بررسی محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی گیاه Isatis cappadocica در سطوح مختلف آرسنیک و فسفر

نویسندگان

1 08314274545

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه رازی کرمانشاه، کرمانشاه، ایران

چکیده

شبه فلز آرسنیک یکی از مهم‌ترین ترکیبات آلوده‌‌‌کننده‌ ‌محیط زیست محسوب می‌شود. برخی از گیاهان با انباشت سطوح بالای آرسنیک در بخش هوایی خود، توانایی پالایش مناطق آلوده به آرسنیک را دارند. به دلیل شباهت شیمیایی آرسنیک و فسفر، رفتار مشابهی از آنها در سیستم جذب گیاهی دیده شده است. در پژوهش حاضر، آزمایش‌های هیدروپونیک بر گیاه Isatis cappadocica که اخیراً به عنوان گیاه بیش انباشتگر آرسنیک شناخته شده است، انجام شد. بذرهای گیاه از منطقه آلوده، جهت بررسی محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی و درک بهتر سازوکارهای مقاومتی گیاه در اثر متقابل بین فسفر و آرسنیک، انتخاب گردید. بدین منظور، غلظت‌های مختلف آرسنیک (0، 50، 200، 800 و 1200 میکرومولار) و فسفر (5، 50، 200، 800 و 1600 میکرومولار)، در مرحله چهار برگی بر گیاه اثر داده و وزن خشک، محتوای پراکسید هیدروژن، ترکیبات آنتی‌اکسیدانی (کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین)، میزان آرسنیک و فسفر تجمع یافته در بخش هوایی اندازه‌گیری شد. بیشترین میزان آرسنیک تجمع یافته در تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر مشاهده گردید. افزایش سطوح بالای فسفر در محیط، باعث کاهش میزان تجمع آرسنیک گردید که نشان‌دهنده اثر متقابل این دو عنصر در طول جذب توسط گیاه است. به دنبال افزایش سطوح آرسنیک، میزان پراکسید هیدروژن و متعاقب آن محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی افزایش یافت. انباشت بیش از 700 میلی‌گرم بر کیلوگرم آرسنیک (بر پایه وزن خشک)، نشان‌دهنده مقاومت بالای گیاه نسبت به آرسنیک و وجود سازوکارهای کارآمد از جمله افزایش ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در آن به منظور مقابله با تنش اکسیداتیو است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluation of different levels of arsenic and phosphorus on antioxidant compounds content in Isatis cappadocica

نویسندگان [English]

  • Naser Karimi 1
  • Zahra Souri 2
2 Department of Biology, Faculty of Sciences, Razi University, Kermanshah, Iran
چکیده [English]

Metalloid arsenic is considered as one of the most important environmental contaminant compounds. Some plants with high concentrations of arsenic accumulation in their shoots, have the ability to purify arsenic-contaminated areas. Due to the chemical similarity between arsenic and phosphate, similar behavior has been observed by plant uptake system. In this study, hydroponic experiment was conducted on Isatis cappadocica, as a newly-discovered hyperaccumulator. Accordingly, we conducted this experiment to compare the interaction of arsenic and phosphorus on antioxidant compounds of I. cappadocica. Therefore, the plants were grown for 6 weeks in a medium, embedded with combinations of 50, 200, 800 and 1200 μmol arsenic and 5, 50, 200, 800 and 1600 μmol phosphorus, respectively. The dry weight, hydrogen peroxide, antioxidant compounds and the arsenic and phosphorus concentration of harvestable parts were determined. The highest concentration of arsenic was obtained in plants treated with 1200 μmol As and 5 μmol phosphorus. Along with a marked increase in arsenic concentration in the media, a built up hydrogen peroxide was observed. Increasing arsenic concentration in the medium lead to increase of antioxidant compounds (carotenoids, anthocyanin and flavonoid). The accumulation of more than 700 mg kg-1 arsenic in the shoots, demonstrated the high resistance of I. cappadocica to arsenic stress and the existence of efficient mechanisms for reduced oxidative stress.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Arsenic
  • Hyperaccumulator
  • Hydrogen peroxide
  • Antioxidant compounds
  • Phosphorus
  • Isatis cappadocica

آرسنیک یک شبه فلز سمّی و غیرضروری برای گیاهان است که از طریق منابع طبیعی (فعالیت‌های زمین‌شناسی و آتشفشان‌ها) و منابع مصنوعی (استفاده از حشره‌کش‌ها، علف‌کش‌ها و غیره) محیط زیست را آلوده می‌کند (Gunes et al., 2009). انسان از طریق فعالیت‌های معدن‌کاری در مناطق آلوده و مصرف آب آشامیدنی و مواد غذایی آلوده به آرسنیک در معرض این سمّ خطرناک قرار می‌گیرد (Zhao et al., 2009). اگرچه آلودگی آرسنیک بیشتر متعلق به کشورهای جنوب شرقی آسیا است ولی در مناطقی از ایران (استان‌های کردستان و خراسان) نیز آلودگی خاک و آب به این آلاینده گزارش شده است (Karimi et al., 2010).

آرسنیک و فسفر هر دو متعلق به گروه پانزده جدول تناوبی عناصر شیمیایی هستند که به دلیل ویژگی‌های شیمیایی مشابه، رفتار مشابهی در خاک و گیاهان دارند (Lihong and Guilan, 2009). بنابراین، بررسی دقیق اثر متقابل آرسنیک و فسفر در فرآیندهای جذب و انتقال آنها در گیاهان می‌تواند اطلاعات مفیدی را در ارتباط با مکانیسم‎های سازگاری و مقاومت به غلظت‌های مختلف آرسنیک فراهم ‎کند.

