تأثیر متیل ژاسمونات بر میزان استویوزید و ربادیوزید A و بیان ژن کائورنوئیک اسید 13-هیدروکسیلاز در گیاه استویا در شیشه

نویسندگان

1 گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

2 گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

گلیکوزیدها شکلی از متابولیت‌های ثانویه هستند که دارای تنوع ساختاری وسیعی هستند و در مواردی، در متابولیسم اولیه گیاهان نیز نقش دارند. گلیکوزیدهای استویول که تنها در گیاه استویا تولید می‌شود، به عنوان شیرین‌کننده طبیعی در صنایع غذایی و دارویی اهمیت ویژه‌ای دارند. سنتز استویول از مسیر ترپنوئیدی کلروپلاستی آغاز شده و با تولید آن از کائورنوئیک اسید توسط کائورنوئیک اسید 13-هیدروکسیلاز به سنتز گلیکوزیدهایی همچون استویوزید و ربادیوزید A منجر می‌شود که گروهی از دی ترپن‌ها به حساب می‌آیند. هدف از انجام پژوهش حاضر، بررسی تأثیر متیل ژاسمونات بر میزان گلیکوزیدهای استویا بود که با دستگاه HPLC به سنجش دقیق گلیکوزیدها پرداخته شد. بیان ژن کلیدی این مسیر با روش نیمه‌کمّی RT-PCR صورت گرفت. نتایج تیمار متیل ژاسمونات (در غلظت 20 میکرومولار) بر گیاهچه‌های درون شیشه نشان دهنده افزایش گلیکوزیدها بود و بیشترین میزان این ترکیبات 3 روز پس از تیمار مشاهده شد. تیمار در غلظت‌های بالا (100 میکرومولار) بر رشد و تولید گلیکوزیدها در گیاه استویا تأثیر منفی داشت. همچنین، تیمار متیل ژاسمونات سبب افزایش بیان ژن کائورنوئیک اسید 13-هیدروکسیلاز پس از 6 تا 48 ساعت نیز شد. از آنجا که ژاسمونات‌ها در ایمنی گیاه نقش کلیدی دارند، نتایج نشان می‌دهد که عملکرد این گلیکوزیدها می‌تواند در پاسخ‌های دفاعی به پاتوژن‌های خارجی یا آسیب‌های فیزیکی باشد. همچنین، غلظت‌های مختلف متیل ژاسمونات بیش از آن که سبب افزایش یک نوع گلیکوزید شود باعث تغییر نسبت بین دو گلیکوزید مذکور می‌شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effects of methyl jasmonate, on stevioside and rebaudioside A content and expression of the ent-Kaurenoic acid 13-hydroxylase gene in Stevia rebaudiana Bert. in vitro

نویسندگان [English]

  • Kamran Moradi Peynevandi 1
  • Mozaffar Sharifi 1
  • Mehrdad Behmanesh 2
1 Department of Plant Biology, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
2 Department of Genetics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Glycosides are a form of secondary metabolites that consist variety compounds and in some cases can play a role in primary metabolism. Steviol is lipophilic skeleton of Stevioside and Rebaudioside A, two main glycosides of Stevia rebuadiana. Steviol glycosides which are synthesized in S.rebaudiana have important medical and nutritional values as high intensity natural sweeteners. Steviol is synthesized from Kaurenoic acid in chloroplastic Terpenoid pathway that mediated by Kaurenoic acid 13-hydroxylase. In this study, HPLC method and RT-PCR were performed for quantification of glycosides and gene expression (ent-Kaurenoic acid 13-hydroxylase) respectively. Methyl jasmonate treatment (at 20 micromolar) in vitro induced glycoside biosynthesis significantly (P≤0.05) whereas higher concentration of Methyl jasmonate (100 µM) caused a decrease in glycoside production and growth. The most glycoside content of the plant was three days after treatment. Also Methyl jasmonate treatment caused an increase in ent-Kaurenoic 13-hydroxylase gene expression from 6 hours to 48 hours (after treatment) Results showed that biosynthesis of Stevia glycosides was probably a defense mechanism against pathogens and herbivore insects. Also we found that different concentrations of Methyl jasmonate, alter the ratio between glycosides rather than the increase in glycoside contents.

کلیدواژه‌ها [English]

  • ent-Kaurenoic acid 13-Hydroxylase
  • Stevia rebuadiana
  • Stevioside
  • Rebaudioside A
  • ent
  • Kaurenoic acid 13
  • Hydroxylase
  • methyl jasmonate

استویا (Stevia rebaudiana Bert.) گیاهی از تیره مرکبان (Asteraceae) و از قبیله Eupatorieae است که بومی جنگل‌های پاراگوئه، مکزیک و برزیل است. گیاه استویا به عنوان یک شیرین‌کننده خوراکی طبیعی از لحاظ دارویی و اقتصادی مطرح است. گلیکوزیدهای استویا، استویوزید و ربادیوزید A،350 تا 400 برابر (از لحاظ وزنی) شیرین‌تر از سوکروز هستند. برای مثال، 5/2 گرم از این شیرین‌کننده‌ها معادل یک کیلوگرم شکر توانایی شیرین کردن مایعات را دارد. ربادیوزید A با یک گلوکوز بیشتر از استویوزید ساخته می‌شود. با توجه به بروز روزافزون بیماری‌هایی چون دیابت، چاقی، سکته‌های قلبی و مغزی این گیاه می‌تواند جایگزین بسیار مناسبی برای تغذیه نامطلوب و مشکلات ناشی از مصرف قند باشد (Sardesai and Waldshan, 1991). استفاده اصلی از این گیاه در مواد غذایی و به عنوان شیرین‌کننده و قند رژیمی است. قندهای استویابه دلیل این که طبیعی هستند، همانند سایر شیرین‌کننده‌های مصنوعی (مانند سوربیتول،آسپارتام، نئوتام، ساخارین و غیره) عوارض جانبی ندارند. به دلیل تولید بالای این مواد بسیار شیرین در گیاه، استخراج گلیکوزیدهای استویوزید و ربادیوزید A مقرون به صرفه است و بازده بالایی خواهد داشت (Lemus-Mondaca et al., 2012).

