بررسی اثر آلودگی نفتی و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام بر برخی شاخص‌های بیوشیمیایی و رشد گیاه ذرت

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

2 03413222032

3 ؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟

چکیده

استفاده از سیستم گیاه و باکتری برای احیای زیستی خاک‌های آلوده به نفت یکی از دستاوردهای بیوتکنولوژی در دهه اخیر بوده و مشخص شده است که آلودگی نفتی باعث ایجاد تنش اکسیداتیو در گیاهان می‌شود. در پژوهش حاضر، به منظور بررسی اثر آلودگی نفتی بر روی گیاه ذرت (Zea mays) و احیای زیستی با همکاری باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت و گیاه، چهار تیمار آزمایشگاهی تحت شرایط گوناگون طراحی شد. عوامل متعدد فیزیولوژیکی و میکروبی جهت مشخص شدن این آثار سنجش شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که با حضور یک درصد نفت‌خام سبک در خاک گلدان‌های گیاه ذرت، میزان وزن خشک اندام هوایی کاهش و ترکیبات فنلی افزایش یافت. در حضور یک درصد نفت‌خام و باکتری Pseudomonas aeruginosa وزن خشک اندام هوایی، کلروفیل a و کلروفیل کل کاهش یافت و آنتوسیانین، ترکیبات فنلی، مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش یافت. یک درصد نفت‌خام به همراه باکتری Acinetobacter calcoaceticus تغییر معنی‌داری در شاخص‌های رشد و میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی نداشت و باعث افزایش آنتوسیانین، ترکیبات فنلی، مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم کاتالاز گردید. در حضور هر دو باکتری و نفت‌خام میزان وزن خشک اندام هوایی و کلروفیل a کاهش و میزان آنتوسیانین و مالون‌دی‌آلدهید افزایش یافت. در شاخص‌های میکروبی افزودن نفت‌خام به خاک حاوی باکتری‌های تجزیه‌کننده باعث افزایش تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت و باکتری‌های هتروتروف خاک و حذف نفت گردید. با به کارگیری سیستم‌های گیاه و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت در مقیاس میدانی می‌توان پساب صنعتی بسیاری از پالایشگاه‌های نفت و کارخانجات شیمیایی به طرز صحیحی پاکسازی نمود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

A study of the effects of crude oil pollution and oil-degrading bacteria on some biochemical and growth factors of Zea mays

نویسندگان [English]

  • Mehrdad Kavousi Bafti 1
  • Zahra Asrar 1
  • Mehdi Hassanshahian 2
  • Batoul Keramat 3
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
چکیده [English]

Bacteria-Plant systems for bioremediation of oil polluted sites are one of the most effective approaches of biotechnology in the recent years. It is well known that oil pollution induces oxidative stress in plants. In this research, the effects of crude oil pollution on Zea mays and bioremediation by synergism between plant and crude oil degrading bacteria, four different treatments were designed. Some physiological and microbial factors were assayed for determining the effects of oil pollution. The results showed that 1% crude oil in soil shoot, dry weight was reduced and the amount of phenolic compounds increased. With crude oil and Pseudomonas aeruginosa bacterium, shoot dry weight, chlorophyll (a), total chlorophyll and anthocyanins decreased wherase phenolic compounds, malodialdehyde and catalase enzyme activity increased. With 1% crude oil and Acinetobacter calcoaceticus bacterium, significant changes were seen in the parameters of growth. Photosynthetic pigment did not increase whereas anthocyanin, phenolic compounds, malodialdehyde and catalase activity increased. White Crude oil and the presence of both bacteria shoot dry weight and chlorophyll levels decreased and increased levels of anthocyanin and malon-dialdehyde were observed. Addition of oil to the soil, increased the numbers of crude oil degrading bacteria and heterotrophic bacteria but crude oil were removed from soil by biodegradation. By application of bacterial-plant systems in the field, industrial wastes from refinery and biochemical factories could be removed oppropriately.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Acinetobacter
  • Oil pollution
  • Oxidative stress
  • Pseudomonas
  • Bioremediation
  • Zea mays

