtNRT2.1 و تا حدودی ژن‌ AtNRT2.2 عملکرد سایر ژن‌های خانواده NRT2در گیاهان هنوز مشخص نشده است. برخی مطالعات بر روی جهش‌یافته‌های دوگانه atnrt2a در گیاه آرابیدوپسیس(این گیاهان دارای حذف کامل ژن AtNRT2.1 و حذف بخشی از ژن AtNRT2.2 هستند) بیانگر آن است که بیان ژن AtNRT2.4 در این جهش‌یافته تشدید می‌شود (Orsel et al., 2004).

همچنین، نتایج حاکی از آن است که بیان ژن AtNRT2.4 به دنبال برقراری شرایط محرومیت نیتروژن افزایش و در شرایطی غنی از نیتروژن کاهش می‌یابد (ذوفن و همکاران، 1389). بنابراین به نظر می‌رسد که ژن فوق جزو ژن‌های ممانعت‌شونده توسط نیترات باشد. بر اساس برخی تحقیقات، استفاده از گیاهان جهش‌یافته و تراریخته و انجام مطالعات مقایسه‌ای با گیاهان وحشی برای درک بهتر و بیشتر نقش ژن‌های مرتبط با جذب نیترات از کارایی بالایی برخوردار بوده است (Cerezo et al., 2001; Filleur et al., 2001; Li et al., 2007). این نتایج یاد شده نشان داده‌اند که حضور چند ژن در یک خانواده ژنی می‌تواند به انعطاف‌پذیری فنوتیپی در پاسخ به شرایط محیطی مختلف منجر گردد و عدم حضور یک ژن می‌تواند با بیان و فعالیت ژن‌های دیگر موجود در آن خانواده ژنی جبران شود. کلرات یک آنالوگ نیترات و یک علف‌کش گیاهی است که توسط سیستم‌های جذب نیترات جذب و با فعالیت نیترات رودکتاز به کلریت تبدیل می‌گردد که کلریت برای گیاه بسیار سمّی است و به تجزیه کلروفیل و ریزش برگ منجر می‌شود. به همین جهت، این ماده در بررسی‌های اولیه بر روی عملکرد سیستم‌های جذب نیترات توسط LATS استفاده شده است (Tsay et al., 1993). یکی از بهترین راهکارها برای تعیین و تأیید نقش یک ژن، بررسی فیزیولوژیک و مولکولی گیاهان جهش‌یافته و تراریخت و مقایسه آن با گیاهان وحشی است که از طریق تفکیک فنوتیپی و فیزیولوژیک این ژنوتیپ‌ها، زمینه مناسبی برای درک نقش این ژن‌ها فراهم می‌آید. به همین جهت، در این تحقیق تلاش بر این بوده است که با استفاده از لاین‌های جهش‌یافته و تراریخت در برخی ژن‌های دخیل در جذب نیترات نقش این ژن‌ها در عملکرد HATS در غلظت‌های میکرومولاری کلرات (به عنوان آنالوگ نیترات) بررسی گردد. بر همین اساس و با توجه به اینکه تاکنون تأثیر غلظت‌های پایین کلرات به عنوان آنالوگ نیترات بر عملکرد HATS در جذب نیترات مطالعه نشده است و با توجه به این که جذب کلرات و تبدیل آن به کلریت سمّی، به ایجاد سمّیت در گیاه و عدم جوانه‌زنی و رشد مناسب منجر می‌شود و همچنین جذب بیشتر کلرات می‌تواند بیانگر توانایی بیشتر گیاه در جذب بیشتر نیترات باشد، بنابراین، اثر کلرات در محدوده فعالیت HATS بر روی درصد جوانه‌زنی بذر برخی لاین‌های جهش‌یافته و تراریخته در ژن‌های NRT بررسی گردید تا درک بیشتری از نقش این ژن‌ها در عملکرد HATS و جذب نیترات از طریق آن به دست آید.

