بررسی تاثیر هم‌زمان اکسین و تیامین بر میزان فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز و محتوای ترکیبات فنلی در دو مرحلة رشد رویشی گیاه سویا (Glycin max)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

2 گروه اکولوژی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پشرفته کرمان، کرمان، ایران

چکیده

سویا (Glycin max L.) گیاهی سرشار از پروتئین، چربی‌های غیر‌اشباع، ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی است که نقش مهمی در سلامت انسان دارد. ایندول 3-­بوتیریک اسید (IBA) از تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بوده  که در تولید ترکیبات فنلی و افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاه نقش بسزایی دارد. تیامین نیز از ویتامین‌های مهم گیاهی در تقویت سیستم دفاعی و افزایش مقاومت به تنش‌های محیطی است. با‌توجه‌ به اثر هورمون اکسین و تیامین بر تولید ترکیبات فنلی با ویژگی آنتی‌اکسیدانی در مراحل رشد، هدف از انجام پژوهش حاضر، بررسی اثر این دو ترکیب بر دو مرحلة رشد رویشی گیاه سویا و تغییرات ترکیبات فنلی جهت ایجاد ظرفیت آنتی‌اکسیدانی بیشتر در مقاومت به تنش‌های محیطی است. به‌این‌منظور بذرهای سویا، رقم DPX کاشته شدند و گیاهان در قالب طرح فاکتوریل با سه غلظت صفر، 10و 50 میکرو‌مولار ایندول 3- بوتیریک اسید و سه غلظت صفر، 50 و 200 میکرو‌مولار تیامین تیمار شدند. اندازه‌‌گیری ترکیبات فنلی کل، آنتوسیانین و رنگیزه‌ها در برگ انجام شد. نتایج نشان دادند که کاربرد هم‌زمان اکسین و تیامین، محتوای فنلی و کاروتنوئید را در هر‌دو مرحله به‌طور معنی‌داری افزایش داد. کاربرد اکسین به‌تنهایی کاهش معنی‌دار محتوای آنتوسیانین را در هر‌دو مرحله سبب شد؛ اما بر محتوای فنلی تاثیر معنی‌داری نداشت. به‌طور‌کلی، فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)، محتوای فنلی و آنتوسیانین در مرحلة 9 برگی نسبت به3 برگی افزایش بیشتری داشته است. این نتایج بیان‌کنندة تاثیر هم‌زمان اکسین و تیامین بر محتوای ترکیبات فنلی در مراحل مختلف رشد رویشی و افزایش قدرت دفاعی گیاه است.
 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of auxin and thiamine interaction effect on PAL activity and phenolic compounds content in vegetative growth stage of soybean plants

نویسندگان [English]

  • nazi nadernejad 1
  • mahdiyeh hamzeh nejadi 1
  • Zahra Asrar 1
  • hossein mozafari 2
1 Department of Biology, Faculty of Science, University of shahid Bahonar Kerman, kerman, iran
2 Department of Ecology, Research Center for Advanced Science and Technology and Environmental Sciences, Graduate University industrial and advanced technology kerman, Kerman, Iran
چکیده [English]

Soybean (Glycin max L.) is one of the most important oily seeds in the world. This plant is rich in protein and unsaturated fats, and plays a significant role in human health with phenolic compounds and flavonoids. Indole Butyric Acid (IBA) is a plant growth regulator that plays a key role in producing phenolic compounds and increasing the antioxidant capacity of the plant. Thiamine is one of the important vitamins in strengthening the immune system and increasing the resistance to environmental stresses in the plant's growth stages. Regarding the effect of hormone auxin and thiamine on the production of phenolic compounds as one of the antioxidant compounds in growth stages, the aim of this study was to investigate the effect of the two compounds in two stages of soybean growth and compare their effect on phenolic compounds changes in order to Detecting higher antioxidant capacity in environmental stress tolerance. For this purpose, the DPX cultivar of soybean seeds were prepared from Dezful Agriculture Research Center and planted in perlite containing flowers. The plants were planted under factorial design under IBA treatments with three concentrations of 0, 10 and 50 and thiamine with three concentrations of 0, 50 and 200. Extraction and evaluation of phenolic compounds, anthocyanins and pigments in leaves were performed. Data were analyzed using Duncan's test at a significant level of 5%. The results showed that the combined use of auxin and thiamine increased the carotenoid content in both phases and caused a significant increase in phenolic content. Application of auxin alone reduced auxin and thiamine the anthocyanin content significantly in both phases, but did not have a significant effect on phenolic content. The results showed that the PAL activity of the phenolic and anthocyanin content increased significantly in the 9-leaf stage compared to 3-leaf. Generally, the results showed that interaction effect between auxin and thiamine on phenolic compounds in different stages of vegetative growth significantly improved and increased plant defense.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • auxin
  • PAL activity
  • Phenolic compounds
  • soybean vegetative stages

گیاه سویا با نام علمی (Glycine max L.) متعلق به خانوادة Fabaceae و گیاه علفی یک‌ساله است که به‌صورت بوته‌ای با شاخ و برگ بسیار رشد می‌کند. سویا دو مرحلة رویشی و زایشی دارد (McWilliams et al, 2004).

