ارزیابی اثر توالی‌های پپتید نشانه پلاستیدی LIM14 و AtCPrecA در هدایت پروتئین‌های گزارشگر فلورسنت سبز (GFP) و بتاگلوکورونیداز (GUS) در گیاهان سیب‌زمینی تراریخت

نویسندگان

گروه بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

چکیده

در این پژوهش، توالی‌های پپتید نشانه یک پروتئین اختصاصی بساک در گیاه Lilium longiflorum cv. Hinomoto به نام LIM14 و یک پروتئین در گیاه آرابیداپسیس با نام AtCPrecA که ویژگی‌های توالی‌های نشانه کلروپلاستی را دارا هستند، به طور جداگانه به پایانه آمینی ژن‌های گزارشگر پروتئین فلورسنت سبز (Green Fluorescent Protein=GFP) و بتاگلوکورونیداز (β-glucoronidase=GUS) متصل شده، سازه‌های حاصل به واسطه اگروباکتریوم به رقم کاردال گیاه سیب‌زمینی (Solanum tuberosum L. cv. Kardal) منتقل شدند. بررسی با میکروسکوپ فلورسنت و همچنین رنگ‌آمیزی هیستو شیمیایی GUS، نشان داد که پروتئین‌های نوترکیب
LIM14-GUS و LIM14-GFP به آمیلوپلاست‌ غده و کلروپلاست سیب‌زمینی‌های تراریخت هدایت شده‌اند. سنجش کمّی فعالیت آنزیم GUS نشان داد که میزان بیان این پروتئین در بخش‌های غنی از آمیلوپلاست گیاهان تراریخت سیب‌زمینی، در حالت حضور توالی نشانه به مراتب بیشتر از گیاهان تراریخت واجد ژن gus به تنهایی است. در این مطالعه همچنین عملکرد پپتید نشانه AtCPRecA، در بالادست پایانه آمینی پروتئین فلورسنت سبز بررسی شد و بیان این پروتئین در سلول‌های اپیدرم پیاز (Allium cepa L.) نشان‌دهنده این بود که AtcpRecA-GFP به طور ویژه در پلاستیدها متمرکز شده‌اند. بر اساس نتایج حاصل از این بررسی، توالی‌های نشانه AtCPRecA و LIM14 وظیفه پیش‌بینی شده را انجام داده، قابلیت هدایت پروتئین نوترکیب را به درون پلاستید دارا هستند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Functional assessment of plastid signal peptide sequences LIM14 and AtCPrecA in localization of Green Fluorescent Protein (GFP) and beta-glucuronidase (GUS) reporter proteins in transgenic potato plants

نویسندگان [English]

  • Omid Taghavian
  • Amir Mousavi
  • Haleh Hashemi Sohi
  • Esmat Jourabchi
  • Kasra Esfahani
Department of Plant Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
چکیده [English]

In this study, signal peptide sequences of Lillum longiflorum anther-specific protein LIM14 and ATCPrecA, a protein with the origin of A. thaliana that had the characteristics of chloroplast signal sequence were independently fused to the N terminus of the green fluorescent protein (GFP) and β-glucoronidase (GUS) genes and subsequently transferred to potato (Solanum tuberosum cv. Kardal) as an important starch storage plant by Agrobacterium-mediated transformation. Fluorescence microscopy and GUS staining showed that the recombinant LIM14-GFP fusion protein was targeted to the amyloplast and chloroplast of transgenic potato plants. Quantitative assay of GUS showed that the level of expression in the enriched amyloplast fragment of signal peptide included plants is higher than the GUS control transformed plants. ATCPrecA is a protein with the origin of Arabidopsis thaliana that had the characteristics of chloroplast signal sequence in N-terminus. To study the function of the transit peptide of ATCPrecA, full length cDNA was fused to the N-terminus of the GFP to make recombinant protein. ATCPrecA-GFP was transferred to potato by Agrobacterium-mediated transformation and transiently expressed in onion (Allium cepa L.) epidermal cells via microprojectile bombardment. According to the results of this research, we concluded that the transit sequence of both LIM14 and ATCPrecA were functional and were capable of directing recombinant proteins into plastids.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Plastid
  • Transgenic potato
  • Recombinant protein
  • Signal peptide
  • Quantitative assay

در یک سلول یوکاریوتی، چندین هزار نوع پروتئین مختلف وجود دارد. برای کارکرد صحیح این پروتئین‌ها در سامانه سلولی، لازم است که هر یک از پروتئین‌ها در جایگاه و محل مناسب خود نظیر غشا سلولی، ماتریکس میتوکندری، شبکه اندوپلاسمی، لیزوزوم، پلاستید یا سیتوسل قرار گیرند. انتقال هر یک از این پروتئین‌ها پس از تولید در ریبوزوم به اندامک‌های مورد نظر، با شناسایی علایم مربوط به محل فعالیت آنها که عمدتاً در توالی ابتدای ساختار پروتئین قرار دارد صورت می‌گیرد (Hoppman et al., 2002؛ (Peng and Gong 2011. از این سامانه برای انتقال پروتئین‌های نوترکیب به اندامک‌های ویژه در گیاهان تراریخت، با مقاصد مختلفی مانند: تولید گیاهان مقاوم به عوامل بیماری‌زا، حشرات و علف‌کش‌ها، مهندسی مسیرهای بیوشیمیایی اندامک‌ها، تولید دارو و پروتئین‌های ارزشمند اقتصادی استفاده شده است (Fischer and Emans, 2000).