 

مواد و روش‌ها

کلیه بذرهای مورد استفاده در این از تحقیق، از بانک بذر مرکز تحقیقات کشاورزی INRA، مرکز ورسای واقع در کشور فرانسه تأمین شد. برای بررسی تأثیر کلرات بر عملکرد HATS، دو آزمایش جداگانه طراحی گردید. در آزمایش مقدماتی از جهش‌یافته‌های آرابیدوپسیس نظیر جهش‌یافته atnrt2.1، atnrt2.4 و chl1-5 به همراه اکوتیپ‌های وحشی Columbia (Col) و
(WS) Wasselewkija استفاده شد. در آزمایش دوم جهش‌یافته atnrt2.1، جهش‌یافته ‌atnrt2.1 تراریخته شده با ژن NpNRT2 از Nicotiana plumbaginifolia به صورت (atnrt2.1 RolD::NpNRT2) و آرابیدوپسیس تراریخته شده با RolD::AtNRT2.1 انتخاب شدند که همگی دارای زمینه ژنتیکی اکوتیپ WS بودند. صرفنظر از مرحله آزمایش، ابتدا کلیه بذرها با محلول ژاول-اتانول 95 درصد استریل شدند و بعد از شستشو با اتانول 95 درصد و تخلیه آن، به مدت 2 ساعت در زیر هود لامینار قرار گرفتند تا اتانول باقی‌مانده کاملاً تبخیر شود. سپس در شرایط کاملاً استریل در هر پتری‌دیش حاوی محیط‌کشت جامد 50 بذر از هر ژنوتیپ با فواصل منظم و در سه تکرار کاشته شد. برای کشت بذرها از محیط‌کشت جامد مطابق با روش Little و همکاران در 2005 استفاده گردید. در مرحله مقدماتی، چهار غلظت کلرات پتاسیم، شامل 0، 10، 50 و 100 میکرومولار در دو اسیدیته 6 و 5/6 بدون حضور نیترات در محیط و در آزمایش بعدی سه غلظت مختلف کلرات پتاسیم شامل 0، 25 و 50 میکرومولار در ترکیب با سه غلظت مختلف نیترات پتاسیم شامل 0، 25 و 50 میکرومولار در اسیدیته 5/6 به‌کار برده شد. هر مرحله از این مطالعه در سه تکرار انجام گردید. برای تنظیم pH از محلول MES 14درصد(Morpholino-ethanesulfonic acid) و BCP 16/0درصد (Bromocresol) استفاده شد. بعد از کشت، کلیه پتری‌دیش‌های حاوی بذر به مدت 48 ساعت به دمای 4 درجه سانتی‌گراد و بعد از آن به اتاقک رشد با شرایط 16 ساعت روشنایی/8 ساعت تاریکی، دمای شبانه‌روزی 25 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 70 درصد و شدت نور 150 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه انتقال یافتند. بررسی و ارزیابی تأثیر کلرات بر روی عملکرد HATS، بر اساس درصد برگچه‌های کاملاً باز بعد از هفت روز از آغاز کشت انجام گردید. شایان ذکر است که با توجه به اینکه در شرایط معمولی (بدون کلرات) برای تهیه این محیط از نیترات پتاسیم و کلسیم به عنوان منبع تأمین‌کننده نیتروژن استفاده می‌شود، بنابراین، در شرایط آزمایش کنونی، کمبود عناصر پتاسیم و کلسیم با افزودن غلظت‌های مناسبی از محلول KCl و CaCl2 جبران شد. کلیه آزمایش‌های انجام شده در این تحقیق، در قالب طرح‌های کاملاً تصادفی در حداقل سه تکرار طراحی گردید. آنالیز داده‌های حاصل از این تحقیق با نرم‌افزار آماری Sigma Stat و از طریق مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن در سطح حداقل اختلاف معنی‌دار با احتمال P≤0.05 صورت پذیرفت.

 

نتایج و بحث

1- آزمایش مقدماتی برای بررسی تأثیر غلظت‌های میکرومولاری کلرات

الف- بررسی تأثیر غلظت‌های میکرومولاری کلرات در اسیدیته‌های مختلف

بر اساس شکل 1- الف و ب، در محیط فاقد کلرات یا حاوی 10 میکرومولار کلرات با اسیدیته 6 در اکثر موارد اختلاف معنی‌داری در درصد برگچه‌های کاملاً باز بین 6 ژنوتیپ ذکر شده وجود ندارد، به استثنای جهش‌یافته atnrt2.1 و تیپ وحشی Col در 10 میکرومولار کلرات که به لحاظ این شاخص با سایر ژنوتیپ‌ها اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهند (شکل 1- ب). همان طور که در شکل 1-ج و د مشاهده می‌گردد، با افزایش غلظت کلرات در محیط این شاخص در شش ژنوتیپ فوق کاهش می‌یابد (مقایسه میانگین غلظت‌های مختلف کلرات در آزمایش مقدماتی، همچنین غلظت‌های مختلف کلرات و نیترات در آزمایش نهایی از طریق آزمون دانکن انجام، ولی نتایج آن ارائه نشده است). با وجود این، در غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار کلرات جهش‌یافتهatnrt2.1 بالاترین میزان این شاخص را نسبت به سایر ژنوتیپ‌ها نشان می‌دهد.