فلزات سنگین یا به طور مستقیم از طریق واکنش هابر-وییز یا به طور غیر مستقیم باعث تولید انواع گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) و در نتیجه ایجاد تنش اکسیداتیو در گیاهان می‌شوند (Mithofer et al., 2004). مکانسیم‌های غیر مستقیم شامل تأثیر متقابل فلزات با سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی خود گیاهان است (Srivastava et al., 2004) که می‌تواند بر اثر اختلال در زنجیره انتقال الکترون (Qadir et al., 2004) یا
بر هم خوردن متابولیسم عناصر ضروری رخ دهد (Dong et al., 2006). یکی از آثار آرسنیک در گیاهان، تولید ROS است (Hartley-Whitaker et al., 2001). شواهد نشان می‌دهند که فعالیت انواع ROS سبب بروز خسارات فراوان از جمله پراکسیداسیون لیپیدها، اکسیداسیون پروتئین‌ها، بی رنگ شدن کلروپلاست‌ها و رنگدانه‌ها می‌گردند Herbinger et al., 2002)؛ (Mittler, 2002. گیاهان برای مقابله با تنش‌های اکسیداتیو دارای یک سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی با کارآیی بالا شامل آنزیم‌ها و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی نظیر کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین هستند که می‌تواند رادیکال‌های آزاد را خنثی یا جاروب نماید (Hosseini and Pourakbar, 2013). یکی از صدمات اکسیداتیو مهم، تخریب مولکول کلروفیل است. به دنبال این تخریب، گیاه رنگی به نظر می‌رسد که دلیل آن افزایش و قابل مشاهده شدن رنگیزه‌های محافظ مانند کاروتنوئیدها (گزانتوفیل، کاروتن و لیکوپن) و آنتوسیانین است (Chalker-Scott, 2002). کاروتنوئیدها در این شرایط قادرند انرژی زیاد طول موج‌های کوتاه را گرفته، اکسیژن یک‌تایی را به سه‌‌تایی تبدیل کرده و با گرفتن رادیکال‌های اکسیژن تولید شده، نقش آنتی‌اکسیدانی خود را ایفا کنند (Inze and Montagu, 2000). ترکیبات فنلی شامل گروه بزرگی از متابولیت‌های ثانویه هستند که بسیاری از ترکیبات حلقوی نظیر ترکیب‌های فنل، فلاونوئیدها، کاروتنوئیدو آنتوسیانین و حتی آمینو اسیدهای حلقوی مثل تریپتوفان، تیروزین و پرولین را شامل می‌شوند. این ترکیب‌ها دارای نقش‌های متعدد اکولوژیکی و فیزیولوژیکی نظیر نقش‌های دفاعی و آنتی‌اکسیدانی هستند (André et al., 2009). فلاونوئیدها می‌توانند از تنش‌های اکسیداتیو جلوگیری کنند، بدین معنا که توان پاک‌سازی انواع گونه‌های فعال اکسیژن را دارند. آنتوسیانین‌ها نیز مشابه فلاونوئیدها، رنگیزه محافظ هستند که گیاه را در برابر تنش محافظت می‌کنند (Chalker-Scott, 2002). گزارش شده است که محتوای آنتوسیانین تحت شرایط تنش اکسیداتیو افزایش می‌یابد، این افزایش به علت نقش حفاظت نوری آنتوسیانین به وسیله حذف مستقیم گونه‌های فعال اکسیژن طی تنش اکسیداتیو است (Zhang et al., 2010).

اخیراً گیاهIsatis cappadocicaبه عنوان یک گیاه بیش انباشتگر آرسنیک معرفی شده و نشان داده شده است که تحت شرایط آزمایشگاهی این گیاه به عنوان نخستین بیش انباشتگر آرسنیک در گیاهان نهان‌دانه است که می‌تواند غلظت بالایی از آرسنیک را در اندام‌های هوایی خود انباشت کند (Karimi et al., 2009). این گیاه بومی غرب کشور ایران است و می‌تواند به عنوان یک گیاه بیش انباشتگر آرسینک در فرآیند گیاه‌پالایی مناطق آلوده غرب کشور مورد استفاده قرار گیرد. با توجه به اثر متقابل فسفر و آرسنیک در جذب و متابولیسم هر یک از آنها در گیاهان و کارآیی بسیار زیاد گیاه I. cappadocica در انباشت آرسنیک، بررسی محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی آن در غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر می‌تواند پژوهشگران را در پیشبرد بهتر مطالعات مکانیسم‌های مقاومت در این گیاه یاری کند. لذا، مطالعه حاضر به منظور بررسی مکانیسم بخش غیر آنزیمی دفاع آنتی‌اکسیدانی گیاه I. cappadocica در شرایط رشد در محیط‌های حاوی غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر انجام شد.

مواد و روش‌ها

کشت گلدانی: بذرهای گیاه I. cappadocica از منطقه معدنی آلوده به آرسنیک زرشوران در استان آذربایجان غربی جمع‌آوری گردید. ابتدا بذرهای گیاه با سدیم هیپوکلریت 1 درصد ضد عفونی و سپس با آب مقطر شستشو شدند. بذرهای استریل شده در داخل گلدان‌هایی که از قبل با پرلیت و ماسه به نسبت 2 به 1 پُر شده بودند قرار گرفت، سپس گلدان‌ها به گلخانه دانشگاه رازی، با شرایط محیطی نیمه کنترل شده شامل دمای متناوب 18 تا 25 درجه سانتیگراد (شب و روز)، رطوبت نسبی 45 درصد، تناوب نوری 16 ساعت نوری و 8 ساعت تاریکی و شدت نوری حدود 150 میکرومول فوتون در متر مربع، انتقال داده شدند. پس از جوانه‌زنی، گلدان‌ها هر هفته دو بار با محلول غذایی تغییر یافته هوگلند 50 درصد با pH برابر با 6 تغذیه شدند که ترکیب آن عبارت بود از: 5/0 میلی‌مولار KNO3، 75/0 میلی‌مولار Ca(NO3)2، 2/0 میلی‌مولار MgSO4، 15 میکرومولار H3BO3، 2 میکرومولار MnCl2، 1 میکرومولار ZnSO4، 5/0 میکرومولار CuSO4، 50 میکرومولار FeEDTA، 2/0 میکرومولار.NaMoO4 پس از رسیدن به مرحله چهار برگی، گلدان‌ها به گروه‌های سه گلدانی (هر تیمار، سه تکرار) تقسیم شدند و به مدت 4 هفته، هر هفته دو بار به آنها تیمارهای 0، 50، 200، 800 و 1200 میکرومولار آرسنات (Na2HASO4) و 5، 50، 200، 800 و 1600 میکرومولار فسفات (KH2PO4) اضافه شد. پس از اتمام زمان تیمار، گیاهان از درون گلدان‌ها بیرون آورده شد و بخش هوایی آنها جدا و به منظور انجام مراحل بعدی، جمع‌آوری گردید.


