بررسی تغییرات فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و متابولیت‌های ثانویه گیاهچه‌های آویشن (Thymus vulgaris) تحت تنش شوری در شرایط کشت درون‌شیشه

نویسندگان

گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، صندوق پستی3697-19395، تهران، ایران

چکیده

شوری از عوامل مهم‌ محدودکننده رشد گیاهان و تهدید کننده پایداری کشاورزی در مناطق وسیعی از جهان است. به نظر می‌رسد ارزیابی گیاهان دارویی ارزشمند از نظر غذایی، دارویی و بهداشتی نظیر گیاه آویشن، تحت تنش شوری، به عنوان تلاش‌های تحقیقاتی با هدف کشف مزایای اقتصادی یا بهداشتی، ضروری است. مطالعه حاضر، به منظور بررسی اثر شوری بر شاخص‏های فیزیولوژیک، بیوشیمیایی و متابولیت‌های ثانویه در یک گونه آویشن (Thymus vulgaris) در شرایط کشت درون‌شیشه طراحی شد. گیاهچه‌های آویشن حاصل از کشت بذرهای آویشن، چهار هفته پس از رشد در دمای 1±25 درجه سانتیگراد و در 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در اتاقک رشد، به محیط‌کشت MS حاوی غلظت‌های مختلف نمک (0، 80، 100، 120 و 150 میلی‌مولار) منتقل شدند و 25 روز پس از واکشت شاخص‌هایی نظیر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و مواد مؤثره دارویی در گیاهچه‌ها اندازه‌گیری شد. 25 روز پس از تیمار شوری، مقدار کلروفیل‌های a، b، کلروفیل کل، کاروتنوئید و پروتئین‌ محلول کل در گیاهچه‌ها با افزایش غلظت نمک کاهش معنی‌داری یافت، در حالی‌ که افزایش کربوهیدرات‌ها، پرولین و فنل‌ها را به طور معنی‌داری افزایش داد. همچنین، تنش شوری موجب افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شد. نتایج GC-MASS نشان داد تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهچه‌های آویشن تحت تأثیر شوری دچار تغییرات عمده‌ای گردید. با افزایش شوری میزان پی-سیمن و گاما-ترپینن افزایش و میزان تیمول کاهش یافت. به طور کلی، مشاهده شد که تنش شوری با تغییر در شاخص‌های فیزیولوژیک، بیوشیمیایی و میزان تولید مواد مؤثره گیاه آویشن می‌تواند سبب تغییر در ارزش و خواص دارویی آن گردد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

An investigation of changes in antioxidant enzymes activities and secondary metabolites of thyme (Thymus vulgaris) seedlings under in vitro salt stress

نویسندگان [English]

  • Roya Razavizadeh
  • Nasim Mohagheghiyan
Department of Biology, Payame Noor Universtiy, PO BOX 19395-3697 Tehran, IRAN
چکیده [English]

Salinity is one of the major factors limiting the growth of plants that threaten the sustainability of agriculture in vast areas of the world. It seems that the evaluation of medicinal plants such as thyme due to food, pharmaceutical and health is essential under salinity stress to discover its benefits of economic and health. This study was designed to investigate the effect of salinity on physiological parameters, biochemical and secondary metabolites in thyme (Thymus vulgaris) under in vitro culture conditions. Thyme seedlings grown from the seeds, 4 weeks after growth at 16 hours of light and 8 hours of dark and at temperature of 25±1 ºC in the growth chamber, were transferred to MS (Murashige and skoog) medium containing different concentrations of NaCl (0, 80, 100, 120 and 150 mM) and 25 days after the subculture, physiological parameters such as antioxidant enzymes activities and active pharmaceutical ingredients were measured. 25 days after salt treatment, the chlorophyll a, b, total chlorophyll, carotenoids, and total soluble protein content were significantly decreased with increasing NaCl concentration, whereas increasing the salt concentration increased carbohydrates, proline and phenolics in thyme seedlings. Also salinity led to a significant increase in the activity of antioxidant enzymes. GC-Mass analysis showed that the productions of secondary metabolites were greatly affected by salinity. By increasing salinity level of P-cymene and Gama Terpinene increased and Thymol decreased. In general, it was observed that salinity with changes the physiological and biochemical parameters and the amount of active ingredients of Thyme can change the value of its medicinal properties.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antioxidant Enzymes
  • in vitro
  • salt stress
  • Secondary metabolites
  • Thyme

انتقال بسیاری از بیماری‌ها از طریق غذا، محصولات آرایشی و بهداشتی است، لزوم اطمینان از ایمنی و سلامت این مواد از یک سو و ترجیح مردم به استفاده از محصولات طبیعی یا برخاسته از طبیعت از سویی دیگر، سبب شده است تا افزایش تقاضا در استفاده از منابع طبیعی در صنایع مختلف غذایی، دارویی، آرایشی، بهداشتی و غیره به جای فرآورده‌های سنتتیک و مصنوعی در صنعت نگهداری غذا یا مصارف دارویی، پزشکی، آرایشی و بهداشتی از اهمیت بسیاری برخوردار گردد. این موضوع، اهمیت مطالعه در مورد نگهدارنده‌های طبیعی، که منبع عمده آنها متابولیت‌های ثانویه یا مواد مؤثره به دست آمده از گیاهان دارویی است و تغییر در میزان تولید این مواد تحت تأثیر شرایط مختلف محیطی را بیشتر نشان می‌دهد. در نتیجه، امروزه پژوهش‌ها برای یافتن جانشینی برای داروهای فعلی نظیر انواع آنتی‌بیوتیک‌ها و آنتی‌سرطان‌ها و بررسی داروهای سنتی مانند گیاهان دارویی شدت یافته است و به عبارتی، گیاهان دارویی از اقبال عمومی بهرمند شده‌اند. بسیاری از گونه‌های گیاهان منبع بزرگی از مواد فعال زیستی در کره زمین هستند به طوری که پیش از معرفی داروهای شیمیایی، انسان برای حفظ سلامتی خود، از گیاهان شف بخش استفاده می‌نمود. گیاه آویشن با نام علمی Thymus vulgaris یکی از شناخته‌شده‌ترین گیاهان دارویی است که در کشورهای آسیایی و اروپایی مصارف متنوعی در طب سنتی، صنایع غذایی، دارویی، بهداشتی و آرایشی دارد (Rustaiyan et al., 2000). این گیاه با دارا بودن متابولیت‌های ثانویه و روغن‌های ضروری نظیر مونوترپن‌های فنلی از جمله: تیمول و کارواکرول که ایزومر تیمول است، پیش‌سازهای هیدروکربنی مونوترپنی‌ مانند پی-سیمن و گاما-ترپنین، مونوترپن‌های اکسیژن‌دار مانند لینالول و بورنئول، کامفن و ... دارای خواص غذایی، دارویی، آرایشی و بهداشتی فراوانی است که می‌توان خواص: ضد سرطان، ضد اسپاسم، ضد نفخ، معرق، ضد عفونی‌کننده، خلط‌آور، آرام‌بخش بودن، خوشبو‌کننده، طعم‌دهنده و دافع حشرات را نام برد (Soto-Mendivil et al., 2006؛ Wong et al., 2006؛ Nakamura et al., 2010؛ (Zarrini et al., 2010. تنش‌های محیطی زیادی نظیر: تغییرات گسترده آب و هوایی کره زمین، بروز خشکسالی و تشدید تنش شوری، بر بهره‌وری محصولات زراعی و سنتز متابولیت‌های ثانویه گیاهان دارویی تأثیر می‌گذارند و ارزش دارویی گیاهان دارویی تولیدکننده آنها را تغییر می‌دهند (Sudha and Ravishankar, 2003). گزارش‌های متعدد تأیید‌کننده بر تأثیر تنش‌های محیطی، مواد معدنی مانند کلسیم و نیتریک اکسید یا فیتوهورمون‌هایی مانند آبسزیک اسید (ABA)، سالیسیلیک اسید (SA)، پلی‌آمین‌ها (polyamines) و جاسمونیک اسید (JA) بر سنتز متابولیت‌های ثانویه در گیاهان موجود است (Bennett and Wallsgrove, 1994؛ Ravishankar and Rao, 2000؛ Tuteja and Sopory, 2008؛ Esmaeilzadeh Bahabadi and Sharifi, 2013). با توجه به تأثیرپذیری گیاهان از عوامل محیطی، شرایط و میزان سنتز و تجمع ترکیبات ثانویه ممکن است در طول زندگی گیاه دست خوش تغییر گردد. شوری و حضور غلظت بالایی از کلرید سدیم و نمک‌های دیگر، به عنوان یکی از تنش‌های مخرب محیطی باعث بروز طیف گسترده‌ای از آشفتگی‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی مانند کم آبی سلولی و حذف آب از سیتوپلاسم و در نتیجه کاهش حجم می‌شود که تنش اسمزی و سمّیت یونی را به دنبال دارد و بر اساس مطالعات صورت گرفته، تغییر در میزان متابولیت‌های ثانویه خاص مانند پلی‌آمین‌ها و فنل‌ها و یا بسیاری دیگر از مواد Navarro et al., 2006)؛ Mutlu and Bozcuk, 2007) را به دنبال داشته است. همچنین شوری با کاهش انتقال الکترون، به تولید بیش از حد گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) منجر می‌شود که می‌تواند باعث آسیب‌های اکسیداتیو قابل توجهی به رنگیزه‌های گیاهی از جمله کلروفیل و درشت مولکول‌هایی مانند نوکلئیک اسیدها، پروتئین‌ها و غشای لیپیدی گردد (Ashraf, 2009).