هزینه تولید پروتئین‌های نوترکیب دارویی و صنعتی، آنتی‌بادی‌ها و واکسن‌ها در گیاهان 10 تا 50 برابر ارزان‌تر از هزینه تولید آنها در باکتری Escherichia coliبرآورد می‌شود (Kusnadi et al., 1997) اما هزینه استخراج و خالص‌سازی این پروتئین‌ها از گیاهان تراریخته نسبتاً بالا بوده (Giddings, 2001)، به ترتیب 40 و 48 درصد از کل هزینه عملیاتی سالانه تولید این مواد با درجه خلوص 83 درصد را شامل می‌شوند (Schiermeyer et al., 2004). همچنین، میزان تولید پروتئین‌های نوترکیب نسبت به کل پروتئین محلول در گیاهان بسیار پایین است (02/0 درصد در اندام‌های هوایی و یک پنجم این مقدار در ریشه و غده) (Farran et al., 2002) و علت این موضوع هنوز کاملاً مشخص نشده است (Shadwick and Doran, 2004). علیرغم اینکه این میزان پایین تولید پروتئین نوترکیب در گیاهان، با عملکرد بسیار بالای تولید توده زیستی (biomass) جبران می‌شود، در عین حال استفاده از دو راهبرد ذخیره این پروتئین‌ها در اندام‌هایی ذخیره‌ای نظیر: بذر (Wright et al., 2001) و غده (Farran et al., 2002) (راهبرد انتقال به اندام) و انتقال پروتئین نوترکیب به اندامک‌های درون سلولی مثل شبکه اندوپلاسمی، میتوکندری و پلاستید می‌تواند راهگشا باشد.

در راهبرد اول، از پیش‌بَرهای (promoters) اختصاصی بافت نظیر: پاتاتین (patatin) (پیش‌بَر اختصاصی غده سیب‌زمینی)، اولئوسین (Oleosin) (پیش‌بَر اختصاص بذور روغنی) و پیش‌بَر اختصاصی بافت‌های سبز ذرت (maize C4 PEP carboxylase) استفاده می‌شود که باعث بیان نسبتاً بالای پروتئین نوترکیب در یک بافت اختصاصی می‌شوند.

در راهبرد دوم، از توالی‌های پپتید نشانه برای انتقال پروتئین‌های نوترکیب به اندامک‌های سلولی استفاده می‌شود. انتقال درون سلولی پروتئین‌ها به محلی خاص تأثیر زیادی بر بیان بالای پروتئین مورد نظر خواهد داشت؛ چرا که تجمع پروتئین در محل‌های خاص و مورد نظر در سلول و بافت، می‌تواند باعث پایداری بیشتر آن و همچنین، سهولت استخراج آن گردد (Thomas et al., 2005). به هر حال، مهم‌ترین عامل تعیین کننده سطح کلی تجمع پروتئین‌ها، پایداری آنها به ویژه در مورد آنتی‌بادی‌ها است که با انتقال هدفمند این پروتئین‌ها قابل حصول است (Schiermeyer et al., 2004).

هر دو راهبرد اشاره شده در بیان دایم و موقت پروتئین هدف قابل اجرا هستند (Fischer and Emans, 2000). میزان تجمع پروتئین بستگی به مقصد آن در داخل سلول دارد (D'Aoust et al., 2004) و یکی از گزینه‌های مطرح برای بیان و تولید پروتئین، هدایت آن به شبکه اندوپلاسمی (Fischer and Emans, 2000) است، چرا که تغییرات پس ترجمه‌ای ایجاد شده در این مسیر کامل بوده، برای ساختار، عمل و کارآیی پروتئین مهم هستند. در عین حال، در برخی موارد هدایت پروتئین‌ها به کلروپلاست به ویژه پروتئین‌هایی که نیاز به تغییرات پس از ترجمه خاصی ندارند، نسبت به سایر اندامک‌ها مناسب‌تر بوده است (D'Aoust et al., 2004). به طور طبیعی نیز بخشی از پروتئین‌های کلروپلاست توسط ژن‌های مستقر در هسته سلول رمز می‌شوند و این پروتئین‌ها پس از تولید در سیتوسل به کلروپلاست منتقل می‌شوند Gould et al., 2008)؛ Jarvis, 2008؛ Li and Chiu, 2010). تعداد زیاد پلاستیدها در تمامی اندام‌های گیاهی و نقش ذخیره‌ای آنها برای لیپیدها، نشاسته و رنگدانه‌ها آنها را در این زمینه مورد توجه ویژه قرار داده است.

ویژگی‌های گیاه سیب‌زمینی مانند سادگی تکثیر رویشی، آن را تبدیل به یکی از مناسب‌ترین گزینه‌ها برای استفاده در زراعت مولکولی به عنوان یک رآکتور زیستی قدرتمند کرده است. در عین حال، بررسی‌های جدید نشان می‌دهد که سیب‌زمینی مزایای بی‌شمار دیگری نیز برای تولید مواد دارویی دارد. غده گیاه سیب‌زمینی اندامی اختصاصی است که برای تجمع مقادیر بالای پروتئین سازش یافته است؛ بنابراین، تولید پروتئین‌های نوترکیب در غده با استفاده از پیش‌بَرهای اختصاصی غده یا هدایت این پروتئین‌ها به آمیلوپلاست با استفاده از پپتیدهای نشانه می‌تواند بسیار سودمند باشد.

گزارش‌های متعددی از بیان تراژن‌های گوناگون در غده سیب‌زمینی با استفاده از روش‌های مختلف وجود دارد که همه آنها به یک میزان موفقیت‌آمیز نبوده‌اند Mason et al., 1996)؛ Ehsani et al., 1997؛ Artsaenko et al., 1998؛ Castanon et al., 1999؛ Farran et al., 2002؛ (Kim et al., 2003. با استفاده از پیش‌بَر پاتاتین که مختص غده است و همچنین، توالی راهنمای آمیلوپلاستی (granule bound starch synthase)، موفقیت در خور توجهی در این زمینه حاصل شده است (Ji et al., 2003).

