ساز و کار زوال در بذر نخود، ارتباط هیدرولیز قندها و پراکسیداسیون لیپید با واکنش‏های آمادوری و مایلارد

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زراعت، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکدة علوم پایه، دانشگاه گلستان، گرگان، ایران

3 گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

چکیده

این آزمایش برای مطالعة ساز و کار‏های زوال در بذر نخود ایرانی (Cicer arietinum L.) در شرایط انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی در آزمایشگاه تحقیقات بذر دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان در سال 1394 انجام شد. آزمایش به‌صورت طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار انجام شد. تیمارها شامل انبارداری طبیعی دو و چهار سال و زوال مصنوعی یک تا پنج روز با آزمون تسریع پیری با تیمار شاهد بودند. نتایج نشان داد با افزایش دورة زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی، درصد جوانه‏زنی کاهش یافت. با افزایش مدت زوال قندهای محلول، قندهای غیراحیایی و پروتئین محلول کاهش یافت؛ ولی میزان پراکسیداسیون لیپید، قندهای احیایی، نشاسته و کربونیلاسیون پروتئین و واکنش‏های آمادوری و مایلارد افزایش یافتند. در شرایط انبارداری طبیعی، میزان پراکسیداسیون لیپید بیشتر از هیدرولیز قندها ولی در شرایط زوال مصنوعی هیدرولیز قندها بیشتر از پراکسیداسیون لیپید بود. این نتایج نشان می‏دهد که دلیل اصلی وقوع واکنش‏های آمادوری و مایلارد در بذر‌های نخود و در شرایط انبارداری طبیعی، پراکسیداسیون لیپید و در شرایط زوال مصنوعی، هیدرولیز قندها است. همچنین نتایج نشان داد در شرایط انبارداری طبیعی نسبت به زوال مصنوعی، میزان واکنش آمادوری، بیشتر ولی واکنش مایلارد به میزان کمتری انجام شد؛ در‌حالی‌که، در شرایط زوال مصنوعی، میزان واکنش مایلارد بیشتر و واکنش آمادوری کمتری انجام شد. نتایج این پژوهش نشان داد که در شرایط زوال مصنوعی شدید، وقوع شدید واکنش مایلارد پس از واکنش آمادوری، خسارت بیشتری را به بذر اعمال کرد و در نهایت، قابلیت حیات بذر را کاهش و افت بیشتر درصد جوانه‏زنی را در شرایط زوال مصنوعی نسبت به انبارداری طبیعی سبب شد.
 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Ageing mechanisms in chickpea seeds: Relationship of sugar hydrolysis and lipid peroxidation with Amadori and Millard reactions

نویسندگان [English]

  • mahdi shaaban 1
  • farshid ghaderifar 1
  • hamidreza sadeghipour 2
  • ahad yamchi 3
1 Department of Agronomy, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
چکیده [English]

This experiment was performed in order to study on ageing mechanisms of chickpea seeds (Cicer arietinum L.) in natural storage and accelerated ageing conditions in seed laboratory of Gorgan Agricultural Science and Natural Resources, Gorgan, Iran at 2015. Experiment was in completely randomized design arrangement with four replications. Treatments were 2 and 4 years natural storage and 1-5 days of accelerated ageing with control treatment. The results showed that with increasing of natural storage and accelerated ageing duration, germination percentage was decreased. Increasing of ageing duration decreased soluble sugars, non-reducing sugars and soluble proteins but lipid peroxidation, reducing sugars, protein carbonylation and Amadori and Millard reaction were increased. In natural storage condition lipid peroxidation was more than sugar hydrolysis but in accelerated ageing condition sugar hydrolysis was more than lipid peroxidation. These results show that the main reason of Amadori and Millard reaction in chickpea seeds in natural storage condition is lipid peroxidation and in accelerated ageing condition is sugar hydrolysis. Also, the results showed that Amadori reaction in natural storage condition was more than Amadori reaction and in accelerated ageing condition Millard reaction was more than Amadori reaction. The results of the present study showed that sever Millard reaction after Amadori reaction induced higher damage on seed and results to more decrease of seed viability and reduce of seed germination percentage in accelerated ageing than natural storage.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • storage
  • Germination
  • accelerated ageing
  • reducing sugars

در مدت انبارداری، قابلیت حیات بذرها کاهش می‌یابد و این پدیده به‌طور طبیعی در همة بذرها اتفاق می‌افتد و سرعت وقوع آن به وضعیت فیزیولوژیک، ساختار بذر و شرایط انبارداری آن‏ها بستگی دارد (Ghaderi-Far et al., 2014a). انبارداری طولانی مدت و زوال تسریع شده، کاهش قدرت حیات و در نتیجه، کاهش درصد جوانه‏زنی بذرها را در شرایط مزرعه‏ای سبب می‌شود. Tahmasebi و همکاران (2015) بیان کردند که زوال، کاهش درصد جوانه‏زنی بذرها را سبب می‌شود و علت اصلی این پدیده کاهش قابلیت حیات بذر در مدت زوال است.

در شرایط زوال مصنوعی و همچنین انبارداری طبیعی، برخی تغییرات بیوشیمیایی زمینه‏ساز زوال بذر می‏شوند (McDonald, 1999). نظریه‏های محتمل در زمینة علت وقوع زوال در بذرها، خسارت به سیستم‏های زیستی بذر توسط گونه‏های فعال اکسیژن است. گونه‌های فعال اکسیژن در فرایندهایی از قبیل پراکسیداسیون لیپید، غیرفعال شدن سیستم آنتی‏اکسیدانی آنزیمی و غیرفعال شدن و تغییر شکل پروتئین‏های دخیل در فرایندهای زیستی و تخریب غشای سلولی تولید می‌شوند(McDonald, 1999; (Walters, 1998. به گفتة ‏Ghaderi-Far و همکاران (b2014) در مدت زوال بذر، رادیکال‏های آزاد با اثر خود بر پراکسیداسیون لیپید تسریع این پدیده را سبب می‌شوند.

با وجود تفاوت‏هایی که در شرایط وقوع زوال در شرایط مصنوعی و طبیعی وجود دارد این پرسش وجود دارد که آیا در این دو شرایط، سازوکار‏های دخیل در زوال بذر مشابه‌اند یا متفاوت؟ با توجه به بالا بودن رطوبت و دمای محیط در شرایط زوال مصنوعی، ممکن است سازوکارهای زوال در این شرایط نسبت به شرایط انبارداری طبیعی متفاوت باشد (Murthy and (Sun, 2000. Walters (1998) بیان کرد که در وقوع زوال بذر، سازوکار‌های متعددی وجود دارند. Wilson و McDonald (1999) اظهار داشتند که پراکسیداسیون لیپید و تخریب و کاهش فسفولیپیدهای غشا علت‌های اصلی زوال بذر هستند. در پژوهش‌های Koostra و Harrington (1969) روی بذرهای خیار، Priestley و Leopold (1983) روی بذرهای سویا و Matsuda و Hirayama (1973) روی بذرهای برنج بیان شد که پراکسیداسیون لیپید و تخریب فسفولیپیدهای غشاء نقش اندکی در زوال بذر در شرایط انبارداری طبیعی دارند یا هیچ نقشی در این زمینه ندارند. این نظریه‏ها به این دلیل است که در شرایط انبارداری طبیعی که دما و رطوبت محیط اندک است، سیتوپلاسم بذرها در یک حالت شیشه‌ای می‌باشند که ویسکوزیتة (گرانروی) زیاد و محتوای آب اندکی دارند که در این شرایط، تحرک مولکولی اندک در سیتوپلاسم، از وقوع بسیاری از فرایند‏های آسیب‏رسان جلوگیری می‌کند (Leopold et (al., 1994. در شرایط زوال مصنوعی که با افزایش دما و رطوبت نسبی محیط همراه است، ویسکوزیته سیتوپلاسم بذر کاهش می‌یابد و حالت ژله‏ای به خود می‌گیرد و در نتیجه، تحرک مولکولی و احتمال وقوع فرایند‏های آسیب‌رسان به سرعت افزایش می‏یابد (Murthy and Sun, 2000).

