مطالعه ریزازدیادی گیاه نوروزک (Salvia leriifolia) با استفاده از کشت جوانه انتهایی

جنس مریم‌گلی (Salvia) با 58 گونه، از معروفترین جنس‌های تیره نعناست که استفاده‌های دارویی، غذایی و زینتی بسیاری دارد (Heywood, 1985). گونه Salvia leriifolia که در ایران به نام نوروزک شناخته می‌شود، بومی استان خراسان و بخشی از استان سمنان است که در فلور طبیعی ایران به آن اشاره شده است (Rechinger, 1982).

گزارش‌هایی در ارتباط با خواص درمانی عصاره‌های برگ و ریشه گیاه نوروزک وجود دارد. برای مثال، خاصیت ضد درد وآرام بخش آن قابل مقایسه با دیازپام (Hosseinzadeh and Lary, 2000) و خاصیت ضد التهابی آن قابل مقایسه با دیکلوفناک است (Hosseinzadeh and Yavary, 1999). همچنین، عصاره آن دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی (مدرس و همکاران، 1386 ب) و ضد باکتری بوده (مدرس و ابریشم‌چی، 1389)، از ایجاد و توسعه زخم معده در موش جلوگیری می‌کند، به طوری که کارآیی آن مشابه داروی sucralfate است (Hosseinzadeh et al., 2000). همچنین، در اسانس این گیاه 49 ترکیب وجود دارد که ترکیبات کامفور با 5/10 درصد، 1 و 8-سینئول با 6/8 درصد، کامفن با2/6 درصد وآلفاپینن با 7/4 درصد بیشترین سهم را به خود اختصاص می‌دهند. خواص ضد تکثیری آن روی سلول‌های سرطانی انسان به اثبات رسیده است (Loizze et al., 2009).

با توجه به محدودیت منابع آب و خاک و محدودیت تولید غذا و علوفه در زمین‌های زراعی، رویکرد کنونی بیشتر به منظور استفاده از گیاهانی است که متحمل به تنش‌های محیطی به ویژه خشکی و شوری باشند. گیاه نوروزک متحمل به شرایط سخت محیطی است و می‌تواند نقش مؤثری در تأمین بعضی از داروهای گیاهی مورد نیاز کشور و صادرات ایفا نماید. بنابراین، تلاش برای تکثیر و تولید انبوه آن، علاوه بر تأمین مصارف دارویی و صنعتی می‌تواند نقش مؤثری در ایجاد پوشش مناسب در مرتع به منظور جلوگیری از فرسایش خاک و کویر‌زدایی داشته باشد.

به طور کلی، هدف از ریزازدیادی، بیشینه تولید از یک گیاه در زمانی معین و در عین حال ایجاد مجموعه‌ای از گیاهان با ویژگی‌های ژنتیکی یکسان و با صفات کمّی و کیفی مورد نظر است (جعفری مفیدآبادی و طبایی عقدایی، 1380). تکثیر سریع گیاهان به ویژه در مورد گیاهانی که ازدیاد غیر جنسی آنها با روش‌های جنسی غیر ممکن و یا مشکل است، از طریق ریزازدیادی امکان‌پذیر است (حاج نجاری، 1373(.

قوه نامیه پایین و درصد جوانه‌زنی کم در بذر گیاه نوروزک، مشکلی اساسی برای تکثیر این گیاه ارزشمند به حساب می‌آید (حداد خداپرست و حسینی، 1372). همچنین، از آنجا که استفاده گسترده از گیاهان دارویی موجود در رویشگاه‌های طبیعی باعث نابودی آنها می‌شود، حفظ ذخایر ژرم‌پلاسم گیاهان دارویی در معرض خطر انقراض امری ضروری است. در گیاه نوروزک به علت تولید مقدار کم بذر سالم، استقرار کم بذرها در رویشگاه اصلی، روش‌های ناپایدار بهره‌برداری توسط افراد بومی و محلی و چرای بی‌رویه توسط دام، بخش وسیعی از رویشگاه‌های طبیعی این گیاه تخریب شده، در نتیجه گیاه نوروزک در معرض خطر انقراض قرار گرفته است (Jalili and Jamzad., 1999). ریزازدیادی گیاهان در معرض خطر انقراض، یکی از روش‌های حفاظتی مؤثر برای جلوگیری از انقراض آنهاست.