گیاهان از سازوکارهای مختلف فیزیولوژی و بیوشیمیایی برای بقای خود در خاک‌های شور استفاده می‌کنند که از آنها می‌توان به تعادل و انتقال یون‌ها، جذب یون‌ها، سنتز املاح محلول و اسمولیت‌ها نظیر کربوهیدرات‌های محلول (Munns and Tester, 2008)، فعال شدن آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نظیر
سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT) و آسکوربات پراکسیداز (APX) (James et al., 2011) و سنتز پلی‌آمین‌ها نظیر پرولین (Rahnama et al., 2010) اشاره کرد. از آنجا که شدت آسیب‌های وارد شده به گیاهان در اثر شوری و تنش اکسیداتیو به عنوان تنش ثانویه و همراه با شوری، در میان گونه‌های مختلف گیاهی، اندام‌های گیاهی یا در مراحل مختلف رشد متفاوت است، عملکرد گونه‌های مختلف گیاهی در میزان سنتز و تجمع این ترکیبات آلی و تغییر در ظرفیت و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در پاسخ به شوری می‌تواند متفاوت باشد (Abraham et al., 2011). بنابراین، لازم است بهبود تحمل به شوری در گیاهان با توسعه روش‌های جدید مانند کشت بافت گیاهی مورد بررسی قرار گیرد.

کشت بافت گیاهی، شرایط کنترل شده و مستقل از تغییرات محیطی و عوامل طبیعی را برای رشد سریع‌تر گیاه و تولید و بازدهی بیشتر در سطح کمتر، در سیستم در شیشه و در تمامی طول سال مهیا می‌سازد که این مزیت برای کشت بسیاری از گیاهان که در طبیعت تنها در فصول خاصی وجود دارند دارای اهمیت بسیاری است. از سوی دیگر، روش کشت بافت تاکنون در بررسی مسیرهای بیوسنتزی، بیوشیمیایی و آنزیمی، متابولیت‌های ثانویه و ترکیبات مؤثر دارویی و مهم گیاهان، اثر عوامل مختلف همچون تنش‌های زیستی و غیرزیستی کاربرد زیادی داشته است. کشت‌های درون‌شیشه‌ای برای ارزیابی مقاومت به شوری در بسیاری از گونه‌های دارویی مفید است که در نهایت به انتخاب صفات مطلوب در سلول و باززایی به گیاهان برتر منجر می‌شود (Rai et al., 2011).

آویشن یک گیاه آروماتیک است که به دلیل داشتن روغن‌های ضروری مانند تیمول و سایر مواد مؤثره دارای خواص دارویی فراوانی است و در صنایع آرایشی و بهداشتی نیز کاربرد فراوانی دارد. با توجه به گستره وسیع تأثیرگذاری تنش شوری در خاک‌های کشور، مطالعه حاضر از یک سو با هدف بررسی میزان تحمل به شوری گیاه آویشن در شرایط کشت در شیشه و همچنین بررسی اثر تنش شوری بر شاخص‌های فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در گیاهچه‌های آویشن انجام شده است و از سوی دیگر، سطح تغییرات متابولیت‌های ثانویه در گیاهچه‌های آویشن و تغییر ارزش دارویی این گیاه در پاسخ به حضور نمک، با استفاده از روش GC-MS، در شرایط کشت درون‌شیشه بررسی شده است.

 

مواد و روش‌ها.

کشت گیاه در شرایط درون‌شیشه: بذرهای آویشن پس از ضدعفونی با الکل 70 درصد به مدت 1 دقیقه و هیپوکلریت سدیم 1 درصد به مدت 10 دقیقه و سپس چندین بار شستشو با آب مقطر استریل، روی محیط‌کشت پایه MS (Murashige and Skoog, 1962) حاوی 30 گرم در لیتر سوکروز و 7 گرم در لیتر آگار با اسیدیته معادل 8/5 به منظور جوانه‌زنی قرار گرفتند. سپس محیط‌های کشت حاوی بذرها در اتاقک رشد در دمای 1±25 درجه سانتیگراد و 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند تا بذرها جوانه زده و رشد کنند. 4 هفته پس از کشت، گیاهچه‌ها به محیط‌کشت حاوی غلظت‌های مختلف نمک (0، 80، 100، 120 و 150 میلی‌مولار) منتقل شدند. 25 روز پس از واکشت گیاهچه‌ها در محیط‌های تحت تیمار شوری، شاخص‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی متعدی از قبیل: میزان پرولین، کلروفیل، کاروتنوئید، فنل و قندهای محلول، مقدار پروتئین، فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز و متابولیت‌های ثانویه و مواد مؤثره دارویی در گیاهچه‌های آویشن اندازه‌گیری شدند.