بر اساس شواهد به دست آمده تاکنون ثابت شده است که بیوسنتز گلیکوزیدهای استویا از پلاستید شروع شده و در سیتوزول به اتمام می‌رسد. اسکلت اصلی که گلوکز روی آن متصل می‌شود، مولکول استویول است که شبیه اسکلت انت-کائورن برای سنتز جیبرلین است. بنابراین، ساخت اسکلت اصلی از مسیر ترپنوئیدها صورت می‌پذیرد و یک دی ترپن است. مسیر بیوسنتز گلیکوزیدهای شیرین در این گیاه با مسیر سنتز جیبرلین‌ها تا تشکیل کائورنوئیک اسید مشترک است. دو آنزیم، سرنوشت کائورنوئیک اسید را به سوی سنتز جیبرلین‌ها یا به سوی تولید گلیکوزید‌های شیرین تعیین می‌کنند. کائورنوئیک اسید اکسیداز (KAO) با هیدروکسیله کردن در موقعیت کربن 7، اسکلت کائورنی را به سمت مسیر بیوسنتزی جیبرلین‌ها و کائورنوئیک اسید 13-هیدروکسیلاز با هیدروکسیله کردن در موقعیت 13، اسکلت کائورنی را به سمت تولید استویول هدایت می‌کند. ساخت اسکلت کائورن در کلروپلاست و هیدروکسیله شدن آن توسط آنزیم مستقر بر روی شبکه آندوپلاسمی زبر صورت می‌گیرد. گلیکوزیل ترانسفرازهایی که در سیتوزول مستقر هستند چند قند به استویول اضافه می‌کنند و این گلیکوزیدها توسط ناقل‌های غشای واکوئل وارد آن می‌شوند (Richman et al., 1999).

به غیر از این ناقل‌ها که هنوز شناسایی نشده‌اند، علت ساخت و نقش گلیکوزیدهای استویا با پرسش‌های فراوانی روبرو است. گلیکوزیدها ترکیباتی غالباً درشت مولکول و دارای گروه‌های مختلف هستند. این ترکیبات همگی دارای یک یا چند قند روی یک اسکلت مرکزی هستند. این اسکلت مرکزی یک مولکول چربی دوست (لیپوفیل) است که روی گروه‌های -SH، -NH2، -COOH، -OH و C-C آن، قند مونوساکارید قرار می‌گیرد. به دلیل پوشیده شدن این اسکلت توسط قند، گلیکوزیدها در آب حلالیت بالایی دارند و محل ذخیره آنها در سلول، واکوئل است (Bowles et al., 2006).

از آنجا که علت ساخت چنین مولکول پر هزینه‌ای در گیاه استویا روشن نیست، این احتمال می‌رفت که شاید این ترکیبات نقش دفاعی در گیاه داشته باشند که این فرضیه مبنای پژوهش حاضر است. متیل ژاسمونات (MJ) طیف وسیعی از ژن‌ها را تحت تأثیر قرار می‌دهد. پژوهش‌ها نشان می‌دهد که متیل ژاسمونات سبب افزایش بیان ژن‌های دخیل در بیوسنتز انواع گلیکوزیدها در گیاهان می‌شود. از آنجا که اغلب گلیکوزیدها در پاسخ به انواع گیاه‌خواران نقش دفاعی دارند و از طرفی آسیب دیدگی‌های غشای سلول سبب تولید ژاسمونات‌ها می‌شود علت این افزایش بیان در ژن‌های گلیکوزیدها قابل توجیه است. در مقالات بسیاری به نقش ژاسمونات‌ها در افزایش گلیکوزیدهای گیاهان اذعان شده است Bodnaryk, 1992, 1994)؛ Doughty et al., 1995؛ Brader et al., 2001؛ Mikkelsen et al., 2003؛ (Grubb et al., 2004. هرچند که میزان تولید گلیکوزیدها در گیاه استویابسیار بالاتر از سایر متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دیگر است، با این وجود پایه‌گذاری یک روش مناسب برای تولید بیشتر مقرون به صرفه است و بهره اقتصادی بالایی خواهد داشت. متیل ژاسمونات می‌تواند تولید بسیاری از متابولیت‌های ثانویه را در گیاه نظیر: آلکالوئیدها (Ruiz-May et al.,2009)، لیگنان‌ها (Berim et al., 2005)، ترپنوئیدها و فلاونوئیدها (Mikkelsen et al., 2003؛ (Shimizu et al., 2010 افزایش دهد. ژاسمونیک اسید یکی از تنظیم‌کننده‌های رشد است که بیشتر در پاسخ به صدمات فیزیکی ناشی از حمله گیاه‌خواران و حشرات به گیاه تولید می‌شود. البته این ترکیب در مراحل مختلف گیاه نقش‌های متعدد دیگری نیز دارد. ژاسمونات‌ها سبب بیان ژن‌هایی می‌شوند که در مقاومت در برابر حمله پاتوژن‌ها و حشرات دخیل هستند. ژاسمونات‌ها سبب افزایش ذخیره پروتئین در بافت‌های رویشی و سبب کاهش پروتئین‌های فتوسنتزی می‌شوند (Creelman and Mullet, 1997).