از جمله تغییراتی که در مدت زوال بذر ایجاد می‌شود تغییرات پس از ترجمه در پروتئین‏ها است (Hana and Salwa, 2014). از جملة این تغییرات، فرایندی به نام کربونیلاسیون پروتئین‏ها است که در آن، یکی از گونه‏های اکسیژن فعال به‌طور مستقیم به پیوند کربن - هیدروژن در پروتئین یا قند حمله می‌کند و گونه‏های کربونیل فعال تولید می‌کند که با پروتئین‏ها واکنش می‏دهند (Grune et al., 2013). کربونیلاسیون پروتئین‏ها در نهایت، کاهش عملکرد طبیعی و فعالیت کاتالیتیک پروتئین‏های هدف را باعث می‏شود (Nystrom, 2005). در مدت زوال، فرایند کربونیلاسیون پروتئین با شدت بیشتری انجام می‌شود (Dalle-Donne et al., 2003).

فرایند پراکسیداسیون لیپید با تولید آلدهیدها، کتون‏ها و الکل‏ها و فرایند هیدرولیز قندها با تولید قندهای احیایی، از دلایل اصلی زوال بذر با راه‌اندازی واکنش‏های غیرآنزیمی آمادوری و مایلارد هستند. این فرایند‌ها در هر دو شرایط زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی اتفاق می‌افتند (Murthy and Sun, 2000). واکنش‌های آمادوری و مایلارد یک‌سری از واکنش‏های پیچیده هستند که به دنبال واکنش کربونیل - آمین اولیه انجام می‌شوند. این واکنش‏ها به‌طور کلی چهار مرحله هستند: 1) تجمع غیرآنزیمی قندهای احیایی، آلدهید یا کتون‏ها که با گروه آمینی پروتئین‏ها یا نوکلئیک اسیدها ترکیب می‌شوند و تشکیل گلوکوزیل آمین می‏دهند (مرحلة بازگشت‌پذیر)؛
2) بازترتیبی گلوکوزیل آمین و در نهایت، تجمع تولید‌های آمادوری از قبیل 1- آمینو –آلفا - داکسی کتوز؛ 3) تخریب و دهیدراسیون تولید‌های آمادوری به ترکیبات حد واسط آمینو یا کربونیل؛ 4) واکنش ترکیبات حدواسط کربونیل با دیگر گروه‏های آمینو و به‌دنبال آن بازترتیبی و تولید ترکیبات نهایی گلیکوزیلاسیون ((Murthy and Sun, 2000. این واکنش‏ها قابلیت حیات بذر‌ها را کاهش می‏دهند (Baker and Bradford, 1994). Wettlaufer و Leopold (1991) بیان کردند که تجمع تولید‌های آمادوری و مایلارد کاهش جوانه‏زنی را در بذرهای سویا موجب شد. محور جنینی بذرها در تشکیل تولیدات آمادوری مستعد است. بین تجمع تولیدات آمادوری و پراکسیداسیون لیپیدی همبستگی وجود دارد (Murthy et al., 2003). بررسی‌ها نشان داده‌اند که زوال تسریع‌شده، کاهش قابلیت حیات بذرهای گندم را سبب شده که همگام با تجمع تولید‌های مایلارد بوده است (McDonald, 1999). نتایج کارStrelec و همکاران (2008) نشان داد در مدت زوال، گلیکوزیلاسیون غیرآنزیمی پروتئین‏های بذر گندم، به شکل‏گیری گلیکوزیل آمین در واکنش آمادوری منجر می‌شود. آن‌ها بیان کردند که شکل‏گیری تولیدات آمادوری به شرایط نگه‏داری بذر بستگی دارد. در بذرهای ماش (Wettlaufer and Leopold, 1991) و سویا (Murthy et al., 2003) زوال بذر، افزایش تجمع تولیدات آمادوری را سبب می‏شود. شرایط دمای پایین نگه‏داری بذرها، تغییرات اندکی در میزان تجمع تولیدات آمادوری سبب شد (Strelec et al., 2008). وقوع واکنش مایلارد خسارت به آنزیم‏ها و کاهش فعالیت آنزیمی را سبب می‏شود (Gamer et al., 1987 (Bonneau و همکاران (1994) گزارش کردند که زوال، خسارت به آنزیم‏های هیدرولیتیک را در بذر سویا و کاهش انتقال ذخایر و در ‌نتیجه، کاهش درصد جوانه‏زنی را سبب می‌شود. Murthy و همکاران (2003) بیان کردند که در بذرهای ماش، آنزیم‏های آنتی‏اکسیدان از قبیل کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز به واکنش‏های مایلارد حساس هستند. Taniguchi و همکاران (1989) بیان کردند که وقوع واکنش‏های مایلارد به کاهش میزان فعالیت آنزیم‏هایی از قبیل سوپراکسید دیسموتاز منجر می‌شود. Murthy و همکاران (2003) بیان کردند که قابلیت حیات بذرها به تجمع تولید‌های مایلارد حساس است و وقوع این واکنش، کاهش قابلیت حیات بذر را موجب می‌شود. آن ها بیان کردند که تجمع تولید‌های مایلارد، حتی پس از از‌بین‌رفتن کامل قابلیت حیات بذر و تبدیل آن به بذر مرده، ادامه دارد. Sun و Leopold (1995) بیان کردند که تجمع تولید‌های مایلارد در بذرهای زوال‌یافته اتفاق می‌افتد؛ ولی در بذرهای خشک نسبت به آب‌نوشی شده کمتر است. در رطوبت بذر حدود 8 تا 12 درصد، دلیل اصلی وقوع واکنش‏های آمادوری و مایلارد، پراکسیداسیون لیپید است. هنگامی‌که رطوبت بذر به کمتر از 6 درصد برسد، به‌دلیل اینکه بذرها در حالت شیشه‏ای قرار دارند و قندها هیدرولیز نمی‌شوند، دلیل اصلی زوال، اکسیداسیون خودبه‏خودی لیپیدها است؛ ولی در رطوبت‏های بیشتر، به دلیل هیدرولیز بیشتر قندها، دلیل اصلی زوال بذر، تجمع قندهای احیایی و وقوع واکنش‏های آمادوری و مایلارد است (McDonald, 1999).

شناخت سازوکارهای دخیل در زوال بذر، علاوه بر کمک به پژوهش‌های بعدی دربارة زوال بذر، درک بهتر چگونگی وقوع زوال بذر را ممکن می‌کند. بر همین اساس می‏توان اعمال مدیریتی را برای انبارداری بذرها و افزایش مدت نگه‏داری آن‌ها در انبار به کار برد. در حال حاضر، اطلاعات دربارة شناخت سازوکارهای شرکت‌کننده در زوال، اندک است و به آزمایش‌های بیشتری برای یافتن سازوکار‏های دخیل در زوال بذر به‌ویژه سازوکارهای شروع‌کنندة زوال، در شرایط انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی نیاز است. از این‌رو هدف از انجام این پژوهش، بررسی سازوکار‏های دخیل در زوال بذرهای نخود ایرانی (Cicer arietinum L.) در شرایط انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی و تفاوت‌های بین این‌دو است.

 

مواد و روش‏ها.

پژوهش حاضر، در آزمایشگاه تحقیقات بذر دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان در سال 1394 انجام شد. در این آزمایش بذر‌های نخود رقم هاشم که به‌مدت دو و چهار سال در شرایط طبیعی انبار نگه‏داری شده بودند، تیمارهای زوال طبیعی در نظر گرفته شدند. بذر‌های تازه برداشت شده برای نمونه‌های شاهد و تیمارهای زوال مصنوعی استفاده شدند. برای شبیه‏سازی زوال مصنوعی، بذرهای نخود در ظروف پلاستیکی به ابعاد 5/3 11 11 سانتی‌متر حاوی
50 میلی‌لیتر آب مقطر قرار داده شدند؛ سپس درب ظرف‌ها کاملاً بسته شد و به مدت یک، دو، سه، چهار و پنج روز در دمای ثابت43 درجة ‌سانتیگراد داخل انکوباتور قرار داده شد. در مدت آزمایش، رطوبت نسبی داخل ظرف‌های پلاستیکی 100 درصد بود.

برای انجام آزمون جوانه‏زنی، در هر تیمار زوال طبیعی و مصنوعی چهار تکرار 25 تایی از بذرها شمارش و روی دو عدد کاغذ حوله‌ای به ابعاد 45×30 سانتی‏متر قرار داده شد. روی بذرها با کاغذ دیگری پوشانده شد و به مدت هشت روز در دمای 20 درجة سانتیگراد قرار داده شد (Mohammadi et al., 2010). معیار جوانه‏زنی، خروج ریشه‏چه به میزان دو میلی‏متر در نظر گرفته شد (Soltani et al., 2006).