مصرف گسترده مشتقات نفتی باعث گسترش آلودگی به همه بخش‌های زیست محیطی گردیده است. این آلودگی‌ها اختلالات وسیعی در ساختارهای زیستی و غیر زیستی به وجود آورده است (Chaillana et al.,2004). نفت‌خامی که از میدان‌های نفتی مختلف استخراج می‌گردد، دارای ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی است. هیدروکربن‌ها جزء اصلی ترکیبات نفت‌خام را تشکیل می‌دهند و مولکول‌های آنها فقط شامل کربن و هیدروژن است. ریشه گیاه طیف گسترده‌ای از مولکول‌های آلی هیدروفیل و لیپوفیل (ترکیبات آلیفاتیک،‌آروماتیک، ‌الکل‌ها،‌ فنول‌ها و آمین‌ها) را جذب می‌کند. همچنین، توانایی جذب ترکیباتی با حلالیت بسیار پایین مانند هیدروکربن‌ها حلقوی را دارد (Kvesitadze et al., 2006). البته میزان آب گریز بودن ترکیبات در مراحل جذب توسط ریشه یک عامل مؤثر در جذب آنها است. گونه‌های مختلفی از گیاهان از توانایی تجمع و تحمل ترکیبات آروماتیک حلقوی (PAHs, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons). برخوردار هستند. گزارش شده است که گیاهانی مانند تاج خروس، چاودار، گندم، جوی دو سر، ذرت، آفتابگردان، لوبیای سویا، نخود و هویج آلاینده‌های نفتی و PAHs را از محیط خودجذب می‌نمایند (Wang et al., 1998؛ (Pradhan et al., 2003. از میان ترکیبات مختلف موجود در نفت‌خام، هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای (PAHs) توسط آژانس حفاظت محیط زیست ایالات متحده آمریکا (EPA, U.S. Environmental Protection Agency) به عنوان سمّی‌ترین ترکیبات شناخته شده‌اند؛ به هر صورت این ترکیبات برای جانوران سرطان‌زا یا جهش‌زا هستند و برای گیاهان نیز سمّی هستند (Hodgeson, 1990). ترکیبات PAHs از عوامل تنش غیرزیستی در گیاه شناخته شده‌اند.از سوی دیگر، افزایش تولید H2O2 در هنگامی که گیاه در معرض این نوع آلاینده قرار می‌گیرد مشاهده گردیده است، اما به درستی مشخص نیست که منشأ پراکسید هیدروژن حاصل از NADPH اکسیداز است یا طی اکسیداسیون PAHs تولید می‌گردد (Alkio et al., 2005). در گیاه Cyperus rotundus گزارش شده است که فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) تحت تأثیر آلودگی نفتی افزایش یافته است، علت این افزایش در فعالیت این آنزیم نقش آن در حذف گونه‌های فعال اکسیژن بیان شده است. این پاسخ به ترکیبات سمّی آلی جذب شده توسط گیاه تولید گردیده است. همچنین، در یونجه نیز آلودگی نفت‌خام به عنوان عاملی تنش‌زا باعث بروز مکانیسم‌های ضد تنش در گیاه شده است (Wang et al., 2010). در گیاهانی که تحت تأثیر هیدروکربن‌های آروماتیک قرار گرفته‌اند، یافته‌ها از این فرضیه حمایت می‌کنند که گیاهانِ تحت تأثیر تنش دچار پراکسیداسیون لیپیدها هستند (Liu et al., 2009). اندازه‌گیری محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدها یکی از راه‌های تشخیص تنش اکسیداتیو است. در نتیجه پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع، مالون‌دی‌آلدهید (MDA) و سایر آلدهیدهای غیر اشباع تولید می‌شود که این ترکیبات ثانویه آلدهیدی حاصل از پراکسیداسیون لیپیدها به طور معمول به عنوان شاخص تنش اکسیداتیو محسوب می‌شوند. افزایش MDA که محصول پراکسیداسیون لیپیدها است بیانگر این مطلب است که از صدمات ROS به طور کامل جلوگیری نگردیده است (Liu et al., 2009). در کلروپلاست‌ها، کارتنوئیدها به عنوان رنگیزه کمکی عمل می‌کنند اما نقش مهم‌تر آنها نقش آنتی‌اکسیدانی آنها است (Egert and Tevini, 2002). ترکیبات فنلی در شرایط طبیعی در سلول سنتز می‌گردند اما تنش‌های محیطی یا زنده مقدار آنها را در سلول تغییر می‌دهد (Wen et al., 2008).گیاهان دارای سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی هستند که قادر به سمّ‌زدایی و جاروب کردن گونه‌های فعال اکسیژن است و با کمک این سیستم‌های آنتی‌اکسیدان قادر به کاهش آثار تنش اکسیداتیو هستند (Jithesh et al., 2006).

امروزه استفاده از سیستم‌های احیای زیستی گیاه و باکتری جهت پاکسازی خاک‌های آلوده به نفت بسیار مورد توجه است. زیرا ترکیب این دو روش موجب حدف سریع‌تر خاک‌های آلوده به هیدروکربن‌ها می‌شود. برای نمونه، Chaudhry و همکاران (2005( از تعامل بین باکتری‌های ریزوسفر و گیاه جهت افزایش شکست آلاینده‌های آلی در خاک استفاده کردند. آنها به این نتیجه رسیدند که تیمار همزمان خاک با تعامل گیاه و باکتری به افزایش تجزیه زیستی آلاینده‌ها در خاک آلوده منجر می‌شود (Chaudhry et al., 2005).