یک مطالعه قدیمی، تولید گلیکوزید در گیاه استویارا نوعی سازوکار دفاعی می‌داند (Nanayakkara et al., 1987) و با این رویکرد که احتمالاً تحریک استویابا متیل ژاسمونات می‌تواند سبب افزایش بیان ژن‌های دخیل در سنتز گلیکوزیدهای آن شود، این پژوهش به منظور بررسی آثار متیل ژاسمونات بر استویا انجام شد.

 

مواد و روش‌ها

گیاه استویابه منظور انجام آزمایش از باغ ملی گیاه‌شناسی ایران تهیه شد. به منظور تهیه نمونه گیاهی کافی برای انجام آزمایش‌ها ابتدا از یک پایه سالم گیاه تعدادی قلمه که هر یک دارای دو جوانه بودند تهیه شد و به این ترتیب ضدعفونی گردید: پس از شستشوی سطحی با آب شیر به مدت 15 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 20 درصد حجمی قرار گرفت؛ سپس، سه بار با آب استریل شستشو داده شد. بعد به مدت 1 دقیقه در الکل 70 درصد قرار گرفت پس از آن، سه بار با آب استریل شستشو شد و قلمه‌ها در محیط جامد MS (Murashige and skoog, 1962) کشت شدند. انشعابات جدید آنها مجدداً در ظروف کشت مناسب و در شرایط استریل در محیط کشت MS تکثیر شدند تا علاوه بر داشتن گیاهان یکدست از تنوع افراد جلوگیری شود. قلمه‌های استویا در محیط بدون هورمون MS ریشه‌دار شدند. هر دو تا سه هفته یکبار عمل تکثیر از طریق قلمه و ریشه‌دار کردن تکرار گردید.

به منظور تیمار، محیط‌کشت MS مایع که در آن غلظت‌های صفر، 20، 40، 80 و 100 میکرومولار از متیل ژاسمونات (MJ) استفاده شده بود تهیه شد. متیل ژاسمونات از شرکت SAFC™ (آمریکا) خریداری و غلظت‌های مختلف آن از رقیق کردن استوک اصلی تهیه شد. استوک اصلی در غلظت 1 میلی‌مولار در اتانول 70 درصد آماده شد. محیط کشت مایع پس از اتوکلاو در لوله‌های آزمایشی که به همین منظور تهیه شده بود پخش شد. در هر لوله، 2 میلی‌لیتر محیط کشت ریخته شد که به همراه متیل ژاسمونات اضافه شده به غلظت‌های مورد نظر رسانده شد. سر شاخه گیاهان کشت شده در محیط MS جامد (گیاهان یک هفته‌ای) بریده شد و در این لوله‌ها قرار گرفت. برای اطمینان از عدم تأثیر اتانول بر متابولیسم گیاه، در هر دو قسمت فیزیولوژی و مولکولی تحقیق حاضر به نمونه‌های شاهد به اندازه حجم محلول متیل ژاسمونات، اتانول اضافه شد. هر سرشاخه گیاه طوری بریده شد که دارای 6 برگ (3 جفت برگ) و از لحاظ اندازه و طول یکسان باشند.

تمامی گیاهان کشت شده زیر نور با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 25 درجه سانتیگراد و شدت نور 2800 لوکس ( 56 میکرومول بر متر مربع بر ثانیه) قرار داده شدند. پس از سه روز گیاهچه‌ها از شیشه‌ها خارج و وزن تر آنها اندازه‌گیری شد. برای سنجش گلیکوزیدها، نمونه‌ها به مدت 24 ساعت در آون در دمای 50 درجه سانتیگراد خشک و وزن آنها اندازه‌گیری شد (Kolb et al., 2001). در بخش فیزیولوژیک مطالعه حاضر تمامی گروه‌ها با سه تکرار انجام شدند.

در مرحله بعد، برای به دست آوردن این که چند روز پس از تیمار متیل ژاسمونات، بیشترین میزان گلیکوزیدهای استویوزید و ربادیوزید A تولید می‌شود، گیاهان تحت تیمار 20 میکرومولار از MJ قرار گرفتند. علت انتخاب این غلظت، اثربخشی و مناسب بودن آن نسبت به غلظت‌های بالاتر (40، 80 و 100 میکرومولار) بود. زمان‌های در نظر گرفته شده برای برداشت 1، 2، 3، 4 و 5 روز پس از تیمار بود. در هر گروه 3 تکرار وجود داشت. شرایط کشت اندام هوایی و برداشت مشابه شرایط ذکر شده در مرحله اول (تعیین غلظت مناسب بین چهار غلظت) بود.