گیاه سویا نقش ویژه‌ای در پیشگیری از خطر ابتلا به طیف وسیعی از بیماری‌های خطرناک مانند سرطان سینه و پروستات دارد و مهم‌ترین محصول جهان از نظر خواص پیشگیری‌کننده است(Hellal and (Abdelhamid, 2013.

گیاهان منبع بسیاری از موادشیمیایی هستند که مصرف دارویی دارند و فراورده‌های حاصل از متابولیسم ثانویة گیاهی جزء گرانبهاترین ترکیبات شیمیایی گیاهی هستند. این ترکیبات منحصر به گونه یا حتی نژاد ویژه‌ای هستند و اغلب در دورة رشدی و نموی ویژه در گیاه تولید می‌شوند. ترکیبات فنلی گروه عمده‌ای از ترکیبات شیمیایی گیاهی حاصل از مسیر فنیل پروپانویید هستند که اهمیت فیزیولوژیک و مورفولوژیک آن‌ها ثابت شده است و گزارش‌های زیادی از ویژگی آنتی‌اکسیدانی آن‌ها و اثرشان بر حذف رادیکال‌های آزاد وجود دارد. این ترکیبات به‌طور گسترده در گیاهان وجود دارند؛ به رنگ، عطر و طعم میوه‌ها کمک می‌کنند(Chang-Kui Ding et al, 2001)؛ در قسمت‌های مختلف سلول گیاهی و در مراحل مختلف رشد گیاه تشکیل می‌شوند (Ewane et (al, 2012. بیشترین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز در گیاهان جوان و در حال نمو مشاهده شده است. فعالیت این آنزیم در مراحل مختلف رشد و نمو گیاه متفاوت است و بیشترین فعالیت آن درمرحلة جوانه زنی مشاهده شده است (Ziaei et al, 2012).

فلاونوئیدها گروه وسیعی از ترکیبات فنلی هستند که گسترة وسیعی از نقش‌های زیستی را به‌ویژه در برابر تنش‌ها دارند. و فعالیت آنتی‌اکسیدانی زیاد این ترکیبات نسبت به کاروتنوئیدها گزارش شده است (Lister and Lancaster, 1996) اکسین از تنظیم‌کنندگان رشد گیاهی است. ایندول 3- بوتیریک اسید (IBA) ترکیبی مصنوعی است که ریشه‌زایی را در گیاهان سبب می‌شود Strader and Bartel, 2011)). گزارش‌ها نشان می‌دهند که ایندول 3-استیک اسید (IAA) نسبت به ایندول 3- بوتیریک اسید به نور و دما حساس‌تر است (Zolman et al, 2000). همچنین ایندول 3- بوتیریک اسید در مسافت‌های طولانی در گیاهان حرکت می‌کند و در طول انتقال دست‌نخورده باقی می‌ماند. در ریشه، ساقه و سایر بافت‌ها انتقال ایندول 3- استیک اسید از ایندول 3- بوتیریک اسید کاملاً متفاوت است (Korasick et al, 2013). عکس‌العمل گیاه، به حساسیت اندام گیاهی بستگی دارد و پاسخ گیاه به اکسین به غلظت آن وابسته است (Jellin et al, 2008). همچنین تاثیر اکسین خارجی بر محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در گیاه Vigna اثبات شده است (Vats et al, 2012).

تیامین (ویتامین B1) جزء ویتامین‌های محلول در آب است و تاثیر این ترکیب در تولید متابولیت‌های ثانویه اثبات شده است(Abrahamian and Kantharajah, 2011). گزارش‌های مبنی بر اثر تیامین بر افزایش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی (Yousef and Talaat, 2003)، افزایش رشد ریشه و همچنین افزایش وزن تر و خشک گیاه وجود دارد (Abdel-Aziz et al, 2009).

با‌توجه‌به‌اینکه گیاه سویا اهمیت زیادی از نظر داشتن ترکیبات فنلی و فلانوئیدی به‌ویژه ایزوفلاونوئید‌ها دارد، هدف اصلی پژوهش حاضر، بررسی تاثیر متقابل تیمار‌های هورمون ایندول 3- بوتیریک اسید و ویتامین تیامین بر محتوای ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی و آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در مراحل مختلف رشد رویشی گیاه سویا و تشخیص مناسب‌ترین مرحلة تیمار‌دهی برای افزایش این ترکیبات است.

 

مواد و روش‌ها

در پژوهش حاضر، رقم DPX مطالعه شد. بذر‌های مطلوب از نظر سالم‌بودن و مناسب‌بودن اندازه و وزن برای کاشت انتخاب شدند. در نخستین هفته پس از کشت در گلدان، آبیاری با آب مقطر انجام شد. برای تامین املاح لازم برای گیاه، پس از یک هفته، آبیاری با محلول کامل غذایی هوگلند سه بار در هفته انجام شد. پس از گذشت سه هفته، نمونه‌های گیاهی در مرحلة 3 تا 5 برگی و 9 تا 11 برگی تا رسیدن به مرحلة زایشی تیمار شدند.تیمار‌های لازم برای پژوهش حاضر، با افزودن ایندول 3-بوتیریک اسید و تیامین (ویتامین B1) به محلول غذایی تهیه شدند. محلول غذایی استفاده‌شده، هوگلند بود که به نسبت 5/0 و اسیدیتة مشخص 4/6 استفاده شد (Hoagland and Arnon, 1950). غلظت‌های صفر، 50 و 200 میکرومولار تیامین و غلظت‌های صفر، 10 و 50 میکرو‌مولار ایندول
3- بوتیریک اسید و جمعا نه تیمار به دست آمد. جدول ترکیب تیمار‌های استفاده‌شده در پژوهش حاضر، با آزمایش فاکتوریل تهیه شد.

