تأثیر سالیسیلیک اسید بر میزان فلاونوئیدها،آپی‌ژنین،آنتوسیانین و قندها در بابونه آلمانی (Matricaria chamomilla L.)

نویسندگان

1 گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

2 گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

در این پژوهش، تأثیر سالسیسلیک اسید بر برخی از ترکیبات فنلی و قندهای محلول در بابونه آلمانی (Matricaria chamomilla L.) بررسی شد. غلظت‌های مختلف سالیسیلیک اسید در گیاهان 90 روزه در کشت هیدروپونیک طی چهار روز مطالعه شد. اگر چه غلظت 125/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید آثار واضحی داشت، بررسی‌ها نشان داد که غلظت‌های بالا سبب توقف رشد و از بین رفتن گیاه می‌شود و غلظت‌های پایین ‌تأثیر ویژه‌ای ندارد. نتایج حاصل از HPLC و سنجش فلاونوئید، آنتوسیانین و آپی‌ژنین نشان داد که میزان این ترکیبات پس از 24 ساعت نسبت به گیاهان شاهد افزایش معنی‌داری نشان می‌دهند. در تیمار سالسیسلیک اسید کاهش معنی‌داری در جوانه‌زنی گیاهان تیمار شده نسبت به شاهد مشاهده شد. به طور کلی، سالیسلیک اسید در غلظت 125/0 میلی‌مولار باعث افزایش فلاونوئید، آپی‌ژنین، آنتوسیانین و قندهای محلول نسبت به گروه شاهد شد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of salicylic acid on flavonoids, apigenin, anthocyanin and carbohydrate in Matricaria chamomilla L.

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Zarinkamar 1
  • Azam Abdollahzadeh Zaviehjak 1
  • Mozaffar Sharifi 1
  • Mehrdad Behmanesh 2
1 Department of Plant Biology, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat ModDepartment of Plant Biology, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iranares University, Tehran, Iran
2 Department of Genetics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Salicylic acid is a common plant-produced phenolic compound and sited as a plant hormone. The work reported in this paper investigated the effects of different concentration of exogenous application of salicylic acid on flavonoids, anthocyanin, apigenin and carbohydrates in hydroponically- grown Matricaria chamomilla L. (german chamomile) during 4 days. Although 0.125 mM salicylic acid applications produced prominent results, higher salicylic acid dose had a toxic effect. Indeed, salicylic acid treatments effectively promoted the production of a wide range of plant secondary metabolites. Generally, 0.125 mM salicylic acid increased flavonoids, anthocyanin, apigenin and soluble sugars compared to the control. Salicylic acid was also shown to inhibit seed germination.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Apigenin
  • Anthocyanin
  • Matricaria chamomilla L
  • Salicylic acid

 

تنش‌های زیستی و غیر زیستی باعث القای پاسخ دفاعی در گیاهان می‌شوند. مکانیسم‌های دفاعی مختلفی در طول تکامل به وجود آمده‌اند. یکی از این مکانیسم‌ها تولید ترکیبات اختصاصی مانند فلاونوئیدها است که علاوه بر نقش متنوع آنها در فیزیولوژی، بیوشیمی و بوم‌شناسی گیاهان، نقش مهمی در تغذیه انسان دارند Winkel-shirley, 2001)؛ Martens and Mithofer, 2005). فلاونوئیدها از ترکیب مسیر شیکمات (shikimate) و مسیر استات (acetate) تولید می‌شوند. در طول مسیر شیکمات، آمینو اسید آروماتیک L- فنیل آلانین (L-Phe) ساخته می‌شود. این آمینو اسید طی دآمیناسیون توسط آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) به مواد سازنده اسیدهای فنیل پروپانوئیک تبدیل می‌شود (Taiz and Zeiger, 2002). فلاونوئیدها ترکیبات طبیعی با ارزشی هستند که در مسیر فنیل پروپانوئید بیوسنتز می‌شوند Stefan and Axel, 2005)؛ Tanaka et al., 2008؛ (Vogt, 2010. گونه گیاهی Matricaria chamomilla L. با نام عمومی بابونه آلمانی (chamomile German) به راسته Asterals، تیره Asteraceae (Compositae)، زیر تیره Asteroidea و قبیله Anthemideae تعلق دارد Mozaffarian, 1996)؛ Judd et al., 2008). بابونه یکی از گیاهان دارویی بسیار قدیمی است که عمدتاً به علت ویژگی‌های ضد التهابی و ضد اسپاسمی کاربرد دارد Appelt, 1985)؛ Murti, 2012)؛ (Strivastava et al., 2010. بیش از 120 ترکیب در گل بابونه شناسایی شده است (Raal et al., 2011). ترکیب اصلی گل‌ها از چندین ترکیب فنلی که عمدتاً شامل فلاونوئیدهای کلروژنیک اسید، آمبلی فرون، آپی‌ژنین، کوئرستین، باتولتین، لوتئولین و سایر فلاونوئیدهاست، تشکیل شده است. ترکیبات اصلی ترپنوئیدی آن ترپنوئیدهای α- بیزابولول و اکسیدهای آن و از آزولن‌ها مانند کامازولن است. از مهم‌ترین مولکول‌های سیگنالی سالیسیلیک اسید (salicylic acid) است. سالیسیلیک اسید روی فرآیندهای مختلف گیاهی مانند گل‌دهی، تولید گرما و افزایش مقاومت به بیماری‌ها تأثیرگذار است. همچنین، تغییر و بهبود فعالیت برخی از آنزیم‌های مهم از دیگر آثار مهم سالیسیلیک اسید است Shah, 2003)؛ Popova et al., 1997؛ Hayat et al., 2010). در این پژوهش، تأثیر غلظت‌های مختلف سالیسیلیک اسید بر تحریک بیوسنتز فلاونوئیدها به ویژه آپی‌ژنین و آنتوسیانین در بابونه آلمانی در محیط هیدروپونیک مطالعه شد.