برای اندازه‌گیری میزان بیان ژن تحت تأثیر تیمار متیل ژاسمونات غلظت 20 میکرومولار انتخاب شد و سرشاخه‌ها با همان ترتیب بالا کشت شدند. برداشت‌های این مرحله به ترتیب در زمان‌های صفر، 6، 12، 24 و 48 ساعت پس از تیمار انجام شد. نمونه‌های گیاهی در هر مرحله در ازت مایع منجمد و به فریزر 80- درجه سانتیگراد مننقل شدند.

استخراج و سنجش گلیکوزیدها: استخراج استویوزید و ربادیوزید A از اندام‌های هوایی گیاهان تیمار شده و شاهد بر اساس روش Kolb و همکاران (2001) انجام شد. ابتدا تمامی اندام هوایی گیاه تیمار شده (خشک) در هاون ساییده شد و با 2 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد مخلوط شد. سپس در حمام آبگرم به مدت 30 دقیقه دردمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس از فیلتر کاغذ صافی برای جداسازی تفاله‌ها استفاده شد. در ادامه برای تغلیظ نمونه‌ها اتانول آنها در هوای آزاد به مدت 24 ساعت تبخیر شد و دوباره در 500 میکرولیتر اتانول حل شدند. این نمونه‌های آماده شده به دستگاه HPLC تزریق شدند.

سنجش استویوزید وربادیوزید A با روش Hearn و Subedi (2009) انجام شد که از دستگاه HPLC (مدل Knauer، آلمان) و از ستون آمین (شرکت Teknokroma®، اسپانیا) با طول 25 سانتی‌متر، قطر 6/4 میلی‌متر و با اندازه ذرات 5 میکرومتر استفاده شد. سرعت جریان حلال 8/0 میلی‌لیتر بر دقیقه و فاز متحرک به صورت ایزوکراتیک، حاوی آب و استونیتریل به ترتیب با نسبت80:20 بود و آشکارساز (detector) دستگاه از نوع UV بود و طول موج دستگاه روی 210 نانومتر تنظیم شد. مقدار عصاره استفاده شده در هر تزریق 40 میکرولیتر بود و میزان دو گلیکوزید استویوزید وربادیوزید A (شرکت Sigma، آلمان) بر اساس سطح زیر منحنی و مقدار استانداردهای تزریق شده به دست آمد. استانداردهای استویوزید و ربادیوزید A در سه غلظت 250/0، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به دستگاه تزریق و منحنی استاندارد آنها رسم شد.

سنجش بیان ژن: استخراج RNA مطابق شیوه پیشنهادی شرکت سازنده RNX Plus [CinnaGen] انجام شد. برای تبدیل RNA به cDNA به دو مخلوط نیاز بود. مخلوط شماره 1 شامل RNA کل استخراج شده از استویا به مقدار7 میکرولیتر، بازدارنده ریبونوکلئاز در غلظت U/µl 40 به مقدار 5/0 میکرولیتر، Oligo dT در غلظت µg/µL  5/0 به اندازه 1 میکرولیتر و آبDEPC ، 5 میکرولیتر بود (در مجموع، 5/13 میکرولیتر). مخلوط شماره 2 شامل بافر PCR (x5) به مقدار 4 میکرولیتر، dNTP در غلظت 5/2 میلی مولار، 1 میکرولیتر، 5/0 میکرولیتر بازدارنده ریبونوکلئاز (همانند مخلوط شماره 1) و 1 میکرولیتر آنزیم رونوشت‌بردار معکوس (reverse transcriptase) در غلظت U/µl200 بود (در مجموع، 5/6 میکرولیتر). پس از مشخص شدن غلظت RNA، یک ویال از مخلوط شماره 1 ساخته و به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا ساختمان ثانویه احتمالی RNA باز شود. سپس مخلوط شماره 1 وارد یخ و مخلوط شماره 2 به آن اضافه شد. در ادامه، برای ساخت cDNA مجموع این دو مخلوط (20 میکرولیتر) به مدت یک ساعت در دمای 42 درجه سانتیگراد قرار گرفت. الگوی cDNA ساخته شده تا انجام مراحل بعدی در فریزر 20- نگهداری شد. واکنش RT-PCR نیز در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام شد. مخلوط واکنش PCR شامل مستر میکس PCR، (x2) ساخت CinnaGen به مقدار 10 میکرولیتر، آغازگر (پرایمر)های بالا و پایین دست [Bioneer] با غلظت 5 پیکومول، (جدول 1)، از هر کدام 8/0 و آب تزریقی عاری از RNase به مقدار 4/7 میکرولیتر و از الگوی cDNA ساخته شده 1 میکرولیتر بود. آغازگرها (پرایمرها) برای ژن کائورنوئیک اسید 13-هیدروکسیلاز (کد دسترسی: EU722415.1) با توجه به اطلاعات ژنومی موجود در NCBI و اکتین (کد دسترسی: AF548026.1) برای گیاه استویا با نرم‌افزارGene Runner طراحی شد. شرایط انجام PCR به این شرح بود: واسرشت‌سازی اولیه 2 دقیقه با 94 درجه، واسرشت‌سازی با 35 سیکل 40 ثانیه در 93 درجه، جفت شدن آغازگرها 45 ثانیه در 58 درجه و طویل شدن 1 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد.