گیاهان موجود، در ۲۷ گلدان کاشته شدند. پس از گذشت ۲۱ روز نمونه‌ها تیمار شدند. از گلدان‌های کاشته‌شده، ۳ گلدان، شاهد و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شدند. تیمار‌ها شامل

1- اکسین صفر+تیامین صفر (شاهد)؛

2- اکسین 10+تیامین 50 میکرومولار؛

3- اکسین 10+تیامین 200 میکرومولار؛

4- اکسین 50+تیامین 50 میکرومولار؛

5- اکسین 50، تیامین 200 میکرومولار؛

6- اکسین صفر+تیامین 50 میکرومولار؛

7- اکسین صفر+تیامین 200 میکرومولار؛

8- تیامین صفر+اکسین 10میکرومولار؛

و 9- تیامین صفر+اکسین 50 میکرومولار

بودند که در پژوهش حاضر، دو مرحلة رویشی 3 تا 5 برگی و 9 تا 11 برگی در نظر گرفته شدند. تیمار‌دهی به‌صورت یک روز در میان تا رسیدن گیاه به مرحلة زایشی ادامه پیدا کرد؛ سپس برگ‌ها و ریشه‌های گیاهان مد نظر برای مطالعه، در ازت مایع منجمد و برای سنجش‌های بعدی به فریزر 20- درجة سانتی‌گراد منتقل شدند.

طول ساقه و ریشه با استفاده از خط کش میلی متری اندازه گیری شد. طول ساقه از یقه تا قسمت انتهایی ساقه، و طول ریشه از یقه تا انتهای ریشه در نظر گرفته شد. برای هر گروه تیماری سه تکرار، هر تکرار از میانگین سه نمونه محاسبه و بر اساس واحد میلی متر گزارش گردید.

اندازه‌گیری وزن تر اندام هوایی و ریشة گیاه:پس از جدا‌کردن اندام هوایی و ریشه از یکدیگر، وزن هریک برحسب گرم با ترازو (مدل BPSIID، شرکت Sartorius، آلمان) با دقت 001/0 گرم اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری طول اندام هوایی و ریشه: طول ریشه و ساقه با خط‌کش میلی‌متری اندازه‌گیری شد. طول ساقه، از یقه تا قسمت پایانی ساقه و طول ریشه، از یقه تا پایان ریشه در نظر گرفته شد. اندازه‌گیری طول ساقه، برای هرگروه تیماری در سه تکرار انجام شد. هر تکرار از میانگین سه نمونه محاسبه و بر‌اساس واحد میلی‌متر گزارش شد.

سنجش میزان کلروفیل و کاروتنوئید:برای سنجش میزان کلروفیل و کاروتنوئید از روش Lichtenthaler (1987) استفاده شد. 2/0 گرم از برگ‌های تازة گیاه در ‌ها‌ون چینی حاوی 1۵ میلی‌لیتر استون 80 درصد سائیده شد و پس از صاف‌کردن با کاغذ صافی، جذب آن با دستگاه ‌اسپکتروفتومتر UV-Visible (مدل Cary-50، شرکت Varian، استرالیا) در طول موج‌های 8/۶۴۶، 20/۶۶3 و ۴70 نانومتر خوانده شد. برای تنظیم دستگاه، ‌استون 80 درصد استفاده شد. غلظت رنگیزه‏ها با رابطه‌های 1 تا 4 محاسبه شدند.

رابطة 1:

 

رابطة 2:

 

رابطة 3:

 

رابطة 4:

 

طبق رابطه‌های 1 تا 4 به‌ترتیب غلظت کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها (شامل: کاروتن‌ها و گزانتوفیل‌ها) محاسبه شدند. غلظت بر‌حسب میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصارة گیاهی تعیین شد. نتایج حاصل از اندازه‌گیری مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی بر‌حسب گرم وزن تر محاسبه و ارائه شدند.

سنجش میزان آنتوسیانین‌ها:برای اندازه‌گیری مقدار آنتوسیانین‌های برگ روش Wagner (1979) استفاده شد. 1/0 گرم از بافت برگی در‌ ها‌ون چینی با 10 میلی‌لیتر متانول اسیدی (متانول خالص و کلریدریک اسید خالص به نسبت حجمی (‌1:99) کاملا سائیده شد. عصاره در لوله‌ها‌ی آزمایش سر‌پیچ‌دار ریخته شد و به‌‌مدت 2۴ ساعت در تاریکی و دمای 2۵ درجة سانتی‌گراد قرار گرفت؛ سپس به‌مدت 10 دقیقه با سرعت ۴000 دور در دقیقه سانتریفیوژ (مدل 5804R، شرکت Eppendorf، آلمان) و جذب محلول رویی در طول موج ۵۵0 نانومتر اندازه‌گیری شد. برای محاسبة غلظت، ضریب خاموشی (ε) 33000 سانتی‌متر بر مول در نظر گرفته شد.