مواد و روش‌ها

کاشت گیاه

بذر M. chamomilla L. از مؤسسه جهاد کشاورزی اصفهان خریداری شد. گلدان‌‌های حاوی بذرهای کاشته شده در گلخانه در دمای بیشینه 28 درجه سانتیگراد و کمینه 15 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و ابتدا به مدت یک‌ ماه با مه‌پاش آبیاری شدند. سپس، گیاهان 90 روزه وارد محیط هوگلند 2/1 شدند.

تیمار سالیسیلیک اسید

طیف غلظت‌های صفر، 05/0، 125/0، 25/0، 5/0 و 1 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید روی گیاه تیمار و آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شد.

اندازه‌گیری درصد جوانه‌زنی بذر

برای اندازه‌گیری درصد جوانه‌زنی، بذرها در پتری‌دیش و شرایط استریل قرار داده شدند. سالیسیلیک اسید 125/0 میلی‌مولار اضافه شد. پس از سه روز درصد بذرهای جوانه‌زده مشخص شد. آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شد.

سنجش فلاونوئید کل

برای سنجش فلاونوئیدها 2/0 گرم توده سلولی منجمد شده در 3 میلی‌لیتر اتانول اسیدی (اتانول و استیک اسید به نسبت 99 به 1) خوب ساییده، به مدت 15 دقیقه در g12000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتیگراد قرار داده شد. میزان جذب نمونه‌ها پس از سرد شدن توسط اسپکتروفتومتر در سه طول موج 270، 300 و 330 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه غلظت فلاونوئیدها از ضریب خاموشی cm-2mol-6 33000 استفاده شد (Krizek et al., 1993).


سنجش آنتوسیانین کل

برای سنجش آنتوسیانین، 2/0 گرم از اندام هوایی گیاه در 3 میلی‌لیتر متانول اسیدی (متانول و کلریدریک اسید به نسبت 99 به 1) خوب ساییده، عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در g12000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی به مدت 12 ساعت درون فویل در شرایط تاریکی و دمای آزمایشگاه قرار داده شد، جذب آن در طول موج 550 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (UV 2100, UNICO USA) خوانده شد. برای محاسبه غلظت آنتوسیانین از ضریب خاموشی cm-2mol-6 33000 استفاده شد (Masukasu et al., 2003).

اندازه‌گیری قندهای محلول

1/0 تا 2/0 گرم از نمونه‌های منجمد در 3 میلی‌لیتر آب مقطر ساییده شد. سپس، محلول همگن حاصل با کاغذ صافی صاف شد. برای اندازه‌گیری قند نمونه، به 50 میکرولیتر از همگن صاف شده 5/0 میلی‌لیتر فنل 5 درصد و 5/2 میلی‌لیتر سولفوریک اسید 98 درصد اضافه شد. بلافاصله پس از افزودن سولفوریک اسید، واکنشی گرمازا همراه با تولید رنگ نارنجی ایجاد می‌شود که تولید حرارت زیادی می‌کند. بنابراین، ضروری است پس از افزودن اسید، مخلوط واکنش 10 دقیقه در دمای اتاق خنک شود.