هدف از پژوهش حاضر، بررسی آثار نفت‌خام بر شاخص‌های بیوشیمیایی و رشد گیاهان و همچنین درک اثر متقابل نفت‌خام و باکتری تجزیه‌کننده بر شاخص‌های بیوشیمیایی گیاهان و در نهایت، تعیین اثر همکاری بین گیاه و باکتری در حذف نفت و شناخت بهتر سازوکار احیای زیستی با عملکرد همزمان گیاه و باکتری است. در واقع، پرسش اساسی تحقیق حاضر این است که آیا می‌توان از سیستم گیاه و باکتری برای احیای زیستی خاک‌های آلوده به آلاینده‌های نفتی استفاده کرد؟

 

مواد و روش‌ها

پژوهش حاضر در گروه زیست‌شناسی دانشگاه شهید باهنر کرمان انجام شده است. ابتدا بذرهای گیاه ذرت رقم سینگل کراس 704 از مرکز تحقیقات کشاورزی کرمان تهیه شد و به مدت 15 دقیقه با محلول هیپوکلریت سدیم 10 درصد ضدعفونی شد و پس از چند بار شستشو با آب مقطر به مدت 24 ساعت در آب مقطر خیسانده شد. برای جوانه‌زنی این بذرها به پتری‌دیش‌های حاوی کاغذ صافی مرطوب انتقال یافت. گلدان‌های حاوی خاک به پنج گروه تقسیم گردید: در گروه اول خاک بدون آلودگی نفتی و بدون افزودن باکتری در سه تکرار آماده گردید، که در هر گلدان چهار دانه‌رُست ذرت 5 روزه کشت گردید؛ در گروه دوم به میزان 1 درصد وزنی نفت‌خام سبک (تهیه شده از پالایشگاه نفت بندرعباس) به یک کیلوگرم خاک اضافه گردید و دانه‌رُست‌ها در آنها کشت گردید؛ در گروه سوم علاوه بر افزودن 1 درصد نفت‌خام سبک به خاک بافر حاوی باکتری کشت داده شده Pseudomonas aeruginosa AS به خاک افزوده شد؛ در گروه چهارم 1 درصد نفت‌خام سبک و باکتری Acinetobacter calcoaceticus BS به خاک اضافه شد و در گروه پنجم علاوه بر 1 درصد نفت‌خام هر دو باکتری AS و BS به خاک اضافه گردید. برای هر تیمار سه گلدان به عنوان سه تکرار در نظر گرفته شد. در هر گلدان 4 گیاه به عنوان 4 نمونه قرار گرفت. همه تیمارها در شرایط فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری شده، به مدت 28 روز در این شرایط رشد کردند. پس از گذشت دوره زمانی 28 روزه شاخص‌های رشد، بیوشیمیایی، آنزیمی و میکروبی جهت بررسی اثر هر یک از تیمارها روی گیاه ذرت سنجش شدند.


باکتری‌های استفاده شده: در پژوهش حاضر، دو باکتری استاندارد با نام‌هایPseudomonas aeruginosa AS و Acinetobacter calcoaceticus BS استفاده شد. این باکتری‌ها در پژوهش‌های پیشین جداسازی و شناسایی شده بودند و همچنین در بانک ژنی NCBI با شماره دستیابی FM881902 و FM957532 به ثبت رسیده‌اند. نام‌های AS و BS را محقق برای این باکتری‌ها انتخاب کرده است (Hassanshahian et al., 2012). این باکتری‌ها قبل از افزودن به خاک در محیط نوترینت براث کشت داده شدند تا کدورت نوری آنها در 600 نانومتر به 5/0 برسد که این کدورت نوری معادل 108 باکتری در هر گرم خاک است. سپس، باکتری‌های رشد یافته با سانتریفیوژ در دور g 5000 به مدت ده دقیقه رسوب داده شدند و در بافر فسفات حل گردیدند، سپس به خاک گلدان‌ها در آزمایش‌های مختلف اضافه شدند. با توجه به این که هدف از تحقیق حاضر استفاده عملی از باکتری‌های نام‌برده است، شرح ویژگی‌های کامل این باکتری‌ها به تحقیق Hassanshahian و همکاران (2012) ارجاع داده می‌شود.

اندازه‌گیری شاخص‌های رشد: برای اندازه‌گیری وزن خشک اندام‌های هوایی و ریشه، نمونه‌ها ‌در فویل آلومینیومی ‌پیچیده و به‌ مدت 72 ساعت درآون در دمای 70 درجه سانتیگراد خشک شد. سپس، وزن خشک نمونه‌ها با ترازوی Sartorius (BPSIID) با دقت 001/0 گرم اندازه‌گیری و بر حسب میلی‌گرم گزارش شد.