 

سنجش میزان فلاونوئیدها:‌فلاونوئیدهای کل با روش اندازه‌گیری آلومینیوم کلرایدکالریمتری  Zhishenو همکاران (۱۹۹۹) انجام شد.1/0گرم از نمونه‌های گیاهی در۱۰ میلی‌لیتر متانول۸۰ درصد به‌خوبی ساییده شد و عصارة حاصل سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای آزمایش‌های بعدی استفاده شد. ۵۰۰ میکرولیتر عصاره برداشته و با آب مقطر به حجم ۵ میلی‌لیتر رسانده شد. پس از ۵ دقیقه ۳۰۰ میکرو لیتر سدیم نیتریت ۵ درصد و ۶۰۰ میکرو‌لیتر آلومینیوم کلرید ۱۰ درصد به محلول اضافه شد. پس از ۶ دقیقه، ۲ میلی‌لیتر سدیم هیدروکسید ۱ مولار با ۲ میلی‌لیتر آب مقطر به محلول اضافه شد. شدت جذب محلول با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۱۰ نانومتر خوانده شد.

اندازه‌گیری میزان فنل کل: محتوای ترکیبات فنلی کل با روش Tunc-Ozdemir (2009) استخراج شد. 1/0 گرم از برگ تر گیاه در ۵ میلی‌لیتر اتانول ۹۵ درصد سائیده و به‌مدت ۲۴ ساعت در تاریکی نگهداری شد؛ سپس به ۱ میلی‌لیتر محلول رویی، ۱ میلی‌لیتر اتانول ۹۵ درصد اضافه شد و حجم محلول با آب مقطر به
۵ میلی‌لیتر رسانده شد؛ سپس 5/0 میلی‌لیتر معرف فولین ۵۰ درصد و ۱ میلی‌لیتر سدیم کربنات ۵ درصد به آن اضافه شد. مخلوط حاصل به‌مدت ۱ ساعت در تاریکی نگهداری و سپس جذب هر نمونه در طول موج
۷۲۵ نانومتر خوانده شد و غلظت ترکیبات فنلی کل بر‌حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.

سنجش غلظت پروتئین:به‌این‌منظور 1 گرم بافت تر در یک ‌ها‌ون چینی محتوی 3 میلی‌لیتر بافر تریس-ساکارز با ۵/7=pH به‌طور‌ کامل سائیده شد. محلول همگن به‌دست‌آمده به لولة سانتریفیوژ منتقل و پس از 10 دقیقه سکون، به‌مدت 2۵ دقیقه در g4000 سانتریفیوژ شد. در پایان مرحلة سانتریفیوژ، لوله‌ها به‌آرامی ‌از دستگاه خارج و محلول رویی در چند لولة ‌آزمایش توزیع شد. عصاره‌ها‌ی حاصل برای سنجش غلظت پروتئین استفاده شدند. برای سنجش غلظت پروتئین به لوله‌ها‌ی آزمایش مقدار 1/0 میلی‌لیتر عصارة پروتئینی و 5 میلی‌لیتر معرف بیوره ‌افزوده و سریعاً ورتکس شد. پس از دو دقیقه و قبل از یک ساعت جذب آنها ‌با دستگاه ‌اسپکتروفتومتر در طول موج ۵9۵ نانومتر خوانده شد (Bradford, 1976).

اندازه‌گیری میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL):اندازه‌گیری با روش Hahldbrock و Rogg (1975) انجام شد. برای تهیة عصارة آنزیمی، مقدار ۳۰۰ میلی‌گرم از بافت تازة برگی با5/6 میلی‌لیتر بافر تریس - هیدرو کلریک اسید ۵۰ میلی‌مولار با 8/8=pH حاوی بتا مرکاپتواتانول ۱۵ میلی‌مولار در هاون سرد ساییده شد؛ سپس عصارة به‌دست‌آمده به‌مدت ۳۰ دقیقه با سرعت ۵۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی برای برای سنجش آنزیم مد نظر استفاده شد.

آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز واکنش تبدیل فنیل آلانین را به سینامیک اسید کاتالیز می‌کند. در این روش فنیل آلانین گهرمایة آنزیم است و فعالیت آنزیم بر‌اساس سرعت تشکیل سینامیک اسید تعیین می‌شود. در لولة آزمایش، ۱ میلی‌لیتر از بافر استخراج با 5/0 میلی‌لیتر ال-فنیل آلانین ۱۰ میلی‌مولار، 4/0میلی‌لیتر آب دو بار تقطیر و ۱ میلی‌لیتر عصارة آنزیمی مخلوط و به‌مدت ۶۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجة سانتی‌گراد نگهداری شد. واکنش با اضافه‌کردن 5/0 میلی‌لیتر تری کلرو استیک اسید ۱۰ درصد به پایان می‌رسد. غلظت سینامیک اسید با اندازه‌گیری میزان جذب در طول موج ۲۹۰ نانومتر و ضریب خاموشی معادل ۹۵۰۰ میلی‌مولار بر سانتی‌متر به دست آمد. یک واحد از فعالیت این آنزیم معادل ۱ میکرومول از سینامیک اسید تولید‌شده در دقیقه است.

 

 

نتایج

نتایج حاصل از تجزیة آماری بین سه عامل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین نشان داد که اثر متقابلی بین این سه عامل وجود داردکه این تاثیر متقابل سه‌گانه در سطح 5 درصد معنی‌دار است. در هر سه تیمار بیشترین مقدار وزن تر اندام هوایی مربوط به مرحلة نه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 و 50 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 1).

