تأثیرات مورفولوژیک و فیزیولوژیک القای پلی‌پلوئیدی در گیاه لیموترش (Citrus ourantifolia)

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

3 مدیریت بیوتکنولوژی کشاورزی منطقه شمال کشور، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، رشت، ایران

چکیده

میوه مرکبات دارای ارزش غذایی، دارویی و اقتصادی فراوان است. پُردانگی به عنوان عامل منفی در انتخاب گونه‌های با کیفیت بالا در میوه مرکبات در نظر گرفته می‌شود. در میان پلی‌پلوئیدها، تریپلوئیدها میوه‌های بی‌دانه تولید می‌کنند. از آنجایی که برای تولید میوه‌های تریپلوئید، وجود گیاه تتراپلوئید ضروری است، تولید گیاه تتراپلوئید در لیموترش با روش قطره چکان و با استفاده از ماده شیمیایی کلشی‌سین، هدف این پژوهش قرار گرفت. 60 روز پس از اعمال تیمار کلشی‌سین با غلظت 2/0، 6/0، 0/1 و 4/1 درصد، بررسی فلوسایتومتریک بر گیاهان تیمار شده انجام گرفت. گیاهان تتراپلوئید حاصل، از نظر ویژگی‌های مورفولوژیک و آناتومیک بررسی شدند. مقایسه برگ‌های گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید نشان داد که برگ‌های گیاهان دیپلوئید از نظر اندازه، طول و عرض بیشتری نسبت به گیاهان تتراپلوئید دارند. ارتفاع گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری نسبت به دیپلوئید کمتر بود. بررسی تراکم روزنه، ابعاد روزنه و همچنین کیسه‌های ترشحی برگ‌ها نشان داد که در گیاهان تتراپلوئید در مقایسه با دیپلوئید تراکم روزنه و کیسه‌های ترشحی کاهش، اما ابعاد روزنه و ابعاد کیسه‌های ترشحی افزایش یافت. میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئید در گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید افزایش معنی‌داری نداشت.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Morphologic and physiologic effects on polyploidy induction in Citrus ourantifolia

نویسندگان [English]

  • Mansour Afshar Mohammadian 1
  • Roghaye Pourakbari Kasmaei 2
  • Zeinab Omidi 2
  • Faezeh Ghanati 2
  • Alireza Tarang 3
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
2 Department of Plant Biology, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
3 Agriculture Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Rasht, Iran
چکیده [English]

Citrus fruit has high nutritious, medical and economical values. Seediness is considered as a weakness in selecting high quality citrus fruits. Among polyploids, triploids produce seedless fruits. In order to produce triploid fruits, there must be a tetraploid plant, therefore, in this research the production of tetraploid plant was highlighted in Citrus ourantifolia using a chemical material named colchicine through dropping method. 60 days after treatment by 0.2, 0.6, 1.0 and 1.4% concentrations of colchicines, the flow cytometric investigation on treatment plants were conducted. The morphological and anatomical characteristics of tetraploid plants were investigated. Comparison of the leaves of tetraploid with diploid plants indicated that the leaves of tetraploid plants in length and width were smaller than the diploid ones. The height of tetraploid plants was reduced significantly compared with that of the diploid ones. Comparison of the density and the size of stomata and secretory sacs showed that the density of stomata and secretory sacs in tetraploid plants decreased but, the size of stomata and secretory sacs increased, significantly, compared with the diploid ones. The amounts of chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll and carotenoids in treatment plants showed no significant increase in tetraploid and diploid plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Citrus ourantifolia
  • Tetraploidy
  • Colchicine
  • Morphological and anatomical characteristics

 

درختان لیموترش با عدد کروموزومی 18=n2=x2، بومی شرق هیمالیا و هند بوده، عقیده بر این است که دورگ ناشی از تلاقی لایم و بالنگ هستند (فتوحی‌قزوینی و فتاحی‌مقدم، 1389) که در صنایع غذایی، داروسازی، عطرسازی و آرایشی کاربردهای فراوانی دارند. در طب سنتی نیز موارد استفاده زیادی دارند (Owhe-Ureghe et al., 2010) به عنوان مثال، برای درمان دردهای معده و سرفه کاربرد دارند (Oyagade et al.,1999). علاوه بر این، لیموترش خاصیت ضد باکتریایی (باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی) نیز دارد (Aibinu et al., 2007).