برای رسم منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف گلوکز (صفر تا 20 میکروگرم در میلی‌لیتر) استفاده شد. جذب استانداردها به همراه جذب قند کل نمونه با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج 490 نانومتر اندازه‌گیری و مقدار قند نمونه بر مبنای وزن تر نمونه تعیین شد (Dubois et al., 1956).

 

استخراج آپی‌ژنین

برای استخراج آپی‌ژنین 5/0 گرم از پودر گُل گیاه در 20 میلی‌لیتر متانول ریخته شد و به مدت 2 ساعت در دستگاه سونیکاتور قرار گرفت. عصاره به مدت 15 دقیقه در g12000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی به مدت 12 ساعت برای تبخیر الکل در دمای آزمایشگاه قرار گرفت. در پایان، در 300 مایکرولیتر متانول حل شد (Dighe et al., 2007).

اندازه‌گیری آپی‌ژنین

عصاره استخراج شده حاوی آپی‌ژنین توسط دستگاه HPLC (مدل Knauer Germany) سنجیده شد. بدین منظور از ستون ODS-80Ts column (4.6×250 mm) استفاده شد. جذب نمونه‌ها با سرعت ml/min 1 و شیب خطی 25-75 درصد حاوی آب دیونیزه و استونیتریل در طول موج 340 نانومتر خوانده شد.

تحلیل داده‌ها

این پژوهش در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار MSTATC و تحلیل واریانس با ANOVA یک طرفه با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال یک درصد انجام شد. همچنین، رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel انجام شد.

 

نتایج

ابتدا برای پیدا کردن غلظت مناسب سالیسیلیک اسید، به منظور انجام مطالعات بیشتر، دامنه وسیعی از غلظت‌ها (صفر، 05/0، 125/0، 25/0، 5/0 و 1 میلی‌مولار) روی گیاه تیمار شد. بررسی‌ها نشان داد که غلظت‌های بالا باعث توقف رشد و از بین رفتن گیاه می‌شوند و غلظت‌های پایین تأثیر ویژه‌ای بر مقدار فلاونوئیدها نداشتند. به همین علت، غلظت 125/0 میلی‌مولار مناسب تشخیص داده شد و برای انجام آزمایش‌ها استفاده شد. از این غلظت 3 تکرار در نظر گرفته شد. غلظت 125/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید در مقایسه با گروه شاهد باعث مهار جوانه‌زنی بذرها شد (شکل 1).

نتایج حاصل از سنجش فلاونوئیدها نشان داد که در نمونه‌های شاهد تفاوت معنی‌داری بین فلاونوئید کل در طی 4 روز وجود ندارد، در حالی که در روز دوم در نمونه‌های تیمار شده با سالیسیلیک اسید، میزان فلاونوئیدها افزایش یافته است. این روند در روز چهارم کاهش پیدا کرد (شکل 2).

نتایج حاصل از سنجش آنتوسیانین در اندام هوایی نشان دادند که میزان آنتوسیانین در تحت تأثیر غلظت 125/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید در طول سه روز نخست روند افزایشی داشته و پس از آن تفاوت معنی‌داری بین میزان آن با شاهد وجود ندارد (شکل 3).

نتایج حاصل از HPLC نشان داد که غلظت 125/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان آپی‌ژنین در اندام هوایی نسبت به گیاهان شاهد شده است، با وجود این، تفاوت معنی‌داری در میزان آپی‌ژنین در طی چهار روز مشاهده نشد (شکل 4).

 

   

شکل 1- درصد جوانه‌زنی بذر بابونه آلمانی. مقادیر میانگین 6 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.

 

شکل 2- اثر سالیسیلیک اسید بر فلاونوئید کل اندام هوایی در بابونه آلمانی. مقادیر میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.

 

   

شکل 3- اثر سالیسیلیک اسید بر میزان آنتوسیانین اندام هوایی در بابونه آلمانی. مقادیر میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.

شکل 4- اثر سالیسیلیک اسید بر میزان آپی‌ژنین اندام هوایی در بابونه آلمانی. مقادیر میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.