رنگیزه‌های فتوسنتزی: اندازه‌گیری مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی شامل کلروفیل‌های a و b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها با روش Lichtenthaler (1987) انجام شد. 2/0 گرم از برگ‌های فریز شده انتهای گیاه با 15 میلی‌لیتر استون 80 درصد ساییده شد و پس از صاف کردن جذب نور آنها با اسپکتروفتومتردر طول موج‌های 8/646، 20/663 و 470 نانومتر خوانده شد و غلظت رنگیزه‌ها بر حسب میکرو‌گرم بر گرم وزن‌تر محاسبه گردید.

 

کلروفیل a:

chla = 12.25 A663.2 - 2.79 A646.8

کلروفیل b:

chlb= 21.21 A646.8 - 5.1 A663.2

کلروفیل کل:

chlT= chla + chlb

کاروتنوئید:

car = (1000A470 -1.8 chla - 85.02 chlb )/198

 

.سنجش مقدار آنتوسیانین، ترکیبات فنلی کل و مالون‌دی‌آلدهید: از روش Wagner (1979) برای اندازه‌گیری مقدار آنتوسیانین‌های اندام هوایی استفاده شد. محتوای ترکیبات فنلی کل با روش Soland وLaima (1999) انجام گرفت. اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدهید با روش Heath و Packer (1969) انجام شد.

.فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT)(EC 1.11.1.6): سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از محاسبه‌ کاهش جذب H2O2 (کاهش مقدار H2O2) در طول موج 240 نانومتر و با روش Dhindsa و Motowe (1981) انجام شد. برای استخراج عصاره آنزیمی یک گرم بافت تر در یک ‌ها‌ون چینی حاوی سه میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 2/7 که شامل اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 1 میلی‌مولار، فنیل متان سولفونیل فلوراید (PMSF) 1 میلی‌مولار و پلی وینیل پیرولیدون (PVP) 1 درصد بود، ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال‌دار در g14000 و دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت. از محلول رویی برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌ استفاده گردید (این محلول در اپندورف و در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید). مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته 7 و پراکسید هیدروژن 15 میلی‌مولار بود. با افزودن 100 میکرولیتر عصاره‌ آنزیمی به مخلوط ذکر شده، واکنش شروع می‌شود. شاهد برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر شامل مخلوط واکنش اما فاقد عصاره آنزیمی بود. تغییرات جذب (یعنی تفاضل جذب در زمان شروع واکنش از جذب در زمان یک دقیقه)، پس از شروع واکنش محاسبه گردید. مقدار H2O2 موجود در مخلوط واکنش پس از یک دقیقه با استفاده از ضریب خاموشی mM-1cm-1) 28/0(ε= و رابطه 1 محاسبه شد که نشان ‌دهنده میزان فعالیت آنزیم کاتالاز است.

رابطه 1                                                    A=εbc

A: جذب خوانده شده، ε: ضریب خاموشی، c: غلظت H2O2 و b: طول کوت (1 سانتی‌متر) است.

فعالیت آنزیم به صورت واحد آنزیمی بر حسب مقدار پروتئین کل (میلی‌گرم) موجود در 100 میکرولیـتر عصاره (به دست آمده از روش Bradford (1976)) در یک دقیقه محاسبه گردید. یک واحد آنزیمی کاتالاز مقدار آنزیمی است که 1 میلی‌مول H2O2 را در یک دقیقه تجزیه می‌کند.

.شمارش تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده و هتروتروف: تعداد باکتری‌های هتروتروف در خاک با روش رقت‌سازی و کشت در محیط نوترینت آگار تعیین گردید. تعداد کل باکتری‌های تجزیه‌کننده نیز با روش رقت‌سازی و کشت در محیط Bushnell Hass Mineral Salt حاوی یک درصد نفت‌خام به عنوان منبع کربن تعیین گردید (Rahman et al., 2004).

.سنجش حذف نفت‌خام توسط باکتری‌های جدا شدهبا روش اسپکتروفتومتری: میزان حذف نفت‌خام با حل کردن مقدار نفت باقیمانده محیط در خاک توسط دی کلرومتان و سپس خواندن کدورت نفت استخراج شده در مقابل شاهد در طول موج 420 نانومتر تعیین گردید و از رابطه 2 برای محاسبه درصد حذف نفت‌خام استفاده شد (Rahman et al., 2004).

رابطه 2                    درصد حذف نفت‌خام= (میزان جذب نمونه- میزان جذب شاهد)/ میزان جذب شاهد

تحلیل آماری: تحلیل‌های آماری در این مطالعه با آزمایش فاکتوریل و با سه تکرار صورت گرفت و داده‌ها توسط نرم‌افزار SPSS نسخه 5 تحت آنالیز واریانس دو طرفه قرار گرفت و اختلاف میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح اطمینان 95 درصد مقایسه شدند.