روش دو برابر کردن کروموزوم با استفاده از کلشی‌سین، به طور وسیعی در برنامه‌های اصلاحی گیاهان استفاده می‌شود (Hancock, 1997; Hartwell et al., 2004). بیشتر گیاهان حاصل از پلی‌پلوئیدی مصنوعی اغلب با افزایش اندازه سلول همراه هستند که به تولید اندام‌های رویشی و زایشی بزرگتر منجر می‌شود (Byrne et al., 1981). القای پلی‌پلوئیدی ممکن است با افزایش عملکرد و تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان پلی‌پلوئید نسبت به والدین دیپلوئید همراه باشد (Dhawan and Lavania, 1996). برای مثال، میزان اسانس در گیاهان اتوتتراپلوئید گونه‌ای از نعناع (Mentha arevensis L.)، به میزان 30 درصد
(Janaki Amal and Sobti, 1962) و در گیاه زیره (Carum carvi L.) به میزان 35 تا 85 درصد (Dijkstra and Speckmann, 1980) نسبت به گیاهان دیپلوئید شاهد افزایش نشان داده است. همچنین، در بسیاری از گیاهان افزایش سطح پلوئیدی با برخی تغییرات مورفولوژیک و فیزیولوژیک همراه بوده است (Randall et al., 1977). برای مثال، در گیاه دارویی اسطوخودوس (Lavandula angustifolia)، گیاهان اتوتتراپلوئید دارای گل‌ها و بذرهای بزرگتر، دمگل ضخیم‌تر و پرزهای سپری بزرگتر روی برگ نسبت به همتاهای دیپلوئید خود بودند (Urwin and Horsnell, 2007). القای پلی‌پلوئیدی در مرکبات سبب تولید گیاهان مرکبات تتراپلوئید و تریپلوئید می‌شود
(Lee, 1988). گیاهان تری‌پلوئید، بی‌دانه هستند و از آنجا که اغلب مرکبات پُردانه هستند، پُردانگی عاملی منفی در کیفیت آنها محسوب می‌شود (Geraci et al., 1975; Esen et al., 1978; Navarro et al., 2002)، علاقه روز افزون پرورش‌دهندگان مرکبات با دستکاری پلوئیدی، استراتژی‌های هدف برای تولید ارقام بی‌دانه تریپلوئید شده است (Vardi, 1996).

برای تعیین سطح پلوئیدی از روش‌های مستقیم (شمارش کروموزوم و فلوسایتومتری) و همچنین، روش‌های غیر مستقیم (مانند اندازه‌گیری طول و عرض سلول‌های روزنه، تراکم سلول‌های روزنه در واحد سطح و مشاهدات مورفولوژیک) استفاده می‌شود
(Sari et al., 1999). تعیین میزان کلروفیل نیز به عنوان ابزاری برای تشخیص سطوح پلوئیدی در گونه‌های مختلف با میزان موفقیت‌های متفاوت همراه بوده است
؛Joseph and Randall, 1981؛ (Timco et al., 1981 Mathura et al., 2006). میزان کلروفیل در گیاهان اتوتتراپلوئید نوعی آکاسیا (Acasia mearnsii)
40 درصد بیشتر از میزان کلروفیل همتای دیپلوئید آنها گزارش شده است (Mathura et al., 2006). به علت افزایش مستقیم میزان ترکیبات ثانویه در بافت و همچنین، افزایش زیتوده در گیاهان پلی‌پلوئید به ویژه گیاهان دارویی که از اندام رویشی (ساقه، برگ و گل) برای به دست آوردن متابولیت‌های ثانویه استفاده می‌شود، دو برابر کردن تعداد کروموزوم‌ها در این گیاهان موجب افزایش عملکرد متابولیت‌های ثانویه شده است (Gonzalez and Weathers, 2003).

هدف از این پژوهش، بررسی امکان استفاده از پلی‌پلوئیدی به عنوان روشی اصلاحی برای مقایسه و همچنین، بررسی برخی ویژگی‌های رشدی و ویژگی‌های کمّی و کیفی بین گیاهان تتراپلوئید ایجاد شده از گیاهان دیپلوئید در گیاه لیموترش است.

 

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی

میوه‌های لیموترش از باغ مؤسسه تحقیقات مرکبات واقع در شهرستان تنکابن تهیه شد. پوسته خارجی و پوسته داخلی بذرها جدا شد، سپس بذرهای نوسلار (بذرهایی با بیش از دو ‌لپه و دارای شکل نامتقارن) از جنسی (بذرهایی با لپه‌های متقارن) جدا شد. بذرهای نوسلار در پتری‌دیش‌های حاوی کاغذ صافی که در اتوکلاو استریل شده بودند، قرار داده شده، و مراحل رشد اولیه را در داخل انکوباتور با دمای 25-27 درجه سانتیگراد گذراندند. پس از 2 هفته و نمایان شدن ریشه‌چه، بذرها به گلدان‌هایی به ارتفاع 10 و قطر 5/6 سانتی‌متر منتقل شدند. گلدان‌ها با نسبت برابر از کود حیوانی، خاک و ماسه (با نسبت 1:1:1) پُر شد. گیاهان پس از کشت در گلدان، در گلخانه با دمای روزانه 25 درجه سانتیگراد و دمای شبانه 18 درجه سانتیگراد نگهداری شد. به منظور ایجاد جمعیت تتراپلوئید، گیاهچه‌ها در مراحل دو برگ حقیقی اولیه برای اعمال تیمار کلشی‌سین استفاده شدند. این پژوهش طی سال‌های 1388-1390 در گلخانه مؤسسه بیوتکنولوژی شمال کشور (رشت) انجام گرفت.