 

 

شکل 1- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر وزن تر اندام هوایی درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

در هر سه تیمار بیشترین مقدار طول ساقه مربوط به مرحلة نه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 50 میکرومولار بیشترین افزایش را داشت (شکل 2).

 

 

شکل 2 - تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر طول ساقه درگیاه سویا ، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

در هر سه تیمار بیشترین مقدارطول ریشه مربوط به مرحلة نه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 3).

 

 

شکل 3- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر طول ریشه درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

در هر سه تیمار بیشترین محتوای کلروفیل a مربوط به مرحلة نه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 4).

 

 

شکل 4- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای کلروفیل a درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

در هر سه تیمار بیشترین محتوای کلروفیل b مربوط به مرحلة سه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 50 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 5).


 

شکل5- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای کلروفیل b درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

بیشترین محتوای کلروفیل b مربوط به مرحلة سه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 6).


 

شکل 6- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای کاروتنوئیدها درگیاه سویا- مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

در هر سه تیمار بیشترین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز مربوط به مرحلة سه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 7).


 

شکل 7- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) درگیاه سویا ، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

در هر سه تیمار بیشترین محتوای فنل کل مربوط به مرحلة نه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین صفر میکرومولار و تیامین صفر میکرومولار بیشترین افزایش را داشت (شکل 8).


 

شکل 8– تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای فنل کلدرگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

بیشترین محتوای فلاونوئید مربوط به مرحلة نه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین صفر میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 9).


 

 

شکل 9- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای فلاونوئیددرگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 

بیشترین محتوای آنتوسیانین مربوط به مرحلة نه‌برگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 10).

 

 

شکل 10- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای آنتوسیانین درگیاه سویا - مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر‌مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 0.05>P است.

 

 


بحث

Fuchs (2001) گزارش کرد که رقم گیاه و هورمون اکسین بر ریشه‌زایی و رشد ریشه در قلمه‌های ساقة گل رز هیبرید موثر است. غلظت بیش از حد اکسین؛ زرد‌شدن و ریزش برگ‌ها، سیاه‌شدن ساقه و خشک‌شدن قلمه‌ها را موجب می‌شود. Abdel-Aziz و همکاران (2009) نشان دادند که کاربرد تیامین، شاخص‌های رشد، از‌جمله وزن تر و خشک گیاه رزماری را به‌طور معنی‌داری افزایش داد.

در پژوهش حاضر طبق شکل (1) تیمار‌های هم‌زمان اکسین و تیامین و مرحلة رویشی تاثیر معنی‌داری بر وزن تر اندام هوایی داشت، بیشترین افزایش مربوط به تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود که در مرحلة 9 تا 11 برگی مشاهده شد. همچنین طبق شکل (3) تیمارهای هم‌زمان اکسین و تیامین تاثیر معنی‌داری بر طول ریشه بین دو مرحلة رشد رویشی داشت که بیشترین تاثیر مربوط به اکسین10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة 9 تا11 برگی بود .علاوه‌بر‌این، طبق شکل (2) مشخص شد که تیمار اکسین، تیامین و مرحلة رویشی تاثیر معنی‌داری بر طول ساقه داشتند که بیشترین افزایش در مرحلة 9 تا 11 برگی در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 50 میکرومولار مشاهده شد.

نتایج بررسی ما با نتایج تحقیق بر گیاه گل داوودی، گل رز و گیاه تاتوره مطابقت دارد (Abdel-Aziz et al, 2009). بنابراین، به نظر می‌رسد کاربرد تیامین و اکسین بیشترین تاثیر را بر شاخص‌های رشد گیاه در مرحلة 9 تا 11 برگی داشته است.

نتایج حاصل از بررسی رنگیزه‌های فتوسنتزی نشان داد تیمار‌های مختلف اکسین و تیامین در مراحل مختلف رشد رویشی تاثیر معنی داری بر محتوای کلروفیل دارد که حداکثر میزان کلروفیل a مربوط به مرحلة 5 تا 7 برگی در تیمار هم‌زمان اکسین 50 و تیامین 200 میکرومولار بود (شکل 4) و محتوای کلروفیل b در مرحلة 9 تا 11 برگی افزایش چشمگیری داشت ( شکل 5). همچنین بررسی محتوای کاروتنوئیدها نشان داد که بیشترین غلظت مربوط به مرحلة 3 تا 5 برگی و در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود و اختلاف معنی‌داری بین دو مرحلة رویشی مطالعه‌شده در تیمار‌های مختلف مشاهده شد.

گزارش شده است که کاربرد تیامین افزایش معنی‌دار محتوای کربوهیدرات‌های گیاهان رزماری را باعث شد که ممکن است ناشی از نقش مهم آن در بیوسنتز مولکول‌های کلروفیل باشد که محتوای کلروفیل را تغییر می‌دهد(Youssef and Talaat, (2003. همچنین نتایج بررسی‌ها بر گلابی نشان داده است که اکسین در غلظت‌های مناسب از شکسته‌شدن کلروفیل جلوگیری می‌کند(Frenkel and Dyck, 1973).

در پژوهش حاضر طبق شکل (7) بین سه عامل مرحلة رویشی، تیمار اکسین و تیامین تفاوت معنی‌داری وجود دارد و بیشترین مقدار آنزیم مربوط به مرحلة 3 تا 5 برگی در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود.