ریزازدیادی گونه‌های مختلف جنس Salvia توسط محققان انجام شده است. به عنوان مثال، کشت جوانه انتهایی S. fruticosa در محیط‌کشت‌های مختلف و تیمار‌های هورمونی مختلف نشان داد که بیشترین شاخه‌زایی در محیط MS حاوی هورمون BAP و بیشترین ریشه‌زایی در محیط‌کشت MS به همراه هورمون IBA بوده است .(Arikat et al., 2004) ریزازدیادی S. branchyodon از طریق کشت تک‌گره در محیط‌کشت MS 2/1 در حضور هورمون‌های BA برای شاخه‌زایی و هورمون‌های IBA، NAA و IAA برای ریشه‌زایی صورت گرفته است (Misic et al., 2006). همچنین، کشت جوانه انتهایی درگونه
S. nemorosa و گونه S. stenophylla نشان داد، محیط‌کشت MS همراه با هورمون‌های BA و IAA موثرترین تیمار برای ریزازدیادی آنها بوده است (Ewa and Wysokinska, 2004)؛ (Hannibal et al., 2010. گونه S. officinalis در محیط‌کشت MS از طریق کشت ریزنمونه گره همراه با هورمون‌های مختلف سیتوکینین و اکسین تکثیر و مشخص شده است که مناسب‌ترین هورمون‌ها برای ریزازدیادی آن BA و IBA است (Gostin, 2008). شایان ذکر است، گونه Salvia leriifolia به علت پراکندگی محدود (بومی بخشی از ایران)، قدرت جوانه‌زنی کم بذرها، قرار داشتن در معرض انقراض و ویژگی‌های غذایی، دارویی و مرتعی منحصر به فرد آن با دیگر گونه‌های Salvia متفاوت است. بنابراین، ریزازدیادی آن از اهمّیت ویژه‌ای برخوردار است. طبق بررسی‌های انجام شده، تاکنون گزارشی از ریزازدیادی گیاه نوروزک منتشر نشده است. لذا، مطالعه حاضر با هدف بررسی امکان ریزازدیادی این گیاه از طریق کشت جوانه انتهایی انجام گرفت.

مواد و روش‌ها

آماده‌سازی مواد گیاهی

بذر گیاه نوروزک از اطراف شهرستان بجستان واقع در استان خراسان رضوی جمع‌آوری و برای استریفیکاسیون بذرها به مدت 3 هفته در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. با توجه به جوانه‌زنی بسیار کم بذرها در شرایط درون شیشه‌ای از کشت جنین (مدرس و همکاران،1386 الف) برای به دست آوردن گیاهچه‌های استریل استفاده شد.

برای کشت جنین، از محیط‌کشت MS 2/1 (Murashige and Skoog ,1962) حاوی سوکروز (30 گرم بر لیتر)، گلایسین (2 میلی‌گرم بر لیتر)، زغال فعال (2 گرم بر لیتر) و آگار (7 گرم بر لیتر) استفاده شد. هورمون‌های BAP (بنزیل آمینو پورین) و NAA (نفتالین استیک اسید) به میزان یک میلی‌گرم بر لیتر به محیط‌کشت اضافه شد و اسیدیته محلول 8/5 تنظیم شد (مدرس و همکاران، 1391). در ادامه، 20 میلی‌لیتر از محیط‌کشت به ظروف شیشه‌ای 200 میلی‌لیتری منتقل و به مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار یک اتمسفر اتوکلاو شد.

ابتدا پوشش روی بذرها حذف شد، سپس برای ضدعفونی شدن به مدت 30 ثانیه در اتانول 70 درصد و 5 دقیقه در آب ژاول 3 درصد قرار گرفتند و 3 مرتبه با آب مقطر شسته شدند. پس از آن، رویان چند میلی‌متری با دقت از میان دو لپه خارج شد و در سطح محیط‌کشت قرار گرفت. رویان‌ها، ابتدا به مدت یک هفته در شرایط تاریکی و سپس به شرایط 16 و 8 ساعت به ترتیب روشنایی (40 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) و تاریکی و دمای 24-25 درجه سانتیگراد منتقل شدند. 10 روز پس از کشت جنین از جوانه انتهایی آن برای ریزنمونه استفاده شد.