 

نتایج

وزن خشک اندام هوایی گیاه در تیمار نفت‌خام و بدون حضور باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت کاهش یافت و در تیمار نفت همراه باکتری AS و در تیمار نفت همراه با دو باکتری کاهش وزن معنی‌داری مشاهده گردید (شکل 1). وزن خشک ریشه گیاه در تیمار نفت و باکتری BS افزایش داشت (شکل 2). میزان کلروفیل a در تیمار نفت و باکتری AS و تیمار نفت و باکتری‌های AS و BS به طور معنی‌داری کاهش نشان داد و در تیمارهای دیگر کاهش معنی‌داری مشاهده نگردید (شکل 3). مقدار کلروفیل b نسبت به شاهد در تیمار نفت و باکتری BS به طور معنی‌داری کاهش نشان داد. در سایر تیمارها کاهش معنی‌داری مشاهده نگردید (شکل 4). میزان کل کلروفیل نسبت به شاهد در تیمار نفت و باکتری BS و در تیمار نفت و باکتری AS کاهش معنی‌داری مشاهده گردید (شکل 5). در میزان کاروتنوئیدها تغییر معنی‌داری مشاهده نگردید (شکل 6). میزان ترکیبات فنلی نسبت به تیمار شاهد در تیمار نفت و بدون حضور باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت افزایشی به میزان 23 درصد مشاهده گردید. تیمار نفت و باکتری ASبه میزان 44 درصد افزایش نشان داد. همچنین، در تیمار نفت و باکتری BS افزایش معنی‌دار بود (شکل 7). مقدار آنتوسیانین نسبت به تیمار شاهد در تیمار نفت و بدون حضور باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت 6 درصد افزایش داشت که کاهش معنی‌داری نبود. در تیمار نفت و باکتریAS با 123 درصد همراه بود، همچنین مقدار آنتوسیانین در تیمار نفت‌خام و باکتری BS در حدود 116 درصد افزایش داشت. از سوی دیگر، در تیمار نفت و باکتری‌های AS و BS افزایش 106 درصدی مشاهده گردید (شکل 8). میزان مالون‌دی‌آلدهید نسبت به شاهد در تیمار نفت و بدون باکتری 258 درصد افزایش داشت و در تیمار نفت و باکتری AS همچنین در تیمار نفت و باکتری BS 472 درصد افزایش و در تیمار نفت و هر دو باکتری 279 درصد افزایش دیده شد (شکل 9). میزان فعالیت کاتالاز در تیمارشاهد بسیار ناچیز بود و در سایر تیمارها که باکتری‌های تجزیه‌کننده فعالیت داشتند نسبت به تیمار نفت و بدون حضور باکتری‌های افزایش مشاهده گردید. در تیمار نفت و باکتری AS به میزان 234 درصد مشاهده شد. همچنین، در تیمار نفت و باکتری BS در حدود 192 درصد افزایش داشت. از سوی دیگر، در تیمار نفت و هر دو باکتری AS و BSافزایش 15 درصدی مشاهده گردید (شکل 10). از آغاز تلقیح نفت (زمان صفر) تا روز هفتم کاهش محسوسی در تعداد کل هتروتروف ها مشاهده شد، به طوری که در تیمار باکتری AS تعداد از 1.35E+5 به 1.00E+5 کاهش یافت و پس از روز هفتم در تمامی تیمارها تعداد کل هتروتروف‌ها افزایش یافت (شکل 11). تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت در تیمارهای دارای باکتری‌های AS و BS افزایش داشته است. اما در تیمار شاهد که تنها حاوی خاک آلوده به نفت بوده است افزایش قابل توجهی مشاهده نشد. تعداد باکتری‌ها در تیمار باکتری BS بیش از سایر گلدان‌ها بود به طوری که در انتهای زمان آزمایش (روز 28ام) به 9.10E+5 رسید (شکل 12). در تیمار بدون باکتری‌های تجزیه‌کننده پس از 28 روز باعث تجزیه 25 درصدی نفت‌خام در خاک گردید و تیمار دارای باکتری AS اثر قابل توجهی بر تجزیه نفت‌خام داشت که به میزان 87 درصد بود. همچنین تیمار دارای باکتری BS باعث تجزیه 85 درصدی نفت‌خام گردید از سوی دیگر همکاری این دو باکتری در تیمار حاوی باکتری‌های AS و BS نفت را به میزان 41 درصد تجزیه نمود (شکل 13).


 

 

 

 

 

شکل 1- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر وزن خشک اندام‌های هوایی Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 2- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر وزن خشک ریشه Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 3- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان کلروفیل a Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 4 - تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان کلروفیل b Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

 

 

شکل 5- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان کلروفیل کل Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 6- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان کاروتنوئید Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 7- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان ترکیبات فنلی Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 8- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان آنتوسیانین Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

 

 

شکل 9- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان مالون‌دی‌آلدهید Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 10- تأثیر آلودگی نفت‌خام سبک با غلظت 1 درصد و باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام شامل باکتری‌های AS و BS به مدت 28 روز بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز Zea mays رقم 704. مقادیر میانگین سه تکرار SE ± است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن (05/0P£) است.