بیشترین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در گیاهان جوان و در حال نمو دیده می‌شود و اغلب در بلوغ با کاهش مقدار آنزیم همراه است(Ziaei et al, 2012).

بررسی‌ بر گیاه ریحان نشان داد که به‌طور‌کلی بیان ژن و فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در مراحل مختلف رشد متفاوت است و فعالیت این آنزیم در مراحل ابتدایی رشد گیاه، بیشترین مقدار است که با نتایج ما مطابقت دارد (Ziaei et al, 2012). گزارش شده است که اکسین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز را در گیاه توت‌فرنگی افزایش می‌دهد و همچنین نقش اساسی در ایجاد مقاومت در گیاهان ضمن مراحل ابتدایی رشد ایفا می‌کند. به نظر می‌رسد زیاد‌بودن میزان آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در مرحلة 3 تا 5 برگی، مقاومت گیاه را در مراحل ابتدایی رشد افزایش می‌دهد که با کاربرد اکسین و تیامین دیده شده است.

ترکیبات فنلی از‌جمله آنتوسیانین‌ها و فلاونوئیدها که حاصل از مسیر فنیل پروپانویید هستند در ساز‌و‌کار‌های فیزیولوژیک مانند رشد، تولید مثل، رویش دانه و ایجاد مقاومت در گیاه نقش اساسی دارند (Ewane et al, 2012).

بر‌اساس نتایج پژوهش حاضر تیمار اکسین و تیامین بر محتوای فنلی کل در مراحل مختلف رشد تاثیر معنی‌داری داشت که بیشترین تاثیر در مرحلة 9 تا 11 برگی گیاهان شاهد و سپس در تیمار‌های اکسین صفر و تیامین 50 میکرومولار دیده شد.

محققان نشان دادند در چهار مرحلة فنولوژیک (ابتدای دورة رویشی، پایان دورة رویشی، جوانه‌زدن گل و گل کامل) در پونة کوهی محتوای فنلی افزایش یافت (Sellami et al, 2009). برخی گزارش‌ها نشان می‌دهند که ضمن مراحل رشد در گیاه گردو ترکیبات فنلی به‌تدریج تغییر می‌یابند و ارتباط مهمی بین میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و تجمع محتوای فنلی و فلاونوئیدی وجود دارد (Malmir, 2014).

همچنین مطالعات نشان می‌دهند که تغییرات فنیل آلانین آمونیالیاز ممکن است بر‌اساس کاربرد اکسین تاثیر عکس بر سنتز پلی‌فنل‌ها داشته باشند. به‌علاوه، کاربرد ایندول 3- بوتیریک اسید تغییرات بر دیگر آنزیم‌ها از‌جمله پلی‌فنل اکسیداز را باعث شده است که این آنزیم در تقسیم، تمایز و نمو موثر است (Lukatkin, 2002). کاربرد خارجی اکسین ایندول
3- بوتیریک اسید ممکن است برفعالیت دو آنزیم پراکسیداز و پلی‌فنل اکسیداز موثر باشد(Basak et al, 2000). همچنین محققان گزارش کردند تیمار تیامین در افزایش مقاومت به قارچ در گیاه انگور موثر است و این ویتامین بیان ژن آنزیم‌های مسیر فنیل پروپانویید را فعال می‌کند و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی افزایش می‌یابند (Boubakri et al, 2013). افزایش محتوای فنلی با کاربرد تیامین در گیاهان سویا (Abdel-(Monaim, 2011، بابونه و سرو به اثبات رسیده است (Abdel-Aziz et al, 2009).

برخی محققان بیان کردندکه غلظت ترکیبات فنلی در فصول مختلف و در مراحل مختلف رشد متفاوت است و این ترکیبات در مراحل ابتدایی رشد، چیره هستند (Kui-Ding et al, 2001). در پژوهش حاضر نیز اکسین و تیامین بر محتوای ترکیبات فنلی در دو مرحلة رشد رویشی اثر معنی‌دار داشت (شکل 8) که بیشترین تاثیر در مرحلة 9 تا 11 برگی بود.

در پژوهش حاضر تفاوت معنی‌داری در میزان غلظت فلاونوئید‌ها در مرحلة 9 تا 11 برگی در تیمار اکسین 50 میکرومولار به‌تنهایی در مرحله3 تا 5 برگی مشاهده شد (شکل 9). در میوة توت‌فرنگی گزارشی دربارة فنل کل، فلاونوئیدها، تانن‌ها و ارتباطشان با فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز هنگام نمو میوه دیده نشد (Cheng and Breen, 1991) که با نتایج ما همخوانی داشت. همچنین اختلاف آشکار بین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز، میزان فنل و فلاونوئید کل در توت‌فرنگی دیده شد که ممکن است ناشی از تجمع فنل‌ها قبل از گرده‌افشانی باشد زیرا بیشترین میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز یک هفته قبل از گرده‌افشانی مشاهده شد. در گیاه سیب درختی نیز ارتباط و همبستگی معنی‌داری بین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز در سه مرحلة رشد و غلظت فلاونوئید‌ها وجود ندارد (Lister and Lancaster, 1996)؛ اما در گیاه گردو مشاهده شده است که تجمع ترکیبات فنلی به‌طور غیر‌مستقیم با فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز تنظیم می‌شود (Jay-Allemand et al, 1989). همچنین تاثیر اکسین خارجی بر محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در گیاه Vigna گزارش شده است (Vats et al, (2012. گزارش شده است که میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در برگ‌ها در مراحل مختلف رشد، به تعادل سوخت و ساز این ترکیبات بستگی دارد. همچنین میزان فلاونوئید‌ها در برگ با افزایش رشد زیاد می‌شود (Malmir, 2014) و به نظر می‌رسد در مرحلة 3 تا 5 برگی میزان ساخته‌شدن این ترکیبات بیشتر از سایر مراحل باشد.