در پژوهش حاضر، فعالیت دو توالی راهنمای پپتیدی پروتئین‌های LIM14 و ATCPrecA در انتقال پروتئین‌های نوترکیب به اندام ذخیره‌ای نشاسته بررسی شده است. توالی اول، توالی راهنمای یک پروتئین اختصاصی بساک (Lily messages Induced at Meiosis) به نام LIM14 است که در تجمع نشاسته و تمایز آمیلوپلاست هنگام شکل‌گیری بساک و تشکیل گرده‌ها در گیاه سوسن (Lilium longiflorum) نقش دارد (Mousavi et al., 1999). توانایی LIM14 در انتقال موفق پروتئین‌های گزارشگر به پلاستیدهای لاین سلولی BY-2 گیاه توتون با استفاده از روش انتقال ژن پایدار پیش از این تأیید شده بود، گرچه در روش انتقال ژن موقت، ‌موفقیتی در این زمینه حاصل نشده بود (Mousavi et al., 1999). این توالی به منظور هدایت و تجمع پروتئین‌های نوترکیب به آمیلوپلاست گیاه سیب‌زمینی استفاده شد. همچنین، پروتئین ATCPrecA که در گیاه Arabidopsis thalianaشناسایی شده است، دارای یک توالی راهنمای کلروپلاستی در پایانه آمینی خود است (Hiratsuka et al., unpublished). با قرار دادن توالی پپتید نشانه این پروتئین در بالادست ژن رمز کننده پروتئین GFP (پایانه آمینی)، فعالیت این توالی نیز مطالعه شد. پس از انتقال سازه‌های مذکور به گیاهان هدف، کارآیی توالی‌های ذکر شده در هدایت پروتئین‌های نوترکیب به پلاستید ارزیابی شد.

 

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی

برای تهیه جداکشت ریز غده، ساقه‌های استریل رقم کاردال گیاه سیب‌زمینی (Solanum tuberosum L. cv. Kardal) در محیط‌کشت MS (Murashige and Skoog, 1962) با اسیدیته 8/5، حاوی 3 درصد سوکروز و 8/0 درصد آگار قرار داده شد. سپس، در شرایط دمای 18 درجه سانتیگراد، با دوره نوری 16 ساعت روشنایی (با شدت نور 6000 تا 8000 لوکس) و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. نمونه‌ها هر دو هفته یک بار به محیط‌کشت تازه منتقل شدند و در نهایت، گیاهچه‌های حاصل به محیط‌کشت MS دارای 9 درصد سوکروز منتقل شدند. از رآکتور زیستی تعلیق موقت (Piao et al., 2003) محتوی محیط‌کشت MS مایع حاوی 9 درصد سوکروز و هورمون BAP با غلظت نهایی 2 میلی‌گرم در لیتر نیز برای تولید ریز غده استفاده شد.

 

شکل 1- غوطه‌وری موقت شاخه‌های حاصل از کشت در شیشه سیب‌زمینی در رآکتور زیستی برای غده‌زایی

برای بررسی بیان موقت ژن از روش بمباران ذره‌ای، از سلول‌های لایه اپیدرمی پیاز خوراکی (Allium cepa L.) استفاده شد.

 

ساخت سازه‌های ژنی

برای ساخت ناقل بیانی ترکیبی LIM14-GUS، قطعه ۷۹ جفت بازی ابتدای توالی LIM14 از پلاسمید pBluscript-LIM14 (Kobayashi et al., 1994) با استفاده از آنزیم‌های XbaΙ و BsaI خارج شده، پس از هضم آنزیمی پلاسمید pBI121 (Clontech) با آنزیم‌های XbaI و SmaI، در این جایگاه‌ها همسانه‌سازی گردید.

برای ساخت ناقل بیانی ترکیبی pBI121-CPGFP2، ابتدا ناحیه رمزکننده پروتئین فلورسنت سبز (GFP) از ناقل pGFP2 (Spielhofer and Chua, unpublished) جایگزین ژن gus در پلاسمید pBI121 شد. سپس، این پلاسمید با آنزیم‌های XbaI و XhoI هضم شده و قطعه ابتدای توالی LIM14 که با استفاده از آنزیم‌های XbaΙ و BsaI از پلاسمید pBluscript-LIM14 خارج شده بود، در این جایگاه‌ها همسانه‌سازی شد.

سازه‌های ساخته شده به همراه ناقل pBI121 با روش انجماد و ذوب (Sambrook and Russell, 2001) به سویه GV3850 باکتری Agrobacterium tumefaciens منتقل شده، سپس، برای انتقال به گیاه سیب‌زمینی استفاده شدند.

در مرحله بعد، قطعه AtCPRecA-GFP2 از پلاسمید pBI121-CPGFP2 با استفاده از آنزیم‌های BamHI و SacI جداسازی شده، در ناقل pBI221 که با استفاده از هضم آنزیمی با BamHI و SacI ژن gus آن خارج شده بود، همسانه‌سازی شد. همچنین، ناقل p35S-GFP (Clontech) نیز در این روش به عنوان سازه ژنی شاهد استفاده شد.

 

تراریختی گیاهان

انتقال ژن هدف توسط آگروباکتریوم

باکتری آگروباکتریوم حامل سازه‌های مورد نظر در محیط LB مایع (تریپتون 10 گرم در لیتر، عصاره مخمر 5 گرم در لیتر، کلرید کلسیم 10 گرم در لیتر) با اسیدیته 7 دارای غلظت مناسب آنتی‌بیوتیک (50 میلی‌گرم در لیتر کانامایسین) در دمای 28 درجه سانتیگراد کشت شدند. وقتی OD600 محیط‌کشت به 5/0 رسید، محیط‌کشت به مدت 10 دقیقه با 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شده، رسوب باکتری در 10 میلی‌لیتر محیط تلقیح (محیط‌کشت MS، 5 درصد سوکروز، اسیدیته 5) مجدداً به صورت سوسپانسیون در آمد.

برش‌های ریز غده‌ استریل با ضخامت 1 تا 3 میلی‌متر که حداقل یک جوانه چشمی داشته باشند در این سوسپانسیون حاوی باکتری به مدت 30 ثانیه معلق شده، پس از آن بر روی کاغذ صافی استریل به منظور خشک شدن قرار داده شدند. پس از آلوده‌سازی جداکشت‌ها، ریز غده‌های آلوده شده روی محیط‌کشت MLS (Domansky et al., 1995) جامد با اسیدیته 8/5 فاقد آنتی‌بیوتیک قرار گرفتند. سپس، نمونه‌ها در شرایط تاریکی و دمای 22 تا 25 درجه سانتیگراد به مدت دو تا سه روز قرار داده شدند.