القای تتراپلوئیدی در گیاه لیموترش

در این پژوهش، برای القای تتراپلوئیدی از روش تیمار مریستم انتهایی 180 گیاهچه با غلظت‌های مختلف کلشی‌سین استفاده شد. به این منظور، مریستم انتهایی رشد گیاهچه‌ها در مراحل دو برگ حقیقی اولیه در
3 روز متوالی، با استفاده از غلظت‌های مختلف محلول آبی کلشی‌سین (2/0، 6/0، 1 و 4/1 درصد) و توئین 20 (برای افزایش تماس سطحی)، با روش قطره‌چکان با استفاده از سمپلر هر روز به میزان 5 میکرولیتر تیمار شدند.

شناسایی گیاهان تتراپلوئید با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری

با توجه به اینکه دستگاه فلوسایتومتری با اندازه‌گیری شدت نسبی فلورسانس، مقدار نسبی DNA را نشان می‌دهد، سطح پلوئیدی یک نمونه ناشناخته تنها پس از ترکیب با هسته‌های استاندارد گیاه شاخص با سطح پلوئیدی و محل پیک در مقایسه با استاندارد مشخص می‌شود. در این تحقیق، برای تخمین صحیح سطح پلوئیدی گیاهان تتراپلوئید مورد نظر توسط دستگاه فلوسایتومتری، از گیاه جعفری به عنوان گیاه استاندارد استفاده شد. برای آنالیز سطح پلوئیدی، برگ‌های دوم گیاهان 60 روز پس از اعمال تیمار جدا شده، توسط دستگاه فلوسایتومتری مدل PA ساخت شرکت Partec کشور آلمان بررسی شدند. شیوه تهیه نمونه برای آنالیز فلوسایتومتریک به این شکل است که برای تهیه سوسپانسیون هسته‌ای، به مقدار مساوی بافت برگی از برگ‌های دوم و ترجیحاً قسمت‌های بدون رگبرگ از گیاه نمونه (گیاهانی که با غلظت‌های مختلف کلشی‌سین تیمار شده بودند)، گیاهان شاهد (فاقد تیمار) و گیاه استاندارد، به اندازه تقریبی cm2 1 برداشته شد. بافت برگ در یک پتری‌دیش پلاستیکی 55 میلی‌متری حاوی 400 میکرولیتر از بافر استخراج هسته متعلق به شرکت Partec قرار داده، با استفاده از یک تیغ تیز خُرد شد. سپس به این نمونه‌ها
1600 میکرولیتر محلول فلوروکروم DAPI که نوعی رنگ مخصوص آنالیز فلوسایتومتری است، اضافه شد. سپس نمونه توسط فیلتر نایلونی فیلتر گردید. نمونه صاف شده به داخل لوله پلاستیکی متعلق به دستگاه فلوسایتومتری منتقل و آنالیز شد. پس از آن، هیستوگرام DNA به دست آمد. مقدار DNA هر نمونه با بررسی حداقل 10000 سلول بررسی شد. همچنین، برای اطمینان از نتایج حاصل، پس از تهیه لام از بافت مربوطه شمارش کروموزومی با استفاده از میکروسکوپ نیز انجام شد.

مقایسه ویژگی‌های کمّی و کیفی بین گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید

پس از شناسایی گیاهان تتراپلوئید توسط آنالیز فلوسایتومتری، گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید از نظر سطح برگ، شکل برگ، اندازه روزنه، تراکم روزنه، ارتفاع، میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و میزان کاروتنوئید با هم مقایسه شدند.

محاسبه سطح برگ گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید

برای مقایسه سطح برگ گیاه شاهد با گیاهان تحت تیمار، برگ‌های دوم از رأس ساقه گیاه هر گلدان جدا شد. از برگ‌های جدا شده، کپی کاغذی تهیه و وزن کپی مورد نظر با ترازو اندازه‌گیری شد. یک سانتی‌متر مربع از کادر کاغذ نیز جدا وزن شد، با محاسبه نسبت وزن برگ به وزن یک سانتی‌متر مربع از کاغذ (رابطه تناسبی) سطح هر برگ محاسبه و مقایسه شد (سلطانی و همکاران، 1385).

اندازه‌گیری کیسه‌های ترشحی گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید

برای سنجش تراکم کیسه ترشحی و تعداد آنها در واحد سطح، برگ‌های دوم از رأس ساقه گیاهان مورد نظر جدا شد و برای بررسی تراکم آنها در واحد سطح از میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 4 و برای سنجش طول آنها از میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 10 استفاده شد.