در پژوهش حاضر، تفاوت معنی‌دار در محتوای آنتوسیانین بین دو مرحلة رویشی وجود داشت و بیشترین غلظت مربوط به مرحلة 9 تا 11 برگی و در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود (شکل 10) که با نتایج حاصل از تحقیق بر گیاه سیب درختی هماهنگی داشت (Lister and (Lancaster, 1996. تنوع گسترده‌ای در میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز، آنتوسیانین و فلاونوئید کل در ارقام مختلف سیب در مراحل مختلف رشد مشاهده شد؛ اما همبستگی معنی‌داری بین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز در سه مرحلة رشد و غلظت آنتوسیانین نهایی دیده نشد که با نتایج ما مطابقت داشت. همچنین گزارش شده است که اگر‌چه تولید آنتوسیانین اغلب با افزایش فنیل آلانین آمونیالیاز همراه است، نمونه‌های زیادی از فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز بدون تولید آنتوسیانین وجود دارند (Lister and Lancaster, 1996. Li) و همکاران (2001) گزارش کردندکه مقادیر اندک آنتوسیانین‌ها با‌وجود افزایش میزان آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز، به‌علت فعالیت‌نکردن آنزیم‌های بیو‌سنتزی آنتوسیانین‌ها در مرحله‌ای خاص است و افزایش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز به تشکیل دیگر ترکیبات فنلی منجر می‌شود.

نتایج پژوهش حاضر نشان داد بین عوامل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین با وزن تر اندام هوایی، طول ساقه و طول ریشه، اثر متقابل معنی‌داری وجود دارد. در تیمار هم‌زمان اکسین 50 و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة رویشی نه تا یازده‌برگی بیشترین وزن تر، در تیمار هم‌زمان اکسین 50 و تیامین 50 میکرومولار در مرحلة رویشی نه تا یازده‌برگی بیشترین طول ساقه و در تیمار هم‌زمان اکسین 10 و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة نه تا یازده‌برگی بیشترین طول ریشه مشاهده شدند. بین رنگیزه‌های فتوسنتزی و سه عامل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین نیز ارتباط معنی‌دار وجود داشت. دربارة اثر این سه عامل بر محتوای فنلی دیده شد که تنها مرحلة رویشی و تیمار تیامین به‌تنهایی اثر معنی‌دار بر محتوای فنلی داشت و بیشترین افزایش مربوط به مرحلة نه تا یازده ‌برگی و گیاهان شاهد بود. دربارة تاثیر متقابل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین هر سه عامل با هم تاثیر معنی‌داری بر محتوای فلاونوئید داشتند و بیشترین افزایش مربوط به مرحلة نه تا یازده‌برگی بود. دربارة تاثیر تیمارها بر محتوای آنتوسیانین دیده شد که هر سه عامل با هم تاثیر معنی‌داری بر محتوای آنتوسیانین داشتند و بیشترین افزایش غلظت مربوط به تیمار هم‌زمان اکسین 10 و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة رویشی 9 تا 11 برگی بود. دربارة تاثیر تیمار‌ها بر محتوای آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز، هر سه عامل تاثیر معنی‌داری داشتند و بیشترین آن مربوط به اکسین 50 + تیامین 50 میکرومولار در مرحلة سه تا پنج ‌برگی بود.

 

جمع‌بندی

با‌توجه ‌به نتایج بررسی حاضر، به نظر می‌رسد کاربرد هم‌زمان اکسین و تیامین بر افزایش ترکیبات فنلی در مراحل مختلف رشد گیاه زراعی و دانة روغنی موثر است.

 

سپاسگزاری

نگارندگان از گروه زیست‌شناسی دانشگاه شهید باهنر کرمان  بابت همکاری صمیمانه در اجرای پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌کنند. 

 

Abdel-Aziz, S., Lobna, T. and Soad, M. (2009) Some studies on the effect of putrescine, ascorbic acid and thiamine on growth, flowering and some chemical constituents of Gladiolus plants at Nubaria. Journal of Applied Sciences 2(2): 169-179.

Abdel-Monaim, M. (2011) Role of riboflavin and thiamine in induced resistance against charcoal rot disease of soybean. African Journal of Biotechnology 10(53): 10842-10855.

Abrahamian, P. and Kantharajah, A. (2011) Effect of vitamins on in vitro organogenesis of plant. American Journal of Plant Sciences 2(5): 669-674.

Basak, U. C., Das, A. B. and Das, P. (2000) Rooting response in stem cuttings from five species of mangrove trees: effect of auxins and enzyme activities. Marine Biology 136(1): 185-189.