همان طور که در شکل 2- الف تا د مشاهده می شود، با افزایش غلظت کلرات در محیط دارای اسیدیته 5/6 درصد برگچه‌های کاملاً باز کاهش معنی‌داری را برای همه ژنوتیپ‌های مورد اشاره نشان می‌دهد (نتایج آماری مربوط به این مقایسه ارائه نشده است). با وجود این، در غلظت‌های بالاتر کلرات (50 و 100 میکرومولار) جهش‌یافته atnrt2.1 افزایش معنی‌داری را در این شاخص در مقایسه با ژنوتیپ‌های دیگر از خود ارائه می نماید (شکل 2- ج و د). علاوه بر این، درغلظت‌های 50 و 100 میکرومولار کلرات درصد برگچه‌های کاملاً باز در تیپ وحشی WS بعد از جهش‌یافته atnrt2.1 دارای افزایش معنی‌داری است.

کلرات یک علف‌کش و یک ماده برگ ریز و تجزیه‌کننده کلروفیل است که در مطالعات اولیه فیزیولوژی جذب نیترات به عنوان یک آنالوگ نیترات، به ویژه در غلظت‌های بالا بسیار مؤثر بوده است. کلرات برای اولین بار برای شناسایی جهش‌یافته‌های مقاوم به غلظت‌های بالای کلرات با عنوان chl1در گیاه آرابیدوپسیس استفاده شد (Tsay et al., 1993). این تحقیقات نشان داد که ژن CHL1 (که به آن ژن AtNRT1.1 نیز گفته می‌شود) احتمالاً یک ناقل LATS را برای جذب کلرات (نیترات) کد می‌نماید. در این بخش از تحقیق، از جهش‌یافته‌های atnrt2.1، chl1-5 (با زمینه ژنتیکی اکوتیپ WS) و جهش‌یافته atnrt2.4 (با زمینه ژنتیکی اکوتیپ Col) استفاده شد. جهش‌یافته atnrt2.1 به منظور بررسی تأثیر غلظت‌های پایین کلرات بر جذب آن به واسطه HATS انتخاب شد. با توجه به این که مطالعات قبلی حاکی از تشدید بیان ژن AtNRT2.4 در فقدان عملکرد ژن AtNRT2.1 است (Orsel et al., 2004)، جهش‌یافته atnrt2.4 برای تعیین نقش ژنAtNRT2.4 در جذب غلظت‌های میکرومولاری کلرات استفاده گردید.

همچنین، برخی مطالعات (Lie et al., 1999; Wang et al., 1998) بیانگر آن است که ژن CHL1 یک ناقل با تمایل دوگانه LATS و HATS را برای جذب نیترات کد می‌کند، بنابراین جهش‌یافته chl1-5 استفاده شد تا تأثیر غلظت‌های پایین کلرات بر این جهش‌یافته بررسی گردد.

بر اساس مطالعات انجام شده در سال 2003 توسط Okamoto و همکاران، پیشنهاد شده است که ژن AtNRT2.4 در گروه ژن‌های القا شونده توسط نیترات قرار می‌گیرد، در حالی که بر اساس نتایج حاصل از تحقیقات ذوفن و همکاران در سال 1389 با استفاده از گیاهان آرابیدوپسیس جهش‌یافته و تراریخت در این ژن، به نظر می‌رسد که ‍ژن مذکور جزو ژن‌های ممانعت‌شونده توسط نیترات باشد؛ به طوری که بیان آن در شرایط غنی از نیترات کاهش و با برقراری شرایط محرومیت از نیتروژن افزایش می‌یابد. با وجود این، نقش دقیق ژن AtNRT2.4 در جذب غلظت‌های پایین نیترات در گیاهان هنوز مشخص نشده است. با توجه به کاهش معنی‌دار درصد برگچه‌های کاملاً باز در جهش‌یافته atnrt2.4در مقایسه با جهش‌یافته atnrt2.1 (شکل 1- ج و د، شکل 2- ج و د) در دو اسیدیته 6 و 5/6 و نتایج حاصل از بررسی میزان جذب 15NO3 در لاین‌های این جهش‌یافته که با ژن AtNRT2.4تراریخت شده‌اند (ذوفن، 1387)، به نظر می‌رسد که احتمالاً پروتئین حاصل از بیان ژن AtNRT2.4در جذب مستقیم غلظت‌های پایین نیترات توسط ریشه‌ها به عنوان یک سیستم HATS مشارکت ندارد.