سنجش کلروفیل و کاروتنوئید

برای اندازه‌گیری میزان کلروفیل a، b و کاروتنوئید کل از برگ دوم، دیسک‌های برگی تهیه، در 5 میلی‌لیتر استون 80 درصد در هاون چینی همگن شد. با استفاده از سانتریفیوژ یخچال‌دار در دمای 4 درجه سانتیگراد و با 3000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه محلول جداسازی شد. سپس شدت جذب محلول در طول موج‌های 470، 8/646 و 2/663 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر UV visible از شرکت Pharmacia biotech در مقابل شاهد خوانده، با قرار دادن در روابط زیر میزان کلروفیل a و b و کاروتنوئید کل در cm2 سطح برگ محاسبه شد (Lichtenthaler, 1983).

Chla=12.25 A663.2 - 2.79 A646.8

Chlb=21.50 A646.8 - 5.1 A663.2

ChlT=Chla + Chlb

Car=(1000 A470 - 1.82 Chla - 85.02 Chlb) / 198

ارزیابی ویژگی‌های روزنه در گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید

بدین منظور، پس از تعیین سطح پلوئیدی گیاهان مورد آزمایش با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری، برگ دوم هر گیاه جدا و سپس اپیدرم زیرین برگ با استفاده از لاک ناخن جدا شد. به این منظور بخشی از برگ (mm 5×mm 10) که ترجیحاً فاقد رگبرگ اصلی بود، با استفاده از لاک ناخن پوشانده، پس از 10 تا 15 دقیقه خشک شد. سپس با استفاده از یک تیغ تیز حاشیه‌های نمونه را به شکل چهار گوش در آورده، نوار چسبی شفاف روی آن چسبانده و با انگشت شست فشار داده تا اپیدرم کاملاً به چسب ملحق شد. سپس چسب که اپیدرم به صورت لایه شفاف بسیار نازکی به آن چسبیده است، جدا و روی لام چسبانده شد. ویژگی‌های روزنه همۀ نمونه‌ها با استفاده از یک میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 40 بررسی شد (Smith et al., 1989).

مطالعات آماری

مراحل مختلف آزمایش با 3 تکرار انجام شد و سپس آنالیزهای آماری با استفاده از آزمون آماری t در نرم‌افزار SPSS و آزمون توکی در نرم‌افزار SAS صورت گرفت. نمودارهای مربوط به تغییرات در نرم‌افزار  Excelرسم شد. طرح مورد استفاده در آزمایشات طرح کاملاً تصادفی بود.

 

نتایج

القا تتراپلوئیدی در گیاه لیموترش

نتایج حاصل از بررسی سطح پلوئیدی گیاهان تیمار شده با سطوح مختلف کلشی‌سین (2/0، 6/0، 0/1 و 4/1 درصد) با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری نشان داد که غلظت 4/1 درصد در گیاه لیموترش بیشترین درصد گیاهان تتراپلوئید (6/48 درصد) و غلظت 2/0 درصد کمترین گیاهان تتراپلوئید (0 درصد) را تولید کرد. این نتایج از طریق شمارش کروموزومی نیز تأیید شد (شکل 1).

 

 

شکل 1- اثر تیمارهای مختلف کلشی‌سین بر تولید گیاهان تتراپلوئید لیموترش با استفاده از آزمون توکی. مقادیر،میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.01 است.

 

مقایسه شکل و سطح برگ

بررسی شکل برگ (شکل 2) در گیاه لیموترش نشان داد که برگ‌های گیاهان تتراپلوئید از نظر اندازه (جدول 1) دارای طول و عرض کمتری نسبت به گیاهان دیپلوئید بودند. علاوه بر این، برگ‌های گیاهان تتراپلوئید چین‌خورده و ناصاف بودند. مقایسه سطح برگ (جدول 1) نشان داد که گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری سطح برگ کمتری نسبت به گیاهان دیپلوئید دارند.

 

شکل 2- شکل برگ (1: گیاه شاهد، 2: گیاه تیمار شده)


مقایسه طول، عرض و تراکم روزنه

نتایج حاصل از اندازه‌گیری طول و عرض روزنه در گیاهان تتراپلوئید لیموترش افزایش معنی‌داری (P<0.05) را نسبت به گیاهان دیپلوئید نشان داد (جدول 1). بررسی تراکم روزنه نیز نشان داد که با افزایش سطوح پلوئیدی تراکم روزنه به طور معنی‌داری (P<0.05) نسبت به گیاه دیپلوئید کاهش می‌یابد (جدول 1).

مقایسه تراکم و مساحت کیسه ترشحی

اندازه‌گیری تراکم کیسه ترشحی در نمونه‌های گیاهی تتراپلوئید و دیپلوئید نشان داد که تراکم آنها در گیاهان دیپلوئید نسبت به گونه تتراپلوئید به طور معنی‌داری (P<0.05) بیشتر بود (جدول 1 و شکل 3) در حالی که مساحت کیسه ترشحی در گیاهان تتراپلوئید افزایش معنی‌داری(P<0.05) نسبت به گیاهان دیپلوئید داشت (جدول 1).