Boubakri, H., Poutaraud, A., Wahab, M. A. and Clayeux, C.(2013)Thiamine modulates metabolism of the phenylpropanoid pathway leading to enhanced resistance to Plasmopara viticola in grapevine. BMC Plant Biology 26: 13-31.

Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72(1): 248- 254.

Cheng, G. W. and Breen, P. J. (1991) activity of phenylalanine ammonia-lyase and concentration of anthocyanins and phenolics in developing strawberry fruit. Journal of the American Society for Horticultural Science 116(5): 865-869.

Ding, C. K., Chachin, K., Ueda, Y., Imahori, Y. and Wang, C. Y. (2001) Metabolism of phenolic compounds during loquat fruit development. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49(6): 2883-2888.

 Ewane, C. A., Lepoivre, P., Lapeyre, L. and Lassois, L. (2012) Involvement of phenolic compounds in the susceptibility of bananas to crown rot. A review. Biotechnology Agronomy Society and Environment 16(3): 393-404.

Frenkel, C. and Dyck, R. (1973) Auxin inhibition of ripening in Bartlett pears. Plant Physiology 51(1): 6-9.

Fuchs, H. (2001) Root regeneration of rose plants as influenced by applied auxins. In: 3rd International Symposium of the Research and Cultivation of Roses, Perth, Australia.

Hellal, F. and Abdelhamid, M. (2013) Nutrient management practices for enhancing soybean (Glycine max L.) production. Acta Biologica Colombiana. 18(2): 301-310.

Hoagland, D. R. and Arnon, D. I. (1950) The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station, University of California, California.

Jay-Allemand, C., Drouet, A., Ouaras, A. and Cornu, D. (1989) Polyphenolic and enzymatic characterization of ageing and rejuvenation of hybrid walnut trees (Juglans nigra x Juglans regia): relationship to growth. Annales Sciences Forestières 46(23): 190-195.

Jellin, J. M., Gregory, P. and Batz, F. (2008) Natural medicines comprehensive database. Journal of the Medical Library Association 90(1): 1-89.

Korasick, D. A., Enders, T. and Strader, L. C. (2013) Auxin biosynthesis and storage forms. Journal of Experimental Botany 64(9): 2541-2555.

Li, Y., Sakiyama, R., Maruyama, H. and Kawabata, S. (2001) Regulation of anthocyanin biosynthesis during fruit development in nyoho strawberry. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 70(1): 28-32.

Lichtenthaler, H. K. (1987) Chlorophyll and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology 148(2): 350-382.

Lister, C. and Lancaster, J. (1996) Phenylalanine ammonia liyase (PAL) activity and relationship to anthocyanin and flavnoid levels New Zealand-grown apple cultivars. Journal of the American Society for Horticultural Science 121(2): 281-285.

Lukatkin, A. S. (2002) Contribution of oxidative stress to the development of cold-induced damage to leaves of chilling-sensitive plants: Reactive oxygen species formation during plant chilling. Russian Journal of Plant Physiology 49(5): 622-627.

Malmir, H. A. (2014) The changes in phenolic and flavonoids compound related to the harvest times and enzyme activity during stages of leaves development in Juglans Regia. International Journal of Agriculture and Forestry 4(4): 338-342.

McWilliams, D. A., Berglund, D. R., and Endres, G. J. (2004) Soybean growth and management quick guide. North Dakota State University NDSU Extension Service, 117(4): 1-5.

Sellami, I. H., Maamouri, E., Chahed, T., Wannes, W. A., Kchouk, M. E. and Marzouk, B. (2009) Effect of growth stage on the content and composition of the essential oil and phenolic fraction of sweet marjoram (Origanum majorana L.). Industrial Crops and Products 30(3): 395-402.

Strader, L. C. and Bartel, B. (2011) Transport and metabolism of the endogenous auxin precursor   indole-3-butyric acid. Molecular Plant 4(3): 477-486.

Tunc-Ozdemir, M., Miller, G., Song, L., Kim, J., Sodek, A., Koussevitzky, Sh,. Narayan Misra, A., Mittler, R. and Shintani, D. (2009) Thiamin confers enhanced tolerance to oxidative stress in Arabidipsis. Plant Physiology 151: 421-432.

Vats, S., Tiwari, R., Alam, A., Behera, K. K. and Pareek, R. (2012) Evaluation of phytochemicals, antioxidant and antimicrobial activity of in vitro culture of Vigna unguiculata. Researcher 4: 70-74.

Wagner, G. J. (1979) Content and vacuole/extravacuole distribution of neutral sugars, free amino acids, and anthocyanin in protoplasts. Plant Physiology 64(1): 88-93.

Youssef, A. A. and Talaat, I. M. (2003) Physiological response of rosemary plants to some vitamins. Egyptian Pharmaceutical Journal (1): 81-93.

Zhishen, J., Mengcheng, T. and Jianming, W. (1999) The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry 64(4): 555-559.

Ziaei, M., Sharifi, M., Behmanesh, M. and Razavi, K. (2012) Gene expression and activity of phenylalanine ammonia liyase and essential oil composition of (Ocimum basilicum L.) at different growth stages. Iranian Journal of Technology (10): 32-39.

Zolman, B. K., Yoder, A. and Bartel, B. (2000) Genetic analysis of IBA response in Arabidipsis thaliana reveals four mutant classes. Genetic 159: 1323-1337.