سنجش کلروفیل و کاروتنوئید: به منظور سنجش کلروفیل و کاروتنوئید، 05/0 گرم از نمونه‌های برگى در 5 میلی‌لیتر استون 80 درصد همگن و سانتریفیوژ شد. سپس، 10 میلی‌لیتر استون اضافه شد تا محلول به حجم 15 میلی‌لیتر برسد و با انتقال 3 میلی‌لیتر از عصاره نمونه‌ها به کووت، جذب خوانی در میلى‌گرم بافت مورد نظر در طول موج‌های 2/663، 8/646 و 470 نانومتر انجام شد و در نهایت، مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی بر حسب گرم وزن تر محاسبه شد (Lichtenthaler, 1987).

.سنجش پرولین، پروتئین، فنل و قندهای محلول: برای سنجش پرولین، نمونه‌های تر وزن شده در ١٠ میلى‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید ٣ درصد همگن و سانتریفیوژ شد. 2 میلی‌لیتر معرف نین‌هیدرین (125 میلی‌گرم نین‌هیدرین، 20 میلی‌لیتر فسفریک اسید 6 مولار و 30 میلی‌لیتر استیک اسید گلاسیال) به نمونه‌ها افزوده شده، به مدت یک ساعت در حمام آب جوش در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. با افزودن تولوئن به نمونه‌ها و جداسازی محلول رویی، شدت جذب محلول‌ها در طول موج 520 نانومتر خوانده شد. سپس با استفاده از منحنی استاندارد، غلظت پرولین بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر محاسبه گردید (Bates et al., 1973).

برای اندازه‌گیری فنل، 1/0 گرم نمونه‌های تر توزین و به مدت 15 دقیقه در ١٠ میلی‌لیتر اتانول ٨٠ درصد جوشانده و سپس به مدت 15 دقیقه در g 3000 سانتریفیوژ شد. 5 میلی‌لیتر محلول فوقانی جدا شد. به 5/2 میلی‌لیتر از این محلول 5/2 میلی‌لیتر فولن رقیق شده با آب (3:1)و 5 میلی‌لیتر کربنات سدیم اشباع، افزوده شده، به مدت 10 دقیقه در شرایط آزمایشگاهی نگه داشته شد. پس از آن، به مدت 15 دقیقه در g 4000 سانتریفیوژ شد.میزان جذب محلول نمونه‌ها در طول موج ٦٤٠ نانومتر در مقابل شاهد خوانده شد. رسم منحنى استاندارد با استفاده از کاتکول در غلظت‌های مختلف 0، 2، 4،6، 8 و 10 میلی‌لیتر و غلظت فنل بر حسب میلی‌گرم در گرم وزن تر محاسبه شد (Matta and Giai, 1969).

براى سنجش مقدار قندهای محلول پس از تهیه معرف آنترون با حل کردن 5/0 گرم آنترون در 50 میلی‌لیتر سولفوریک اسید 95 درصد، 5/0 گرم از نمونه‌ها در 10 میلی‌لیتر آب مقطر به مدت 10 دقیقه همگن و سانتریفیوژ شد. سپس به 4 میلی‌لیتر از محلول رویی 8 میلی‌لیتر معرف آنترون اضافه شد و نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد نگهداری شد و جذب نورى آنها در طول موج 625 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل U-100، شرکت Shimadzu، ساخت ژاپن) خوانده شد. منحنى استاندارد با استفاده از گلوکز رسم شد و تعیین میزان قند بر حسب میلی‌گرم در گرم وزن تر محاسبه گردید (Yemm and Willis, 1954).

برای سنجش پروتئین‌ها، 1/0 گرم بافت برگ در 4 میلی‌لیتر بافر فسفات 1/0 مولار (اسیدیته=2/7) به همراه 1/0 گرم پلی وینیل پلی پیرولیدین (PVP) در هاون ساییده و سانتریفیوژ گردید. جهت اندازه‌گیری پروتئین‌ها با استفاده از روش Bradford (1976) از محلول رویی استفاده شد. جذب عصاره‌ها در طول موج 595 نانومتر خوانده و منحنی استاندارد پروتئین‌ها با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) رسم انجام شد. میزان پروتئین محلول کل بر حسب میلی‌گرم در گرم وزن تر محاسبه شد.

.فعالیت سنجى آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز: مقدار 1/0 گرم از بخش هوایی توزین و درون هاون روی یخ قرار داده شد و 5/1 میلی‌لیتر از بافر نمک‌های فسفات حاوی PVP با اسیدیته برابر 4/7 به آن افزوده شد. بافت مورد نظر در هاون ساییده شد. بافت‌های عصاره‌گیری شده به مدت 10 دقیقه در 10000 دور بر دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند.

در سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز، محلول واکنش شامل 625 میکرولیتر بافر فسفات حاوی EDTA، 175 میکرولیتر آسکوربیک اسید، 50 میکرولیتر H2O2، 50 میکرولیتر BSA و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمى بود. سنجش مقدار فعالیت آنزیمى یک دقیقه پس از افزودن عصاره آنزیمى به محیط واکنش انجام شد و کاهش جذب طى 2 دقیقه از واکنش در 290 نانومتر اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیمی آسکوربات پراکسیداز با استفاده از ضریب جذب مولی آسکوربیک اسید (8/2 بر میلی‌مولار بر سانتی‌متر) محاسبه شد (Nakano and Asada, 1981).

بررسى میزان فعالیت کاتالاز با بررسى کاهش مقدار H2O2 در 240 نانومتر براى یک دقیقه انجام شد. مخلوط واکنش شامل: بافر فسفات پتاسیم 100 میلی‌مولار (اسیدیته=7)، 15 میلی‌مولار H2O2 و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمى در یک حجم 3 میلی‌لیتر بود. میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشى مولی 039/0 بر میلی‌مولار بر سانتی‌متر محاسبه و بر حسب یک واحد (میکرومول پراکسید هیدروژن مصرف شده در دقیقه) به ازاى میلی‌گرم پروتئین بیان شد (Aebi, 1984).

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز بر اساس بازدارندگی آنزیم SOD از احیا نوری نیتروبلوتترازولیوم (NBT) اندازه‌گیری شد. در این روش، مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات سدیم 50 میلى‌مولار (اسیدیته=2/10)، متیونین 13 میلى‌مولار، نیتروبلوتترازولیوم 63 میکرومولار، EDTA 1/0 میلی‌مولار، ریبوفلاوین 3/1 میکرومولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود که با آب مقطر به حجم 3 میلی‌لیتر رسید. واکنش با برداشتن فویل آلومینیومی و قرار دادن نمونه‌ها در مقابل نور (5000 LUX) آغاز گردید. پس از 15 دقیقه نور قطع شده و بلافاصله جذب نمونه‌ها در 560 نانومتر خوانده شد. یک واحد فعالیت آنزیمی مقداری از آنزیم است که موجب 50 درصد ممانعت احیاى NBT در 560 نانومتر می‌شود. میزان فعالیت آنزیم بر حسب یک واحد در دقیقه به ازاى میلی‌گرم پروتئین محاسبه گردید (Giannopolitis and Ries, 1977).