اگرچه پیشنهاد شده است که ناقل CHL1 یک ناقل با تمایل دوگانه LATS و HATS است (Huang et al., 1999)، با این حال، اختلال در بیان ژن AtCHL1-5، درصد برگچه‌ها را در قیاس با جهش‌یافته atnrt2.1به شدت کاهش می‌دهد و این کاهش در سطح قابل مشاهده برای تیپ وحشی است (شکل 1- ج و د، شکل 2- ج و د). بنابراین، با تکیه بر این نتایج تصور می‌شود که ژن AtNRT2.1 نقش اصلی و کلیدی را در عملکرد HATS ایفا می‌نماید؛ به طوری که ایجاد جهش در ژن AtCHL1 ویا ژن AtNRT2.4نمی تواند به ایجاد مقاومت در ژنوتیپ‌های مربوطه در غلظت‌های 50 و 100 میکرومولاری کلرات منجر گردد، در حالی که اختلال در بیان ژن AtNRT2.1 با ممانعت از جذب کلرات به ایجاد مقاومت در برابر کلرات، بروز سمّیت کمتر و در نتیجه درصد جوانه‌زنی بالاتر منجر می‌گردد.

 

 

 

شکل 1- درصد برگچه‌های کاملاً باز در غلظت‌های الف)0؛ ب)10؛ ج)50 و د) 100 میکرومولار کلرات در محیط بدون نیترات با اسیدیته 6 در آرابیدوپسیس تالیانا با زمینه ژنتیکی اکوتیپ Col و WS. مقادیر بیانگر میانگین حداکثر سه تکرار ± SD است. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% انجام گرفته و حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی‌دار است.

 

شکل 2- درصد برگچه‌های کاملاً باز در غلظت‌های الف)0؛ ب)10؛ ج)50 و د)100 میکرومولار کلرات در اسیدیته 5/6 در آرابیدوپسیس تالیانا با زمینه ژنتیکی دو اکوتیپ Col و WS. مقادیر بیانگر میانگین حداکثر سه تکرار ± SD است. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% انجام گرفته و حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی‌دار است.

 


2- تأثیر غلظت‌های میکرومولاری کلرات به همراه غلظت‌های پایین نیترات

با توجه به اینکه نتایج حاصل از آزمایش مقدماتی نشان داد که جهش‌یافته atnrt2.1 بالاترین میزان مقاومت به کلرات را به ویژه در غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار هم در اسیدیته 6 و هم در اسیدیته 5/6 دارد، بنابراین، در آزمایش دوم از جهش‌یافته atnrt2.1، جهش‌یافته atnrt2.1 تراریخته شده با ژن NpNRT2.1 از تنباکو و آرابیدوپسیس تراریخته شده با ژن AtNRT2.1 استفاده شد تا نقش و توانایی ژن AtNRT2.1 در جذب کلرات به شکل دقیق‌تری بررسی گردد. کلیه ژنوتیپ‌های مورد استفاده در این قسمت از تحقیق دارای زمینه ژنتیکی اکوتیپ WS بودند. از طرف دیگر، نتایج آزمایش مقدماتی بیانگر آن بود که اسیدیته 6 در غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار کلرات مقاومت کمتری را در جهش‌یافته atnrt2.1 و تیپ وحشی WS در مقایسه با اسیدیته 5/6 نشان می‌دهد. بنابراین، برای تعیین و درک بهتر نقش ژن AtNRT2.1 در جذب کلرات تصمیم گرفته شد که در آزمایش دوم فقط اسیدیته 5/6 به محیط‌کشت اعمال گردد. علاوه بر این، آزمایش اول بیانگر آن بود که غلظت 100 میکرومولار کلرات تقریباً برای همه ژنوتیپ‌ها به استثنای جهش‌یافته atnrt2.1 کُشنده است. همچنین، به نظر می‌رسید که عدم حضور نیترات در محیط باعث از بین رفتن سریع‌تر گیاهچه‌ها توسط کلرات می‌گردد. بنابراین، در بخش دوم این تحقیق و در یک طراحی جدید حداکثر غلظت کلرات 50 میکرومولار و به همراه سه غلظت مختلف نیترات شامل 0، 25 و 50 میکرومولار نیترات انتخاب شد.