ریز غده‌ها با محیط‌کشت مایع MS حاوی آنتی‌بیوتیک سفاتاکسیم با غلظت 500 میلی‌گرم در لیتر برای از بین بردن آگروباکتریوم شستشو شدند. جداکشت‌ها برای باززایی و انتخاب گیاهان تراریخت بر روی محیط باززایی MLS جامد دارای کانامایسین با غلظت 100 میلی‌گرم در لیتر و سفاتاکسیم با غلظت 500 میلی‌گرم در لیتر کشت شده، در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی و دمای 23 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از 3 هفته، گیاهچه‌های باززایی شده به منظور ریز غده زایی به محیط‌کشت MS حاوی 9 درصد سوکروز منتقل شدند و پس از یک ماه، ریز غده‌های لازم برای مطالعات بعدی تولید شد.

 

انتقال ژن با روش بمباران ذره‌ای

انتقال ژن به سلول‌های لایه اپیدرمی پیاز با استفاده از دستگاه Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad, Richmond, CA) انجام شد. شرایط انجام آزمایش عبارت بودند از فاصله صفحه پاره‌شونده تا صفحه حمل‌کننده ذرات 10 میلی‌متر، فاصله صفحه حمل‌کننده ذرات تا صفحه متوقف‌کننده 14 میلی‌متر و غیر متغیر، فاصله صفحه متوقف‌کننده تا بافت هدف 90 میلی‌متر، صفحه پاره‌شونده psi 1100 و فشار خلأ 25 اینچ جیوه.

ذرات طلا (با قطر یک میکرومتر) با توجه به دستورالعمل ارایه شده توسط شرکت سازنده تهیه شدند بدین صورت که 60 میلی‌گرم از ذرات ریز طلا درون ویال 5/1 میلی‌لیتری به مدت 15 دقیقه در اتانول 70 درجه قرار داده شد. سپس، 3 بار با آب مقطر استریل شسته شده، پس از آن 1 میلی‌لیتر گلیسرول استریل 50 درصد به آن اضافه شد. DNA پلاسمیدی به صورت مستقیم برای پوشش دادن ذرات طلا بدون خالص‌سازی استفاده شد. برای هر بمباران 50 میکرولیتر از محلول ذرات طلا (60 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) استفاده شد. محلول سانتریفیوژ و روشناور دور ریخته شد و پس از آن 5 میکرولیتر معادل 5 میکرو گرم DNA، 50 میکرولیتر کلرید کلسیم 5/2 مولار و 20 میکرولیتر spermidine 1/0 مولار به رسوب حاصل اضافه شده، به خوبی مخلوط شدند. ویال به مدت نیم ساعت بر روی یخ قرار گرفته، طی این مدت چندین بار مخلوط شد. پس از سانتریفیوژ، محلول رویی دور ریخته شده و رسوب به ترتیب با 300 میکرولیتر اتانول 70 درجه و 100 میکرولیتر اتانول مطلق شستشو داده شد و در نهایت، در 170 میکرولیتر اتانول مطلق مجدداً مخلوط شد. 20 میکرولیتر از این مخلوط بر روی هر صفحه حمل‌کننده ذرات پخش شد. عمل انتقال ژن 5 تا 10 دقیقه پس از خشک شدن صفحه مذکور انجام شد.

 

آزمون PCR

DNA ژنومی از گیاهان تراریخته سیب‌زمینی در مراحل نخست باززایی با روش ارایه شده توسط Kawata و همکاران (2003) با اندکی تغییر استخراج شد. گیاهچه‌های تراریخت با استفاده از PCR برای حضور DNA‌ خارجی تحلیل شدند. PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن gus با توالی:

5′ -GGT GGT CAG TCC CTT ATG TTA CG -3′.

5′ -CCG GCA TAG TTA AAG AAA TCA TG -3′.

و شرایط: 94 درجه سانتیگراد یک دقیقه، دمای اتصال 62 درجه سانتیگراد یک دقیقه و بسط در 72 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه در 30 چرخه انجام شد. برای تشخیص ژن GFP از آغازگرهای اختصاصی این ژن با توالی:

5′ -CAA ATT TTC TGT CAG TGG AGA GG -3′.

5′ -GAT TGT GTG GAC AGG TAA TGG TT -3′.

و شرایط: 94 درجه سانتیگراد یک دقیقه، دمای اتصال 57 درجه سانتیگراد یک دقیقه و بسط در 72 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه در 30 چرخه برای انجام PCR استفاده شد. DNA تکثیر شده بر روی ژل 8/0 درصد آگاروز الکتروفوز شده و قطعات تکثیر شده بررسی شد.

 

سنجش پروتئین‌های گزارشگر در گیاهان تراریخت

جداسازی کلروپلاست و آمیلوپلاست

از یک محیط یونی ضعیف برای جداسازی و تعلیق مجدد کلروپلاست‌ها استفاده شد (Cerovic and Plesnicar, 1984). این محیط پایه حاوی سوربیتول (330 میلی‌مولار)، کلرید پتاسیم (10 میلی‌مولار)، EDTA (1 میلی‌مولار) و HEPES
[4-(2- hydroxyethyl) -1-piperazine-ethanesulphonic. acid] با غلظت نهایی 50 میلی‌مولار بود و اسیدیته این محیط با هیدروکسید پتاسیم بر روی 8/7 تنظیم شد. برای ساخت محلول جداسازی، محیط پایه با سوربیتول 330 میلی‌مولار 25 بار رقیق شد (4 میلی‌لیتر محیط پایه در 96 میلی‌لیتر سوربیتول 330 میلی‌مولار). برای ساخت محیط تعلیق مجدد، کلرید منگنز و کلرید منیزیم با غلظت 1 میلی‌مولار به محیط پایه اضافه شد (Cerovic et al., 1987). هر دو محلول بایستی به صورت تازه تهیه و مصرف شوند. برای استخراج کلروپلاست، دو برگ سبز و جوان گیاهان تراریخته به خوبی خُرد شده، سپس، در درون ویال حاوی 500 میکرولیتر محلول جداسازی قرار داده شد. سوسپانسیون حاصل با استفاده از یک لایه پارچه چیت فیلتر شده و مایع سبز رنگ حاصل به مدت 4 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتیگراد با 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل مجدداً در 30 میکرولیتر محلول استخراج معلق شده، برای بررسی‌های بعدی در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.