ساقه‌زایی (پرآوری)

به منظور ساقه‌زایی دو آزمایش طراحی شد. در آزمایش اول 9 تیمار شامل هورمون‌های سیتوکینین BAP و Kin (کینتین) با غلظت‌های صفر، 5/0، 1، 2 و 3 میلی‌گرم بر لیتر، هر کدام به تنهایی در محیط‌کشت MS حاوی سوکروز (30 گرم بر لیتر) و زغال فعال (2 گرم بر لیتر) در ساقه‌زایی جوانه انتهایی بررسی شد. در آزمایش دوم نیز به محیط‌کشت یاد شده، غلظت‌های مورد نظر از BAP و Kin، در ترکیب با IBA در 2 سطح 1 و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر (16 تیمار) برای ساقه‌زایی از جوانه انتهایی بررسی شد. اسیدیته همه محلول‌ها روی 8/5 تنظیم شد، پس از آن، به مدت 20 دقیقه در 121 درجه سانتیگراد و فشار یک اتمسفر اتوکلاو شد. جوانه انتهایی حاصل از رشد جنین به طول 5 میلی‌متر جدا شد و به صورت عمودی روی محیط‌کشت قرار گرفت. محیط‌های کشت حاوی جوانه انتهایی به شرایط فتوپریود 16 ساعت روشنایی(40 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) و دمای 24-25 درجه سانتیگراد منتقل شدند. پس از 4 هفته درصد ریز‌نمونه‌هایی که تشکیل ساقه دادند، تعداد ساقه‌ها در هر ریزنمونه و طول ساقه ها محاسبه شد. همچنین، با توجه به این که در برخی تیمارها ساقه‌زایی همراه با تولید ریشه بود، طول ریشه و درصد ریشه‌زایی نیز بررسی شد.

ریشه‌زایی

در پایان هفته چهارم ساقه‌های کوچک به دست آمده در مرحله ساقه‌زایی برای حذف تأثیرات سیتوکینین وارد محیط MS بدون هورمون شدند، پس از گذشت 4 هفته، ساقه‌ها به منظور ریشه‌زایی به محیط‌کشت MS حاوی هورمون‌های اکسین NAA، 2,4-D و IBA در 3 غلظت (25/0، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) منتقل شدند. درصد ریشه‌زایی، تعداد ریشه‌ها و طول ریشه‌ها پس از 4 هفته بررسی شد.

سازگاری

ساقه‌های ریشه‌دار شده پس از شستشوی ریشه‌ها با آب مقطر استریل در گلدان‌های پلاستیکی حاوی پرلیت، شن و خاک استریل شده به نسبت (5:1:1/0) کشت داده شدند. برای جلوگیری از تبخیر آب روی گیاهچه‌ها با لیوان یک‌بار مصرف شفاف پوشیده شد و در اتاق رشد با شرایط قبلی قرار گرفتند. گیاهچه‌ها هر روز به مدت 14 روز آبیاری شدند. پس از این مدت، به منظور سازگاری گیاهچه‌ها، سوراخ‌هایی توسط پانچ روی لیوان‌ها ایجاد و پس از 3 هفته سرپوش روی گلدان‌ها برداشته و به گلخانه منتقل شدند.

تحلیل آماری

آزمایش‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. در هر تیمار 25 ریزنمونه کشت شد و همه آزمایش‌ها 2 بار تکرار شد. برای محاسبات آماری از نرم‌افزارهای JMP و MSTAT-C استفاده شد و مقایسه میانگین‌ها بر اساس آزمون دانکن (P<0.05) انجام شد.

نتایج

ساقه‌زایی

در این مطالعه، تأثیر افزودن غلظت‌های مختلف هورمون‌های سیتوکینین BAP و Kin به تنهایی و یا در ترکیب با هورمون اکسین IBA به محیط‌کشت MS در ساقه‌زایی از جوانه انتهایی گیاه نوروزک بررسی شد. نتایج آزمایش اول نشان داد، بیشترین درصد ساقه‌زایی در تیمارهای حاوی سیتوکینین به تنهایی به غلظت‌های 2 و 3 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP مربوط بود. محیط‌کشت MS بدون هورمون و پس از آن محیط حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin دارای کمترین درصد ساقه‌زایی بودند.

همچنین، در غلظت‌های مختلف BAP و Kin به تنهایی بیشترین میانگین تعداد ساقه‌ها متعلق به غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر از هورمون‌های یاد شده بود. در این ارتباط، کمترین تعداد ساقه را محیط‌کشت MS بدون هورمون و سپس 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin تولید نمود. بر اساس مقایسه میانگین‌ها، در محیط‌کشت‌های حاوی سیتوکینین، غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BAP بلندترین طول ساقه را ایجاد کرد.