همان طور که در شکل 3 - الف، ب و ج مشاهده می‌شود، در محیط فاقد نیترات با افزایش غلظت کلرات درصد برگچه‌های کاملاً باز در همه ژنوتیپ‌ها از خود کاهش نشان می‌دهد. با این حال، این کاهش در جهش‌یافته atnrt2.1به طور معنی‌داری کمتر است. در محیط حاوی 50 میکرومولار کلرات، تشدید بیان ژن NpNRT2.1 در جهش‌یافته atnrt2.1به کاهش شدید شاخص ذکر شده در سطح مشاهده شده برای تیپ وحشی منجر می‌شود (شکل 3- ج).

با افزودن 25 میکرومولار نیترات به محیط، افزایش غلظت کلرات به کاهش درصد برگچه‌های کاملاً باز در همه ژنوتیپ‌ها منجر می‌گردد (شکل 4- الف، ب و ج). با وجود این، جهش‌یافته atnrt2.1بالاترین درصد شاخص رشدی فوق را نشان می‌دهد.

بر اساس شکل 5- الف، ب و ج، درصد برگچه‌های کاملاً باز در جهش‌یافته atnrt2.1و گیاهان تراریخت شده با ژن AtNRT2.1 در مقایسه با تیپ وحشی و جهش‌یافته تراریخت شده با ژن NpNRT2.1 در محیط حاوی 50 میکرومولار نیترات با سه غلظت مختلف کلرات، به ویژه در غلظت‌های 25 و 50 میکرومولار از خود افزایش نشان می‌دهد. بخش دوم این تحقیق با هدف درک بهتر نقش ژن NRT2.1 و تکمیل نتایج به دست آمده از بخش اول انجام گردید. نتایج حاصل از بخش مقدماتی نشان می‌دهد که احتمالاً ژن AtNRT2.1 عملکرد اصلی را در جذب نیترات از این طریق دارد (شکل‌های 1 و 2). جهش‌یافته atnrt2.1 تراریخت شده با ژن NpNRT2.1 از گیاه تنباکو، باعث کاهش قابل توجه مقاومت گیاهچه‌های آرابیدوپسیس تالیانا، به ویژه در غلظت 50 میکرومولار کلرات همراه با غلظت‌های 0، 25 و 50 میکرو مولار نیترات می‌گردد، به طوری که این کاهش در سطح مشاهده شده برای تیپ وحشی است (شکل‌های 3، 4 و 5 موارد ب و ج).

بنابراین، به نظر می‌رسد که احیای بیان ژن NRT2.1 در جهش‌یافته atnrt2.1 با فعال کردن سیستم HATS و جذب کلرات، شرایط را برای کاهش شاخص فوق فراهم نموده است. با وجود این، بر اساس برخی از نتایج به دست آمده از این تحقیق تشدید بیان ژن AtNRT2.1 تحت کنترل پروموتر RolD در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا منجر به جذب بیشتر کلرات و در نتیجه کاهش درصد برگچه‌های کاملاً باز نشده است (شکل 3- ج). با توجه به تأیید بیان ژن انتقالی NpNRT2.1 در جهش‌یافته atnrt2.1 در سطح کپی‌برداری و ترجمه (مکاتبه شخصی با Daniel-Vedele)، تصور می‌شود که عوامل درونی ناشناخته‌ای در سطوح بعد از کپی‌برداری (برای مثال، افزایش بیش از حد کپی‌های ‍ژن بر اثر بیان مداوم ژن انتقالی) از بیان پروتئین عملکردی و فعال تحت شرایط آزمایش کنونی ممانعت می‌نمایند؛ به طوری که بیان مداوم ژن انتقالی منجر به کاهش درصد برگچه‌های کاملاً باز در اکثر موارد، به ویژه در غلظت‌های 25 و 50 میکرومولار نیترات نمی‌گردد (شکل‌های 3، 4 و 5 موارد ب و ج). همان‌طور که در نتایج حاصل از بخش دوم مشاهده می‌شود، اعمال نیترات به محیط در حضور کلرات، از کاهش بیش از حد شاخص رشدی مورد مطالعه در ژنوتیپ‌های ذکر شده ممانعت می‌نماید؛ به طوری که با افزایش غلظت نیترات در محیط، حتی تیپ وحشی نیز اندکی مقاومت در برابر غلظت‌های میکرومولاری کلرات از خود نشان می‌دهد (شکل‌های 3، 4 و 5).