برای استخراج آمیلوپلاست‌ها، قطعات کوچک ریز غده در داخل یک ویال 5/1 میلی‌لیتری خُرد شده و به آن 500 میکرولیتر بافر استخراج شامل: HEPES/KOH(pH 7.2) (20 میلی‌مولار)، سوربیتول (500 میلی‌مولار)، کلرید منیزیم (1 میلی‌مولار)، کلرید سدیم (5 میلی‌مولار)، کلرید منگنز (1 میلی‌مولار)، DTT (20 میلی‌مولار)، EDTA (1 میلی‌مولار) و 10 درصد حجمی/حجمی اتیلن گلایگول، یک درصد وزنی/حجمی PVP و یک در هزار وزنی/حجمی BSA افزوده شد (Wischmann et al., 1999) و به خوبی له و مخلوط شد. مخلوط حاصل با استفاده از یک لایه پارچه چیت صاف شد و به مدت 10 دقیقه و با 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از دور ریختن روشناور، رسوب حاوی آمیلوپلاست‌ها برای بررسی‌های بعدی در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.

 

سنجش GFP

نمونه‌های بمباران شده به مدت 24 ساعت در محیط مرطوب و تاریک نگهداری شدند سپس، برای سنجش GFP، قطعات کوچک از اپیدرم رویی پیاز بین لام و لامل همراه با یک قطره آب مقطر استریل قرار گرفته، با میکروسکوپ فلورسنت Zeiss مطالعه شدند. تصاویر توسط دوربین دیجیتال نصب شده بر روی میکروسکوپ فلورسنت مجهز به لامپ زنون 75 وات و با نرم‌افزار Cytovision v.2 ضبط شد و نور از فیلتر FITC (محدود 450 تا 500 نانومتر) و فیلتر سبز (540 نانومتر) عبور نمود.

 

سنجش GUS

فعالیت GUS با روش هیستوشیمیایی ارایه شده توسط Jefferson (1987) با برخی تغییرات ارزیابی شد. برای این آنالیز، بافت برگ و بخش‌های غنی از آمیلوپلاست یک شب در محلول واکنش شامل بافر فسفات با اسیدیته 7 (50 میلی‌مولار)، یک در هزار حجمی/حجمی Triton X-100، Na2EDTA
(1 میلی‌مولار)، بتامرکاپتواتانول (78/0 میکرولیتر در یک لیتر) و سه در هزار وزنی/حجمی 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid به عنوان سوبسترای اختصاصی آنزیم نگهداری شد. نمونه‌های برگی با شستشو با اتانول 70 درجه کلروفیل‌زدایی شدند. نمونه‌ها برای بررسی فعالیت GUS و رنگ آبی حاصل زیر میکروسکوپ با نور مرئی مطالعه شدند.

سنجش کمّی فعالیت GUS در بافت غده و بخش‌های غنی از آمیلوپلاست در نمونه‌های باززایی شده تراریختی که در آزمون PCR و رنگ‌آمیزی اولیه تأیید شده بودند با روش اسپکتوفتومتری (Aich et al., 2001) انجام شد. بدین منظور 10 میلی‌گرم از بافت با استفاده از نیتروژن مایع منجمد شده، پس از خُرد شدن به ویال 5/1 میلی‌لیتری منتقل شدند. سپس، یک میلی‌لیتر بافر استخراج شامل بافر فسفات با اسیدیته 7 (50 میلی‌مولار) و بتامرکاپتواتانول (10 میلی‌مولار) به نمونه‌ها افزوده شد و با ورتکس به خوبی مخلوط شد. نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه با 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شده، روشناور شفاف به ویالی جدید منتقل شد. سپس، para nitro-phenyl-β-D-glucoronide (pNPG) با غلظت نهایی یک میلی‌مولار به نمونه‌ها افزوده شد و طیف جذبی نمونه‌ها با اسپکتروفتومتر در طول موج 405 نانومتر اندازه‌گیری شد. نمونه‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد (دمای فعالیت بهینه آنزیم) نگهداری شده، اندازه‌گیری مجدداً انجام شد. افزایش جذب نشان‌دهنده تولید p-nitro-phenol در نتیجه فعالیت GUS است.

 

نتایج

بررسی بیان موقت ژن GFP با روش زیست پرتابی در لایه‌های اپیدرمی پیاز نشان‌دهنده این بود که پروتئین ترکیبی AtcpRecA-GFP به طور خاص در پلاستیدها متمرکز شده است (شکل 2- A و C).

 

شکل 2- تجمع درون سلولی GFP در الحاق با پپتید نشانه AtcpRecA A) و (C و بدون پپتید نشانه (B) در سلول‌های اپیدرمی پیاز که با روش بمباران ذره‌ای تراریخت شده است. این تصاویر در 24 ساعت پس از بمباران به دست آمده است.

 

حضور سازه‌های ژنی واجد GFP و GUS در گیاهچه‌های تراریخته با روش PCR تأیید شد که نتایج آن در شکل‌های 3 و 4 ملاحظه می‌شود. مشاهده قطعات 539 نوکلئوتیدی حاصل از تکثیر ژن GFP و 520 نوکلئوتیدی حاصل از تکثیر ژن gus نتیجه مورد انتظار برای گیاهان تراریخت بود.

 

 

شکل 3- الکتروفورز نتایج واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مربوط به تکثیر قطعات ژنومی با آغازگرهای اختصاصی GFP. از چپ به راست، چاهک اول، کنترل مثبت (PBI121-GFP)، چاهک‌های 1، 2 و 3 لاین‌های تراریخت شده با ناقل p35SGFP، چاهک‌های 4، 5، 6 و 7 لاین‌های تراریخت شده با ساختار LIM14-GFP، چاهک‌های 8، 9، 10 و 11 لاین‌های تراریخت شده با ساختار AtcpRecA-GFP و چاهک آخر کنترل منفی (pBI121). تکثیر قطعه 539 جفت بازی در تمام چاهک‌ها به غیر از نمونه کنترل منفی قابل مشاهده است. الگوی باندی نشانگر اندازه مولکولی 1kb شرکت Fermentas در سمت راست شکل قرار دارد.