اندازه‌گیری محتوای کاروتنوئید: برای تعیین محتوای کاروتنوئید در نمونه‌ها، مقدار 2/0 گرم از بافت تر برگ با استون 80 درصد ساییده شد. سپس، حجم محلول با استون به 20 میلی‌لیتر رسید. محلول به دست آمده به مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. پس از آن، جذب محلول رویی به وسیله دستگاه اسپکترفتومتر (مدل Bausch & Lomb 70، آمریکا) در طول موج 470 نانومتر ثبت گردید. در نهایت، به منظور محاسبه کاروتنوئید از رابطه 1 استفاده گردید:

رابطه 1:   میزان کاروتنوئید=

(کلروفیل b ´ 02/85 - کلروفیل a ´ 8/1) - OD470 ´ 1000

198

 

.اندازه‌گیری محتوای فلاونوئید و آنتوسیانین: برای اندازه‌گیری میزان فلاونوئید و آنتوسیانین از روش Nogués و Baker (2000) استفاده گردید. به این ترتیب که مقدار 5/0گرم از بافت تر را در 5 میلی‌لیتر متانول اسیدی (شامل الکل متیلیک 5/99 درصد و هیدرو کلریک اسید خالص به نسبت 99 به 1) به خوبی ساییده و سپس محلول همگن حاصل را به مدت 30 دقیقه با سرعت 4000 دور و در دمای 4 درجه سانتیگراد، سانتریفیوژ شد و جذب عصاره بالایی توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 300 و 520 نانومتر به ترتیب برای فلاونوئید و آنتوسیانین ثبت شد. مقدار آنتوسیانین از رابطه A=ebc به دست آمد. در این رابطه، A: شدت جذب، b: عرض کووت برابر با 1 سانتی‌متر، c: غلظت آنتوسیانین (مول بر گرم) و
:e ضریب خاموشی برابر با mol-1 Cm-1 33000 است. همچنین، میزان فلاونوئید با استفاده از رابطه 2 بر حسب درصد محاسبه گردید (V= حجم عصاره).

رابطه 2:   Fla = (OD300 nm) V/700 ´ 100

.اندازه‌گیری محتوای پراکسید هیدروژن(H2O2): برای تعیین محتوای پراکسید هیدروژن، از روش Sergiev و همکاران (1997) با اندکی تغییر استفاده شد. 2/0 گرم از بافت برگی با 3 میلی‌لیتر تری کلرو استیک اسید 1/0 در هاون چینی ساییده شد و عصاره حاصل در 12000 دور، به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سپس، 5/0 میلی‌لیتر از مایع رویی برداشته و به 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 2/0 مولار و 1 میلی‌لیتر یدید پتاسیم 1 مولار اضافه شد. جذب مخلوط ذکر شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 390 نانومتر خوانده شد و در نهایت میزان H2O2 با استفاده از ضریب خاموشی Mm-1 cm-1 28 محاسبه و به صورت میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید.

اندازه‌گیری میزان آرسنیک: برای اندازه‌گیری غلظت آرسنیک کل در نمونه‌های گیاهی از روش Meharg و Jardine (2003) استفاده شد. به 2/0 گرم از نمونه‌های خشک برگی، 1 میلی‌لیتر نیتریک اسید غلیظ اضافه گردید. پس از نگهداری مخلوط حاصل به مدت 24 ساعت در دمای اتاق، 1 میلی‌لیتر آب اکسیژنه اضافه شد. در مرحله بعد، لوله‌های آزمایش در بن ماری با دمای 70 درجه سانتیگراد، به مدت نیم ساعت قرار گرفتند. سپس به دمای 100 درجه سانتیگراد، یک ساعت تا بخار شدن کل نیتریک اسید موجود در نمونه، منتقل شدند. پس از سرد شدن، محلول حاصل صاف گردید و با آب مقطر به حجم 50 میلی‌لیتر رسید. سپس، به 1 میلی‌لیتر از محلول رقیق شده هر یک از نمونه‌ها 5 میلی‌لیتر کلریدریک اسید 10 درصد، 5 میلی‌لیتر یدید پتاسیم 10 درصد و 5 میلی‌لیتر آسکوربیک اسید 5 درصد اضافه گردید. در نهایت، آرسنیک موجود در نمونه‌ها به وسیله دستگاه طیف‌سنج جذب اتمی (مدل Shimadzu, 6200، شرکت Shimadzu، ژاپن) به همراه تولید هیدرید (دستگاه تولید هیدرید، مدل FIG 100، شرکت Shimadzu، ژاپن) اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری میزان فسفر: برای سنجش فسفر از روش خاکستر خشک استفاده گردید. بدین منظور، به 5/0 گرم ماده خشک گیاهی 2 میلی‌لیتر نیتریک اسید (1:2) اضافه شد و پس از صاف کردن با آب مقطر به حجم 100 میلی‌لیتر رسید. از محلول به دست آمده، 25 میلی‌لیتر برداشته و به بالن ژوژه 50 میلی‌لیتری انتقال داده شد. با توجه به pH اسیدی نامشخص محلول، با اضافه نمودن آمونیاک (1:1)، pH به 8/7 رسانده شد. پس از خنثی شدن محلول با اضافه کردن نیتریک اسید (1:2)، pH در محدوده 5/1 تا 2 تنظیم شده، سپس با افزودن 15 میلی‌لیتر معرف آمونیوم وانادات، پس از تشکیل کمپلکس زرد رنگ، حجم محلول با آب مقطر به 50 میلی‌لیتر رسانده شد. سپس، مقدار جذب هر محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 450 نانومتر ثبت گردید. به کمک منحنی حاصل از مقدار جذب محلول‌های استاندارد (دی هیدروژن فسفات پتاسیم)، غلظت فسفر در نمونه‌های گیاهی سنجش شد.

تحلیل داده‌ها: آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب بلوک کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. تحلیل داده‌های حاصل از مراحل مختلف این تحقیق با نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 16 صورت گرفت. همچنین برای مقایسه میانگین‌ها، از آزمون دانکن استفاده گردید و نمودارها توسط نرم‌افزار Excel ترسیم شدند.

 

نتایج

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان وزن خشک بخش هوایی: میزان وزن خشک در غلظت‌های مختلف آرسنیک (به جز تیمار 1200 میکرومولار) روند کاهشی محسوسی نداشت که این امر بیانگر مقاومت بالای گیاه در مقابله با تنش آرسنیک است. بیشترین میزان وزن خشک بخش هوایی در مقایسه با سایر تیمارها، تیمار 50 میکرومولار آرسنیک و 1600 میکرومولار فسفر بود که 52/2 برابر کمترین میزان، مربوط به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر بود. در تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر، کاهش محسوسی در میزان وزن خشک بخش هوایی مشاهده نشد به طوری که با سایر تیمارها اختلاف معنی‌داری داشت. از سوی دیگر، با افزایش غلظت فسفر، روند افزایشی در میزان وزن خشک بخش هوایی مشاهده شد (شکل 1).