برای اندازه‏گیری صفات زیست‌شیمیایی مربوط به سازوکار زوال بذر نخود، از بذرهایی استفاده شد که به‌مدت 14 ساعت آب‌نوشی کرده بودند و وارد مرحلة دوم آب‌نوشی شده بودند. برای تعیین مراحل مختلف آب‌نوشی بذرهای نخود، از هر تیمار سه تکرار از بذرهای نخود، درون پتری‏دیش و به‌ مدت 52 ساعت در دمای 20 درجة سانتیگراد آب‌نوشی شدند و مراحل مختلف آب‌نوشی تعیین شد.

استخراج قندهای محلول، با اتانول و طبق روش Omokolo و همکاران (1996) با تغییراتی انجام شد. برای اندازه‏گیری قند کل، 100 میکرولیتر از عصارة الکلی تغلیظ شده و 100 میکرولیتر آب مقطر با 3 میلی‏لیتر معرف آنترون مخلوط و به‌مدت 20 دقیقه در بن‏ماری با دمای 100 درجة‏ سانتیگراد قرار داده شد؛ سپس میزان جذب نور هر‌یک از تیمارها پس از سرد‌شدن، با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV-1800، شرکت Shimadzu، ژاپن) در طول موج 620 نانومتر خوانده شد و با مقایسه با نمودار استاندارد گلوکز، میزان قند کل اندازه‏گیری شد ((McCready et al., 1950.

برای اندازه‌گیری قندهای احیایی، 5/1 میلی‏لیتر از عصارة تغلیظ شدة حاوی قندهای محلول، با 5/1 میلی‏لیتر از معرف دی نیترو سالیسیلیک اسید مخلوط شد و به مدت 20 دقیقه در بن‏ماری در دمای 90 درجة سانتیگراد قرار گرفت. بلافاصله، 5/0 میلی‏لیتر پتاسیم سدیم تارتارات 40 درصد به آن افزوده شد و پس از سرد‌شدن لوله‏ها، جذب نمونه در طول موج 575 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. با مقایسة نمودار استاندارد قندهای احیایی (گلوکز)، میزان قندهای احیایی هر‌ یک از نمونه‌ها محاسبه و اندازه‌گیری شد (Miller, 1959).

برای اندازه‏گیری قندهای غیراحیایی، 1/0 میلی‏لیتر از عصارة الکلی تغلیظ‌شده، با 1/0 میلی‏لیتر هیدروکسید پتاسیم 30 درصد مخلوط و به‌مدت 10 دقیقه در بن‏ماری با دمای 100 درجة سانتیگراد قرار داده شد. پس از سرد‌شدن لوله‏ها، 3 میلی‏لیتر معرف آنترون به آن افزوده شد و به‌ مدت 20 دقیقه در بن‏ماری با دمای 40 درجة سانتیگراد قرار گرفتند؛ سپس جذب هر یک از نمونه‏ها در طول موج 620 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. با مقایسة نمودار استاندارد ساکارز، قندهای غیراحیایی محاسبه شدند ((Handel, 1968.

برای استخراج و اندازه‏گیری نشاسته از روش McCready و همکاران (1950) با تغییراتی استفاده شد. مقدار 20 میکرو‌لیتر از عصارة حاوی نشاسته استخراج شد. در مرحلة بعد با 3 میلی‏لیتر از معرف آنترون مخلوط شد و به‌مدت 20 دقیقه در دمای 100 درجة سانتیگراد قرار گرفت. پس از سرد‌شدن لوله‏ها، جذب آن‌ها در طول موج 620 نانومتر با دستگاه خوانده شد. برای اندازه‏گیری مقدار نشاسته، از نمودار استاندارد قند کل (گلوکز) استفاده شد.

اندازه‏گیری پراکسیداسیون لیپید به روش Du و Bramlage (1992) با تغیراتی انجام شد. در این روش میزان پراکسیداسیون لیپید براساس مقدار مالون‌‌‌دیآلدهید (MDA) موجود در هر عصاره، با دستگاه اسپکتروفتومتر و طبق رابطة 1 محاسبه شد.

LP=[[(A532-A600)-[(A440-A600) (MA)]]/157000]×106

رابطة 1:

در این رابطه، LP، مقدار مالون‌دی‌آلدهید بر حسب نانومول بر میلی‏لیتر و MA، جذب مولی ساکارز در غلظت‌های 1 تا 10 میلی‌مولار در 532 و 440 نانومتر است که به‌ترتیب 4/8 و 147 محاسبه شد که نسبتی معادل 0571/0 است(Du and Bramlage, (1992. میزان پراکسیداسیون لیپید بر اساس نانومول مالون‌دی‌آلدهید موجود به ازای هر گرم بذر بیان شد.

برای اندازه‌گیری پروتئین محلول، مقدار100 میلی‏گرم بافت بذری (بر‌مبنای وزن تازه) با 2 میلی‏لیتر بافر استخراج، هموژنیزه شد. پس از سانتریفیوژ‌ کردن نمونه‏ها، از فاز بالایی برای اندازه‌گیری پروتئین محلول استفاده شد. برای اندازه‏گیری پروتئین محلول، 10 میکرولیتر از عصارة پروتئینی به لوله‏های آزمایش منتقل و به آن 90 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد. به محلول حاصل، 5 میلی‏لیتر معرف برادفورد اضافه و به‌ مدت 2 دقیقه مخلوط شد. پس از 20 دقیقه، میزان جذب در طول موج 595 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. میزان پروتئین محلول در هر‌ یک از تیمارها، با مقایسه با نمودار استاندارد پروتئین، تعیین شد (Bradford, 1976).

برای استخراج و دیالیز پروتئین‏ها به‌منظور اندازه‏گیری واکنش‏های آمادوری، مایلارد و کربونیلاسیون پروتئین‏ها، ابتدا 5/0 گرم بافت بذری (بر مبنای وزن تازه) با شش میلی‏لیتر بافر استخراج، کاملاً هموژنیزه شد. عصارة حاصل، پس از صاف‌شدن و سانتریفیوژ، به مدت 16 ساعت داخل لوله‏های دیالیز با کات آف 8000 تا 10000 کیلودالتون دیالیز شد. از عصارة حاصل، برای اندازه‏گیری تولید آمادوری، مایلارد و کربونیلاسیون پروتئین‏ها استفاده شد(Sun (and Leopold, 1995.

اندازه‏گیری محصولات آمادوری در پروتئین بذر نخود بر اساس روش Wettlaufer و Leopold (1991)، با نیترو بلو تترازولیوم انجام شد. بدین‌منظور، مقدار 100 میکرولیتر عصارة دیالیز‌شده به یک میلی‏لیتر از معرف نیترو بلو تترازولیوم 5/0 میلی‏مولار در سدیم کربنات 100 میلی‏مولار با pH برابر 3/10، اضافه شد. محلول بلانک، حاوی 1100 میکرولیتر معرف نیترو بلو تترازولیوم بود. تغییرات جذب هر نمونه در طول موج 550 نانومتر به مدت 10 دقیقه و هر 30 ثانیه یک‏بار با دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت و فاصلة زمانی صفر تا
8 دقیقه برای محاسبة میزان محصولات آمادوری، استفاده شد.

میزان محصولات مایلارد با اندازه‏گیری میزان فلوئورسانس پروتئین‏های استخراج شده از بذر با دستگاه اسپکتروفلوئوریمتر (مدل F-2500، شرکت Hitachi، ژاپن) اندازه‏گیری شد (Sun and Leopold, 1995). بدین منظور، برای هر یک از نمونه‏ها به‌طور جداگانه در تکرار اول، میزان 3/0 گرم از پروتئین با طیف طول موج 320 تا 410 نانومتر تحریک و در طول موج ساطعی 270 تا 470 نانومتر اندازه‏گیری شدند. پیک به‌دست آمده در همة نمونه‏ها، با اندکی تغییر، 440/370 به دست آمد؛ سپس میزان تجمع تولید‌های مایلارد در سایر تکرارهای هر نمونه، با این دامنة طول موج اندازه‏گیری شد.

میزان کربونیلاسیون پروتئین‏ها بر اساس روش Reznick و Packer (1994) با اسپکتوفتومتری و با یک میلی‏لیتر از عصارة پروتئینی به دست آمده از عمل دیالیز (در محلول دی نیتروفنیل هیدرازین 10 میلی‏مولار در کلریدریک اسید 5/2‏ مولار) اندازه‌گیری شد. پس از استخراج پروتئین‏های کربونیل، جذب نمونه‏ها با تیمار بلانک آن‌ها در طول موج 375 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده و میزان کربونیلاسیون پروتئین، با ضریب خاموشی کمپلکس پروتئین - فنیل هیدرازین به مقدار 22000 بر مولار بر سانتی‏متر، اندازه‏گیری شد.