 

شکل 4- الکتروفورز نتایج واکنش زنجیره ای پلی مراز مربوط به تکثیر قطعات ژنومی با آغازگرهای اختصاصی GUS. از چپ به راست، چاهک های 1، 2، 3 و 4 لاین‌های تراریخت شده با ناقل p35SGUS، چاهک‌های 5، 6، 7، 8، 9 و 10 لاین‌های تراریخت شده با ساختار LIM14-GUS، چاهک 11 (+)، کنترل مثبت (PBI121) و چاهک آخر (-) کنترل منفی pBI121) بدون (GUS. تکثیر قطعه 520 جفت بازی در تمام چاهک ها به غیر از نمونه کنترل منفی قابل مشاهده است. الگوی باندی نشانگر اندازه مولکولی 1kb شرکت Fermentas در سمت راست شکل قرار دارد.

تصاویر میکروسکپ فلورسنت از غده سیب‌زمینی و بخش‌های سلول‌های بافت سبز گیاهان تراریخت، نشان داد که فلورسانس GFP منحصراً در پلاستیدها تجمع یافته است، به ویژه زمانی که به پپتیدهای نشانه LIM14 یا AtcpReecA متصل باشد (شکل 5). این نتایج نشان می‌دهد که پروتئین ترکیبی GFP با پپتید نشانه به سوی کلروپلاست و آمیلوپلاست هدف‌گیری شده است.

 

 

 

شکل 5- بررسی میکروسکوپی مقاطع مختلف برگ و غده‌های گیاهان تراریخت سیب‌زمینی دارای ساختارهای ژنی GFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مجهز به فیلتر FTC؛ فلورسنت تابشی برش عرضی سیب‌زمینی غیر تراریخت (A) و همان تصویر در زیر میکروسکوپ با نور مرئی (B). بیان سیتوزولیک پروتئین GFP بدون پپتید نشانه در برگ (C) و غده (D) گیاهان تراریخت pBI121-GFP. تصویر فلورسنت تابشی برش عرضی غده سیب‌زمینی تراریخت pBI–LIMGFP2 (E) و همان تصویر در زیر میکروسکوپ با نور مرئی (F). تصویر فلورسنت تابشی برگ سیب‌زمینی تراریخت pBI–LIMGFP2 (G) و همان تصویر در زیر میکروسکوپ با نور مرئی (H). تصویر فلورسنت تابشی برگ سیب‌زمینی تراریخت pBI–CPGFP2 (I) و همان تصویر در زیر میکروسکوپ با نور مرئی (J). تظاهر پروتئین GFP در آمیلوپلاست غنی شده گیاه تراریخت pBI-CPGFP2 (K). تظاهر پروتئین GFP در غده گیاهان تراریخت pBI-CPGFP2 (L). تصویر فلورسنت تابشی آمیلوپلاست های غنی شده گیاه تراریخت pBI-LIMGFP2 (M) و همان تصویر در زیر میکروسکوپ با نور مرئی (N). تصویر فلورسنت تابشی کلروپلاست های غنی شده گیاهان تراریخت pBI-CPGFP2 (O). تصویر فلورسنت تابشی آمیلوپلاست های غنی شده گیاهان تراریخت pBI-GFP (P).

 

در گیاهان تراریخت واجد سازه pBI-LIM-GUS، پروتئین GUS هم در داخل آمیلوپلاست و هم در داخل کلروپلاست هدف‌گیری و ذخیره‌سازی شد (شکل 6). گیاهان تراریخت شده با pBI121، بیان سیتوزولی پروتئین GUS را نشان دادند و بیان بسیار ضعیفی در پلاستیدهای استخراج شده داشتند (شکل 6-A).

 

شکل 6- آزمون هیسستوشیمیایی GUS روی اجزای آمیلوپلاستی جداشده از ریز غده گیاهان تراریخته دارای ناقل pBI121 (A) و ریزغده‌های گیاهان تراریخته دارای ساختار LIM14-GUS (B). مقاطع تهیه شده از بافت ساقه گیاهچه‌های واجد ساختار LIM14-GUS (D) و همان شکل با بزرگ‌نمایی بیشتر (C). کلروفیل‌ها با تیمار نمونه‌ها در اتانول 70 درصد حذف شدند.

 

GUS بدون کمک پپتید نشانه نمی‌تواند وارد پلاستیدها شود (A) ولی با پپتید نشانه این امر صورت گرفته است (B). شکل‌های C و D نقطه‌های آبی، فعالیت GUS را در پلاستیدها در بافت ساقه گیاهچه و در نتیجه هدف‌گیری و تجمع GUS را در این اندامک‌ها نشان می‌دهد.

در عین حال، آزمون سنجش کمّی فعالیت GUS در آمیلوپلاست گیاهان تراریخت سیب زمینی و شاهد نشان‌دهنده فعالیت بیشتر آنزیم GUS در گیاهان تراریخت با سازه واجد پپتید نشانه LIM14 در مقایسه با گیاهان تراریخت با سازه بدون پپتید نشانه و شاهد بود (جدول 1). هر دو پروتئین ترکیبی AtCPRecA و LIM14 با ژن‌های GUS و GFP به خودی خود الگوهای تجمع‌سازی در اندامک‌های زیرسلولی مانند پلاستیدها (آمیلوپلاست، کلروپلاست) را نشان می‌دهند، که در نهایت، نشان‌دهنده این نکته است که این نوع پروتئین‌ها قابلیت هدفمندی به سوی این اندامک‌ها را دارا هستند.

 

جدول 1- نتایج حاصل از سنجش کمّی GUS در گیاهان تراریخت. pNPG به عنوان یک سوبسترای اسپکتروفتومتریک برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم استفاده شد. جذب در 410 نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر پس از اضافه کردن سوبسترا پس از 24 ساعت (A24) اندازه گیری شد. تفاوت معنی‌داری بین دو بار اندازه‌گیری، تولید محصول تراژن و در نتیجه حضور و فعالیت آنزیم را نشان می‌دهد.