مقایسه ارتفاع گیاهان

نتایج حاصل از مقایسه ارتفاع گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید نشان داد که ارتفاع گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری (P<0.05) نسبت به دیپلوئید کاهش یافت (جدول 1).

مقایسه میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل و کاروتنوئید کل

نتایج حاصل از مقایسه میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل و کاروتنوئید کل بین گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید تفاوت معنی‌داری (P<0.05) را نشان نداد (جدول 1).

 

بحث

تولید گیاهان تتراپلوئید

در این پژوهش، به منظور تولید گیاهان تتراپلوئید از روش تیمار کلشی‌سین به صورت قطره‌چکان استفاده شد. نتایج حاصل از این تیمار نشان داد که در غلظت 4/1 درصد کلشی‌سین، 6/48 درصد از گیاهان لیموترش تتراپلوئید شدند که برتری روش فوق را نسبت به روش‌هایی که اساس آنها تیمار گیاهان با استفاده از کلشی‌سین در مراحل تولید بذر، برگ‌های لپه‌ای و یا روش‌های کشت درون شیشه‌ای است، نشان می‌دهد. برای مثال، در مطالعه‌ای که توسط Dutt و همکاران (2010) روی Citrus reticulate انجام شد، از روش تیمار بر سوسپانسیون سلولی که روش جدیدی محسوب می‌شود، استفاده شد که بیشینه راندمان تولید تتراپلوئید در این روش 35 درصد بود. در پژوهشی دیگر راندمان تولید گیاهان تتراپلوئید حاصل از تیمار بذرهای آبگیری شده گونه‌ای از بنفشه در نسل اول 73/0 درصد گزارش شد و در روش تیمار مریستم انتهایی در مرحله تولید برگ‌های لپه‌ای، راندمان 16/2 درصد گزارش گردید (Ajalin et al., 2002). همچنین، در پژوهشی که توسط Roy و همکاران (2001) گزارش شد، راندمان تولید گیاهان تتراپلوئید در گیاه رازک از طریق باززایی گیاهان تتراپلوئید از گیاهان میکسوپلوئید در شرایط کشت درون شیشه‌ای، 33 درصد گزارش شد.

سطح برگ

نتایج حاصل از این پژوهش در ارتباط با سطح برگ با القای پلی‌پلوئیدی در گیاه Spathiphyllum wallisii مشابه بود که سبب کاهش سطح برگ و نسبت طول به عرض گیاه تتراپلوئید نسبت به گیاه دیپلوئید شد
(Van Laere, et al., 2010). کاهش سطح برگ و همچنین کوتاه‌تر شدن گیاهان پلی‌پلوئید نسبت به گیاهان دپلوئید، می‌تواند سبب افزایش مقاومت این گیاهان در برابر عوامل نامساعد محیطی از جمله نور و بادهای شدید، خصوصاً در مناطق کوهستانی شود. پلی‌پلوئیدی آثار قابل توجهی بر تغییر نحوه بیان ژن‌ها دارد که ممکن است شامل خاموش یا روشن شدن برخی از ژن‌هایی شود که دو برابر شده‌اند. البته الگوی تغییر بیان ژن در سلول‌ها و اندام‌های مختلف و حتی در ژنوتیپ‌های مختلف یک گیاه می‌تواند متفاوت باشد (Adams and Wendel, 2005).

 

 

 

شکل 3- مقایسه کیسه ترشحی گیاهان لیموترش (1: گیاه شاهد، 2: گیاه تحت تیمار) با بزرگنمایی 40

 

جدول 1- مقایسه میانگین برخی ویژگی‌های کمّی و کیفی در گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید لیموترش. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.05 است.

ویژگی‌های کمّی وکیفی بررسی شده

گیاهان تتراپلوئید (SE± میانگین)

گیاهان دیپلوئید (SE± میانگین)

طول روزنه (µm)

 a4/1±62/48

 b8/0±4/29

عرض روزنه (µm)

 a3/1±8/42

 b6/0±8/22

کلروفیل a (mg/ml)

 a009/0±6/4

 a02/0±6/4

کلروفیل b (mg/ml)

 a02/0±5/1

 a1/0±4/1

کلروفیل کل (mg/ml)

 a01/0±1/6

 a1/0±9/5

ارتفاع گیاه (cm)

 b09/0±7/3

 a09/0±4/14

مساحت کیسه ترشحی (µm2)

 a8/169±1884

 b09/64±471

تراکم کیسه ترشحی (µm2)

b 01/0±04/0

a 04/0±09/0

طول برگ (cm)

b 1/0±2/3

a 2/0±8/6

عرض برگ (cm)

b 05/0±1/1

a 1/0±1/3

سطح برگ (cm2)

b 15/0±9/8

a 2/0±7/22

تراکم روزنه (µm2)

b 08/0±0004/0

a 2/0±003/0

کاروتنوئید (mg/ml)

a 1/0±2/1

a 05/0±4/1

 