.اندازه‌گیری مواد مؤثره اسانس با دستگاه گاز کروماتوگراف جرم‌سنجی: بدین منظور، از دستگاه گاز کروماتوگراف (مدل HP-5890، شرکت Hewlett-Packard، ساخت آمریکا) دارای سیستم تله یونی استفاده شد که در آن انرژی یونیزاسیون 70 الکترون ولت و درجه حرارت 250 درجه سانتیگراد برای تولید منبع یون تنظیم گردید. رقیق کردن نمونه‌ها با روش شکافت با نسبت100:1 انجام شد. ستون مویینه به طول 50 متر و قطر داخلی 20/0 میلی‌متر و ضخامت فیلم 25 میکرومتر و ذرات از جنس متیل سیلیکون کراس لینک بود. شناساگر از نوع انتخابگر جرمی (دستگاه MS، مدل HP-5890، شرکت Hewlett-Packard، ساخت آمریکا) بود. برنامه حرارتی از 100 تا 250 درجه سانتیگراد با تغییرات 4 درجه در دقیقه استفاده شد. از هلیم فوق خالص با سرعت عبور 1 میلی‌لیتر در دقیقه به عنوان گاز حامل استفاده شد. انرژی یونیزاسیون 70 الکترون ولت و درجه حرارت 250 درجه سانتیگراد برای تولید منبع یون تنظیم شد. شناسایی هر ترکیب بر اساس زمان بازداری و جرم ثبت شده آنها انجام شد Davies, 1990)؛ (Li et al., 2009.

تحلیل داده‌ها: تمام آزمایش‌ها بر اساس طرح کاملاً تصادفی انجام شد و آنالیز واریانس داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 19 انجام گرفت. مقایسه میانگین بر اساس آزمون دانکن در سطح معنی‌داری p≤0.05 محاسبه گردید.

 

نتایج.

.اثر تنش شوری بر شاخص‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاهچه‌های آویشن.

.تأثیر تنش شوری بر سنتز کلروفیل و کاروتنوئید: تغییرات مشاهده شده در میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در گیاهچه‌های آویشن تحت تأثیر تنش شوری در شکل نشان 1 داده شده است. افزایش غلظت نمک در محیط‌کشت، باعث کاهش معنی‌دار کلروفیل‌های a و b در گیاهچه‌های آویشن در مقایسه با شاهد شد (شکل 1-A و B). در تیمار 150 میلی‌مولار نمک طی 25 روز سطح کلروفیل در گیاهچه‌های آویشن به کمترین میزان رسید. میزان کلروفیل کل در گیاهچه‌های آویشن کشت شده در محیط‌کشت MS حاوی غلظت‌های مختلف نمک نسبت به گیاهچه‌های شاهد کاهش معنی‌دار نشان داد و در تیمار 150 میلی‌مولار نمک به کمترین مقدار رسید (شکل 1-C). همچنین، افزایش غلظت نمک در محیط‌کشت باعث کاهش میزان کاروتنوئید در مقایسه با شاهد و نیز در مقایسه با سایر غلظت‌های نمک گردید (شکل 1-D).


 

 

شکل 1- تأثیر تنش شوری بر غلظت کلروفیل‌ a (A)، کلروفیل‌ b (B)، کلروفیل کل (C) و کاروتنوئید (D) در گیاهچه‌های آویشن. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح P<0.05 است.

 


.اثر تنش شوری بر سنتز پرولین، فنل، قندهای محلول و پروتئین‌: افزایش غلظت نمک تا سطح 150 میلی‌مولار در محیط‌کشت MS، میزان پرولین را در گیاهچه‌های آویشن به طور معنی‌داری افزایش داد (شکل 2-A)، به طوری که بیشترین میزان تولید و تجمع این اسمولیت، 25 روز پس از کشت در غلظت‌های 120 و 150 میلی‌مولار نمک و کمترین مقدار در گیاهان شاهد مشاهده گردید.

نتایج اندازه‌گیری قندهای محلول نشان داد که طی 25 روز پس از کشت، افزایش غلظت نمک تا سطح 150 میلی‌مولار در محیط‌کشت MS، باعث افزایش معنی‌دار میزان قندهای محلول در گیاهچه‌های آویشن نسبت به گیاهان شاهد و نیز در مقایسه سطوح مختلف تیمار با یکدیگر گردید و به طور کلی، با تشدید تنش شوری، سنتز قندهای محلول افزایش معنی‌داری نشان داد (شکل 2-B).

شکل 2-C نشان‌دهنده تأثیر غلظت‌های مختلف نمک بر سنتز فنل‌ها در گیاهچه‌های آویشن است. مشاهده شد که 25 روز پس از کشت با افزایش غلظت نمک تا سطح 150 میلی‌مولار، سنتز فنل‌ها در گیاهچه‌های آویشن نسبت به گیاهان شاهد به طور معنی‌داری افزایش یافته است. به طور کلی، با تشدید تنش شوری، سنتز فنل‌ها افزایش معنی‌دار داشت و گیاهچه‌های آویشن در 150 میلی‌مولار نمک از تمام ظرفیت خود در سنتز فنل‌ها استفاده کرده‌اند.

شکل 2-D نشان‌دهنده وجود تفاوت آماری معنی‌دار در محتوای پروتئین‌ در گیاهچه‌های آویشن کشت شده در محیط‌کشت MS حاوی سطوح مختلف نمک در مقایسه با گیاهان شاهد و نیز در مقایسه سطوح مختلف تیماری با یکدیگر است. 25 روز پس از کشت بیشترین میزان پروتئین در گیاهچه‌های آویشن کشت شده در محیط‌کشت MS بدون نمک دیده شد. به طور کلی، افزایش غلظت نمک به کاهش میزان پروتئین منجر گردید.

 

 

 

شکل 2- تأثیر تنش شوری بر غلظت پرولین (A)، قندهای محلول (B)، فنل (C) و پروتئین (D) در گیاهچه‌های آویشن. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح P<0.05 است.

 


.فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز تحت تنش شوری: همان طور که در شکل 3-A نشان داده شده است، طی 25 روز پس از کشت، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهچه‌های آویشن با افزایش غلظت نمک تا 120 میلی‌مولار در محیط‌کشت MS، افزایش معنی‌داری نسبت به گیاهان شاهد و سایر غلظت‌های نمک داشت، اما با افزایش غلظت نمک تا 150 میلی‌مولار، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز نسبت به سطح 120 میلی‌مولار کاهش نشان داد.

شکل 3-B نشان می‌دهد که فعالیت کاتالاز در گیاهچه‌های آویشن کشت شده در محیط‌کشت MS حاوی سطوح مختلف نمک نسبت به گیاهان شاهد افزایش معنی‌دار داشته، در غلظت‌های 100 و 120 میلی‌مولار بیشترین فعالیت را نشان داده است، اما با افزایش میزان تنش در 150 میلی‌مولار کاهش معنی‌داری در فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به غلظت 120 مشاهده شد.

در شکل 3-C مشخص است که سطح فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز نیز در گیاهچه‌های آویشن، با افزایش غلظت نمک تا سطح 120 میلی‌مولار در محیط‌کشت MS، طی 25 روز پس از کشت، افزایش معنی‌داری نسبت به گیاهان شاهد و در مقایسه با سایر غلظت‌های نمک داشت. اما افزایش بیشتر غلظت نمک به کاهش فعالیت این آنزیم منجر شد. بیشترین سطح فعالیت SOD در 100 و 120 میلی‌مولار نمک، مشاهده گردید.

 

 

 

شکل 3- تأثیر تنش شوری بر فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز (a)، کاتالاز (b) و سوپر اکسید دیسموتاز (c) در گیاهچه‌های آویشن. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح P<0.05 است.