.میزان انباشت آرسنیک در بخش هوایی، تحت تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر: با اعمال تیمارها، میزان فلز تجمع یافته بین حداقل 0965/2 (تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 50 میکرومولار فسفر) و حداکثر 937/700 میلی‌گرم در کیلوگرم وزن خشک (تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر) متغیر بود. غلظت آرسنیک تجمع یافته در تیمارهای 1200 میکرومولار آرسنیک، افزایش معنی‌داری نسبت به سایر تیمارها داشت (شکل 2). در سطوح پایین فسفر (5 و 50 میکرومولار) میزان آرسنیک تجمع یافته نسبت به سایر تیمارها بیشتر بود اما به دنبال افزایش سطوح فسفر، میزان تجمع آرسنیک کاهش یافته است که این امر می‌تواند به دلیل افزایش رقابت و اثر متقابل بین این دو عنصر باشد. علت وجود مقادیر اندک آرسنیک در تیمارهای فاقد آرسنیک، نشان دهنده خطای آزمایش در مراحل مختلف شامل آبیاری، برداشت و عصاره‌گیری است.

 

.میزان تجمع فسفر در بخش هوایی، تحت تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر: میزان فسفر تجمع یافته در بخش هوایی گیاه بین حداقل 62/16 (تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر) و حداکثر 31/123 میلی‌گرم برکیلوگرم وزن خشک (تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 1600 میکرومولار فسفر) متغیر بوده است. با افزایش غلظت آرسنیک (Mµ 200£)، میزان جذب و تجمع فسفر روند کاهشی یافت. از سوی دیگر، در سطوح بالای فسفر (Mµ 50£) به موازات افزایش غلظت آرسنیک در هر تیمار، میزان تجمع فسفر به طور محسوسی کاهش پیدا کرده است. این کاهش در غلظت‌های 800 و 1200 میکرومولار آرسنیک با شدت بیشتری صورت گرفته است به نحوی که با سایر تیمارها اختلاف معنی‌داری داشت (شکل 3).

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای پراکسید هیدروژن: بیشترین میزان پراکسید هیدروژن در مقایسه با سایر تیمارها، تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر با 9285/18 میکرومول بر گرم وزن تر است که 3/5 برابر کمترین میزان، مربوط به تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 50 میکرومولار فسفر است (شکل 4). محتوای پراکسید هیدروژن بخش هوایی تحت اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک، دارای روند افزایشی در تیمارهای 50، 200، 800 و 1200 میکرومولار است، به نحوی که در تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر، محتوای پراکسید هیدروژن 82/4 برابر تیمار
0 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر است. اما با افزایش سطوح فسفر، این روند افزایشی کاهش یافته به طوری که کاهش میزان پراکسید هیدروژن در تیمارهای 50، 200، 800 و 1600 میکرومولار محسوس است.

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای کاروتنوئید: با توجه به شکل 5، به موازات افزایش غلظت آرسنیک به ویژه در تیمارهای بالاتر از 50 میکرومولار محتوای کاروتنوئیدروندی افزایشی پیدا کرده، اما با افزایش سطوح فسفر، این روند افزایشی به طور نسبی رو به کاهش رفته است به طوری که کاهش نسبی محتوای کاروتنوئید در تیمارهای 50، 200، 800 و 1600 میکرومولار (به جز در تیمار 50 میکرومولار آرسنیک، 50 میکرومولار فسفر، 200 میکرومولار آرسنیک، 200 میکرومولار فسفر و 800 میکرومولار آرسنیک، 1600 میکرومولار فسفر) مشهود است. بیشترین میزان کاروتنوئید در مقایسه با سایر تیمارها، مربوط به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر است که 66/1 برابر کمترین میزان، متعلق به تیمار 200 میکرومولار آرسنیک و 1600 میکرومولار فسفر است.

تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای فلاونوئید: همان طور که در شکل 6 ملاحظه می‌شود، بیشترین محتوای فلاونوئید در بخش هوایی مربوط به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر با میزان 014/4 درصد و کمترین آن متعلق به تیمار 0 میکرومولار آرسنیک، 1600 میکرومولار فسفر با میزان 97/1 درصد است. محتوای فلاونوئید در اکثر تیمارها به موازات افزایش غلظت آرسنیک، افزایش یافته و به دنبال آن با افزایش سطوح فسفر در هر کدام از تیمارها ( به جز تیمارهای 200 میکرومولار آرسنیک، 800 میکرومولار فسفر و 800 میکرومولار آرسنیک، 800 میکرومولار فسفر)، روند کاهشی پیدا کرده است، به نحوی که افزایش غلظت فسفر در محیط تا حدودی توانسته محتوای فلاونوئید گیاه را در غلظت‌های پایین آرسنیک (کمتر از 1200 میکرومولار) کاهش دهد.

.تأثیر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای آنتوسیانین: در تیمارهای اعمال شده، محتوای آنتوسیانینبین حداقل 98/3 (میانگین تیمارهای 0 میکرومولار آرسنیک، 5 و 200 میکرومولار فسفر) و حداکثر 03/13 میکروگرم برگرم وزن تر (تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک و 5 میکرومولار فسفر) متغیر بوده است. بیشترین محتوای آنتوسیانین در تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر مشاهده گردید، به طوری که محتوای آن تقریباً 27/3 برابر کمترین میزان، مربوط به میانگین تیمارهای 0 میکرومولار آرسنیک، 5 و 200 میکرومولار فسفر است. محتوای آنتوسیانین در تمام تیمارها با افزایش غلظت آرسنیک در محیط، افزایش یافته و به دنبال آن با افزایش سطوح فسفر در هر تیمار، روند کاهشی پیدا کرده است، به نحوی که افزایش غلظت فسفر در محیط توانسته محتوای آنتوسیانین گیاه را در اغلب غلظت‌های آرسنیک کاهش دهد. این نکته جالب توجه است که این روند کاهشی در تیمارهای بالای آرسنیک با سرعت بیشتری صورت گرفته است. برای مثال، می‌توان به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 800 میکرومولار فسفر اشاره کرد که محتوای آنتوسیانین در آن نسبت به تیمار 1200 میکرومولار آرسنیک، 5 میکرومولار فسفر 15/2 برابر کاهش پیدا کرده است. همچنین، حضور آرسنیک در محیط حتی در سطح 50 میکرومولار، باعث افزایش 84/2 برابری محتوای آنتوسیانین نسبت به میانگین تیمارهای 0 میکرومولار آرسنیک گردید (شکل 7).