 

 

جدول 1- توالی آغازگرهای استفاده شده ژن اکتین (ACT) و ژن کائورنوئیک اسید 13-هیدروکسیلاز (KA13H)

ژن

توالی

اندازه قطعه تکثیر شده (bp)

ACT

Forward primer : 5' GCA GGG ATC CAC GAG ACC ACC 3'

Reverse primer: 5' CCC ACC ACT GAG CAC AAT GTT CC 3'

520

KA13H

Forward primer: 5' ATA TCG AAG ACG AAA GAA GCA TGG 3'

Reverse primer : 5' TCT CAT CAG GTA TCA ACA GGT CCC 3'

406

 

محصول PCR در ژل 1 درصدآگاروز با اختلاف پتانسیل 80 تا 100 ولت الکتروفورز گردید. در پایان الکتروفورز، باندهای PCR در دستگاه
Gel Documentation بررسی شد. برای ارزیابی کمّی بیان ژن‌ها، از مقایسه شدت چگالی باندها نسبت به شاهد (اکتین) با نرم‌افزار Image Guage نسخه 4 استفاده شد.

تحلیل‌های آماری: از نرم‌افزارهای SPSS نسخه 16 و Excel برای انجام محاسبات آماری استفاده شد. داده‌ها با نرم‌افزار SPSS و با استفاده از آنالیز غیر پارامتری تحلیل شد. برای مشخص کردن معنی‌دار بودن تفاوت‌ها بین گروه‌ها از آزمون Mann-Whitney در سطح 05/0p≤ استفاده شد. آزمون آماری گروه‌های مختلف دو نوع گلیکوزید نیز به طور جداگانه انجام شد.

 

نتایج

.تأثیر غلظت‌های مختلف تیمار متیل ژاسمونات بر میزان گلیکوزیدهای استویا: همان طور که در شکل 1 مشخص است در غلظت 20 میکرومولار MJ بیشترین میزان تولید گلیکوزید ربادیوزید A به دست آمد که نسبت به شاهد به طور معنی‌داری بیشتر بود. اما با افزایش غلظت متیل ژاسمونات مقدار آن به طور معنی‌داری کاهش یافت (05/0p≤). میزان استویوزید در نمونه شاهد بیشتر از نمونه‌های تیمار شده بود و با افزایش غلظت MJ، مقدار آن افزایش یافت و در غلظت80 میکرومولار MJ به بیشترین مقدار، یعنی مشابه شاهد رسید. روند تغییرات مقدار استویوزید و ربادیوزید A در حضور غلظت‌های MJ برعکس یکدیگر بود.

همان طور که در شکل 2 نشان داده شده است، میزان گلیکوزید کل در غلظت‌های مختلف MJ در زمان سنجیده شده اختلاف معنی‌داری با شاهد نداشت (7میلی‌گرم بر گرم وزن خشک). متیل ژاسمونات تنها درصد این دو نوع گلیکوزید را در غلظت‌های مختلف تغییر داد. در پژوهش حاضر نیز آثار منفی ناشی ازغلظت بالای تیمار متیل ژاسمونات (100 میکرومولار) بر رشد و فتوسنتز دیده شد. گیاهان در این غلظت از تیمار زرد رنگ شدند و رشد کمتری داشتند.

.نتایج میزان گلیکوزیدهای استویا در زمان‌های مختلف پس از تیمار متیل ژاسمونات: تغییرات میزان استویوزید و ربادیوزید A در گیاهان شاهد و گیاهان تیمار شده با 20 میکرومولار از MJ در زمان‌های مختلف پس از تیمار در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که در گیاهان شاهد میزان ربادیوزید A در طول زمان تغییرات چندانی نداشته است و بین 10 تا 18 میلی‌گرم در گرم وزن خشک بوده است. در حالی که در حضور MJ تغییرات معنی‌داری در میزان ربادیوزید A در طول زمان حاصل شد و سه روز پس از آغاز تیمار به بالاترین مقدار رسید (شکل 3). میزان استویوزید نیز در گیاهان شاهد در زمان‌های مختلف تفاوت چندانی نداشت اما در گیاهان تیمار شده با متیل ژاسمونات در دو و سه روز پس از آغاز تیمار به بیشترین حد خود رسید که از لحاظ آماری معنی‌دار بود (شکل 4). اختلافی که بین نمونه‌های شاهد وجود دارد ممکن است به علت آسیب‌های فیزیکی غشا باشد که به تولید ژاسمونیک اسید منجر می‌شود. این آسیب‌ها در حین کار با گیاه اجتناب‌ناپذیر است و ناخواسته توسط ابزارهای مانند پنس یا به علت برش‌های ساقه، صورت می‌گیرد. هرچند در حین آزمایش حداکثر تلاش بر این بود که از این آسیب‌ها که در نتایج، تداخل ایجاد می‌کند (غلظت متیل ژاسمونات را غیر واقعی می‌کند) پرهیز شود.



   

شکل 1- تأثیر غلظت‌های مختلف تیمار متیل ژاسمونات بر میزان استویوزید و ربادیوزید A در اندام هوایی پس از 3 روز. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار در میزان استویوزید و ربادیوزید A در هر گروه و در سطح 05/0p≤ است.

شکل 2- مجموع میزان بیوسنتز گلیکوزیدهای استویوزید وربادیوزید A در غلظت‌های مختلف تیمار متیل ژاسمونات پس از 3 روز. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار در میزان استویوزید و ربادیوزید A در هر گروه و در سطح 05/0p≤ است.

 

 

   

شکل 3- میزان قند ربادیوزید A در غلظت 20 میکرومولار متیل ژاسمونات پس از 5 روز. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار در میزان ربادیوزید A در گروه‌ها در سطح 05/0p≤ است.