 


.اثر تنش شوری بر مواد مؤثره اسانس گیاه آویشن: تغییرات ترکیبات اسانس گیاهچه‌های آویشن کشت شده در محیط‌کشت MS حاوی 120 میلی‌مولار نمک در مقایسه با گیاهان شاهد، طی 25 روز پس از واکشت، با استفاده از GC-MS آنالیز شد (جدول 1). به طور کلی، در گیاهان شاهد سطح مونوترپن فنلی (تیمول) به مراتب بیشتر از پیش‌سازهای هیدروکربن مونوترپنی (HC) شامل پی-سیمن و گاما-ترپینن است که در پاسخ به حضور نمک در محیط‌کشت MS، تنوع الگویی هماهنگی را نشان دادند. در غلظت 120 میلی‌مولار نمک، میزان آلفا-ترپینولن، آلفا-پینن، آلفا-فیلندرن، میرسن و 2،6-دی متیل 5-5 هپتانال کاهش یافت که این کاهش در سطح مونوترپن فنلی مانند: تیمول، مونوترپن‌های اکسیژن‌دار (لینالول و بورنئول)، کامفن قابل توجه بود. در حالی‌ که با اعمال تنش شوری سطح مونوترپن‌های مونوکربنی (پی-سیمن و گاما-ترپینن)، 1،7-اکتا دی ان، پارامنتن، ترانس-اوسیمین، منتا-3،8- دی انر، ترانس-دی هیدروکارون، کالامنن، گاما-کادینن، کارواکرول و کارواکرول استات، ترپن‌ها (به طور عمده بتا-کاریوفیلن)، مشتقات اکسیژن آن (برای نمونه: کاریوفیلن اکسید) در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش یافت. شوری در سطح 120 میلی‌مولار تولید سابینن را به صفر رساند، در حالی که به تولید ماده مؤثره 2،4- دی متیل 2،4- هپتادین منجر شد. می‌توان گفت که غلظت بالای نمک در محیط‌کشت آویشن به افزایش سطح پیش‌سازهای مونوترپن‌های هیدروکربنی (پی-سیمن و گاما-ترپینن) منجر شده در حالی‌ که سطح تیمول را کاهش داده است.

 

 

جدول 1- محتوای نسبی مواد مؤثره اسانس گیاهچه‌های آویشن در غلظت‌های 0 و 120 میلی‌مولار نمک در شرایط کشت در شیشه

محتوای نسبی (درصد)

زمان بازداری (دقیقه)

نام ماده

120 میلی‌مولار NaCl

0 میلی‌مولار NaCl

9/0

2/1

7:1

1,3-Octadiene

4/2

5/1

8:2

1,7-Octadiene

8/1

-

8:8

2,4- dimethyl-2,4-heptadiene

4/1

6/3

9:9

a-Pinene

9/0

5/1

10:5

Camphene

-

8/1

11:8

Sabinene

6/3

4/1

13:1

Para-Menthene-3

4/1

6/2

14:3

Myrcene

5/1

8/1

15:3

a-Phellandrene

2/1

0/2

15:9

2,6-Dimethyl-5-5heptanal

9/0

9/0

16:8

a-Terpinene

9/21

2/19

17:6

P-Cymene

4/22

4/15

18:9

Gama- Terpinene

1/2

4/1

19:5

Trans-Ocimene

9/0

3/2

21:4

Linalool

8/1

5/1

22:1

Mentha-3,8-diener

4/1

5/2

25:2

a-Terpinolene

1/2

1/2

26:7

Para-Cimene

5/1

8/1

29:8

Borneol

6/1

9/0

33:5

Trance-Dihydrocarvone

0/2

1/1

34:7

Thymol methyl ether

4/1

3/1

35:8

3,6-Dimethyl-5-5heptanal

0/18

1/26

36:6

Thymol

5/1

3/1

39:2

Caevacrol

1/1

9/0

40:1

Caevacrol acetate

4/1

1/1

42:2

b-caryophyllene

0/1

8/0

43:5

Calamenene

2/1

6/1

45:1

ɤ-Cadinene

 


 

بحث.

از آنجا که تنش شوری اثر بسیار گسترده‌ای در گیاهان دارد، نحوه پاسخ‌دهی گیاه آویشن، به عنوان یک گیاه ارزشمند از نظر دارویی و بهداشتی، نسبت به تنش شوری در شرایط کشت درون‌شیشه مورد ارزیابی قرار گرفت. گیاهان عالی، غلظت و میزان پرولین خود را در پاسخ به انواع تنش‎های زیستی و غیرزیستی تغییر می‌دهند و تولید زیاد پرولین یک پاسخ وسیع مشاهده شده در گیاهان در مواجهه با انواع تنش‎های محیطی است. در واقع، این اعتقاد وجود دارد که پرولین در ایجاد تحمل به تنش‎ها نقش دارد (Trovato et al., 2008؛ Verbruggen and Hermans, 2008؛ Mattioli et al., 2009). تجمع اسمولیت‌هایی نظیر پرولین در شرایط تنش شوری در گیاهان متعددی از جمله: نخود (Waheed et al., 2006) و ذرت (Chaum and Kirdmanee, 2009) اثبات شده است که می‌تواند به عنوان یک معیار انتخاب برای ارزیابی مقاوم‌ترین گونه‌ها در نظر گرفته شود (Ahmad et al., 2009). در پژوهش حاضر، با افزایش غلظت نمک در گیاهچه‌های آویشن، سنتز پرولین به طور معنی‌داری افزایش یافت و در غلظت 150 میلی‌مولار به حداکثر رسید. این افزایش ممکن است در اثر افزایش بیان ژن P5Csدر پاسخ به شوری باشد به نحوی که افزایش سطح بیان ژن P5Cs در Opuntia streptacantha (Silva-Ortega et al., 2008)به موازات افزایش پرولین در پاسخ به شوری نیزگزارش شده است.

کلروفیل نقش بسیار مهمی در فرآیندهای رشدی گیاهان دارد (Eckhardt et al., 2004). بیوسنتز و تخریب کلروفیل تحت کنترل مسیرهای پیچیده سلولی و مولکولی است و این مسیرها توسط عوامل مختلفی تنظیم می‎شوند. فتوسنتز، به عنوان یک مسیر متابولیک مهم در گیاهان عالی و رنگیزه‎های مرتبط با آن یکی از اهداف اصلی مورد تهدید طی تنش شوری محسوب می‎گردد (Eckhardt et al., 2004). محتوای کلروفیل در گیاهچه‌های آویشن با افزایش غلظت نمک کاهش معنی‌دار یافت و در غلظت بالاتر از 120 میلی‌مولار برگ‌ها دچار نکروز شدند. احتمالاً سمّیت ناشی از کلر در سنتز کلروفیل اختلال ایجاد کرده است. اگر چه هر دو یون‌ سدیم و کلر در بسیاری از اختلالات فیزیولوژیک گیاهان نقش دارند اما سمّیت کلر بیشتر از سدیم است (Tavakkoli et al., 2010). گزارش شده است که محتوای کلروفیل در گونه‌های مختلف گیاهی تحت تنش شوری متفاوت است (Bayuelo-Jimenez et al., 2012؛ (Jamil and Rha, 2013 و در شرایط تنش کاهش می‌یابد که در بسیاری از گیاهان مانند Stevia rebaudiana (Rathore et al., 2014) و خیار (Zhang et al., 2009) گزارش شده است. کاهش کلروفیل و فتوسنتز در واکنش گیاهان به تنش شوری اثبات شده است (Jamil and Rha, 2013). کاهش کلروفیل، ظرفیت فتوسنتزی (واکنش هیل و تثبیت نوری CO2)، رنگیزه‎های کاروتنوئیدی و فعالیت آنزیم روبیسکو در گیاهچه‎های ذرت‎ نیز تحت تنش شوری مشاهده شده است (Khodary, 2004).