تجزیة داده‏ها با نرم افزار SAS و مقایسة میانگین‌ها با آزمون LSD در سطح 5 درصد انجام شد.

 

نتایج.

‌نتایج این پژوهش نشان داد که در تیمارهای زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی، قابلیت جوانه‏زنی بذر با افزایش شدت زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی کاهش یافت. با افزایش تعداد روزهای زوال، درصد جوانه‏زنی بذرها کاهش یافت؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان جوانه‏زنی در تیمار شاهد به میزان 96 درصد و کمترین میزان جوانه‏زنی به میزان‌ 24 درصد در تیمار پنج روز زوال، مشاهده شد (شکل 1). در تیمار سه روز زوال، درصد جوانه‏زنی بذر‌ها نسبت به شاهد حدود 15 درصد کاهش یافت و در تیمار چهار سال انبارداری نیز افت جوانه‏زنی بذرها به همین میزان بود. در تیمارهای انبارداری طبیعی دو و چهار سال نسبت به تیمارهای زوال‏ شدید چهار و پنج روز، افت درصد جوانه‏زنی کمتری مشاهده شد و تیمار سه روز با تیمار چهار سال تفاوت معنی‏داری نداشت.

 

شکل 1- اثر زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی بر درصد جوانه‏زنی بذرهای نخود ایرانی - مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‏دار با استفاده از آزمون LSD است.

تیمار شاهد، بیشترین و تیمار زوال مصنوعی پنج روز، کمترین میزان قندهای محلول را داشتند. افزایش شدت زوال مصنوعی کاهش میزان قندهای محلول را سبب شد. در حالت انبارداری طبیعی نیز با افزایش مدت انبارداری، میزان قندهای محلول کاهش یافت. زوال مصنوعی شدید چهار و پنج روز نسبت به انبارداری طبیعی دو و چهار سال، اثر بیشتری بر میزان قندهای محلول داشت و کاهش میزان قندهای محلول در تیمارهای زوال مصنوعی چهار و پنج روز، بیشتر از تیمارهای انبارداری طبیعی دو و چهار سال بود. میزان قندهای محلول در انبارداری طبیعی چهار سال تقریبا مشابه زوال مصنوعی سه روز بود (شکل 2-A).

بیشترین میزان قندهای احیایی، مربوط به تیمار زوال سه روز و کمترین میزان آن نیز مربوط به تیمار زوال مصنوعی پنج روز بود. در زوال مصنوعی، با افزایش روزهای زوال تا سه روز، میزان قندهای احیایی افزایش یافت و از آن به بعد در تیمارهای زوال چهار و پنج روز، روند کاهشی را نشان داد. در تیمارهای زوال طبیعی نیز میزان قندهای احیایی در تیمار انبارداری دو سال، کمتر از تیمار انبارداری چهار سال بود. در تیمار انبارداری چهار سال، میزان تولید قندهای احیایی، بیشتر از زوال مصنوعی چهار و پنج روز بود؛ در‌حالی که در انبارداری دو سال، میزان قندهای محلول، تنها از زوال مصنوعی پنج روز، بیشتر و نسبت به سایر تیمارهای زوال مصنوعی، کمتر بود (شکل 2-B).

برخلاف قندهای احیایی، تولید قندهای غیراحیایی در زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی روند کاهشی را نشان داد؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان تولید قندهای غیراحیایی مربوط به تیمار شاهد و کمترین میزان آن مربوط به تیمار زوال پنج روز بود. تولید قندهای غیراحیایی در تیمار انبارداری چهار سال، بیشتر از تیمارهای زوال مصنوعی سه، چهار و پنج روز بود؛ ولی از سایر تیمارهای زوال مصنوعی، کمتر بود. در تیمارهای انبارداری طبیعی نیز با افزایش مدت انبارداری بذر میزان قندهای غیر احیایی کاهش یافت (شکل 2-C).

کمترین میزان تجمع نشاسته، در تیمار شاهد دیده شد. بیشترین میزان تجمع نشاسته، مربوط به تیمار زوال پنج روز بود. با افزایش شدت زوال مصنوعی و همچنین افزایش مدت انبارداری طبیعی، پس از
14 ساعت آب‌نوشی بذرها میزان تجمع نشاسته نیز افزایش یافت. تجمع نشاسته در تیمار انبارداری دو سال، مشابه زوال مصنوعی یک روز بود و تنها از تیمار شاهد بیشتر بود؛ ولی در تیمار انبارداری چهار سال، تجمع نشاسته از تیمارهای شاهد و زوال یک روز، بیشتر بود و نسبت به سایر تیمارهای زوال مصنوعی، کمتر بود (شکل 2-D).

 

 

 

شکل 2- اثر زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی بر میزان قندهای محلول، احیایی، غیر احیایی و نشاسته در بذرهای آب‌نوشی شدة نخود ایرانی -

مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‏دار با استفاده از آزمون LSD است.

 

تولید مالون‌دی‌آلدهید در تیمارهای زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی، با افزایش شدت زوال و مدت انبارداری بذر‌ها، روند افزایشی داشت. بیشترین تولید مالون‌دی‌آلدهید مربوط به تیمار انبارداری چهار سال بود که نشان‌دهندة پراکسیداسیون لیپید بیشتر در این تیمار است (شکل3). در تیمار انبارداری چهار سال، میزان تولید مالون‌دی‌آلدهید نسبت به تیمار دو سال، بیشتر بود و تفاوت بین آن‌ها هم معنی‏دار بود. در تیمار بین تیمار زوال دو روز و انبارداری دو سال نیز از این نظر تفاوت معنی‏داری وجود نداشت.

 

شکل 3- اثر زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی بر میزان مالون‌دی‌آلدهید بذرهای آب‌نوشی‌شدة نخود ایرانی -

مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‏دار با استفاده از آزمون LSD است.

با افزایش تعداد روزهای زوال مصنوعی، میزان پروتئین محلول در بذرهای نخود ایرانی روند کاهشی داشت؛ ولی میزان پروتئین محلول، در تیمار زوال دو روز، بیشتر از زوال مصنوعی یک روز بود. میزان پروتئین محلول در حالت انبارداری طبیعی بیشتر از زوال مصنوعی بود و مشاهده شد که بین تیمارهای مختلف انبارداری طبیعی از این نظر تفاوت معنی‏داری وجود نداشت. میزان پروتئین محلول، در تیمارهای انبارداری دو و چهار سال، با تیمار زوال مصنوعی دو روز تفاوت معنی‏داری نداشت (شکل 4-A).

‌در مدت زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی، تغییراتی در کربونیلاسیون پروتئین بذرهای نخود مشاهده شد. نتایج این بررسی نشان داد که با افزایش شدت زوال مصنوعی و همچنین افزایش مدت انبارداری طبیعی، میزان کربونیلاسیون پروتئین افزایش یافت. میزان کربونیلاسیون پروتئین در تیمارهای انبارداری طبیعی از تیمارهای زوال مصنوعی چهار و پنج روز، کمتر بود. میزان کربونیلاسیون پروتئین‏ها در تیمارهای زوال مصنوعی یک تا چهار روز با تیمارهای انبارداری طبیعی دو و چهار سال تفاوت معنی‏داری نداشت (شکل 4-B).

 

 

شکل 4- اثر زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی بر میزان پروتئین محلول و کربونیلاسیون پروتئین‏ها در بذرهای آب‌نوشی‌شدة نخود ایرانی -

مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‏دار با استفاده از آزمون LSD است.

 

افزایش مدت انبارداری و همچنین افزایش شدت زوال مصنوعی، افزایش تولید و تجمع محصولات آمادوری را موجب شد. بیشترین میزان تجمع تولید‌های آمادوری مربوط به تیمار انبارداری چهار سال، بود و همچنین تیمار شاهد کمترین میزان تجمع تولید‌های آمادوری را داشت. تجمع تولید‌های آمادوری در تیمارهای زوال مصنوعی تا زوال سه روز، افزایش و در تیمارهای چهار و پنج روز دوباره کاهش یافت. تجمع تولید‌های آمادوری در تیمارهای زوال مصنوعی شدید نسبت به تیمارهای انبارداری طبیعی چهار سال، کمتر بود که نشان‌دهندة نمود بیشتر واکنش آمادوری در شرایط انبارداری طبیعی است (شکل 5-A).

زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی، میزان واکنش مایلارد را افزایش می‌دهند. بیشترین میزان تجمع تولید‌های مایلارد در تیمار زوال مصنوعی پنج روز، مشاهده شد. درصد وقوع واکنش مایلارد در تیمار انبارداری طبیعی چهار سال، نسبت به تیمارهای زوال مصنوعی چهار و پنج روز، کمتر بود. این نتایج نشان داد که افزایش شدت زوال مصنوعی تا پنج روز، بیشترشدن تجمع تولید‌های مایلارد را نسبت به شرایط انبارداری طبیعی دو و چهار سال، سبب شد. کمترین میزان تجمع تولید‌های مایلارد نیز در تیمار شاهد حاصل شد. درصد افزایش تولید‌های مایلارد در تیمار زوال پنج روز،
80 درصد بود؛ ولی این تجمع در تیمار دو و چهار سال، به‌ترتیب به 10 و 45 درصد رسید (شکل 5-B).

 

 

شکل 5- اثر زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی بر تجمع تولید‌های آمادوری و مایلارد در بذرهای نخود ایرانی-

مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‏دار با استفاده از آزمون LSD است.

 


بحث.

‌درصد جوانه‏زنی در زوال تسریع‌شده به‌ویژه زوال چهار و پنج روز، بیشتر از انبارداری طبیعی کاهش یافت؛ به‌طوری‌که در شرایط انبارداری پنج روز، درصد جوانه‏زنی به‌ میزان 20 درصد تیمار شاهد رسید. در شرایط مختلف زوال طبیعی و مصنوعی، دما و رطوبت نسبی محیط بر میزان جوانه‏زنی بذرها اثر گذاشت و در شرایط زوال مصنوعی، رطوبت و دمای محیط بیشتر بود؛ در ‌نتیجه، میزان خسارت وارد شده به بذر نخود بیشتر از انبارداری طبیعی و کاهش درصد جوانه‏زنی نیز بیشتر از انبار‌داری طبیعی بود که با نتایج سایر محققان مطابقت داشت(Akhter et al., (1992; Nkang and Umoh, 1997.

ذخایر بذری شامل مولکول‏های پیچیده‏ای هستند (Bewley and Black, 1994). پروتئین‏ها، چربی‏ها و کربوهیدرات‏ها از‌جمله ماکرومولکول‏های ضروری برای انجام فرایند جوانه‏زنی هستند زیرا بخشی از اسیدهای چرب آزاد و قندهای محلول، در مدت زوال بذر تخریب می‌شوند و برای تأمین انرژی و بیوسنتز ترکیبات جدید کاربردی ندارند (McDonald, 1999). کاهش درصد جوانه‏زنی با کاهش میزان قندهای محلول و قندهای غیراحیایی و افزایش میزان قندهای احیایی و نشاسته همراه بود. Ghaderi-Far و همکاران (a2014) بیان کردند که زوال، افزایش قندهای احیایی و کاهش میزان قندهای غیراحیایی در بذرهای کدو تخم کاغذی را سبب شد. در پژوهش حاضر مشاهده شد که میزان قندهای محلول با افزایش شدت زوال کاهش یافت که این پدیده در تیمارهای زوال مصنوعی، شدیدتر از تیمارهای انبارداری طبیعی بود. کاهش میزان ساکارز، رافینوز و استاکیوز می‏تواند بر خاصیت نفوذپذیری غشا اثر بگذارد و افزایش میزان قندهای احیایی را باعث شود که می‏تواند به تخریب ترکیبات پروتئینی منجر شود (Marcos-Filho, 2005). افزایش میزان قندهای احیایی تا شدت زوال سه روز نشان‌دهندة دخالت این پدیده در فرایند زوال بذر است. Murthy و Sun (2000) در بررسی خود روی ماش بیان کردند که افزایش هیدرولیز قندها در مدت انبارداری طبیعی و تبدیل آن‏ها به قندهای احیایی از قبیل گلوکز، فروکتوز و گالاکتوز، دلیل اصلی وقوع واکنش‏های آمادوری و مایلارد بود که در نهایت به زوال بذر منجر می‏شود. در مدت زوال مصنوعی با افزایش آبگیری بذر فعالیت آنزیم‏های هیدرولیزکنندة قندها از قبیل اینورتاز و آلفا -گالاکتوزیداز افزایش میزان قندهای احیایی را سبب می‏شوند (Wettlaufer and Leopold, 1991). با افزایش مدت تیمار زوال مصنوعی تا پنج روز، بذرها در معرض رطوبت بیشتری قرار گرفتند که این رطوبت زیاد، فعالیت آنزیم‏های یاد‌شده را افزایش داد و در نهایت، بذرها میزان قندهای احیایی بیشتری نسبت به انبارداری طبیعی تولید کردند (Viviana et al., (2010. Braccini و همکاران (2001) و Marcos-Filho (2005) بیان کردند که در مدت زوال بذر میزان قندهای محلول، کاهش ولی قندهای احیایی افزایش یافتند. Lugo-Bernal و Leopold (1992) بیان کردند که افزایش میزان قندهای محلول، در مدت زوال بذر کاهش میزان سوبسترای لازم را برای تنفس بذر باعث شد و در نهایت، قابلیت حیات و جوانه‏زنی بذر را کاهش داد. Sun و Leopold (1993) و همچنین Leopold و همکاران (1992) گزارش کردند که حالت شیشه‌ای بذر خشک، افزایش قابلیت انبارداری آن‌ها را سبب می‏شود. آن‌ها بیان کردند که حالت کریستالی بذر‌ها از هیدرولیز قندها و در نتیجه، کند‌شدن روند زوال بذر جلوگیری می‏کند. در بررسی حاضر نیز مشخص شد در شرایط انبارداری طبیعی، میزان جوانه‏زنی پس از آب‌نوشی، بیشتر از حالت زوال مصنوعی شدید بود. به نظر می‏رسد که بیشتر‌ بودن میزان قندهای محلول، در شرایط انبارداری طبیعی، با قابلیت حیات بذر رابطة مثبتی داشته باشد. Corte و همکاران (2006) نیز بیان کردند که مقادیر زیاد کربوهیدرات‌های محلول در بذرها، علاوه بر تأمین انرژی لازم برای بذر در زمان جوانه‏زنی، عاملی مهم در تعیین قابلیت انبارداری طولانی ‏مدت آن‌ها است. ارتباط افزایش میزان قندهای محلول با افزایش قابلیت انبارداری بذرها به‌ دلیل نقش مهم قندها در نگه‏داری غشاها و نفوذپذیری پروتئین‏های غشایی در شرایط رطوبت اندک انبار است (Carpenter et al., 1987).

McDonald (1999) بیان کرد که در رطوبت 8 تا 12 درصد بذرها، اکسیداسیون خود‌به‌خودی لیپید‏ها افزایش یافت. همچنین در شرایطی که بذر رطوبت اندکی داشت، میزان هیدرولیز قندها در آن بسیار اندک بود و دلیل اصلی زوال در این شرایط، پراکسیداسیون لیپید بود. در پژوهش حاضر، میزان پراکسیداسیون لیپید در تیمارهای انبارداری طبیعی بیشتر از تیمارهای زوال مصنوعی بود. به گفتة Goel و همکاران (2003) افزایش میزان تولید مالون‌دی‌آلدهید و نشت الکترولیت‏ها بخش درخور توجهی از کاهش قابلیت جوانه‏زنی بذر‌ها و رشد گیاهچه را توجیه می‏کند. افزایش میزان تولید مالون‌دی‌آلدهید، ناشی از افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن در بذر بود که خود ممکن است ناشی از ضعف سیستم آنتی‏اکسیدان باشد (Bailly, 2004).