با توجه به اینکه کلرات به عنوان یک آنالوگ نیترات عمل می‌کند، به نظر می‌رسد که نیترات و کلرات در رقابت با یکدیگر توسط یک سیستم ناقل مشترک جذب می‌شوند و جذب نیترات می‌تواند تا حدودی از آثار مخرب کلرات بر شاخص رشدی مذکور جلوگیری نماید. در یک جمع‌بندی کلی و با تکیه بر نتایج به دست آمده از تأثیر غلظت‌های میکرومولاری کلرات بر روی سیستم HATS، مجدداً نتایج مطالعات فیزیولوژیک و مولکولی انجام شده (Cerezo et al., 2001; Chopin et al., 2007; Fraisier et al., 2000; Nazoa et al., 2003;Orsel et al., 2003 مبنی بر مشارکت مستقیم ژن NRT2.1 در جذب غلظت‌های پایین نیترات به واسطه HATS تأیید می‌گردد.

 

 

شکل 3- درصد برگچه‌های کاملاً باز در غلظت‌های الف)0؛ ب)25 و ج)50 میکرومولار کلرات در محیط بدون نیترات با اسیدیته 5/6 در آرابیدوپسیس تالیانا با زمینه ژنتیکی اکوتیپ WS. مقادیر بیانگر میانگین حداکثر سه تکرار ± SD است. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% انجام گرفته و حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی‌دار است.

 

 

شکل 4- درصد برگچه‌های کاملاً باز در غلظت‌های الف)0؛ ب)25 و ج)50 میکرومولار کلرات در محیط دارای 25 میکرومولار نیترات با اسیدیته 5/6 در آرابیدوپسیس تالیانا با زمینه ژنتیکی اکوتیپ WS. مقادیر بیانگر میانگین حداکثر سه تکرار ± SD است. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% انجام گرفته و حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی‌دار است.

 

شکل 5- درصد برگچه‌های کاملاً باز در غلظت‌های الف)0؛ ب)25 و ج)50 میکرومولار کلرات در محیط دارای 50 میکرومولار نیترات با اسیدیته 5/6 در آرابیدوپسیس تالیانا با زمینه ژنتیکی اکوتیپ WS. مقادیر بیانگر میانگین حداکثر سه تکرار ± SD است. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5% انجام گرفته و حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی‌دار است.

 

 

 

تشکر و قدردانی

از مرکز تحقیقات کشاورزی INRA واقع در کشور فرانسه جهت تأمین منابع بذری قدردانی می‌گردد.

 

 

 

ذوفن، پ. (1387) فیزیولوژی جذب نیترات توسط ناقل NRT2.1 در گیاه ترانسژنی تنباکو (Nicotiana plumbaginifolia). پایان‌نامه دکتری، دانشگاه اصفهان، اصفهان.

ذوفن، پ.، شریعتی، م. و دنیل- ودل، ف. (1389) پاسخ‌های فیزیولوژیکی و مولکولی ناقل AtNRT2.4 به شرایط محرومیت نیتروژن در گیاه Arabidopsia thaliana. مجله زیست‌شناسی ایران 23: 94- 108.

 

Cerezo, M., Tillard, P., Filleur, S., Munos, S., Daniel-Vedele, F. and Gojon, A. (2001) Major alterations of the regulation of root NO-3 uptake are associated with the mutation of NRT2.1 and NRT2.2 genes in Arabidopsis. Plant Physiology 127: 262-271.

Chopin, F., Wirth, J., Dorbe, M. F., Lejay, L., Krapp, A., Gojon, A. and Daniel-Vedele F. (2007) The Arabidopsis nitrate transporter ATNRT2.1 is targeted to the root plasma membrane. Plant Physiology and Biochemistry 45: 630-635.

Crawford, N. M. and Glass, A. D. M. (1998) Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants. Trends in Plant Science 3: 389-395.