درآزمایش دوم، نتایج کشت جوانه‌های انتهایی در محیط MS حاوی سطوح مختلف از سیتوکینین‌های BAP و Kin در ترکیب با هورمون اکسین IBA نشان داد، تفاوت معنی‌داری بین تیمارهای مختلف از نظر میانگین تعداد ساقه‌های ایجاد شده در هر ریزنمونه وجود دارد و ترکیب غلظتی 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA بیشترین میانگین تعداد ساقه را تولید نمود که نسبت به سایر تیمارها تفاوت معنی‌داری نشان داد. علاوه بر این، بیشترین درصد تولید ساقه از هر ریزنمونه به تیمار فوق اختصاص داشت. همچنین، بین ترکیب غلظت‌های مختلف BAP، Kin و IBA از نظر طول ساقه‌های تولیدی نیز تفاوت معنی‌داری وجود داشت. بر اساس نتایج مقایسه میانگین توسط آزمون دانکن، سطح هورمونی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA بلندترین ساقه را ایجاد کرد که نسبت به تیمارهای دیگر معنی‌دار بود. شایان ذکر است، در محیط‌های حاوی ترکیب غلظت‌های مختلف سیتوکینین در ترکیب با اکسین علاوه بر ساقه‌زایی، ریشه‌زایی نیز صورت گرفت (جدول 1 و شکل‌های 1 و 2).

ریشه‌زایی

در مرحله ریشه‌زایی تأثیر 3 هورمون اکسین IBA، NAA و 2,4-D در غلظت‌های صفر، 25/0، 5/0 و 1 بر ریشه‌زایی ساقه‌های حاصل از مرحله قبل بررسی شد. ابتدا ساقه‌ها به مدت 4 هفته در محیط MS بدون هورمون قرار گرفتند. ولی در این مدت ریشه‌زایی انجام نشد. نتایج ریشه‌زایی در محیط‌کشت‌های دارای هورمون اکسین پس از 4 هفته نشان داد که ریشه‌زایی تنها در محیط‌کشت‌های حاوی هورمون‌های IBA و 2,4-D اتفاق می‌افتد و غلظت‌های مختلف NAA تأثیری بر تولید ریشه در ساقه‌ها نداشتند. بالاترین درصد ریشه‌زایی به سطح یک میلی‌گرم بر لیتر IBA و پس از آن غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D مربوط بود.

طول ریشه نیز تحت تأثیر غلظت‌های مختلف هورمون IBA قرار گرفت و بلندترین ریشه در غلظت یک میلی‌گرم بر لیتر IBA تشکیل شد که نسبت به دیگر تیمارها تفاوت معنی‌دار نشان داد. از بین غلظت‌های مختلف 2,4-D ساقه‌ها تنها در غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر ریشه‌زایی نمودند و کمترین طول ریشه نیز به همین غلظت مربوط بود. در تیمارهایی که ریشه‌زایی در آنها انجام شده بود، از نظر تعداد ریشه تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (جدول 2 و شکل‌های 3 و 4). ریشه‌ها به طور مستقیم از قاعده خارج شدند، بنابراین، ارتباط آوندی بین ساقه و ریشه که مستلزم جذب و انتقال املاح به بخش هوایی است به موقع صورت گرفته است (حاج نجاری، 1373). گیاهان به دست آمده مراحل سازگاری را در اتاق رشد طی کردند و بقای آنها در حدود 75 درصد بود.

جدول 1- تأثیر هورمون‌های BAP، Kin و IBA در محیط‌کشت MS بر ساقه‌زایی از جوانه انتهایی S. leriifolia پس از 4 هفته. مقادیر میانگین 5 تکرار ± StD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

جدول 2- تأثیر هورمون‌های IBA، 2,4-D و NAA در محیط‌کشت MS بر ریشه‌زایی ساقه‌های حاصل از ریزازدیادی گیاه S. leriifolia پس از 4 هفته. مقادیر میانگین 5 تکرار±StD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