بیشترین میزان پروتئین محلول مربوط به تیمار شاهد بود. با افزایش شدت زوال مصنوعی و همچنین افزایش مدت نگه‏داری بذرها در انبار، میزان پروتئین محلول کاهش و میزان کربونیلاسیون پروتئین افزایش یافت. کاهش میزان پروتئین محلول در تیمارهای انبارداری طبیعی نسبت به تیمارهای زوال مصنوعی کمتر بود. محققان دیگر نیز بیان کردند که افزایش شدت زوال، کاهش میزان سنتز پروتئین را در بذر سبب می‏شود (McDonald, 1999; Basra et al., 2003). McDonald (1999) بیان کرد که در مدت زوال بذر، آسیب به DNA به فرایند پروتئین‏سازی آسیب می‌زند و در نهایت، میزان پروتئین محلول لازم برای جوانه‏زنی بذر کاهش می‏یابد. با افزایش شدت زوال، میزان کربونیلاسیون پروتئین‏ها افزایش یافت که این میزان در تیمارهای انبارداری طبیعی کمتر از زوال مصنوعی بود. در شرایط انبارداری طبیعی، میزان قندهای محلول نسبت به شرایط زوال مصنوعی، بیشتر بود؛ به همین دلیل تجمع قندهای احیایی در آن‌ها کمتر از زوال مصنوعی بود و در‌ نهایت، میزان کربونیلاسیون پروتئین‏ها در این تیمار نسبت به زوال مصنوعی، کمتر بود.

واکنش‎های آمادوری و مایلارد به دنبال حملة غیرآنزیمی ساده به گروه‏های آمینواسیدی پروتئین‏ها و نوکلئیک اسیدها با قندهای احیایی و آلدهیدها انجام می‌شود (Murthy et al., 2003; Ryoji et al., 2012). این واکنش‏ها در فعالیت آنزیم‏های ترمیمی دخالت می‌کنند؛ به‌طوری‌که در مدت زوال کاهش فعالیت برخی آنزیم‏های ترمیمی DNA را از قبیل DNA لیگاز سبب می‌شود. با‌ توجه به اینکه این آنزیم یکی از آنزیم‎های اصلی کنترل‌کنندة تغییر در ویژگی‎های ژنتیکی بذر است، آسیب به آن در مدت زوال می‏تواند کاهش کارایی بذرهای زوال دیده را شود(Osborne, (1980. Wettlaufer و Leopold (1991) بیان نمودند بین تجمع تولید‌های مایلارد با زوال بذر ارتباط نزدیکی وجود دارد. قندهای احیایی، نیرو محرکة اولیه برای شروع اجباری واکنش‎های آمادوری و مایلارد هستند و از این نظر ضروری هستند(Veselovsky and (Veselova, 2012; Colville et al., 2012. در ادامة واکنش و با افزایش میزان قندهای احیایی یا آلدهیدها و کتون‎ها، واکنش‏های آمادوری و مایلارد افزایش می‏یابند. در شدت‎های زوال مصنوعی شدید (چهار و پنج روز) میزان قندهای احیایی تولید شده بیشتر از شرایط انبارداری طبیعی بود و تجمع تولید‌های آمادوری و مایلارد نیز در این تیمارها بیشتر بود. Murthy و همکاران (2003) بیان کردند که در مدت زوال بذر، اضافه‌شدن قندهای احیایی به پروتئین‏ها به‌صورت غیرآنزیمی، غیرفعال شدن آنزیم‏های آنتی‏اکسیدان را سبب می‌شود. به عقیدة Hanan و Salwa (2014) با افزایش تجمع تولید‌های آمادوری، تغییرات پس از ترجمه در برخی از پروتئین‏های سیستم آنتی‏اکسیدانی آنزیمی ایجاد می‌شود که کاهش کارایی این سیستم و ضعف در جوانه‏زنی بذر را سبب می‌شود. Sun و Leopold (1995) در بررسی خود روی بذرهای سویا بیان کردند که در مدت انبارداری، قندهای احیایی ناشی از هیدرولیز رافینوز و استاکیوز افزایش یافت و به‌ دنبال آن واکنش آمادوری و مایلارد نیز انجام شد. نتایج پژوهش حاضر نیز افزایش میزان تجمع تولید‌های آمادوری و مایلارد را با افزایش شدت زوال مصنوعی و همچنین افزایش مدت انبارداری طبیعی نشان داد.

محققان بیان کرده‏اند که در آغاز سازوکار‏های دخیل در زوال مصنوعی و طبیعی، شباهت بسیار و در مراحل بعدی این سازوکار‌ها و نیز سرعت آن‌ها تفاوت وجود دارد(Delouche and Baskin, 1973; Santos (and Paol, 2007. برخی دیگر از محققان بیان کرده‏اند که در شرایط زوال مصنوعی، یک‌سری وقایع متابولیک دیگر اتفاق می‌افتد که ممکن است در شرایط انبارداری طبیعی اتفاق نیفتد (Bailly et al., 1996; Fanan et (al., 2006. Lugo-Bernal و Leopold (1992) بیان کردند که افزایش قندهای احیایی از قبیل گالاکتوز می‏تواند به تخریب پروتئین و در نهایت، کاهش کیفیت بذرهایی منجر شود که به‌طور مصنوعی زوال یافته‏اند؛ در‌ حالی‌که قندهای احیایی از عوامل اصلی دخیل در واکنش‎های بازترتیبی یا ایزومریزاسیون آمادوری و مایلارد هستند. Locher و Bucheli (1998) بیان کردند که در مدت زوال مصنوعی افزایش میزان قندهای احیایی، تسریع زوال بذر را با تخریب ساختاری ترکیبات پروتئینی و در نهایت، کاهش حیات بذر را سبب می‌شود. در بررسی حاضر مشاهده شد که در زوال مصنوعی شدید، میزان کربونیلاسیون پروتئین‏ها بیشتر از انبارداری طبیعی بود. افزایش میزان قندهای احیایی در شدت‏های زیاد زوال مصنوعی آسیب را به پروتئین‎‏ها سبب شد که خود افزایش بیشتر کربونیلاسیون پروتئین‏ها را در تیمار زوال مصنوعی نسبت به انبارداری طبیعی موجب شد. کربونیلاسیون پروتئین‏ها می‏تواند در ساعات ابتدایی جوانه‏زنی خسارات جبران‌ناپذیری به بذر وارد کند و کاهش معنی‏دار درصد جوانه‏زنی را باعث شود (Simontacchi (et al., 1993. با افزایش میزان کربونیلاسیون پروتئین‏ها، درصد جوانه‏زنی کاهش یافت. با توجه به بیشتر بودن میزان کربونیلاسیون پروتئین‏ها در تیمارهای زوال مصنوعی شدید، افت درصد جوانه‏زنی در این تیمار نسبت به تیمار انبارداری طبیعی بیشتر بود.