 

 

میزان قندهای محلول کل در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد افزایش معنی‌داری داشت. پس از 24 ساعت میزان آن به بیشترین مقدار خود می‌رسد که تا روز سوم ادامه پیدا می‌کند، با وجود این، پس از روز سوم، میزان آن تقریباً تا حد گیاهان شاهد کاهش پیدا می‌کند (شکل 5).

 

شکل 5- اثر سالیسیلیک اسید بر میزان قندهای محلول کل در بابونه آلمانی. مقادیر میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است.

 

بحث

سالیسیلیک اسید مولکولی مؤثر است که باعث ایجاد مقاومت به تنش‌های زیستی و غیر زیستی در گیاهان می‌شود. تأثیر سالیسیلیک اسید وابسته به غلظت، نوع گیاه و مرحله نموی آن است. با وجود این، زمانی که در غلظت‌های بالا استفاده می‌شود عاملی سمّی برای گیاه محسوب می‌شود که به مرگ گیاه منجر می‌شود (Kovacik et al., 2009).

در آزمایش‌های ابتدایی با غلظت‌های 25/0، 5/0 و 1 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید گیاهان پس از 24 و 48 ساعت به ترتیب پژمرده شدند و گیاه از بین رفت. در مطالعات Kovacik و همکاران (2009) نیز در غلظت‌های 1 و 2 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید گیاهان از بین رفتند. با وجود این، جای سؤال است که طبق گزارش Pastirova و همکاران (2004) گیاهانی که در غلظت‌های 1 و 2 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید کاشته شده بودند، زنده ماندند. غلظت‌های 200 میکرومولار از سالیسیلیک اسید در کشت سلولی ریشه Panax ginseng نیز آثار مخرب داشته است (Ali et al., 2006).

فلاونوئیدها یکی از متنوع‌ترین ترکیبات طبیعی هستند که توانایی جذب رادیکال‌های آزاد را دارند. مشاهدات ثابت می‌کند که 20 میکرومولار سالیسیلیک اسید باعث افزایش درخور توجه میزان فلاونوئیدها در گیاه Panax ginseng می‌شود Yu et al., 2006)؛ Ali et al., 2007). در این پژوهش نیز میزان فلاونوئیدها پس از 24 ساعت تحت تأثیر سالیسیلیک اسید افزایش یافت که در نتیجه پاسخ گیاه در برابر سالیسیلیک اسید است.

کاربرد سالیسیلیک اسید به عنوان عاملی تنش‌زا باعث تولید طیف وسیعی از فلاونوئیدها می‌شود. Pastirova و همکاران (2004) بیشترین مقدار آمبلی فرون را در 72 ساعت پس از کاربرد یک میلی‌مولار سالیسیلیک اسید مشاهده کردند. در غلظت‌های 50 و 250 میکرومولار تغییری در ترکیب آمبلی فرون مشاهد نشد، در حالی که افزایش بسیار معنی‌داری در میزان اسیدهای فنلی مشاهده شد (Kovacik et al., 2009). در مجموع در پژوهش حاضر، غلظت 125/0 میلی‌مولار سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان آپی‌ژنین در اندام هوایی نسبت به گیاهان شاهد شده است، در حالی که تفاوت معنی‌داری در میزان آپی‌ژنین در طی چهار روز مشاهده نشد.

در گیاهان تولید آنتوسیانین تحت تأثیر متقابل عوامل داخلی و خارجی مانند نور، دما، کربوهیدرات، هورمون‌های گیاهی و تنش آبی است. این عوامل اکثراً از طریق تأثیر بر عوامل رونویسی بر میزان آنتوسیانین تأثیر می‌گذارند (Kim et al., 2006). مطالعات Sudha و Ravishankar (2003) نشان داد که میزان آنتوسیانین در هویج تحت تأثیر غلظت 200 میکرومولار سالیسیلیک اسید در طول نُه روز اول کاهش یافته، اما در طول دوره زمانی 21 روزه افزایش یافته است. در تحقیقات kim و همکاران (2006) سالیسیلیک اسید تأثیری بر میزان آنتوسیانین در برگ‌های غیر سبز ذرت نداشته است. در پژوهش حاضر مطابق شکل 3 تفاوت معنی‌داری بین میزان آنتوسیانین در نمونه‌های شاهد و تیمار شده وجود دارد. این نتایج تأثیر سالیسیلیک اسید بر تولید آنتوسیانین را تأیید می‌کند.