 

 

مقایسه طول، عرض و تراکم روزنه

نتایج حاصل از طول و عرض روزنه در این تحقیق، با نتایج پژوهش‌هایی که افزایش سطح پلوئیدی سلول‌ها با افزایش طول و عرض روزنه ارتباط داشتند، منطبق است. Heping و همکاران (2008) مشاهده کردند که میانگین طول روزنه در گیاه تتراپلوئید زنجبیل 8/50 میکرومتر و در گیاهان دیپلوئید 7/36 میکرومتر بود. Omidbaigi و همکاران (2010) مشاهده کردند که اندازه عرض روزنه در گیاهان تتراپلوئید ریحان به طور غیر‌منتظره‌ای بیشتر از گیاهان دیپلوئید است، به طوری که عرض روزنه در گیاهان تتراپلوئید بیش از 3 برابر گیاهان دیپلوئید بود. علت تغییر اندازه اندام‌های گیاهی در اثر القای پلی‌پلوئیدی، سازگاری بیشتر گیاهان با محیط است. در واقع پلی‌پلوئیدها ممکن است قدرت زنده ماندن بیشتری نسبت به اجداد دیپلوئید خود در برابر عوامل نامساعد محیطی داشته باشند، زیرا با کاهش سطح برگ و از طرف دیگر افزایش اندازه سلول روزنه، توانایی گیاه در حفظ آب و ایجاد تعادل آبی بیشتر می‌شود (Grant, 1981; Stebbins, 1971). همچنین، نتایج این پژوهش با نتایج پژوهش‌هایی که نشان دادند با افزایش سطح پلوئیدی، تراکم روزنه در واحد سطح برگ کاهش می‌یابد، منطبق است. در همین راستا، Omidbaigi و همکاران (2010) گزارش کردند که وابستگی بین تراکم روزنه و سطح پلوئیدی در ریحان منفی است و تراکم روزنه مشاهده شده در گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاه دیپلوئید کمتر است، به طوری که فراوانی روزنه در گیاهان دیپلوئید 63 درصد بیشتر از گیاهان تتراپلوئید بود. Joshi و Verna (2004) نیز در پژوهشی گزارش کردند که افزایش سطح پلوئیدی در نمونه‌های تتراپلوئید لوبیا به علت افزایش اندازه سلول‌ها، سبب افزایش اندازه روزنه‌ها، در نتیجه کاهش تعداد آنها در واحد سطح در مقایسه با نمونه‌های دیپلوئید می‌شود.

ارتفاع

بر اساس نتایج حاصل از این تحقیق، کلشی‌سین بر ارتفاع گیاهان تیمار شده تأثیر دارد. به طوری که با افزایش غلظت تیمار، ارتفاع کاهش بیشتری نشان می‌دهد که این کاهش ارتفاع، یک روش آسان در تشخیص گیاهان دیپلوئید از تتراپلوئید است. سحرخیز (1385) نیز در گیاه بابونه کبیر مشاهده کرد که با افزایش غلظت کلشی‌سین، میزان ارتفاع گیاهان بابونه کبیر کاهش می‌یابد. کاهش ارتفاع ممکن است به علت پلی‌پلوئیدی شدن باشد، زیرا گیاهان پلی‌پلوئید مناطق کوهستانی که کوتاه‌تر از گیاهان معمول هستند، سازگاری بیشتری با محیط خود دارند. بررسی اثر کلشی‌سین روی گیاه دارویی Astragalus memberanaceus نشان داد که رشد آهسته گیاهان تتراپلوئید ممکن است به علت تخریب فیزیولوژیک ایجاد شده توسط کلشی‌سین باشد که در نتیجه باعث کاهش سرعت تقسیم سلولی می‌شود (Chen and Gao, 2007).

کلروفیل

نتایج حاصل از این پژوهش که عدم تغییر محتوای کلروفیل در گیاه لیموترش را نشان داد، با مطالعات انجام شده توسط حسنی و همکاران (1389) مغایر بود. آنها گزارش کردند که با افزایش سطح‌پلوئیدی در گیاه ریحان میزان کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل نیز به طور معنی‌داری افزایش می‌یابد. البته در پژوهشی دیگر که روی گیاه Urgenia indica انجام شد، نشان داد که میزان کلروفیل در گیاه تتراپلوئید و دیپلوئید تغییر معنی‌داری نمی‌کند (Phulari, 2011). لذا، چنین استنباط می‌شود که نوع گونه و رقم مورد مطالعه نیز می‌تواند در میزان کلروفیل در سطوح متفاوت پلوئیدی تأثیر داشته باشد (Andersson, 2009).

کاروتنوئید

نتایج پژوهش حاضر که عدم تغییر کاروتنوئید در گیاه لیموترش را نشان داد، با نتایج انجام شده توسط Randolph و Hand (1940) مغایر بود که گزارش کردند گیاهان ذرت تیمار شده با کلشی‌سین میزان کاروتنوئید بیشتری نسبت به گیاهان دیپلوئید داشتند. البته دما، شدت پرتو و میزان آب در دسترس در طول فصل رشد نیز بر میزان کاروتنوئید تأثیر می‌گذارند (Andersson, 2009).