شکل 4- میزان قند استویوزید در تیمار متیل ژاسمونات در غلظت 20 میکرومولار پس از 5 روز. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار در میزان استویوزید در گروه‌ها در سطح 05/0p≤ است.

 

 

نتایج حاصل از بررسی زمان تولید بیشینه گلیکوزیدها نشان داد که هر دو گلیکوزید 3 روز پس از آغاز تیمار به بیشترین مقدار خود می‌رسند. این افزایش در مورد ربادیوزید A بیشتر از استویوزید بود به طوری که میزان افزایش ربادیوزید A در تیمار MJ حدود 5 برابر شاهد بود. اما MJ سبب افزایش استویوزید در حدود 5/1 تا 2 برابر شاهد شد. میزان گلیکوزیدها در روز چهارم و پنجم پس از تیمار به اندازه روزهای اول و دوم بود (شکل 5).

.تأثیر غلظت 20 میکرومولار متیل ژاسمونات بر .بیان ژن کائورنوئیک اسید 13-هیدروکسیلاز (KA13H): برای بررسی بیان ژن KA13H از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده برای این ژن استفاده شد، همچنین از ژن اکتین (ACT) به عنوان شاهد داخلی برای بررسی مقایسه کمّی بیان KA13H نسبت به این ژن مورد استفاده قرار گرفت. شکل 6 نتایج تکثیر ژن KA13H و اکتین را بر ژل آگاروز 5/1 درصد پس از 35 دور PCR در اندام هوایی استویانشان می‌دهد. تمامی شرایط PCR (دما، تعداد چرخه PCR و شاهد داخلی) از قبل برای این ژن بهینه شده بود. برای هر مرحله از دو تکرار، استخراج RNA انجام شد و از هر RNA، cDNA سنتز شد و برای هر cDNA به منظور استفاده در سنجش RT PCR با استفاده از شاهد داخلی اکتین هم‌غلظت‌سازی انجام گرفت. پس از هم‌غلظت‌سازی، PCR نیمه کمی رونوشت‌بردار معکوس (reverse transcriptase-PCR) انجام شد. تفاوت در شدت رنگ ژل‌ها به علت میزان رنگ‌پذیری آنها با اتیدیوم بروماید است که توسط نرم‌افزار Image Guag با توجه به شدت رنگ زمینه اصلاح شده است.

نتایج اندازه‌گیری کمّی بیان ژن KA13H و اکتین به طور خلاصه در شکل 7 نشان داده شده است. نتایج بیانگر آن است که میزان بیان ژن KA13H 6 ساعت پس از تیمار متیل ژاسمونات، نسبت به شاهد روند افزایشی داشته و تا زمان 48 ساعت بر این روند باقی مانده است.

 

 

   

شکل 5- میزان گلیکوزید کل (گلیکوزیدهای استویوزید و ربادیوزید A) در اثر تیمار متیل ژاسمونات طی 5 روز در غلظت 20 میکرومولار. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار میزان گلیکوزیدها در گروه‌ها در سطح 05/0p≤ است.

شکل 6- تغییرات بیان ژن KA13H در اثر تیمار متیل ژاسمونات در طی 48 ساعت. (A طرح الکتروفورزی محصول PCR ژن KA13H. هر دو باند مربوط به تکرارهای یک گروه بر اساس ساعات نوشته شده است. (B ژن اکتین به عنوان شاهد داخلی. منظور از صفر زمان شروع آزمایش است.

 

 

 

شکل 7- تغییرات مقدار نسبی بیان ژن KA13H در اندام هوایی کشت شده تحت تیمار متیل ژاسمونات نرم‌افزار Image Guag. مقادیر، میانگین 2 تکرار ± SE است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار میزان نسبی بیان ژن در گروه‌ها در سطح 05/0p≤ است.


 

بحث

بر اساس پژوهش حاضر،اثر محرک بودن متیل ژاسمونات، در غلظت مؤثر، برای تولید گلیکوزیدهای استویوزید و ربادیوزید A ثابت شد. در زمان 3 روز پس از تیمار، گلیکوزیدهای استویوزید وربادیوزید A به بیشترین مقدار خود رسیدند و این در حالی بود که این اثر فقط در غلظت‌های پایین تیمار متیل ژاسمونات وجود داشت. در غلظت‌های بالاتر به وضوح آثار مهاری متیل ژاسمونات بر روی رشد و فتوسنتز دیده شد.

هورمون متیل ژاسمونات در غلظت‌های بالاتر اثر ممانعتی بر روی رشد و تولید دارد. نتایج حاصل از بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف متیل ژاسمونات بر میزان تولید تاکسول در گیاه سرخدار نشان داده است که تیمار 10 میکرومولار از متیل ژاسمونات سبب افزایش تاکسول تا بیش از سه برابر می‌شود در حالی که تولید این ماده در گیاهان شاهد ودر تیمارهای 100 میکرومولار کمتر بود. بیشترین تولید تاکسول از سلول‌های سرخدار 7 روز پس از تیمار ذکر شده است (Ketchum et al., 1999).