علاوه بر هیدرولیز قندها، پراکسیداسیون لیپید نیز آغازی برای واکنش‎های غیرآنزیمی آمادوری و مایلارد و در نهایت، تخریب پروتئین و DNA است (Murthy and Sun, 2000; Bhatia et al., 2010). Murthy و Sun (2000) بیان کردند که در مدت زوال بذر، ممکن است هر دو آن‌ها با هم یا تنها یکی از آن‌ها انجام شود که بستگی به شرایط دارد. در شرایطی که رطوبت بذر اندک است، پراکسیداسیون لیپید به دلیل هیدرولیز‌نشدن قندها، علت اصلی وقوع و آغاز واکنش‎های آمادوری و مایلارد است(Murthy (and Sun, 2000. در بررسی حاضر، مشخص شد که در هر دو شرایط انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی، هر دو فرایند اتفاق می‌افتد؛ ولی میزان آن‌ها در شرایط انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی متفاوت است. دلایل اصلی زوال بذر، هر کدام به‌طور جداگانه بر وقوع دو واکنش آمادوری و مایلارد اثر می‏گذارند. قندهای احیایی ناشی از هیدرولیز قندها و همچنین آلدهیدها، کتون‏ها و الکل‌های تولیدی ناشی از پراکسیداسیون لیپید با گروه آمینی پروتئین‏ها واکنش می‌دهند و وقوع این دو واکنش را سبب می‌شوند (Wettlaufer and (Leopold, 1991; Sun and Leopold, 1995. نتایج پژوهش حاضر، نشان داد که در بین تیمارهای زوال مصنوعی، بیشترین میزان تجمع تولید‌‌های مایلارد، در تیمار زوال پنج روز و به میزان 95 درصد نسبت به تیمار شاهد بود. در بین تیمارهای انبارداری طبیعی نیز بیشترین میزان تجمع تولید‌های مایلارد به تیمار انبارداری چهار سال و به میزان 45 درصد نسبت به تیمار شاهد تعلق داشت. از سویی، میزان تجمع تولید‌های مایلارد در تیمارهای زوال مصنوعی چهار و پنج روز (به ترتیب 58 و 95 درصد نسبت به تیمار شاهد) بیشتر از تیمارهای انبارداری طبیعی دو و چهار سال (به ترتیب 14 و 45 درصد نسبت به تیمار شاهد) بود. در تیمار زوال مصنوعی سه روز، بیشترین میزان واکنش آمادوری در تیمارهای زوال مصنوعی و حدود 300 درصد تیمار شاهد بود؛ ولی در تیمار انبارداری طبیعی چهار سال، میزان وقوع واکنش‏های آمادوری به حدود 500 درصد تیمار شاهد رسید. به نظر Murthy و Sun (2000) دلایل اصلی وقوع واکنش آمادوری و مایلارد به‌ترتیب، پراکسیداسیون لیپید و هیدرولیز قندها است. نتایج این آزمایش نشان داد تجمع تولیدهای آمادوری در شرایط انبارداری طبیعی، بیشتر از شرایط زوال مصنوعی بود. همچنین در شرایط انبارداری طبیعی چهار سال میزان تجمع تولید‌های مایلارد حدود 50 درصد شرایط زوال مصنوعی پنج روز بود. این نتایج نشان دادکه پراکسیداسیون لیپید و هیدرولیز قندها، دلایل اصلی وقوع واکنش‎های آمادوری و مایلارد، هر کدام به‌طور جداگانه بر این واکنش‏ها اثر گذاشته‏اند. در حالت انبارداری طبیعی به دلیل کم‌بودن دما و رطوبت محیط، میزان پراکسیداسیون لیپید نسبت به هیدرولیز قندها اثر بیشتری بر زوال بذر داشت؛ ولی در حالت زوال مصنوعی به دلیل زیاد‌بودن میزان رطوبت محیط، تجمع قندهای احیایی افزایش یافت و اثر بیشتری بر وقوع زوال بذر داشت. به نظر می‏رسد پیش‌روی زوال بذر تا وقوع واکنش‏ مایلارد که پس از واکنش‎ آمادوری اتفاق می‌افتد، کاهش شدید قدرت حیات بذر و در نهایت، کاهش درصد جوانه‏زنی بذرها را باعث شده است. به هرحال، این نتایج بیان می‌کند که در شرایط انبارداری طبیعی، واکنش‎ آمادوری نسبت به واکنش‏ مایلارد دخالت بیشتری در زوال بذر داشته است؛ ولی در شرایط زوال مصنوعی علاوه بر واکنش آمادوری، واکنش مایلارد بیشتر افزایش یافته است و کاهش بیشتر جوانه‏زنی بذر را نسبت به انبارداری طبیعی موجب شده است (شکل 6).

 

 

بذر

 

شرایط زوال مصنوعی مصنوعی

 

شرایط انبارداری طبیعی

 

پراکسیداسیون لیپید

 

هیدرولیز قندها

 

هیدرولیز قندها

 

پراکسیداسیون لیپید

 

واکنش مایلارد

 

واکنش آمادوری

 

واکنش مایلارد

 

واکنش آمادوری

 

درصد جوانه‏زنی

 

درصد جوانه‏زنی

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 6- شمای کلی سازوکار‏های اثر‌گذار بر زوال بذر نخود در مدت انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی

 


جمع‌بندی

کاهش درصد جوانه‏زنی در شرایط زوال مصنوعی و انبارداری طبیعی، به‌دلیل کاهش قابلیت حیات بذر‌های نخود است. در هر دو شرایط انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی، واکنش‎هایی انجام می‌شوند که بذر را به سمت زوال و در‌نتیجه، کاهش جوانه‏زنی سوق می‌دهند. در شرایط انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی در وقوع زوال شباهت‏هایی وجود دارد؛ ولی سازوکار اصلی زوال در این دو شرایط متفاوت است. در شرایط انبارداری طبیعی، تولید قندهای احیایی نسبت به شرایط زوال مصنوعی کمتر ولی میزان پراکسیداسیون لیپید، بیشتر است. در شرایط زوال مصنوعی، تولید بیشتر قندهای احیایی، ترکیب شدن آن‌ها را با پروتئین‏های بذر، افزایش میزان کربونیلاسیون پروتئین و در نهایت کاهش میزان پروتئین محلول را نسبت به انبارداری طبیعی سبب شد. بررسی حاضر مشخص کرد که در مراحل زوال بذرهای نخود در مدت انبارداری طبیعی و زوال مصنوعی، سازوکار‏های متفاوتی نقش دارند؛ به‌طوری‌که در شرایط انبارداری طبیعی، میزان پراکسیداسیون لپیید و در شرایط زوال مصنوعی، هیدرولیز قندها نقش مهمی در وقوع واکنش‏های آمادوری و مایلارد و در نهایت، زوال بذر دارند. در شرایط انبارداری طبیعی، وقوع واکنش آمادوری و در شرایط زوال مصنوعی، وقوع واکنش مایلارد بیشتر بود. با توجه به افت بیشتر درصد جوانه‏زنی در تیمارهای زوال مصنوعی شدید نتیجه گرفت که وقوع واکنش مایلارد که مرحله‏ای پس از واکنش آمادوری است، بیشتر به بذرها آسیب می‌زند و بیشتر درصد جوانه‏زنی را کاهش می‌دهد.

 

سپاسگزاری.

در اینجا از دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان بابت فراهم‌کردن امکانات انجام این پژوهش سپاسگزاری می‏شود.

 

Akhter, F. N., Kabir, G., Mannan, M. A. and Shaheen, N. N. (1992) Aging effect of wheat and barley seeds upon germination mitotic index and chromosomal damage. Journal of Islamic Academic of Science 5: 44-48.

Bailly, C. (2004) Active oxygen species and antioxidants in seed biology. Seed Science Research 14: 93-107.

Bailly, C., Benamar, A., Corbineau, F. and Come, D. (1996) Changes in malondialdehyde content and in superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase activities in sunflower seeds as related to deterioration during accelerated aging. Physiologia Plantarum 97: 104-110.

Baker, E. H. and Bradford, K. J. (1994) The fluorescence assay for Maillard product accumulation does not correlate with seed viability. Seed Science Research 4: 103-106.

Basra, S. M. A., Ahmad, N., Khan, M. M., Iqbal, N. and Cheema, M. A. (2003) Assessment of cotton seed deterioration during accelerated ageing. Seed Science and Technology 31: 531-540.

Bewley, J. D. and Black, M. (1994) Seeds: physiology of development and germination. Plenum Press, New York.

Bhatia, V. S., Sanjeev, Y., Kanchan, J. and Guruprasad, K. N. (2010) Field deterioration of soybean seed: role of oxidative stresses and antioxidant defense mechanism. Journal of Plant Biology 37(2): 179–190.

Bonneau, L., Carre, M. and Martin-Tanguy, J. (1994) Polyamines and related enzymes in rice seeds differing in germination potential. Plant Growth Regulators 15: 75-82.

Braccini, A. L., Braccini, M. C. L. and Scapim, C. A. (2001) Mecanismos de deterioração das sementes: aspectos bioquímicos e fisiológicos. Informativo Abrates 11(1): 10-15.

Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-252.

Carpenter, J. F., Crowe, L. M. and Crowe, J. H. (1987) Stabilization of phosphofructokinase with sugars during freeze-drying. Biochemica et Biophysica Acta 92(3): 109-115.

Colville, L., Emma, L. B., Antony, S. L., Hugh, W. P., Laurence, C. and Ilse, K. (2012) Volatile fingerprints of seeds of four species indicate the involvement of alcoholic fermentation, lipid peroxidation, and Maillard reactions in seed deterioration during ageing and desiccation stress. Journal of Experimental Botany 63(18): 6519–6530.

Corte, V. B., Borges, E. E. L., Pontes, C. A., Leite, I. T. A., Ventrella, M. C. and Mathias, A. A. (2006) Mobilização de reservas durante a germinação das sementes e crescimento das plântulas de Caesalpinia peltophoroides Benth. (Leguminosae Caesalpinoideae). Revista Árvore 30(6): 941-949.

Dalle-Donne, I., Giustarini, D., Colombo, R., Rossi, R. and Milzani, A. (2003) Protein carbonylation in human diseases. Trends in Molecular Medicine 9(4): 169–176.

Delouche, J. C. and Baskin, C. C. (1973) Accelerated aging techniques for predicting the relative storability of seed lots. Seed Science and Technology 1(2): 427-452.