 

جمع‌بندی

مقایسه برگ‌های گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید نشان داد که برگ‌های گیاهان تتراپلوئید از نظر اندازه دارای طول و عرض کمتری نسبت به دیپلوئید بودند. مقایسه ارتفاع بین گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید نشان داد که ارتفاع گیاهان تتراپلوئید به طور معنی داری نسبت به دیپلوئید کمتر بود. بررسی تراکم و ابعاد روزنه و همچنین کیسه ترشحی نیز نشان داد که در گیاهان تتراپلوئید در مقایسه با دیپلوئید تراکم روزنه کاهش یافته، اما ابعاد روزنه افزایش می‌یابد. همچنین، بررسی میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل و کاروتنوئید کل گیاهان لیموترش تیمار شده با کلشی‌سین افزایش معنی‌داری نداشت.

 

تشکر و قدردانی

از زحمات ارزشمند کارکنان محترم پژوهشکده بیوتکنولوژی شمال، به ویژه آقای دکتر اسد اسدی آبکنار و آقای مهندس علی صیاد رمضانی و کارشناسان محترم دانشکده علوم دانشگاه گیلان به ویژه آقای مهندس سید ابوالقاسم ناصر علوی و خانم‌ها مهندس فاطمه جمال امیدی، مهوش هادوی و زهرا شایگان تشکر و قدردانی می‌شود.

 

 

 
 

حسنی، م. ا.، میرزایی، م.، امیدبیگی، ر. و فتحی قره بابا، م. (1389) مجله علوم باغبانی ایران 41(2): 111-118.

سحرخیز، م. ج. (1385) تأثیر برخی از عوامل اقلیمی و سطح پلوئیدی بر خصوصیات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی گیاه دارویی زینتی بابونه کبیر (Tanacetum parthenium L.). پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس، تهران.

سلطانی، ف.، قربانلی، م. و منوچهری کلانتری، خ. (1385) اثر کادمیوم بر مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی، قندها و مالون‌دی‌آلدئید در گیاه کلزا (Brassica napus L.). مجله زیست‌شناسی ایران 19: 136-145.

فتوحی قزوینی، ر. و فتاحی‌مقدم، ج. (1389) پرورش مرکبات در ایران. ویرایش دوم، چاپ سوم، انتشارات دانشگاه گیلان، رشت.

 

 

 

 

 

 

Adams, K. and Wendel, J. F. (2005) Novel paterns of gen expression in polyploidy plants. Trends in genetics 21(3): 539-543.

Aibinu, I., Adenipekun, T., Adelowotan, T., Ogunsanya, T. and Odugbemi, T. (2007) Evaluation of the antimicrobial properties of different parts of Citrus aurantifolia (lime fruit) as used locally. African Journal of Biotechnology 4(2): 185-195.

Ajalin, I., Kobza, F. and Dolezel, J. (2002) Ploidy identification of doubled chromosome number plants in Viola × wittrockiana Gams. M 1-generation. Horticulture Science(Prague) 29(1): 35-40

Andersson, S. C. (2009) Carotenoids, tocochromanols and chlorophylls in sea buckthorn berries (Hippophae rhamnoides) and rose hips (Rosa sp.). Ph.D. Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp, Sweden.

Byrne, M. C., Nelson, C. J. and Randall, D. D. (1981) Ploidy effects on anatomy and gas exchange of tall fescue leaves. Plant Physiology 68: 891-893.

Chen, L. L. and Gao, Sh. L. (2007) In vitro tetraploid induction and generation of tetraploids from mixoploids in Astragalus memberanaceus. Scientia Horticulturae 112: 339-344.

Dhawan, O. P. and Lavania, U. C. (1996) Enhancing the productivity of secondary metabolites via induced polyploidy. Euphytica 87: 81-89.

Dijkstra, H. and Speckmann, G. I. (1980) Autotetrapliody in caraway (Carum carvi L.) for the increase of the aetheric oil content of the seed. Euphytica 29: 89-96.

Dutt, M., Vasconcellos, M., Song, K. J., Gmitter Jr, F. G. and Grosser, J. W. (2010) In vitro production of autotetraploid ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco) using cell suspension cultures. Euphytica 173: 235-242.

Esen, A., Soost, R. K. and Geraci, G. (1978) Seed set, size and development after 4x-2x and 4x-4x crosses in Citrus. Euphytica 27: 283-293.

Geraci, G., Esen, A. and Soost, R. K. (1975) Triploid progenies from 2x-2x crosses of Citrus cultivars. Journal of Hered 66: 177-178.

Gonzalez, L. D. J. and Weathers, P. J. (2003) Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploids. Plant Cell Reports 21: 809-811.