تنش‌های اکسیداتیو مانند شوری عامل اصلی تولید ROS و دفاع آنتی‌اکسیدانی هستند که به عدم تعادل و بروز چالش‌های فیزیولوژیکی در گیاهان منجر می‌شوند (Foyer and Noctor, 2003). ترکیبات آنتی‌اکسیدانی عبارت از فنل‌ها، کاروتنوئیدها و ویتامین‌ها هستند که در میان این ترکیبات، پلی فنل‌ها به ویژه فلاونوئیدها نقش مهمی در مهار ROS در گیاهان تحت تنش شوری دارند (Navarro et al., 2006). افزایش فنل‌ها تحت تنش شوری در بسیاری از گیاهان مانند Lactuca sativas (Lee et al., 2014) گزارش شده است. در پژوهش حاضر، افزایش غلظت نمک در محیط‌کشت نیز سطح فنل‌ها را در گیاهچه‌های آویشن افزایش داد.

گزارش‌های متعددی در مورد اثر شوری بر تجمع قندهای محلول به عنوان پاسخ به تنش شوری یا خشکی در گیاهان مختلف وجود دارد (Murakeozy et al., 2003)، این ترکیبات با حفاظت اسمزی (osmoprotection)، ذخیره‌سازی کربن و مهار ROS در کاهش تأثیرات تنش نقش دارند که نقش یک اسمولیت را در تثبیت سلولی غشا و حفظ تورژسانس بازی می‌کند (Jouve et al., 2004). در شرایط تنش، در گیاهچه‌های آویشن تحت تنش شوری، میزان قندهای محلول افزایش معنی‌داری نشان داد. قندها نقش مهمی در سازش ریشه‎ها از طریق تولید پیش‎سازهای لازم برای آنزیم‎های سنتازی، تولید انرژی متابولیک و تنظیم اسمزی ریشه‎ها دارند (Barakat, 2011). انباشته شدن قندها می‎تواند به علت فعال شدن آنزیم‎های بیوسنتزی کربوهیدرات‎ها باشد که این انباشتگی نقش مهمی در کاهش آثار مخرب تنش شوری از طریق تنظیم اسمزی دارد (Ackerson, 1985).

تأثیر منفی تنش شوری بر سنتز پروتئین در شرایط در شیشه در گیاهانی مانند چاودار و سیب‌زمینی تأیید شده است که مطابق با نتایج پژوهش حاضر است. آمینو اسیدهایی مانند سیستئین، آرژنین و متیونین، حدود 55 درصد از کل آمینو اسید‌های آزاد را تشکیل می‌دهند و در زمان مواجهه با تنش شوری کاهش می‌یابند، در حالی که غلظت پرولین در پاسخ به تنش شوری افزایش می‌یابد (Fidalgo et al., 2004). فعال شدن آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و سنتز ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در گیاهان یکی از سازوکارهای دفاعی برای مهار سنتز ROS در پاسخ به تنش‌های مختلف زیست محیطی از جمله شوری است (Ashraf and Harris, 2004). گزارش‌های متعددی نیز در ارتباط با افزایش سطح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان برای مهار ROS و افزایش مقاومت به شوری در گیاهان مانند برنج و ذرت ثبت شده است Sancho et al., 1996)؛ Gill et al., 2013؛ Saxena et al., 2013) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.

اگرچه بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه از مسیرهای ژنتیکی تنظیم می‌شود اما بیوسنتز و عملکرد آنها متأثر از عوامل محیطی نیز هست Yaniv and Paleitch, 1982)؛ (Charles et al., 1994. بررسی‌های متعدد مشخص کرده است که تغییر در عملکرد اسانس و ترکیبات آنها ناشی از فعالیت آنزیم‌ها و بهبود متابولیسم آنهاست (Hendawy and Khalid, 2005). در مطالعات پیشین از تنش‌های محیطی (درجه حرارت بالا و پایین، خشکسالی، شوری، اشعه فرابنفش و آلودگی پاتوژن‌ها) و محرک‌های مختلف برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه استفاده شده است(Dixon and Paiva, 1995). مشخص شده است که تنش‌ها و محرک‌ها اثر قابل توجهی در تغییرات سطح فنل‌ها در کشت بافت داشته‌اند (Chalker-Scott and Fnchigami, 1989). مقدار کل متابولیت‌های ثانویه نظیر: آلکالوئیدها، ماده مؤثره و ترکیبات فنلی در اندام‌های هوایی آویشن، نشان‌دهنده ارزش دارویی آن است. با توجه به نتایج جدول 1 مشاهده شد که بیشترین حضور مواد مؤثره اسانس آویشن به مونوترپن‌های فنلی فعال (تیمول) و پیش‌سازهای هیدروکربنی مونوترپنی مانند پی-سیمن و گاما-ترپینن تعلق دارد. در پژوهش حاضر، تنش شوری به اعمال تغییراتی در میزان تولید و تجمع این ترکیبات منجر شد به طوری که شوری در سطح 120 میلی‌مولار سبب افزایش و کاهش برخی از متابولیت‌های ثانویه گیاهچه‌های آویشن نسبت به شاهد گردید. با افزایش غلظت نمک تا سطح 120 میلی‌مولار میزان پی‌سیمن و گاما-‌ترپینن نسبت به گیاه شاهد افزایش و از میزان تیمول کاسته شد. گزارش‌های متناقضی از تأثیر تنش شوری بر میزان روغن‌های ضروری در گیاهان دارویی موجود است. برای نمونه، تنش شوری به کاهش این ترکیبات در Thymus maroccanus (Belaqziz et al., 2009)، Trachyspermum ammi.(Ashraf and Orooj, 2006) و Mentha piperita (Tabatabaie and Nazari, 2007) منجر شده است. این در حالی است که افزایش متابولیت‌های ثانویه و روغن‌های ضروری در Satureja hortensis (Baher et al., 2002) نیز گزارش‌ شده است. تحریک تولید متابولیت‌های ثانویه و روغن‌های ضروری تحت تنش شوری یا افزایش مقدار این ترکیبات می‌تواند به علت افزایش تراکم غدد ترشح‌کننده این ترکیبات یا افزایش تعداد این غدد باشد (Charles et al., 1990) یا به کاهش تولید متابولیت‌های اولیه در اثر شوری و در نتیجه در دسترس قرار گرفتن ترکیبات حد واسط برای تولید متابولیت‌های ثانویه نسبت داده شود (Morales et al., 1993). از سوی دیگر، کاهش آنابولیسم گیاهان تحت تنش شوری می‌تواند کاهش سنتز متابولیت‌های اولیه و تجمع مواد مؤثره گیاهان را در پی داشته باشد (Morales et al., 1993). در هر حال، تغییر در فعالیت آنزیم‌ها و متابولیسم گیاهی در اثر شوری، سطح متابولیت‌های ثانویه را در گیاهان دارویی دست خوش تغییر می‌نماید (Burbott and Loomis, 1969).