 

 

 

شکل 1- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان وزن خشک گیاه I. cappadocica، حروف مشابه در هر ستون بیانگر معنی‌دار نبودن اثر تیمارها بر میانگین وزن خشک بخش هوایی، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

 

 

شکل 2- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان انباشت آرسنیک گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین انباشت آرسنیک در بخش هوایی گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

 

 

شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر میزان تجمع فسفر گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین انباشت آرسنیک در بخش هوایی گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

 

 

شکل 4- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای پراکسید هیدروژن (H2O2)گیاه I. cappadocica. حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای پراکسید هیدروژن، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار، ± SE است.

 

 

شکل 5- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای کاروتنوئید گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای کاروتنوئید گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار، ± SE است.

 

 

شکل 6- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای فلاونوئید گیاه I. cappadocica.، حروف مشابه در هر ستون بیانگر معنی‌دار نبودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای فلاونوئید گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.

 

 

شکل 7- اثر غلظت‌های مختلف آرسنیک و فسفر بر محتوای آنتوسیانین گیاه I. cappadocica.، حروف متفاوت در هر ستون بیانگر معنی‌دار بودن اثر تیمارها بر میانگین محتوای آنتوسیانین گیاه، با استفاده از آزمون دانکن است. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است.


 

بحث

شکل‌های قابل استفاده گیاهی آرسنیک (آرسنات و آرسنیت) می‌توانند در محلول خاک توسط گیاهان جذب شوند و به بخش هوایی، میوه‌ها و بذرهای گیاهان از طریق آبیاری با آب‌های آلوده، راه یابند (Kim et al., 2009). مطالعات مختلف نشان داده است که حضور فسفات در مراحل رشد گیاه، آثار زیادی بر جذب و تجمع آرسنیک دارد (Tu and Ma, 2003). برخلاف آرسنیک، فسفر جزو عناصر ضروری مورد نیاز گیاه به شمار می‌آید. آرسنات (5+) به عنوان آنالوگ فسفات توسط سیستم انتقال دهنده فسفات در گیاه، جذب می‌شود (Macnair et al., 1992) و فسفات به عنوان مهار کننده رقابتی مؤثری برای جذب آرسنات به شمار می‌رود. بنابراین، چگونگی توزیع آرسنیک و فسفر در گیاه می‌تواند به عنوان یک سرنخ برای فهم بیشتر مکانیسم بیش انباشت آرسنیک در گیاه I. cappadocica باشد. به دلیل جذب آرسنیک توسط سیستم با تمایل بالای فسفر و اشباع شدن سیستم در غلظت‌های کم فسفر، سطوح بالای آرسنیک در محیط می‌تواند باعث کاهش میزان جذب فسفر توسط گیاه شده و احتمالاً در غلظت‌های بسیار سمّی (بالاتر از 1200 میکرومولار) و افزایش شدت تنش اکسیداتیو و به دنبال آن تخریب ساختار غشای سلول موجب از کار افتادن این ناقل غشایی می‌گردد. تاکنون در تمام گونه‌های گیاهی مطالعه شده، نشان داده شده است که جذب آرسنات از طریق سیستم‌های انتقال دهنده فسفات صورت می‌گیرد (Meharg and Hartley-Whitaker, 2002). در مطالعه حاضر مشخص شد که گیاه بیش انباشتگر I. cappadocica از این قاعده مستثنی نیست. نتایج تحقیق حاضر با نتایج حاصل از مطالعه Ma و همکاران (2006) مطابقت دارد.

گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از حضور آرسنیک در محیط از مکانسیم‌های دفاعی استفاده می‌کنند. مکانسیم‌های دفاعی، اغلب از همکاری آنزیم‌ها و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند فلاونوئید (Sakihama et al., 2002)، کاروتنوئید (Müller et al., 2006) و غیره تشکیل شده‌اند. ترکیبات آنتی‌اکسیدان در حفظ تعادل سلول‌های گیاهی نقش بسیار مهمی را ایفا می‌کنند (Vaidyanathan et al., 2003). زیرا این متابولیت‌ها توانایی واکنش مستقیم با انواع ROS و جمع‌آوری آنها را دارند (Israr and Sahi, 2006)، به طوری که کاهش فعالیت برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نظیر سوپر اکسید دیسموتاز با افزایش میزان آنها جبران می‌گردد (Esfandiari et al., 2008). به علاوه، آنتی‌اکسیدان‌ها به عنوان کوآنزیم آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان عمل می‌کنند (Guo et al, 2005). برخی از پژوهشگران افزایش میزان آنتی‌اکسیدان‌ها را عامل اصلی مقاومت گیاهان به تنش‌های محیطی می‌دانند Herbinger et al., 2002)؛ Esfandiari et al., 2008). با توجه به این که امروزه نقش دفاعی متابولیت‌های ثانویه تقریباً پذیرفته شده است، اما هنوز بررسی سازوکار تأثیر تنش‌های محیطی بر تولید این مواد، تصویر پیچیده و پُر ابهامی پیش روی ما می‌گذارد. شواهد زیادی نشان می‌دهند که در شرایط تنش تولید برخی از این ترکیبات تا چندین برابر افزایش می‌یابد (Koc et al., 2010). در پژوهش حاضر، افزایش میزان برخی از آنتی‌اکسیدان‌های غیر آنزیمی (کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین) بر اثر افزایش تنش آرسنیک مشاهده گردید که این امر ارتباط مستقیمی با ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاه
I. cappadocica دارد.