 

 

 

شکل 11- تغییرات در شمارش تعداد کل هتروتروف‌های خاک (CFU) در ریزوسفر گیاه Zea mays رقم 704 در تیمار شاهد در حضور 1 درصد نفت‌خام و بدون تلقیح باکتری و در تیمارهای تلقیح شده با باکتری‌های AS و BS به همراه 1 درصد نفت‌خام

 

 

 

شکل 12- تغییرات در شمارش تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت‌خام (CFU) در ریزوسفر گیاه Zea mays رقم 704 در تیمار شاهد در حضور 1 درصد نفت‌خام و بدون تلقیح باکتری و در تیمارهای تلقیح شده با باکتری‌های AS و BS به همراه 1 درصد نفت‌خام

 

 

 

شکل 13- تغییرات در میزان درصد نفت حذف شده در ریزوسفر گیاه Zea mays رقم 704 در تیمار شاهد در حضور 1 درصد نفت‌خام و بدون تلقیح باکتری و در تیمارهای تلقیح شده با باکتری‌های AS و BS به همراه 1 درصد نفت‌خام

 


بحث

اثر نفت‌خام با غلظت 1 درصد بر گیاه ذرت باعث تغییراتی در شاخص‌های رشد و بیوشیمیایی گیاه گردید، شاید این تغییرات بیانگر تنش اکسیداتیو در گیاه باشد. به نظر می‌رسد این تغییرات حاصل فعالیت گیاه در جذب گروهی از هیدروکربن‌های نفت‌خام (هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای) و سمّ‌زدایی و تجزیه این ترکیبات است (Moller et al.,2007). در تیمارهای که نفت‌خام بدون باکتری‌های AS و BS در گلدان‌ها بود، کاهش در وزن خشک اندام هوایی مشاهده گردید. همچنین در شاخص‌هایی نظیر: ترکیبات فنلی، میزان مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش مشاهده گردید که نشان دهنده بروز تنش در گیاه است. در تیمارهایی که باکتری AS به همراه نفت‌خام وجود دارد، در وزن خشک اندام هوایی، میزان کلروفیل a و کلروفیل کل کاهش مشاهده گردید و میزان آنتوسیانین همراه با افزایش بود. در شاخص‌های ترکیبات فنلی، مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش مشاهده گردید که میزان افزایش در این تیمار نسبت به سایر تیمارها بیشتر بود که نشان‌دهنده افزایش میزان تنش است. در تیمار نفت‌خام و باکتری BS میزان وزن خشک اندام هوایی، کلروفیل b و کلروفیل کل کاهش مشاهده گردید و در میزان آنتوسیانین، ترکیبات فنلی، مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش مشاهده شد که میزان این افزایش نسبت به تیمار نفت‌خام و باکتری AS کمتر بود و بیانگر تنش کمتر نسبت به این تیمار است. در تیمار حاوی هر دو باکتری و نفت‌خام وزن خشک اندام هوایی و میزان کلروفیل a کاهش یافت و میزان آنتوسیانین، ترکیبات فنلی، مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش یافت؛ مقدار این افزایش نسبت به تیمار دارای باکتری AS و تیمار دارای باکتری BS کمتر بود. در هیچ یک از تیمارها میزان کاروتنوئید تغییر معنی‌داری نداشت.

سایر پژوهشگران نیز در تحقیقات خود روی گیاهان دیگر به نتایج مشابه با نتایج تحقیق حاضر بر روی گیاه ذرت رسیده‌اند. برای مثال، Gao و همکاران (2006) با بررسی میان کنش بین گیاه برنج و باکتری‌های تجزیه‌کننده PAHs در خاک‌های آلوده به فنانترن و پیرن مشاهده نمودند که وزن خشک ریشه و ساقه هنگامی که گیاه برنج به صورت منفرد کشت داده می‌شود در مقایسه با حالتی که در ترکیب با باکتری‌های تجزیه‌کننده در خاک الوده کشت داده می‌شود کاهش قابل ملاحظه‌ای دارد. آنها علت این کاهش در وزن خشک ریشه و ساقه را آثار فوق سمّی ترکیبات آروماتیک چند حلقه‌ای بر ریشه و ساقه گیاه عنوان کردند.

Mohsenzadeh و همکاران (2010) خاک را به طور مصنوعی به نفت‌خام آلوده کردند و گیاه خار شتر (Alhaji cameleron) را در آن کشت دادند و قارچ Altenaria sp. را در برخی از خاک‌ها اضافه نمودند. نتایج حاصل از تحقیق آنها نشان داد که در حالتی که گیاه خارشتر همراه با قارچ در خاک آلوده به نفت کشت داده می‌شود میزان ترکیبات فنلی، مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش می‌یابد. آنها علت این افزایش را زیاد شدن تنش اکسیداتیو در گیاه و تلاش و همکاری گیاه و قارچ برای حذف نفت‌خام از خاک عنوان کردند.