 

جمع‌بندی.

نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر نشان داد که تنش شوری و تنش اکسیداتیو ناشی از تیمار غلظت‌های نمک سبب القای پاسخ‌های فیزیولوژیک و افزایش فعالیت آنزیم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدان در گیاهچه‌های آویشن در شرایط درون‌شیشه‌ای می‌شود که می‌تواند در سازگاری و مقابله گیاهان در برابر شرایط تنش اهمیت داشته باشد. همچنین، تنش شوری به اعمال تغییراتی در میزان تولید و تجمع مواد مؤثره اسانس آویشن منجر گردید. بنابراین، شاید بتوان با تنظیم و بهینه‌سازی شرایط محیطی در شرایط کشت درون‌شیشه در مقاطعی از رشد رویشی گیاه از اعمال تنش شوری به منظور افزایش برخی متابولیت‌ها و مواد مؤثره در آویشن بهره‌برداری نمود.

 

سپاسگزاری.

نگارندگان از دانشگاه پیام نور و قطب تنش‌های گیاهی دانشگاه اصفهان برای همکاری با این پروژه تشکر و قدردانی می‌نمایند.

Abraham, I., Salamo, P., Koncz, C. and Szabados, L. (2011) Identification of Arabidopsis and Thellungiella genes involved in salt tolerance by novel genetic system. Acta Biologica Szegediensis 55(1): 53-57.

Ackerson, R. C. (1985) Osmoregulation of cotton in response to water stress III, effect of phosphorus fertility. Journal of Plant Physiology 77: 309-312.

Aebi, H. (1984) Catalase in vitro. Methods in Enzymology 105: 121-126.

Ahmad, P., Jeleel, C. A., Azooz, M. M. and Nabi, G. (2009) Generation of ROS and non-enzymatic antioxidants during abiotic stress in Plants. Botany Research International 2: 11-20.

Ashraf, M. (2009) Biotechnological approach of improving plant salt tolerance using antioxidants as markers. Biotechnology Advances 27: 84-93.

Ashraf, M. and Harris, P. J. C. (2004) Potential biochemical indicators of salinity tolerance in plants. Plant Science 166: 3-16.

Ashraf, M. and Orooj, A. (2006) Salt stress effects on growth, ion accumulation and seed oil concentration in an arid zone traditional medicinal plant ajwain (Trachyspermum ammi [L.] Sprague). Journal of Arid Environment 64(2): 209-220.

Baher, Z. F., Mirza, M., Ghorbanli, M. and Rezaii, M. B. (2002) The influence of water stress on plant height, herbal and essential oil yield and composition in Satureja hortensis L.. Flavour and Fragrance Journal 17: 275-277.

Barakat, N. A. M. (2011) Oxidative stress markers and antioxidant potential of wheat treated with phytohormones under salinity stress. Journal of Stress Physiology and Biochemistry 7(4): 250-267.

Bates, L. S., Waldern, R. W. and Treare, L. D. (1973) Rapid determination of free proline for stress students. Plant and soil 39: 205-207.

Bayuelo-Jimenez, J. S., Jasso-Plata, N. and Ochoa, I. (2012) Growth and physiological responses of Phaseolus species to salinity stress. International Journal of Agronomy 2012: 13-23.

Belaqziz, R., Romane, A. and Abbad, A. (2009) Salt stress effects on germination, growth and essential oil content of an endemic thyme species in Morocco (Thymus maroccanus Ball.). Journal of Applied Science and Research 5(7): 858-863.

Bennett, R. N. and Wallsgrove, R. M. (1994) Secondary metabolites in plant defense mechanisms. New Phytology 127: 617-633.

Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

Burbott, A. J. and Loomis, W. D. (1969) Evidence for metabolic turnover of monoterpenes in peppermint. Plant Physiology 44: 173-179.

Chalker-Scott, L. and Fnchigami, L. H. (1989) The role of phenolic compounds in plant stress responses. In: Low temperature stress physiology in crops (ed. Paul, H. L.) 67-79. CRC Press, Boca Raton.

Charles, D. J., Joly, R. J. and Simon, J. E. (1990) Effect of osmotic stress on the essential oil content and composition or peppermint. Phytochemistry 29: 2837-2840.

Charles, O., Joly, R. and Simon, J. E. (1994) Effect of osmotic stress on the essential oil content and composition of peppermint. Phytochemistry 29: 2837-2840.

Chaum, S. and Kirdmanee, C. (2009) Effect of salt stress on proline accumulation, photosynthetic ability and growth characters in two maize cultivars. Pakistan Journal of Botany 41:87-98.

Davies, N. W. (1990) Gas chromatographic retention indices of monoterpenes and sesquiterpenes on methylsilicon and carbowax 20M phases. Journal of Chromatography 503: 1-24.

Dixon, R. A. and Paiva, N. (1995) Stressed induced phenyl propanoid metabolism. Plant Cell 7(7): 1085-1097.

Eckhardt, U., Grimm, B. and Hortensteiner, S. (2004) Recent advances in chlorophyll biosynthesis and breakdown in higher plants. Plant Molecular Biology 56: 1-14.

Esmaeilzadeh Bahabadi, S. and Sharifi M. (2013) Increasing the production of plant secondary metabolites using biotic elicitors. Journal of Cell Tissue 4(2): 119-128.

Fidalgo, F., Santos, A., Santos, I. and Salema, R. (2004) Effect of long term salt stress on antioxidant defense system, leaf water relations and chloroplast ultrastructure of potato plants. Annals of Applied Biology 145: 185-192.

Foyer, C. H. and Noctor, G. (2003) Redox sensing and signaling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Physiolgia Plantarum 119: 355-364.

Giannopolitis, C. N. and Ries, S. K. (1977) Superoxide dismutase I. occurrence in higher plants. Plant Physiology 59: 309-314.

Gill, S. S., Tajrishi, M., Madan, M. and Tuteja, N. (2013) A DESD-box helicase functions in salinity stress tolerance by improving photosynthesis and antioxidant machinery in rice (Oryza sativa L. cv. PB1). Plant Molecular Biology 82(1-2): 1-22.

Hendawy, S. F. and Khalid, K. H. A. (2005) Response of sage (Salvia officinalis L.) plants to zinc application under different salinity levels. Journal of Appied Science and Research 1(2): 147-155.

James, R. A., Blake, C., Byrt, C. S. and Munns, R. (2011) Major genes for Na+ exclusion, Nax1 and Nax2 (wheat HKT1;4 and HKT1;5), decrease Na+ accumulation in bread wheat leaves under saline and waterlogged conditions. Journal of Experimental Botany 62(8): 2939-2947.

Jamil, M. and Rha, E. S. (2013) NaCl stress-induced reduction in growth, photosynthesis and protein in Mustard. Journal of Agricultural Science 5(9): 114-127.

Jouve, L., Hoffmann, L. and Hausman, J. F. (2004) Polyamine, carbohydrate, and proline content changes during salt stress exposure of Aspen (Populus tremula L.): involvement of oxidation and osmoregulation metabolism. Plant Biology 6:74-80.