 

برگ توتون به عنوان کنترل + (GUS)

آمیلوپلاست

(Wt)

آمیلوپلاست

(GUS)

آمیلوپلاست

(LIM14-GUS)

A0

951388/0

299675/0

013788/2

268839/0

A24

56215/1

275857/0

9716732/1

313559/0

A24-A0

610762/0

023818/0-

0421148/0-

04472/0

 

بحث

توالی پپتید نشانه ATCPrecA که در گیاه آرابیداپسیس توالی راهنمای انتقال به کلروپلاست است، توانایی انتقال پروتئین متصل به خود را به کلروپلاست و آمیلوپلاست (پلاستیدها) در هر دو حالت بیان موقت و انتقال دایم ژن داراست. این امر نشان‌دهنده این موضوع است که این توالی برای انجام عمل خود نیازی به تغییرات پس از ترجمه-که در انتقال دایم ژن رخ می‌دهد- ندارد.

با توجه به گزارش Mousavi‌ و همکاران (1999) که اعلام کردند پروتئین LIM14 به دانه‌های نشاسته مربوط است، توالی نشانه LIM14 که یک توالی هدایت‌کننده به آمیلو پلاست و کلروپلاست در گیاه Lilium lingiflorum است و همچنین، توانایی هدایت پروتئین‌های گزارشگر به آمیلوپلاست و کلروپلاست را در حالت انتقال دایم ژن به گیاه تراریخت دارد و این در حالی است که این توالی در شرایط بیان موقت ژن این توانایی را ندارد. این دو مشاهده تأیید کننده این موضوع است که توالی‌های هدایت‌کننده به پلاستیدها دارای شباهت‌هایی در عملکرد خود هستند و علت این امر آن است که همگی دارای منشأیی مشترک (پیش پلاست) هستند Gould et al., 2008)؛ Li and Chiu, 2010). بنابراین، سامانه‌های مشابهی در انتقال و هدایت پروتئین‌ها به پلاستیدها نقش دارند.

توالی نشانه AtCPRecA در سلول‌های اپیدرم پیاز و توالی نشانه LIM14 در کشت سلولی BY-2 و هر دو توالی در سیب‌زمینی، توانایی هدایت پروتئین‌های گزارشگر را به پلاستید دارا هستند.

داده‌های به دست آمده از سنجش کمّی GUS نشان می‌دهد که در گیاهان تراریخت شده با سازه pBI-LIMGUS، افزایش فعالیت پروتئین گزارشگر GUS که توسط پپتید نشانه LIM14 به آمیلوپلاست‌ها منتقل شده بود در طول 24 ساعت مشاهده شد، در حالی که در گیاهان تراریخت شده با سازه pBI121 که فاقد توالی نشانه است، این افزایش دیده نشد. همچنین، بیان GUS در سیتوسل هر دو گیاه تراریخت مذکور نیز مشاهده شد.

بر اساس نتایج تحقیق حاضر، توالی‌های نشانه LIM14 و AtCPRecA وظیفه پیش‌بینی شده را انجام داده، قابلیت هدایت پروتئین نوترکیب را به درون پلاستید داشتند. بنابراین، می‌توان نتیجه گرفت که هر دو پپتیدهای نشانه پلاستیدی هستند و می‌توانند در هدایت پروتئین‌های نوترکیب متصل به خود به این اندامک‌ها نقش داشته باشند و در حوزه‌های زراعت مولکولی، مهندسی متابولیت‌ها و تولید گیاهان تراریخت مقاوم استفاده شوند. البته باید توجه داشت که بسیاری از پروتئین‌ها برای فعالیت خود نیاز به تغییرات پس از ترجمه دارند و هدایت آنها به پلاستیدها به دلیل عدم وجود راه کاری برای ایجاد این تغییرات، نمی‌تواند مفید باشد. همچنین، محدودیت‌هایی برای انتقال پروتئین‌هایی که باعث اختلال در انجام وظایف حیاتی این اندامک‌ها و در نتیجه مرگ سلول می‌شوند، وجود دارد.

با توجه به این که اثر پروتئازهای سلول میزبان بر روی پروتئین‌های مختلف یکسان نیست بنابراین، میزان بیان ژن گزارشگر نمی‌تواند شاخص میزان تولید پروتئین‌های نوترکیب دیگر باشد.

پپتیدهای نشانه پلاستیدی از نظر طول توالی تنوع بالایی نشان می‌دهند و دارای تعداد بسیار اندک یا فاقد اسیدهای آمینه اسیدی هستند در مقابل، تعداد زیادی اسیدهای آمینه بازی با پیوندهای هیدروکسیلی متعدد دارند (Emanuelsson and Heijne, 2001). اما توالی پایانه آمینی پروتئین LIM14 یا همان توالی نشانه این پروتئین، دارای ویژگی ذکر شده توالی‌های نشانه پلاستیدی نیست و در عین حال دارای توالی معمول جایگاه برش مشابه اغلب پپتیدهای نشانه پلاستیدی نمی‌باشد (Li et al., 1992).

در برخی سامانه‌های بیان هترولوگوس، ممکن است در زمان بیان پروتئین‌های ترشحی، توالی نشانه پروتئین به درستی برداشته نشود و این موضوع به افزایش یا کاهش اسیدهای آمینه پایانه آمین پروتئین نوترکیب منجر می‌شود. در بسیاری از موارد، این تغییرات ناخواسته، در تولید مواد دارویی نوترکیب نامطلوب است (Aoust et al., 2004).

نخستین انتقال ژن به پلاستید در گیاهان عالی در سال 1990 به کلروپلاست گیاه توتون انجام شد (Svab et al., 1990). با وجود این، این فناوری در سایر گونه‌ها، به ویژه گیاهان زراعی مهم مانند سیب‌زمینی هنوز به راحتی قابل انجام نبوده، بسیار پُر چالش است. لذا، هدفمند‌سازی پروتئین‌های تولید شده توسط ژن‌های انتقال یافته به هسته همچنان راه‌کاری مؤثر و ساده‌تر در مقایسه با بیان ژن در پروکاریوت‌هاست و برای تولید تجاری پروتئین‌های نوترکیب مطرح است.


 

 

Aich, S., Delbaere, L. T. and Chen, R. (2001) Continuous spectrophotometric assay for beta-glucuronidase. BioTechniques 30(4): 846-851.