در شاخص‌های میکروبی در تیمار فاقد باکتری‌های AS و BS تغییری در تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده مشاهده نگردید، اما در میزان کل هتروتروف‌های خاک مشاهده گردید. در تیمارهای حاوی نفت و باکتری‌های AS و تیمار نفت و باکتری BS در میزان کل هتروتروف‌های خاک و تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت، افزایش بیشتری نسبت به سایر تیمارها مشاهده گردید این موارد بیانگر تجزیه بیشتر نفت‌خام در این تیمارها است. در تیماری که هر دو باکتری حضور دارند میزان کل هتروتروف‌های خاک و تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت، افزایش کمتر نسبت به تیمارهای دارای یک باکتری مشاهده گردید. از این رو، توانایی گیاه در تغییر بر ترکیبات موجود در نفت‌خام می‌تواند به افزایش تحرک آنها در ریشه و کاهش سمّیت این ترکیبات منجر گردد (Meudec et al., 2006). این تأثیر حاصل توانایی‌های باکتری‌های AS و BS در تجزیه هیدروکربن‌های آلیفاتیک و از سوی دیگر توانایی محدود این باکتری‌ها در تجزیه PAHs است، در نتیجه این تغییرات هیدروکربن‌های موجود در نفت‌خام که خاصیت آب‌گریزی بیشتری دارند و مانع جذب سایر هیدروکربن‌ها با آب‌گریزی کمتر (آروماتیک‌های حلقوی) می‌شوند، توسط باکتری‌های AS و BS تجزیه می‌شوند و در نتیجه این تغییر در ترکیب نفت‌خام، جذب PAHs افزایش یافته است (Mitaishvili et al., 2005).

افزایش تعداد باکتری‌های هتروتروف و تجزیه‌کننده نفت‌خام پس از آلودگی خاک با آلاینده‌ها به ویژه نفت توسط محققان دیگر نیز گزارش گردیده است. برای نمونه، Phillips و همکاران (2008) در خاک آلوده به گازوئیل که گیاه یونجه را کشت داده بودند افزایش معنی‌دار باکتری‌های تجزیه‌کننده را در مقایسه با خاک غیر آلوده مشاهده نمودند. آنها علت افزایش تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت در خاک آلوده نسبت به خاک غیر آلوده را فشار انتخابی نفت وارد شده به خاک و در نتیجه گزینش باکتری‌های مصرف‌کننده نفت و تطابق آنها با آلودگی نسبت به سایر باکتری‌های خاک عنوان کردند.

بنابراین به نظر می‌رسد در تیمارهایی که نفت‌خام در محیطی عاری از باکتری‌های AS و BS قرار داشت حضور هیدروکربن‌های آلیفاتیک آب‌گریز با کاهش جذب هیدروکربن‌ها آروماتیک همراه بود، شاخص‌ها بیانگر میزان تنش کمتری نسبت به سایر تیمارها بود و تیمارهایی با باکتری‌های AS یا BS در آنها حضور داشتند، کاهش هیدروکربن‌های آب‌گریز آلیفاتیک توسط باکتری‌ها باعث جذب بیشتر ترکیبات آروماتیک گردید که در نتیجه آن افزایش تنش در گیاه را به دنبال داشت. نتایج پژوهش حاضر در مجموع نشان داد که استفاده از یک باکتری منفرد در سیستم حذف آلاینده‌های نفتی با همکاری گیاه و باکتری کارآیی بالاتری نسبت به استفاده از مخلوط باکتری‌ها دارد. به نظر می‌رسد که فعالیت باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت شرایط مساعدی را در جذب این آلاینده توسط گیاه فراهم می‌آورند.

 

سپاسگزاری

نگارندگان از دانشگاه شهید باهنر کرمان به خاطر حمایت مالی قدردانی می‌نمایند.

 

 

Alkio, M., Tabuchi, X. and Wang, A. (2005) Stress responses to polycyclic aromatic hydrocarbons in Arabidopsis include growth inhibition and hypersensitive response-like symptoms. Journal of Experimental Botany 56(421): 2983-2994.

Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annual Biochemistry 72: 248-254.

Chaillana, F., Flècheb, A., Burya, E., Phantavonga, Y., Saliot, A. and Oudot, J. (2004) Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research Microbiology 155(7): 587-595.

Chaudhry, Q., Blom-Zandstra, M., Gupta, S. and Joner, E. J. (2005) Utilizing the synergy between plants and rhizosphere microorganisms to enhance breakdown of organic pollutants in the environment. Environment Science Pollution Research 12: 34-48.

Kvesitadze, G., Khatisashvili, G., Sadunishvili, T. and Ramsden, J. (2006) Biochemical mechanisms of detoxification in higher plants basis of phytoremediation. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.