Khodary, S. E. A. (2004) Effect of salicylic acid on the growth, photosynthesis and carbohydrate metabolism in salt stressed maize plants. International Journal of Agriculture and Biology 6(1): 5-8.

Lee, M. J., Son, J. E. and Oh, M. M. (2014) Growth and phenolic compounds of Lactuca sativa L. grown in a closed-type plant production system with UV-A, -B, or -C lamp. Journal Science Food Agricultural 94(2): 197-204.

Li, X. M., Tian, S. L. and Pang, Z. C. (2009) Extraction of Cuminum cyminum essential oil by combination technology of organic solvent with low boiling point and system distillation. Food Chemistry 115: 1114-1119.

Lichtenthaler, H. K. (1987) Chorophylls and carotenoids: pigments photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology 148: 350-382.

Matta, A. G. and Giai, I. (1969) Accumulation of phenol in tomato plant infected by different forms of Fusarium oxysporum. Phytphatology 59: 512-513.

Mattioli, R., Costantino, P. and Trovato, M. (2009) Proline accumulation in plants: not only stress. Plant Signal Behavavior 4(11): 1016-1018.

Morales, C., Cusido, R. M., Palazon, J. and Bonfill, M. (1993) Response of Digitalis purpurea plants to temporary salinity. Journal of Plant Nutrition 16(2): 327-335.

Munns, R. and Tester, M. (2008) Mechanisms of salinity tolerance. Annual Review of Plant Biology 59: 651-681.

Murakeozy, E. P., Nagy, Z. and Duhaze, C. Bouchereau A. and Tuza, Z. (2003) Seasonal changes in the levels of compatible osmolytes in three halophytic species of inland saline vegetation in Hungary. Plant Physiology 160(4): 395-401.

Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiolgia Plantarum 15: 473-497.

Mutlu, F. and Buzcuk, S. (2007) Salinity induced changes of free and bound polyamine levels in Sun flower (Helianthus annuus L.) roots differing in salt tolerance. Pakistan Journal of Botany 39: 1097-1102.

Nakamura, A., Fujiwara, S., Matsumoto, I. and Abe, K. (2010) Stress repression in restrained rats by (R)-(-)-linalool inhalation and gene expression profiling of their whole blood cells. Journal of Agriculture Food Chemistry 57(12): 5480-5485.

Nakano, Y. and Asada, K. (1981) Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiology 22: 867-880.

Navarro, J. M., Flores, P., Garrido, C. and Martinez, V. (2006) Changes in the contents of antioxidant compounds in pepper fruits at ripening stages, as affected by salinity. Food Chemisrtry 96: 66-73.

Rahnama, A., James, R. A., Poustini, K. and Munns, R. (2010) Stomatal conductance as a screen for osmotic stress tolerance in durum wheat growing in saline soil. Functional Plant Biology 37(3): 255-263.

Rai, M. K., Kalia, R. K., Singh, R., Gangola, M. P. and Dhawan, A. K. (2011) Developing stress tolerant plants through in vitro selection- an overview of the recent progress. Environmental and Experimental Botany 71: 89-98.

Rathore, S., Singh, N. and Singh, S. K. (2014) Influence of NaCl on biochemical parameters of two cultivars of Stevia rebaudiana regenerated in vitro. Stress Physiology and Biochemistry 10: 287-296.

Ravishankar, G. A. and Rao, S. R. (2000) Biotechnological production of phytopharmaceuticals. Plant Genetic Resources 4(1): 73-102.

Rustaiyan, A., Masoudi, S., Monfared, H., Kamalinejad, A, Lajevardi, M., Sedaghat, T. and Yari, S. (2000) Volatile constituents of three Thymus species grown wild in Iran. Planta Medica 66(2): 197-198.

Sancho, M. A., Milrad de Forchetii, S., Pliego, F., Valpuesta, V. and Quesada, M. A. (1996) Total peroxidase activity and isoenzymes in the culture medium of NaCl adapted tomato suspension cells. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 161-167.

Saxena, S., Kaur, H. and Verma, P. (2013) Osmoprotectants: potential for crop improvement under adverse conditions. In: Plant acclimation to environmental stress (Eds. Tuteja, N. and Singh Gill, S.) 197-232. Springer, New York.

Silva-Ortega, C. O., Ochoa-Alfaro, A. E., Reyes-Agüero, J. A., Aguado-Santacruz, G. A. and Jiménez-Bremont, J. F. (2008) Salt stress increases the expression of p5cs gene and induces proline accumulation in cactus pear. Plant Physiology and Biochemistry 46(1): 82-92.

Soto-Mendivil, E. A., Moreno-Rodriguez, J. F., Estarron-Espinosa, M., Garcia-Fajardo, J. A. and Obledo-Vazquez, E. N. (2006) Chemical composition and fungicidal activity of the essential oil of Thymus vulgaris against Alternaria citri. e-Gnosis 4: 16.

Sudha, G. and Ravishankar, G. A. (2003) Elicitation of anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota and involvement of calcium channel modulators. Current Science 84: 775-779.

Tabatabaie, S. J. and Nazari, J. (2007) Influence of nutrient concentration and NaCl salinity on growth, photosynthesis and essential oil content of peppermint and lemon verbena. Turkish Journal of Agriculture 31: 245-253.

Tavakkoli, E., Rengasamy, P. and McDonald, G. K. (2010) High concentrations of Na+ and Cl ions in soil solution have simultaneous detrimental effects on growth of faba bean under salinity stress. Journal of Experimental Botany 61: 4449-4459.

Trovato, M., Mattioli, R. and Costantino, P. (2008) Multiple roles of proline in plant stress tolerance and development. Rendiconti Lincei 19: 325-346.

Tuteja, N. and Sopory, S. K. (2008) Chemical signaling under abiotic stress environment in plants. Plant Signal Behavior 3(8): 525-536.

Verbruggen, N. and Hermans, C. (2008) Proline accumulation in plants: a review. Amino Acids 35: 753-759.

Waheed, A., Hafiz, I. A., Qadir, G., Murtaza, G., Mahmood, T. and Ashraf, M. (2006) Effect of salinity on germination, growth, yield, ionic balance and solute composition of pigeon Pea (Cajanus cajan (L.) Mill. sp.). Pakistan Journal of Botany 38: 1103-1117.

Wong, K. C., Ong, K. S. and Lim, C. L. (2006) Composition of the essential oil of rhizomes of Kaempferia Galanga L. Flavour and Fragrances Journal 7(5): 263-266.

Yaniv, Z. and Paleitch, D. (1982) Effect of drought on the secondary metabolites of medicinal and aromatic plants. In: Cultivation and utilization of medicinal plants (Eds. Atal, C. K. and Kapur, B. M.) 1: 1-12. Council of Scientific and Industrial Research, Jammu-Tawi.

Yemm, E. W. and Willis, A. J. (1954) The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. Biochemistry 57: 508-514.

Zarrini, G., Bahari-Delgosha, Z., Mollazadeh-Moghaddam, K. and Shahverdi, A. R. (2010) Post-antibacterial effect of thymol. Pharmaceutical Biology 48(6): 633-636.

Zhang, R. H., Li, J., Guo, S. R. and Tezuka, T. (2009) Effects of exogenous putrescine on gas exchange characteristics and chlorophyll fluorescence of NaCl-stressed cucumber seedlings. Photosynthesis Research 100: 155-162.