Grant, V. (1981) Plant Speciation. Columbia University Press, New York.

Hancock, J. F. (1997) The colchicine story. Hortscience 32: 1011-1012.

Hartwell, L. H., Hood, L., Goldberg, M. L., Reynolds, A. E., Silver, L. M. and Veres, R. C. (2004) Genetics from genes to genomes. 2nd Ed, McGraw-Hill Companies, Inc., New York.

Heping, H., Shanlin, G., Lanlan, C. and Xiaoke, J. (2008). In vitro induction and identification of autotetraploids of Dioscorea zingiberensis. In Vitro Cell Development Biology Plant 44: 448-455.

Janaki Amal, E. R. and Sobti, S. M. (1962) The origin of the Jammu Mint. Current Science 31: 387-388.

Joseph, M. C. and Randall, D. D. (1981) Photosynthesis in polyploidy tall fescue. Plant physiology 68: 894-898.

Joshi, P. and Verna, R. C. (2004) High frequency production of induced autotetraploids in Faba Bean (Vicia Faba L.). Cytologia69(2):141-147.

Lee, L. S. (1988) Citrus polyploidy: origins and potential for cultivar improvement. Australian Journal Agriculture 39: 735-747.

Lichtenthaler, H. K. and Wellburn, A. R. (1983) Determination of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf in different solvents. Journal of Biology and Society 11: 591-592.

Mathura, S., Fossey, A. and Beck, S. (2006) Comparative study of chlorophyll content in diploid and tetraploid black wattle (Acacia mearnsii). Forestry 79(4): 381-388.

Navarro, L., Jua´rez, J., Aleza, P. and Pina, J. A. (2002) Recovery of triploid seedless mandarin hybrids from 2n x 2n and 2n x 4n crosses by embryo rescue and flow cytometry. In: Proceedings of the 10th IAPTC and B Congress, plant biotechnology 2002 and beyond, Orlando.

Omidbaigi, R., Mirzaee, M., Hassani, M. E. and Sedghi Moghadam, M. (2010) Induction and identification of polyploidy in basil (Ocimum basilicum L.) medicinal plant by colchicine treatment. International. Plant Production 4(2): 87-98.

Owhe-Ureghe, U. B., Ehwarieme, D. A. and Eboh, D. O. (2010) Antibacterial activity of garlic and lime on isolates of extracted carious teeth. African Journal of Biotechnology 9(21): 3163-3166.

Oyagade, J. O., Awotoye, O. O., Adewunmi, J. T. and Thorpe, H. T. (1999) Antimicrobial activity of some nigerian medicinal plants. Bioscience 11: 193-197.

Oyagade, J. O., Awotoye, O. O., Adewunmi, J. T. and Thorpe, H. T. (1999) Antimicrobial Activity of some Nigerian medicinal plants. I. Screening for Antibacterial Activity. Bioscience Research Communications 11(3): 193-197.

Phulari, S. S. (2011) Polyploidy breeding in Urgenia indica - to study the effect of colchicines treatment on morphological character of Urgenia indica. Botany 1: 207-210.

Randall, D. D., Nelson, C. J. and Asay, K. H. (1977) Ribulose bisphosphate carboxylase altered genetic expression in tall fescue. Plant physiology 59: 38-41.

Randolph, L. F. and Hand D. B. (1940) Relation between carotenoid content and number of genes per cell in diploid and tetraploid corn. Journal of Agriculture Res 60: 51-64.

Roy, A. T., Leggett, G. and Koutoulis A. (2001) In vitro tetraploid induction and generation of tetraploids from mixoploids in hop (Humulus lupulus L.). Plant Cell 20: 489-495.

Sari, N., Abak, K. and Pitrat, M. (1999) Comparison of ploidy level screening methods in watermelon. Journal of Scientia of Horticulturae 82: 265-277.

Smith, S., Weyers, J. D. B. and Berry, W. G. (1989) Variation in stomatal characteristics over the lower surface of Commelina communis leaves. Journal of Plant Cell and Enviroment12: 653-654.

Stebbins, G. L. (1971) Chromosomal evolution in higher plants. Columbia University Press, New York.

Timco, M. P., Vasconcelos, A. C. and Fairbrother, D. E. (1981) Euploidy in ricinus I. euploidy and genen dosage effects on cellular proteins. Biochemistry Genetica 18: 171-183.

Urwin, N. A. R. and Horsnell, J. (2007) Generation and characterisation of colchicine-induced autotetraploid Lavandula angustifolia. Euphytica 156: 257-266.

Van Laere, K., Franca, S. C., Vansteenkiste, H., Van Huylenbroeck, J., Steppe, K. and Van Labeke, M. C. (2010) Influence of ploidy level on morphology, growth and drought susceptibility in Spathiphyllum wallisii. Acta Physiologiae Plantarum 33: 1149-1156.

Vardi, A. (1996) Strategies and consideration in mandarin improvement programmes. Proceedings of International Society of Citriculture 1: 109-120.