پژوهش Jung (2004) ثابت کرده است که تیمار متیل ژاسمونات در غلظت 100 میکرومولار پس از دو روز متوالی تیمار سبب کاهش میزان کلروفیل شده است. بر اساس تحقیقات Weidhase و همکاران (1987) خیساندن برگ‌های جو درمحلول آبی 45 میکرومولار متیل ژاسمونات سبب کاهش سطح کلروفیل و آنزیم روبیسکو شد. در پژوهش حاضر نیز در غلظت 100 میکرومولار از لحاظ ریخت‌شناسی، کاهش رشد و زرد شدن گیاه به طور محسوسی مشاهده شد.

با توجه به نتایج مولکولی ثابت شد که ژن KA13H تحت تأثیر متیل ژاسمونات قرار می‌گیرد. افزایش بیان این ژن از 6 ساعت پس از تیمار آغاز شد و در 24 ساعت پس از تیمار دارای بیشترین بیان بود. از سوی دیگر، تولید گلیکوزیدهای استویوزید وربادیوزید A پس از 72 ساعت پس از تیمار به بیشینه مقدار خود در بافت گیاه رسید. به نظر می‌رسد پس از 24 ساعت مدت زمانی لازم است تا عملیات پس از رونویسی صورت گیرد. بنابراین از 24 تا 72 ساعت پس از تیمار احتمالاً مدت زمان لازم برای ساخت محصول ژن KA13H است و این فاصله زمانی بین افزایش بیان ژن و تولید گلیکوزید نیز به چند مرحله‌ای بودن تولید گلیکوزیدهای استویوزید وربادیوزید A مربوط می‌شود. چون این دو گلیکوزید در انتهای مسیر بیوسنتزی گلیکوزیدهای استویا قرار می‌گیرند و انباشتگی آنها پس از افزایش بیان ژن مدت زمانی طول می‌کشد. بنابراین نتیجه حاصل از تیمار متیل ژاسمونات مؤثر بودن آن در غلظت‌های پایین است. در بسیاری از موارد بین بیان ژن تا ترجمه مدت زمانی طول می‌کشد؛ فعال شدن برخی پروتئین‌ها یا آنزیم‌ها نیازمند تغییرات خاصی است و در مواردی بین جایگاه اثر تا پاسخ، فاصله مکانی وجود دارد (Kleinhofs et al., 1989). از آنجا که افزایش گلیکوزیدها در اثر MJ احتمال دفاعی بودن این ترکیبات را قوت می‌بخشد، افزایش ترکیبات دفاعی در کوتاه مدت، گیاه را در مقابل حمله حشرات مصونیت می‌بخشد. از طرفی، چون تولید متابولیت‌های ثانویه و به طور کلی آمادگی گیاه برای مقابله و دفاع، از رشد و متابولیسم اولیه می‌کاهد، مسیر پیام‌رسانی MJ پس از علامت‌دهی باید خاموش شود. این نتیجه‌گیری می‌تواند دلیل کاهش گلیکوزیدها در 4 و 5 روز پس از تیمار باشد. از طرفی این احتمال وجود دارد که این گلیکوزیدها در گیاه مصرف شده باشد یا قند اننتقالی باشند و MJ سبب افزایش موقتی در محتوای گلیکوزیدی گیاه شود.

با توجه به شکل‌های 1 و 2 این نتیجه به دست می‌آید که غلظت‌های مختلف تیمار متیل ژاسمونات بیش از آن که سبب افزایش گلیکوزیدهای استویوزید و ربادیوزید A شود نسبت این دو گلیکوزید را تغییر می‌دهد. در واقع، هر چه از مقدار یک گلیکوزید کم می‌شود بر مقدار دیگری افزوده می‌شود. این نتیجه با مسیر بیوسنتزی گلیکوزیدهای استویول مطابقت دارد. در این مسیر ابتدا استویوزید تولید و ربادیوزید A از استویوزید سنتز می‌شود. بنابراین اگر از میزان استویوزید کم شده باشد به همان مقدار ربادیوزید A سنتز شده است. در واقع، آثار غلظت‌های مختلف MJ بر متابولیت‌های مختلف یک مسیر می‌تواند متفاوت باشد. از سوی دیگر، احتمال دارد تیمارهایی نظیر MJ سبب بیان گلیکوزیل ترانسفرازهایی شود که سبب ساخت گلیکوزیدها به یک اندازه شود. از این داده‌ها به نتیجه مهم دیگیر نیز می‌توان رسید که در تیمار با محرک‌هایی همچون متیل ژاسمونات نباید به سنجش یک ترکیب شیمیایی از مسیر مورد مطالعه اکتفا کرد. سنجش ترکیبات مختلف (اعم از پیش‌سازها، ترکیبات حد واسط، متابولیت‌های انتهای مسیر اصلی و سایر مسیرهای مرتبط) و همچنین ژن‌های مرتبط (نظیر ژن‌های مسیر جیبرلیک اسید، گلیکوزیل ترانسفرازها و سایر ژن‌های پاسخگر به ژاسمونات‌ها) نتایج دقیق‌تر و موثق‌تری را خواهد داد.

 

جمعبندی

با توجه به نتایج به دست آمده، متیل ژاسمونات اثر فزاینده بر میزان گلیکوزیدهای استویا دارد که دفاعی بودن این ترکیبات را پیشنهاد می‌کند. البته میزان تغییرات در نسبت دو نوع گلیکوزید بیشتر مشهود بود. در صورت استفاده از متیل ژاسمونات در مزارع به جهت افزایش بهره تولید، زمان برداشت آن باید حداکثر تا 3 روز پس از تیمار لحاظ شود. این گلیکوزیدها نقش‌های احتمالی دیگری نیز دارند که پژوهش‌های بیشتری را می‌طلبد.