به طور کلی، میزان قندهای محلول در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد افزایش معنی‌داری داشت که نشان می‌دهد تنش‌های مختلف می‌توانند از طریق تولید سالیسیلیک اسید علاوه بر متابولیت‌های ثانویه بر متابولیت‌های اولیه نیز اثر گذارند

 

Ali, M. B., Yu, K. W., Hahn, E. J. and Paek, K. Y. (2006) Methyl jasmonate and salicylic acid elicitation induces ginsenosides accumulation, enzymatic and non-enzymatic antioxidant in suspension culture of Panax ginseng roots in bioreactor. Plant Cell Reports 25: 613-620.

Ali, M. B., Hahn, E. J. and Paek, K. Y. (2007) Methyl jasmonate and salicylic acid induced oxidative stress and accumulation of phenolics in Panax ginseng bioreactor root suspension cultures. Molecules 12: 607-621.

Appelt, G. D. (1985) Pharmacological aspects of selected herbs employed in Hispanic folk medicine in the San Luis Valley of Colorado, USA: I. Ligusticum porter (osha) and Matricaria chamomilla (manzanilla). Journal of Ethnopharmacology 13: 51-55.

Dighe, V. V., Pathak, G. M., Tulpule, K. M. and Gokarn V. N. (2007) HPTLC method for quantification of apigenin in the dried root powder of Gmelina arborea linn. Journal of Planar Chromatography 20: 179-182.

Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, F. (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28: 350-356.

Hayat,Q., Hayat, S., Irfan, M. and Ahmad, A. (2010) Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: a review. Environmental and Experimental Botany 68: 14-25.

Judd, W. S., Campbell, C. S., Kellog, E. A., Stevens, P. F. and Donahue, M. J. (2008) Plant Systematics: A Phylogenetic Approach. 3rd edition, Sinauer Associates, Sunderland.

Kim, J. S., Lee, B. H., Kim, S. H., Ok, K. H. and Cho, K. Y. (2006) Response to environmental and chemical signals for anthocyanin biosynthesis in nonchlorophyllous corn (Zea mays L.) leaf. Journal of Plant Biology 49: 16-25.

Kovacik, J., Gruz, J., Backor, M., Strnad, M. and Repcak, M. (2009) Salicylic acid-induced changes to growth and phenolic metabolism in Matricaria chamomilla plants. Plant Cell Reports 28: 135-143.

Krizek, D. T., Kramer, G. F., Upadyaya, A. and Mirecki, R. M. (1993) UV-B response of cucumber seedling grown under metal halide and high pressure sodium/deluxe lamps. Plant Physiolgy 88: 350-358.

Martens, S. and Mithofer, A. (2005) Flavones and flavone synthases. Phytochemistry 66: 2399-2407.

Masukasu, H., Karin, O. and Kyoto, H. (2003) Enhancement of anthocyanin biosynthesis by sugar in radish (Raphanus sativus) hypocotyls. Plant Science 164(2): 259-265.

Pastirova, A., Repcak, M. and Eliasova, A. (2004) Salicylic acid induces changes of coumarin metabolites in Matricaria chamomilla L. Plant Science 167: 819-824.

Popova, L., Pancheva, T. and Uzunova, A. (1997) Salicylic acid: properties, biosynthesis andphysiological role. Plant Physiolgy 23: 85-93.

Raal, A., Kaur, H., Orav, A., Arak, E., Kailas, T. and Müürisepp, M. (2011) Content and composition of essential oils in some Asteraceae species. Proceedings of the Estonian Academy of Sciences 1: 55-63.

Shah, J. (2003) The salicylic acid loop in plant defense. Current Opinion in Plant Biology 6: 365-371.

Murti, K., Panchal, M. A., Gajera, V. and Solanki, J. (2012) Pharmacological properties of Matricaria recutita: a review. Pharmacologia 3 (8): 348-351.

Strivastava, J. K., Shankar, E. and Gupta, S. (2010) Chamomile: a herbal medicine of the past with bright future. Molecular Medicine Reports 3: 895-901.

Stefan, M. and Axel, M. (2005) Flavones and flavone synthases. Phytochemistry 66: 2399-2407.

Sudha, G. and Ravishankar, G. A. (2003) Influence of methyl jasmonate and salicylic acid in the enhancement of capsaicin production in cell suspension cultures of Capsicum frutescens Mill.. Current Science 85: 1212-1217.

Tanaka, Y., Sasaki, N. and Ohmiya, A. (2008) Biosynthesis of plant pigments: anthocyanins, betalains and carotenoids. The Plant Journal 54: 733-749.