Doddema, H., Hofstra, J. J. and Feenstra, W. J. (1978) Uptake of nitrate by mutants of Arabidopsis thaliana disturbed in uptake or reduction of nitrate. I. Effect of nitrogen source during growth on uptake of nitrate and chlorate. Physiologia Plantarum 43: 343-350.

Fraisier, V., Gojon, A., Tillard, P. and Daniel-Vedele, F. (2000) Constitutive expression of a putative high-affinity nitrate transporter in Nicotiana plumbaginifolia: evidence for post-transcriptional regulation by a reduced nitrogen source. Plant Journal 23: 489-496.

Filleur, S. and Daniel-Vedele, F. (1999) Expression analysis of a high-affinity nitrate transporter isolated from Arabidopsis thaliana by differential display. Planta 207: 461-469.

Filleur, S., Dorbe, M. F., Cerezo, M., Orsel, M., Granier, F., Gojon, A. and Daniel-Vedele, F. (2001) An Arabidopsis T-DNA mutant affected in NRT2 genes is impaired in nitrate uptake. Federation of European Biochemical Societies Letters 489: 220-224.

Forde, B. G. and Clarkson, D. T. (1999) Nitrate and ammonium nutrition of plants: Physiological and molecular perspectives. Advances in Botanical Research 30: 1-90.

Glass, A. D. M., Shaff, J. E. and Kochian, L. V. (1992) Studies of nitrate uptake in barley. IV: electrophysiology. Plant Physiology 99: 456-463.

Huang, N. C., Liu, K. H., Lo, H. J. and Tsay, Y. F. (1999) Cloning and functional characterization of an Arabidopsis nitrate transporter gene that encodes a constitutive component of low-affinity uptake. The Plant Cell 11: 1381-1392.

Kronzucker, H. G., Siddiqi, M. Y. and Glass, A. D. M. (1995) Kinetics of NO3 influx in spruce. Plant Physiology 109: 319-326.

Li, W., Wang, Y., Okamoto, M., Crawford, N. M., Siddiqi, M. Y. and Glass, A. D. M. (2007) Dissection of the AtNRT2.1: AtNRT2.2 inducible high-affinity nitrate transporter gene cluster. Plant Physiology 143: 425-433.

Little, D. Y., Rao, H., Oliva, S., Daniel-Vedele, F., Krapp, A. and Malamy, J. E. (2005) The putative high-affinity nitrate transporter NRT2.1 represses lateral root initiation in response to nutritional cues. Proceedings of the NationalAcademy of Science of the United States of America. 102: 13693-13698.

Liu, K. H., Huang, C. Y. and Tsay, Y. F. (1999) CHL1 is a dual-affinity nitrate uptake. The Plant Cell 11: 865-874.

Miller, A. J. and Smith, S. J. (1992) The mechanisms of nitrate transport across the tonoplast of barley root cells. Planta 187: 554-557.

Nazoa, P., Vidmar, J. J., Tranbarger, T. J., Mouline, K., Damiani, I., Tillard, P., Zhou, D., Glass, A. D. M. and Touraine, B. (2003) Regulation of the nitrate transporter gene AtNRT2.1 in Arabidopsis thaliana: responses to nitrate, amino acids and developmental stage. Plant Molecular Biology 52: 689-703.

Okamoto, M., Vidmar, J. J. and Glass, A. D. M. (2003) Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana: responses to nitrate provision. Plant Cell Physiology 44: 304-317.

Orsel, M., Eulenburg, K., Krapp, A. and Daniel-Vedele, F. (2004) Disruption of the nitrate transporter genes AtNRT2.1 and AtNRT2.2 restritcs growth at low external nitrate concentration. Planta 219: 714-721.

Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. and Rufty, T. (1990) Studies of the uptake of nitrate in barley: I. Kinetics of 13NO3 influx. Plant Physiology 93: 1426-1432.

Tsay, Y. F., Schroeder, J. I., Feldmann, K. A. and Crawford, N. M. (1993) The herbicide sensivity gene CHL1 of Arabidopsis encodes a nitrate-inducible nitrate transporter. Cell 72:705-713.

Wang, R., Liu, D. and Crawford, N. M. (1998) The Arabidopsis CHL1 protein plays a major role in high-affinity nitrate uptake. Proceedings of the NationalAcademy of Science of the United States of America 95: 1248-1254.

Zhuo, D., Okamoto, M., Vidmar, J. J. and Glass, A. D. M. (1999) Regulation of a putative high-affinity nitrate transporter (Nrt2:1At) in roots of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 17: 563-568.