 

سپاسگزاری

نگارندگان از زحمات خانم‌ها احمدیان و فخاری و آقایان دکتر یوسف‌زادی و دکتر رضایی به خاطر مشاوره و راهنمایی کمال تشکر را می‌نمایند.

 

 

Berim, A., Spring, O., Conrad, J., Maitrejean, M., Boland, W. and Petersen, M. (2005) Enhancement of lignan biosynthesis in suspension cultures of Linum nodiflorum by coronalon, indanoyl-isoleucine and methyl jasmonate. Planta 222(5): 769-776.

Bodnaryk, R. R. (1992) Effects of wounding on glucosinolates in the cotyledons of oilseed rape and mustard. Phytochemistry 31(8): 2671-2677.

Bodnaryk, R. P. (1994) Potent effect of jasmonates on indole glucosinolates in oilseed rape and mustard. Phytochemistry 35(2-3): 301-305.

Bowles, D., Lim, E. K., Poppenberger, B. and Vaistij, F. E. (2006) Glycosyltransferases of lipophilic small molecules. Annual Review of Plant Biology 57: 567-597.

Brader, G., Tas, E. and Palva, E. T. (2001) Jasmonate-dependent induction of indole glucosinolates in Arabidopsis by culture filtrates of the nonspecific pathogen Erwinia carotovora. Plant Physiology 126(2): 849-860.

Creelman, R. A. and Mullet, J. E. (1997) Biosynthesis and action of jasmonates in plants. Annual Review of Plant Physiology 48: 355-381.

Doughty, K. J., Kiddle, G. A., Pye, B. J., Wallsgrove, R. M. and Pickett, J. A. (1995) Selective induction of glucosinolates in oilseed rape leaves by methyl jasmonate. Phytochemistry 38(2): 347-350.

Grubb, C. D., Zipp, B. J., Ludwig-Müller, J., Masuno, M. N., Molinski, T. F. and Abel, S. (2004) Arabidopsis glucosyltransferase UGT74B1 functions in glucosinolate biosynthesis and auxin homeostasis. The Plant Journal 40(6): 893-908.

Hearn, L. K. and Subedi, P. P. (2009) Determining levels of steviol glycosides in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy. Journal of Food Composition and Analysis 22(2): 165-168.

Jung, S. (2004) Effect of chlorophyll reduction in Arabidopsis thaliana by methyl jasmonate or norflurazon on antioxidant systems. Plant Physiology and Biochemistry 42(3): 225-231.

Ketchum, R. E. B., Gibson, D. M., Croteau, R. B. and Shuler, M. L. (1999) The kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of Taxus following elicitation with methyl jasmonate Biotechnology and Bioengineering 62(1): 97-105.

Kleinhofs, A., Warner, R. L., Lawrence, J. M., Melzer, J. M., Jeter, J. M., Kudrna, D. A. Kinghorn, J. R. (1989) Molecular genetics of nitrate reductase in barley. Molecular and Genetic Aspects of Nitrate Assimilation 197-211.

Kolb, N., Herrera, J. L., Ferreyra, D. J. and Uliana, R. F. (2001) Analysis of sweet diterpene glycosides from Stevia rebaudiana: Improved HPLC method. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49(10): 4538-4541.

Lemus-Mondaca, R., Vega-Gálvez, A., Zura-Bravo, L. and Ah-Hen, K. (2012) Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects. Food Chemistry 132: 1121-1132.

Mikkelsen, M. D., Petersen, B. L., Glawischnig, E., Jensen, A. B., Andreasson, E. and Halkier, B. A. (2003) Modulation of CYP79 genes and glucosinolate profiles in Arabidopsis by defense signaling pathways. Plant Physiology 131(1): 298-308.

Murashige, T. and skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and biassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497.

Nanayakkara, N. P. D., Klocke, J. A., Compadre, C. M., Hussain, R. A., Pezzuto, J. M. and Kinghorn, A. D. (1987) Characterization and feeding deterrent effects on the aphid, Schizaphis graminum, of some derivatives of the sweet compounds, stevioside and rebaudioside A. Journal of Natural Products 50(3): 434-441.

Richman, A. S., Gijzen, M., Starratt, A. N., Yang, Z. and Brandle, J. E. (1999) Diterpene synthesis in Stevia rebaudiana: Recruitment and up-regulation of key enzymes from the gibberellin biosynthetic pathway. Plant Journal 19(4): 411-421.

Ruiz-May, E., Galaz-Ávalos, R. M. and Loyola-Vargas, V. M. (2009) Differential secretion and accumulation of terpene indole alkaloids in hairy roots of Catharanthus roseus treated with methyl jasmonate. Molecular Biotechnology 41(3): 278-285.

Sardesai, V. M. and Waldshan, T. H. (1991) Natural and synthetic intense sweeteners. Journal of Nutritional Biochemistry 2(5): 236-244.

Shimizu, Y., Maeda, K., Kato, M. and Shimomura, K. (2010) Methyl jasmonate induces anthocyanin accumulation in Gynura bicolor cultured roots. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 46(5): 460-465.

Weidhase, R. A., Kramell, H. M., Lehmann, J., Liebisch, H. W., Lerbs, W. and Parthier, B. (1987) Methyljasmonate-induced changes in the polypeptide pattern of senescing barley leaf segments. Plant Science 51(2-3): 177-186.