بحث

تأثیر سطوح مختلف هورمون‌های BAP و Kin به تنهایی و نیز در ترکیب با IBA در محیط‌کشت MS بر ساقه‌زایی از جوانه انتهایی گیاه S. leriifolia بررسی شد. توانایی ساقه‌زایی تحت تأثیر غلظت‌های مختلف BAP و Kin واقع شد و در غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 2 میلی‌گرم بر لیتر Kin بیشترین درصد ساقه‌زایی و بیشترین تعداد ساقه‌ها به ازای هر ریزنمونه ایجاد شد. از طرف دیگر، رشد طولی ساقه‌ها با افزایش غلظت BAP کاهش یافت. این نتیجه در گونه
S. nemorosa نیز گزارش شده است (Ewa and Wysokinska, 2004). پژوهش حاضر نشان داد که استفاده از ترکیب غلظت‌های مختلف BAP و Kin با هورمون IBA نسبت به سیتوکینین‌ها به تنهایی، نتیجه بهتری در ارتباط با افزایش تعداد ساقه به ازای هر ریزنمونه و رشد طولی ساقه‌ها دارد. در این بین، ترکیب سطوح مختلف BAP با IBA بر ساقه‌زایی مؤثرتر بود. مناسب‌ترین تیمار برای ساقه‌زایی از جوانه انتهایی
S. leriifolia در محیط‌کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA به دست آمد. اگرچه در این تیمار بیشینه تولید ساقه به ازای هر ریزنمونه به وجود آمد، ولی، طول ساقه‌ها به طور معنی‌داری کاهش یافت. به علاوه تیمار یاد شده به تولید ریشه در ساقه‌ها منجر شد که نقش مهمی در افزایش مقاومت ساقه‌ها و رشد مناسب برگ‌ها داشت. برتری هورمون BAP نسبت به دیگر سیتوکینین‌ها برای ریزازدیادی جنس Salvia پیش از این گزارش شده است. برای مثال، در گونه S. guaranitica از میان هورمون‌های سیتوکینین BAP، Kin، TDZ و 2-iP، هورمون BAP بیشترین تأثیر را بر افزایش تعداد ساقه‌ها به ازای هر ریزنمونه داشت (Echeverrigaray et al., 2010). همچنین، Arikat و همکاران (2004) BAP، Kin و TDZ را روی ساقه‌زایی از جوانه انتهایی گونه
S. fruticosa آزمایش و مناسب‌ترین سیتوکینین را BAP گزارش کردند. Misic و همکاران (2006) نیز نتیجه مشابهی را در ریزازدیادی گونه S. brachydon به‌دست آوردند. در توافق با نتیجه پژوهش حاضر در گونه S.brossontii، تأثیر BAP به همراه اکسین بهتر از BAP به تنهایی بود (Mederos-Molina, 2006). پژوهش‌ Zhao و همکاران (2010) نشان داده است که ژن‌های تنظیم‌کننده ARR (A-type Arabidopsis Responsive Regulator) که در مریستم انتهایی حضور دارند، در ترارسانی علامت سیتوکینین نقش منفی دارند. از طرفی، مشخص شده است که اکسین بر ARR‌ها اثر بازدارندگی دارد. پس وجود اکسین به همراه سیتوکینین سبب تقویت نقش سیتوکینین می‌شود. بنابراین، در تحقیق حاضر، اثر مثبت اکسین و سیتوکینین در ساقه‌زایی از جوانه انتهایی منطقی به نظر می‌رسد.

در این پژوهش، ساقه‌های حاصل از جوانه‌های انتهایی S. leriifolia طبیعی بوده، شیشه‌ای شدن در هیچ کدام از تیمارها مشاهده نشد. شایان ذکر است که جوانه‌های انتهایی حاصل از ساقه‌های به دست آمده در محیط‌کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA، 6 بار به طور ماهیانه در تیمار یاد‌شده واکشت شدند و تحت این شرایط توان ساقه‌زایی و شکل طبیعی آنها تغییر نکرد.

شکل 5- ساقه‌زایی از جوانه انتهایی گیاه S. leriifolia در محیط‌کشت MS حاوی تیمارهای هورمونی. (a 2 میلی‌گرم بر لیتر Kin ؛
(b 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP؛ c و (d 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 5/0میلی‌گرم بر لیتر IBA؛ e و (f ریشه‌زایی در محیط‌کشت MS حاوی یک میلی‌گرم بر لیتر IBA و رشد طولی گیاه در همین تیمار پس از 4 هفته.