به دلیل ویژگی‌های بیش انباشتگری گیاه
I. cappadocica، تغییرات محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی بخش هوایی در این گیاه، تحت تیمارهای مختلف آرسنیک و فسفر مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دهنده افزایش میزان آرسنیک انباشته شده در بخش هوایی به موازات افزایش سطوح آرسنیک در محیط است. در گیاهان مقاوم به آرسنیک علیرغم محتوای بالای آرسنیک در بخش هوایی، عوارض آشکاری از سمّیت فلز در گیاه مشاهده نمی‌شود که احتمالاً به دلیل وجود مکانیسم‌های مقاومتی از جمله افزایش محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدان است. همان طور که انتظار می‌رفت، گیاه بیش انباشتگر آرسنیک I. cappadocica، در جذب آرسنیک بسیار کارآمد بود و بیش از 700 میلی‌گرم بر کیلوگرم آرسنیک (بر پایه وزن خشک) را در بخش هوایی خود انباشت کرد، که این امر نشان دهنده مقاومت بالای این گیاه نسبت به آرسنیک و وجود مکانیسم‌های کارآمد در آن به منظور سمّیت‌زدایی آرسنیک است.

به موازات افزایش غلظت آرسنیک در محیط، به ویژه در تیمارهای بالاتر از50 میکرومولار محتوای کاروتنوئید بخش هوایی گیاه I. cappadocica،روندی افزایشی پیدا کرد. هنگامی که گیاه در معرض تنش اکسیداتیو قرار می‌گیرد، انواع گونه‌های فعال اکسیژن تولید می‌شوند. در بسیاری از گیاهان سیستم‌های آنزیمی برای از بین بردن رادیکال‌ها فعال می‌شوند (Jubany- Marí et al., 2010). اما اغلب ترکیبات آنتی‌اکسیدانی پیش از آن که سیستم‌های آنزیمی وارد عمل شوند، عمل پاک‌سازی را در گیاه انجام می‌دهند. کاروتنوئیدها می‌توانند از تنش‌های اکسیداتیو جلوگیری کنند، بدین معنا که توان پاک‌سازی انواع گونه‌های فعال اکسیژن را دارند (Esfandiari et al., 2008). نقش کاروتنوئیدها به عنوان آنتی‌اکسیدان در تنش‌های اکسیداتیو مورد توجه قرار گرفته است (Zhang and Kirkham, 1996). کاروتنوئید با انرژی برانگیختگی بالا در جریان فتوسنتز از کلروفیل تولید می‌شود و رادیکال‌های آزاد را جاروب می‌کند (Arora et al., 2002). همچنین، از طریق فروکش کردن سریع وضعیت برانگیخته کلروفیل، عمل حفاظت نوری را انجام می‌دهند. گیاهI. cappadocicaاز محتوای نسبی بالای کاروتنوئید در همه تیمارها برخوردار بود. بالا بودن محتوای کاروتنوئید گیاه، نشان دهنده این مطلب است که پیش از آن که آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی فعال شوند، این ترکیب می‌تواند از طریق پاک‌سازی انواع رادیکال‌های آزاد از تنش اکسیداتیو جلوگیری کند. همچنین به دلیل نقش محافظتی کاروتنوئید از فتوسیستم گیاه و عمل حافظت نوری در شدت تنش اکسیداتیو، میزان آن با افزایش سطوح آرسنیک در محلول غذایی افزایش یافت. یافته‌های حاصل از پژوهش حاضر با نتایج حاصل از تحقیق Ma و همکاران (2006) روی Pteris ensiformis تحت تنش آرسنیک، همخوانی دارد.

در مطالعه حاضر، محتوای فلاونوئید در اغلب تیمارها به موازات افزایش غلظت آرسنیک در محلول غذایی افزایش یافت. فلاونوئیدها به دلیل نقش آنتی‌اکسیدانی خود به طور مستقیم با وارد شدن در واکنش‌های احیایی یا به طور غیر مستقیم به وسیله کلاته کردن آهن، مانع تنش اکسیداتیو می‌شوند و مانند بسیاری دیگر از پلی فنل‌ها جاروب کننده رادیکال‌های آزاد هستند، زیرا به عنوان گروه‌های قوی الکترون‌دهنده و پروتون‌دهنده عمل می‌کنند (Seyoum et al., 2006). فلاونوئیدها با شناسایی تعداد و موقعیت گروه های OH فنلی حاضر، کار پاک‌سازی رادیکالی را انجام می‌دهند Chen et al., 2002)؛ Amic et al., 2003). همچنین خواص آنتی‌اکسیدانی فلاونوئیدها به اثر بازدارندگی آنها در تنفس میتوکندریایی مربوط می‌شود (Sangtarash et al., 2009). نتایج این تحقیق بیانگر آن است که فلاونوئیدها توانایی پاک‌سازی گونه‌های اکسیژن فعال را در گیاه I.cappadocica تحت تنش آرسنیک را دارند. تجمع ترکیبات فلاونوئیدی در گیاهان مختلفی که تحت تأثیر انواع تنش‌ها بوده‌اند، گزارش شده است (Pourcel et al., 2006). بررسی میزان فلاونوئید Brassica napus در شرایط تنش آبی نشان داد که این ترکیب به عنوان متابولیت ثانویه در گیاه افزایش می‌یابد (Sangtarash et al., 2009). همچنین محققان نتایج مشابهی را نیز بر روی گیاه Stellaria longipes به دست آوردند و نشان دادند که محتوای فلاونوئید به عنوان یک ماده آنتی‌اکسیدان در تنش اکسیداتیو وارد عمل شده و میزان آن افزایش می‌یابد (Seyoum et al., 2006)، این نتایج در توافق با نتایج حاصل از تحقیق حاضر بود.