Artsaenko, O., Kettig, B., Fiedler, U., Conrad, U. and During, K. (1998) Potato tubers as a biofactory for recombinant antibodies. Molecular Breeding 4: 313-319

Castanon, S., Marin, M. S., Martin-Alonso, J. M., Boga, J. A., Casais, R., Humara, J. M., Ordas, R. J. and Parra, F. (1999) Immunization with potato plants expressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus. Journal of Virology 73: 4452-4455.

Cerovic, Z. G. and Plesnicar, M. (1984) An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity. Biochemical Journal 223: 543-545.

Cerovic, Z. G., Cheesbrouch, J. K. and Walker, D. A. (1987) Photosynthesis by intact isolated chloroplasts on solid support. Plant Physiology 84: 1249-1251.

D'Aoust, M. A., Busse, U., Martel, M., Lerouge, P., Levesque, D. and Vézina, L. P. (2004) Perennial plants as a production system for pharmaceuticals. In: Handbook of plant biotechnology (Eds. Paul, C. and Klee, H.) 321-330. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Domansky, N., Ehsani, P., Salmanian, A. H. and Medvedeva, T. (1995) Organ specific expression of hepatitis B surface antigen in potato. Biotechnology Letters 17(8):863-866.

Ehsani, P., Khabiri, A. and Domansky, N. N. (1997) Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato. Gene 190:1 07-111.

Emanuelsson, O. and Heijne, G. (2001) Prediction of organellar targeting signals. Biochemica et biophysica Acta 1541: 114-119.

Farran, I., Sanchez-Serrano, J. J., Medina, J. F., Prieto, J. and Mingo-Castel, A. M. (2002) Targeted expression of human serum albumin to potato tubers. Transgenic Research 11: 337-346.

Fischer, R. and Emans, N. (2000) Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic Research 9: 279-299.

Giddings, G. (2001) Transgenic plants as protein factories. Current opinion in Biotechnology 12: 450-454.

Gould, S. B., Waller, R. F. and McFadden, G. I. (2008) Plastid evolution. Annual Review of Plant Biology 59: 491-517.

Hoppman, V., Di Fiore, S., Zimmermann, S., Emans, N., Rademacher, T., Fischer, R. and Schillberg, S. (2002) The potato granule bound starch synthase chloroplast transit peptide directs recombinant proteins to plastids. Journal of Plant Physiology 159: 1061-1067.

Jarvis, P. (2008) Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist 179: 257-285.

Jefferson, R. A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405.

Ji, Q., Vincken, J. P., Suurs, L. C. J. M. and Visser, R. G. F. (2003) Microbial starch-binding domains as a tool for targeting proteins to granules during starch biosynthesis. Plant Molecular Biology 51: 789-801.

Kawata, M., Matsumura, Y., Oikawa, T., Kimizu, M., Fukumoto, F. and Kuroda, S. (2003) Analysis of DNA extraction buffer components from plant tissue by polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry 318(2): 314-317.

Kim, H.-S., Euym, J.-W., Kim, M.-S., Lee, B.-C., Mook-Jung, I., Jeon, J.-H. and Joung, H. (2003) Expression of β-human amyloid in transgenic potato. Plant Science 165: 1445-1451.

Kobayashi, T., Kobayashi, E., Sato, S., Hotta, Y., Miyajima, N., Tanka, A. and Tabata, S. (1994) Characterization of cDNAs induced in meiotic prophase in lily microsporocytes. DNA Research 1: 15-26

Kusnadi, A., Nikolov, Z. L. and Howard, J. A. (1997) Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations. Biotechnology and Bioengineering 56: 473-484.

Li, H. M. and Chiu, C. C. (2010) Protein transport into chloroplasts. Annual Review of Plant Biology 61: 157-180.

Li, H., Sullivan, T. D. and Keegstra, K. (1992) Information for targeting to the chloroplastic inner envelope membrane is contained in the mature region of the maize Bt1-encoded protein. The Journal of Biological Chemistry 267: 18999-19004.

Mason, H. S., Ball, J. M., Shi, J. J., Jiang, X., Estes, M. K. and Arntzen, C. J. (1996) Expression of norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5335-5340.

Mousavi, A., Hiratuka, R., Takase, H., Hiratsuka, K. and Hotta, Y. (1999) A novel glycine-rich protein is associated with starch grain accumulation during anther development. Plant and Cell Physiology 40: 406-416.

Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497.

Peng, J. S. and Gong, J.-M. (2011) The mechanisms of protein sorting and translocation regulated by signal peptides. Zhiwu Shengli Xuebao/Plant Physiology Journal 47: 9-17.

Piao, X. C., Chakrabarty, D., Hahn, E. J. and Peak, K. Y. (2003) A simple method for mass production of potato microtubers using a bioreactor system. Current Science 84: 1129-1132.

Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001) Molecular cloning. Cold Spring Harbor, New York.

Schiermeyer, A., Dorfmüller, S. and Schinkel, H. (2004) Production of pharmaceutical proteins in plants and plant cell suspension cultures. In: Molecular farming: plant-made pharmaceuticals and technical proteins (eds. Fischer, R. and Schillberg, S.) 91-112. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Shadwick, F. S. and Doran, P. M. (2004) Foreign protein expression using plant cell suspension and hairy root cultures. In: Molecular farming: plant-made pharmaceuticals and technical proteins (eds. Fischer, R. and Schillberg, S.) 13-36. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P. (1990) Stable transformation of plastids in higher plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) 87(21): 8526-8530.

Thomas, B. R., Deynze, A. V. and Bradford, K. J. (2005) Production of therapeutic proteins in plants. Agricultural and Natural Resources Publication, University of California, Berkeley.

Wischmann, B., Nielsen, T. H. and Muller, B. L. (1999) In vitro biosynthesis of phosphorylated starch in intact potato amyloplasts. Plant Physiology 119: 455-462.

Wright, K. E., Prior, F., Sardana, R., Altosaar, I., Dudani, A. K., Ganz, P. R. and Tackaberry, E. S. (2001) Sorting of glycoprotein B from human cytomegalovirus to protein storage vesicles in seeds of transgenic tobacco. Transgenic Research 10: 177-181.