Dhindsa, R. S. and Motowe, W. (1981) Drought tolerance in two mosses: correlation with enzymatic defense against lipid peroxidation. Journal of Experimental Botany 32: 79-91.

Egert, M. and Tevini, M. (2002) Influence of drought on some physiological parameters symptomatic for oxidative stress in leaves of chives (Allium schoenoprasum). Environment and Experimental Botany 48: 43-49.

Gao, X. Z., Yu, S. C., Wu, K. C., Cheung, N. F. Y., Tam, P. Y. and Qian, M. H. (2006) Interactions of rice (Oryza sativa L.) and PAH-degrading bacteria (Acinetobacter sp.) on enhanced dissipation of spiked phenanthrene and pyrene in waterlogged soil. Science of the Total Environment 372: 1-11.

Hassanshahian, M., Emtiazi, G., Cappello, S. (2012) Isolation and characterization of crude-oil-degrading bacteria from the Persian Gulf and the Caspian Sea. Marine Pollution Bulletin 64: 7-12.

Heath, R. L. and packer, L. (1969) Photoperoxidation in isolated chloroplast kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archive of Biochemistry Biophysics 125: 189-198.

Hodgeson, J. W. (1990) Polynuclear aromatic hydrocarbons. Ecotoxicology and Environmental Safety 20: 234-240.

Jithesh, S. R., Prashanth, K. R., Sivaprakash, S. and Ajayk, P. (2006) Antioxidative response mechanisms in halophytes: their role in stress defence Taramani. Journal of Genetics 85: 87-97.

Lichtenthaler, H. K. (1987) Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology 148: 350-382.

Liu, H., Weisman, D., Yua.n-bei, Y., Bo Cui, Y., Huang, A., Carmona C. and Zong-hua, W. (2009) An oxidative stress response to polycyclic aromatic hydrocarbon exposure is rapid and complex in Arabidopsis thaliana. Plant Science 176: 375-382.

Meudec, A., Dussauze, E., Deslandes, N. and Poupart, P. (2006) Evidence for bioaccumulation of PAHs within internal shoot tissues by a halophytic plant artificially exposed to petroleum-polluted sediments. Journal of Experimental Botany 65: 474-481.

Mitaishvili, T., Scalla, R., Ugrekhelidze, D., Tsereteli, B., Sadunishvili, T. and Kvesitadze, G. (2005) Transformation of aromatic compounds in plants grown under aseptic conditions. Zeitsschrift fur Naturforschung 60: 97-102.

Mohsenzadeh, F., Nasseri, S., Mesdaghinia, A., Nabizadeh, R., Zafari, D., Khodakaramian, G. and Chehregan, A. (2010) Phytoremediation of petroleum-polluted soils: application of Polygonum aviculare and its root-associated (penetrated) fungal strains for bioremediation of petroleum-polluted soils. Ecotoxicology and Environmental Safety 73: 613-619.

Moller, M., Poul, E., Jensen, B. and Andreas, H. (2007) Oxidative modifications tocellular components in plants. Annual Review Plant Biology 58: 459-81.

Phillips, L., James, J. Germida, F. and Charles, W. (2008) Hydrocarbon degradation potential and activity of endophytic bacteria associated with prairie plants. Soil Biology and Biochemistry 40: 3054-3064.

Pradhan, J. R., Conrad, J. R. and Paterek, S. (2003) Potential of phytoremediation for treatment of PAHs in soil at MGP sites. Soil and Sediment Contamination 7(4): 467-480.

Rahman, K. S. M., Thahira-Rahman, J., Lakshmanaperumalsamy, P. and Banat, I. M. (2004) Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium. Bioresource Technology 85: 257-261.

Soland, S. F. and Laima, S. K. (1999) Phenolics and cold tolerance of Brassica napus. Plant Agriculture 5: 1-5.

Wagner, G. J. (1979) Content and vacuole/ extra vacuole distribution of neutral sugars, free amino acids and anthocyanins in protoplast. Plant Physiology 64: 88-93.

Wang, J., Liu, X., Zhang, X., Wang, Z., Zheng-nan, Z., Cheng-lin, S. and Peng, R. (2010) Phytoremediation potential of Cyperus rotundus for dieselcontaminated wetland. Journal of Shanghai University (English Edition) 14(5): 326-331.

Wang, L., Ke, W. Q. and Wong, T. W. Y (1998) Removal of pyrene from contaminated sediments by mangrove microcosms. Chemosphere 51 (1): 25-34.

Wen, P. F, Chen, J. Y., Wan, S. B., Kong, W. F., Zhang, P., Wang, W., Zhan, J., Pan, Q. H. and Hung, W. D. (2008) Salicylic acid activates phenylalanine ammonia-lyase in grape berry in response to high temperature stress. Plant Growth Regulation 55(1): 1-10.