در پژوهش حاضر، محتوای آنتوسیانین در تمام تیمارها با افزایش غلظت آرسنیک در محیط، افزایش یافت. آنتوسیانین‌ها نیز مشابه فلاونوئیدها، رنگیزه محافظ بوده و گیاه را در برابر تنش محافظت می‌کنند (Chalker-Scott, 2002). گزارش شده است که مقدار آنتوسیانین در گیاه Begonia semperflorens تحت شرایط تنش افزایش یافته است. این افزایش به علت نقش حفاظت نوری آنتوسیانین به وسیله حذف مستقیم ROS در طول تنش اکسیداتیو است (Zhang et al., 2010). آنتوسیانین نیز به عنوان گیرنده رادیکال‌های آزاد عمل می‌کند و گیاه را در برابر تنش‌های اکسیداتیو محافظت می‌کند (Sairam et al., 1998). علت افزایش محتوای آنتوسیانین در مورد فلزات سنگینی نظیر نیکل به عملکرد هورمون اتیلن نسبت داده شده است (Qinghua and Zhujun, 2008). احتمال داده می‌شود که اتیلن با اثر بر آنزیم‌های مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین‌ها و فلاونوئیدها از جمله فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) ، باعث تجمع آنتوسیانین در گیاه می‌گردد (Hyodo and Yang, 1997). آنزیم PAL یکی از آنزیم‌های مهم در مسیر فنیل پروپانوئید و سنتز ترکیبات فنلی است که در پاسخ به برخی تنش‌ها القا شده، می‌تواند به عنوان آنزیم آنتی‌اکسیدان در نظر گرفته شود، زیرا دارای خاصیت به دام‌اندازی رادیکال‌های آزاد اکسیژن از طریق ترکیبات فنلی (فلاونوئید و آنتوسیانین) تولید شده، است (Tian and Li, 2007). در تحقیق حاضر، محتوای آنتوسیانین گیاه
I. cappadocica به شدت تحت تأثیر تنش آرسنیک در سطوح پایین فسفر، افزایش یافت و از این حیث بین تیمارها اختلاف معنی‌داری مشاهده گردید. این الگو برخلاف سایر آنتی‌اکسیدان‌ها (کاروتنوئید و فلاونوئید) بود. به نظر می‌رسد آرسنیک با افزایش هورمون اتیلن و متعاقب آن افزایش فعالیت آنزیم PAL در مسیر فنیل پروپانوئید، باعث تجمع آنتوسیانین شده است. از سوی دیگر، آنتوسیانین با کلاته کردن آرسنیک در داخل واکوئل، موجب کاهش سطح آرسنیک در سیتوزول شده و اثر سمّیت و تخریب حاصل از آن را کاهش می‌دهد. نتایج مطالعات Venkatesan و همکاران (2007) نیز افزایش محتوای آنتوسیانین را در گیاه چای، تحت تنش منگنز نشان می‌دهد که با یافته‌های پژوهش حاضر همخوانی دارد.

 

نتیجه‌گیری کلی

با توجه به نتایج حاصل از مطالعه حاضر، به دنبال افزایش سطوح آرسنیک در محیط، محتوای اغلب ترکیبات آنتی‌اکسیدانی نظیر کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین افزایش می‌یابد. این افزایش در غلظت‌های بالایی آرسنیک به همراه سطوح پایین فسفر کاملاً مشهود است. این ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در حفظ تعادل سلول‌های گیاه نقش بسیار مهمی را از طریق واکنش مستقیم با انواع اکسیژن فعال و کاهش شدت تنش اکسیداتیو ایفا می‌کنند، به طوری که کاهش احتمالی میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در شدت تنش اکسیداتیو ناشی از حضور آرسنیک، می‌تواند با افزایش میزان آنها جبران گردد. در پژوهش حاضر مشخص گردید که محتوای بالای برخی از آنتی‌اکسیدان‌های غیر آنزیمی (کاروتنوئید، فلاونوئید و آنتوسیانین) بر اثر افزایش تنش اکسیداتیو ناشی از حضور آرسنیک ارتباط مستقیمی با ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاه I. cappadocica دارد. ظرفیت بالا و کارآمد سیستم آنتی‌اکسیدانی یا افزایش سطوح آنتی‌اکسیدان‌ها می‌تواند باعث جلوگیری از آسیب‌های اکسیداتیو و بهبود تحمل گیاه به تنش اکسیداتیو گردد.

 

سپاسگزاری

نگارندگان از بخش تحصیلات تکمیلی دانشگاه رازی کرمانشاه سپاسگزاری می‌نمایند.

 

 

 

Amic, D., Davidovic-Amic, D., Beslo, D. and Trinajstic, N. (2003) Structure radical scavenging activity relationships of flavonoids. Croatica Chemica Acta 76(1): 55-61.

André, C. M., Schafleitner, R., Legay, S., Lefèvre, I., Aliaga, C. A. A., Nomberto, G., Hoffmann, L., Hausman, J. F., Larondelle, Y. and Evers, D. (2009) Gene expression changes related to the production of phenolic compounds in potato tubers grown under drought stress. Phytochemistry 70(9): 1107-1116.

Arora, A., Sairam, R. K. and Srivastava, G. C. (2002) Oxidative stress and antioxidative systems in plants. Current Science 82: 1227-1238.

Chalker-Scott, L. (2002) Do anthocyanins function as osmoregulators in leaf tissues? Advances in Botanical Research 37: 103-106.

Chen, J. W., Zhy, Z. Q., Hu, T. X. and Zhu, D. Y. (2002) Structure-activity relationship of natural flavonoids in hydroxyl radical-scavenging effects. Acta Pharmacologica Sinica 23(7): 667-672.

Dong, J., Wu, F. B. and Zhang, G. P. (2006) Influence of cadmium on antioxidant capacity and four microelement concentrations in tomato seedlings (Lycopersicon esculentum). Chemosphere 64: 1659-1666.

Esfandiari, A., Mahboob, S.A. and Shekari, F. (2008) Damaging effects of reactive oxygen species, plant protection mechanisms and their importance. 10th Iranian Crop Science congress, Seed and plant improvement institute, Karaj (in Persian).

Gunes, A., Pilbeam, D. J. and Inal, A. (2009) Effect of arsenic- phosphorus interaction on arsenic- induced oxidative stress in chickpea plants. Plant Soil 314: 211-220.

Guo, Z., Tan, H., Zhu, Z., Lu., S. and Zhou, B. (2005) Effects of intermediates on ascorbic cacid and oxalate biosynthesis of rice and in relation to its stress resistance. Plant Physiology and Biochemistry 43: 955-962.

Hartley-Whitaker, J., Ainsworth G. and Meharg A. A. (2001) Copper-and arsenate-induced oxidative stress in Holcus lanatusL. clones with differential sensitivity. Plant, Cell and Environment 24: 713-722.

Herbinger, K., Tausz M., Wonisch A., Soja G., Sorger A. and Grill, D. (2002) Complex interactive effects of drought and ozone stress on the antioxidant defense systems of two wheat cultivars. Plant Physiology and Biochemistry 40: 691-696.

Hosseini, Z. and Pourakbar, L. (2013) Investigation of interaction between zinc and organic acid (malic acid, citric acid) on antioxidant responses in Zea mays L.. Iranian Journal of Plant Biology 16: 1-12 (in Persian).

Hyodo, H. and Yang, S. f. (1997) Ethylene enhance synthesis of phenylalanine ammonialyase in pea seedlings. Plant Physiology 47: 765-770.

Inze, D. and Montagu, M. V. (2000) Oxidative stress in plant. Trecerus Industrial Estate, Pad stow, Cornawall.