Du, Z. and Bramlage, W. J. (1992) Modified thiobarbituric acid assay for measuring lipid oxidation in sugar-rich plant tissue extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40: 1566-1570.

Fanan, S., Medina, P. F., Lima, T. C. and Filho, J. M. (2006) Avaliação do vigor de sementes de trigo pelos testes de envelhecimento acelerado e de frio. Revista Brasileira de Sementes 28(2): 152-158.

Gamer, M. H., Wang, G. M. and Spector, A. (1987) Stimulation of glucosylated lens epithelial Na, K-ATPase by an aldose reductase inhibitor. Experiment Eye Research 44: 339-345.

Ghaderi-Far, F., Soltani, A. and Sadeghipour, H. R. (2014a) Biochemical changes in pumpkin seeds during ageing: lipid peroxidation and membrane damages. Iranian Journal of Plant Biology 6(20): 69-112 (in Persian).

Ghaderi-Far, F., Soltani, A. and Sadeghipour, H. R. (2014b) Changes in soluble carbohydrates and reactive oxygen species scavenger enzymes activity in pumpkin seeds during storage in different temperatures and seed humilities. Journal of Plant Production 7(1): 157-179 (in Persian).

Goel, A., Coel, A. K. and Sheoran, I. S. (2003) Changes in oxidative stress enzymes during artificial ageing in cotton (Gossypium hirsutum L.) seeds. Journal of Plant Physiology 160: 1093-1100.

Grune, T., Catalgol, B., Jung, T. and Uverski, V. N. (2013) Protein oxidation and aging. In: different model systems and affecting factors. (Ed. Uverski, V. N.) 295–370. Wiley, Inc., Hoboken, New Jersey.

Hanan, M. A. and Salwa. A. A. (2014) Effects of gamma irradiation on biochemical and antioxidant defense system in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. International Journal of Advanced Research 2(8): 287-300.

Handel, E. V. (1968) Direct microdetermination of sucrose. Analytical Biochemistry 22: 280-283.

Koostra, P. T. and Harrington, J. F. (1969) Biochemical effect of age on membranal lipids of Cucumis sativus L. seed. Proceedings of the International Seed Testing Association 34: 329-340.

Leopold, A. C., Bruni, F. and Williams, R. J. (1992) Water in dry organisms. In:Water and life (Eds. Somero, G. N., Osmond, C. B. and Bolis, C. L.) 161-169. Springer, Berlin, Heidelberg.

Leopold, A. C., Sun, W. Q. and Bernal-Lugo, I. (1994) The glassy states in seeds: Analysis and function. Seed Science Research 4: 267-274.

Locher, R. and Bucheli, P. (1998) Comparison of soluble sugar degradation in soybean seed under simulated tropical storage conditions. Crop Science 38: 1229-1253.

Lugo-Bernal, I. and Leopold, A. C. (1992) Changes in soluble carbohydrates during seed storage. Plant Physiology 98(3): 1207-1210.

Marcos-Filho, J. M. (2005) Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. Piracicaba, Fealq.

Matsuda, H. and Hirayama, O. (1973) Changes of lipid components and lipolytic acylhydrolase activities in rice grains during their storage. Journal of Agricultural Chemistry Society of Japan 47: 279-384.

McCready, R. M., Guggolz, J., Silviera, V. and Owens, H. S. (1950) Determination of starch and amylase in vegetables. Analytical Chemistry 22: 1156-1158.

McDonald, M. B. (1999) Seed deterioration: physiology, repair and assessment. Seed Science and Technology 27: 177-237.

Miller, G. L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducting sugars. Analytical Chemistry 31: 426-428.

Mohammadi, H., Soltani, A., Sadeghipour, H.R. and Zeinali, E. (2010) Effects of seed aging on subsequent seed reserve utilization and seedling growth in soybean. International Journal of Plant Production 5 (1): 65-70.

Murthy, U. M. N., Kumar, P. P. and Sun, W. Q. (2003) Mechanisms of seed ageing under different storage conditions for Vigna radiate (L.) Wilczek: lipid peroxidation, sugar hydrolysis, Maillard reactions and their relationship to glass state transition. Journal of Exprimental Botany 54: 1057-1067.

Murthy, U. M. N. and Sun, W. Q. (2000) Protein modification by Amadori and Maillard reactions during seed storage: roles of sugar hydrolysis and lipid peroxidation. Journal of Experimental Botany 348: 1221-1228.

Nkang, A. and Umoh, E. O. (1997) Six month storability of five soybean cultivars as influenced by stage of harvest, storage temperature and relative humidity. Seed Science and Technology 25: 93-99.

Nystrom, T. (2005) Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence. EMBO Journal 24: 1311–1317.

Omokolo, D. N., Tsala, G. N. and Djocgoue, P. F. (1996) Changes in carbohydrate, amino acid and phenol contnts in cocoa pods from three clones after infection with phytophtora megakarya Bra and Grif. Annals of Botany 86: 29-36.

Osborne, D. J. (1980) Senescence in seeds. In: Senescence in plants (Ed. Thimann, W. J.) 13–36. CRC Press, Florida.

Priestley, D. A. and Leopold, A. C. (1983) Lipid changes during natural ageing of soybean seeds. Physiologia Plantarum 59: 467-470.

Reznick, A. Z. and Packer, L. (1994) Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay. Methods Enzymology233: 357–363.

Ryoji, N., Masao, J., Masamitsu, I., Hidenori, K., Yasuhiko, Y. and Yoshikazu, Y. (2012) Advanced glycation end products and their receptors as risk factors for aging. Anti-Aging Medicine 9(4): 108-113.

Santos, S. R. G. and Paula, R. C. (2007) Teste de envelhecimento acelerado para avaliação do vigor de lotes de sementes de Sebastiania commersoniana (Baill.) Smith und Downs (branquilho) – Euphorbiaceae. Revista Instituto Florestal 19(1): 1-12.

Simontacchi, M., Caro, A., Fraga. C. G. and Puntarulo, S. (1993) Oxidative stress affects a-tocopherol content in soybean embryonic axes upon imbibition and following germination. Plant Physiology 103: 949-953.

Soltani, A., Gholipoor, M. and Zeinali, E. (2006) Seed reserve utilization and seedling growth of wheat as affected by drought and salinity. Environmental and Experimental Botany 55: 195-200.

Strelec, I., Hardi, Z. U. and Hlevnjak, M. (2008) Accumulation of Amadori and Maillard products in wheat seeds aged under different storage conditions. Croatica Chemica Acta 81(1): 131-137.

Sun, W. Q. and Leopold, A. C. (1993) The glassy state and accelerated aging of soybeans. Physiolgia Plantarum 89: 767-114.

Sun, W. Q. and Leopold, A. C. (1995) The Maillard reaction and oxidative stress during aging of soybean seeds. Plant Physiology 94: 94–104.

Tahmasebi, B., Ghaderi-Far, F., Sadeghipour, H. R. and Galeshi, S. (2015) Effect of accelerate germination traits, lipids and lipid hydroperoxide in sunflower seeds. Journal of Plant Process and Function 4(12): 73-83 (in Persian).

Taniguchi, N., Kinoshita, N., Arai, K., Iizuka, S., Usui, M. and Naito, T. (1989) Inactivation of erythrocyte Cu-Zn-superoxide dismutase through non-enzymatic glycosylation. In: The Maillard reaction in ageing, diabetes and nutrition (Eds. Baynes, J. W., Monnier, V. M.) 277-290. Alan R Liss, Inc., New York.

Veselovsky, V. A. and Veselova, T. V. (2012) Lipid peroxidation, carbohydrate hydrolysis, and Amadori–Maillard reaction at early stages of dry seed aging. Russian Journal of Plant Physiology 59(6): 811–817.

Viviana, B. C., Eduardo, E. D. E., Lima, E. B., José, F. D. E., Carvalho, G. V. and Mirian, S. S. (2010) Alterations in the lipid and soluble sugar content of melanoxylon brauna seeds during natural and accelerated ageing. Revista Brasileira de Sementes 32(3): 152-162.

Walters, C. (1998) Understanding the mechanisms and kinetics of seed aging. Seed Science Research 8: 223-244.

Wettlaufer, S. H. and Leopold, A. C. (1991) Relevance of Amadori and Maillard products to seed deterioration. Plant Physiology 97: 165-169.

Wilson, D. O. and McDonald, M. B. (1986) The lipid peroxidation model of seed ageing. Seed Science and Technology 14: 269-300.