Israr, M. and Sahi S. V. (2006) Antioxidative responses to mercury in the cell cultures of Sesbania drummondii. Plant Physiology and Biochemistry 44: 590-595.

Jubany-Marí, T., Munné-Bosch, S. and Alegre, L. (2010) Redox regulation of water stress responses in field-grown plants, role of hydrogen peroxide and ascorbate. Plant Physiology and Biochemistry 48(5): 351-358.

Karimi, N., Ghaderian, S. M., Marofi, H. and Schat, H. (2010) Analysis of arsenic in soil and vegetation of a contaminated area in Zarshuran, Iran, identifies two angiosperm arsenic hyperaccumulators. International Journal of Phytoremediation 12: 159-173.

Karimi, N., Ghaderian, S. M., Raab, A., Feldmann, J. and Meharg, A. A. (2009) An arsenic-accumulating, hypertolerant brassica, Isatis cappadocica. New Phytologist 184: 41-47.

Kim, K. W., Bang, S., Zhu, Y., Meharg, A. A. and Bhattacharya, P. (2009) Arsenic geochemistry, transport mechanisms in the soil-plant system, human and animal health issues. Environment International 35(3): 453-454.

Koc, E., İslek, C. and Üstun, A. S. (2010) Effect of cold on protein, proline, phenolic compounds and chlorophyll content of two pepper (Capsicum annuum L.) varieties. Gazi University Journal of Science 23: 1-6.

Lihong, W. and Guilan, D. (2009) Effect of external and internal phosphate status on arsenic toxicity and accumulation in rice seedlings. Journal of Environmental Sciences 21: 349-351.

Ma, Q. L., Singh, N., Srivastava, M. and Rathinasabapathi, B. (2006) Metabolic adaptations to arsenic-induced oxidative stress in Pteris vittata L. and Pteris ensiformis L.. Plant Science 170: 274-282.

Macnair, M. R., Cumbes, Q. J. and Meharg, A. A. (1992) The genetics of arsenate tolerance in Yorkshire fog, Holcus lanatus L.. Heredity 69: 325-335

Meharg, A. A. and Hartley-Whitaker, J. (2002) Arsenic uptake and metabolism in arsenic resistant and nonresistant plant species. New Phytolologist 154: 29-43.

Meharg, A. A. and Jardine L. (2003) Arsenite transport into paddy rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist 157: 39-44.

Mithofer, A., Schulze B. and Boland, W. (2004) Biotic and heavy metal stress response in plants: evidence for common signals. FEBS Letters 566: 1-5.

Mittler, R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science 7(2): 405-410.

Müller, M., Hernandez, I., Alegre, L. and Munne-Bosch, S. (2006) Enhanced α-tocopherol quinine levels and xanthophyll cycle de-epoxidation in rosemary plants exposed to water deficit during a Mediterranean winter. Plant Physiology 163: 601-606.

Nogués, S. and Baker, N. (2000) Effects of drought on photosynthesis in Mediterranean plants growing under enhanced UV-B radiation. Experimental Botany 51: 1309-1317.

Pourcel, L., Routaboul, J. M., Cheynier, V., Lepiniec, L. and Debeaujon, I. (2006) Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions (Review). Trends in Plant Science 12(1): 29-36.

Qadir, S., Qureshi, M. I., Javed, S. and Abdin, M. Z. (2004) Genotypic variation in phytoremediation potential of Brassica juncea cultivars exposed to Cd stress. Plant Science 167: 1171-1181.

Qinghua, S. H. and Zhujun, Z. (2008) Effectof exogenous salicylic acid on manganese toxicity, element contents and antioxidative system in cucumber. Environmental and Experimental Botany 63: 317-326.

Sairam, R. K., Deshmukh, P. S. and Saxena, D. C. (1998) Role of antioxidant systems in wheat genotype tolerance to water stress. Biologia Plantarum 41(3): 387-394.

Sakihama, Y., Cohen M. F., Grace, S. C. and Yamasaki, H. (2002) Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals. Toxicology 177: 67-80.

Sangtarash, M. H., Qaderi, M. M., Chinnappa, C. C. and Reid, D. M. (2009) Carotenoid differential sensitivity of canola (Brassica napus) seedlings to ultraviolet-B radiation, water stress and abscisic acid. Environmental and Experimental Botany 66(2): 212-219.

Sergiev, I., Alexieva, V. and Karanov, E. (1997) Effect of spermine, atrazine and combination between them on some endogenous protective systems and stress markers in plants. Comptes Rendus de L'Academie Bulgare des Sciences 51: 121-124.

Seyoum, A., Asres, K. and El-Fiky, F. K. (2006) Structure radical scavenging activity relationships of flavonoid. Phytochemistry 67(18): 2058-2070.

Srivastava, S., Tripathi, R. D. and Dwivedi, U. N. (2004) Synthesis of phytochelatins and modulation of antioxidants in response to cadmium stress in Cuscuta reflexa an angiospermic parasite. Plant Physiolology 161: 665-674.

Tian, X. and Li, Y. (2007) Nitric oxide treatment alleviates drought stress in wheat seedlings. Biologia Plantarum 50: 775-778.

Tu, C. and Ma, L. Q. (2003) Effects of arsenate and phosphate on their accumulation by an arsenic-hyperaccumulator Pteris vittata L.. Plant and Soil 249: 373-382.

Vaidyanathan, H., Sivakumar, P., Chakrabarsty, R. and Thomas, G. (2003) Scavenging of reactive oxygen species in NaCl-stressed rice (Oryza sativa L.) - differential response in salt-tolerant and sensitive varieties. Plant Science 165: 1411-1418.

Venkatesan, S., Hemalatha, K. V. and Jayaganesh, S. (2007) Characterization of manganese toxicity and its influence on nutrient uptake antioxidant enzymes and biochemical parameters in tea. Phytochemistry 1(2): 52-60.

Zhang, J and Kirkham M. B. (1996) Antioxidation responses to drought in sunflower and sorghum seedling. New Phytologist 132: 361-373.

Zhang, K. M., Yu, H. J., Shi, K., Zhou, Y. H., Yu, J. Q. and Xia, X. J. (2010) Photoprotective roles of anthocyanins in Begonia semperflorens. Plant Science 179(3): 202-208.

Zhao, F.J., Ma, J. F., Meharg, A. A. and McGrath, S. P. (2009) Arsenic uptake and metabolism in p