بررسی تنوع‌آللی با روش SDS-PAGE در بافت برگ گندم نان

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

گروه کشاورزی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران

چکیده

پژوهش حاضر برای بررسی قرابت ژنتیکی بین ژنوتیپ‌هایی از گندم نان (Triticum aestivum L.) براساس مطالعات الکتروفورزی پروتئین‌های برگ با روش SDS-PAGE انجام شد. در پژوهش حاضر، الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های محلول برگ 16 ژنوتیپ گندم نان بررسی شد. غلظت پروتئین‌های کل محلول برگ، با روش برادفورد و اسپکتروفتومتری تعیین شد. پس از رنگ‌آمیزی با کوماسی‌بلو R-250 برای تجزیة داده‌های الکتروفورزی، به حضور هریک از باندها عدد 1 و به نبودن آنها عدد صفر داده شد. ماتریس تشابه محاسبه و تجزیة خوشه‌ای براساس ضریب تشابه جاکارد با روش UPGMA انجام شد. مقایسة الگوی باندی حاصل از الکتروفورز پروتئین‌های محلول در برگ نمونه‌های مطالعه‌شده نشان داد باندهای پروتئینی ازنظر موقعیت روی ژل، وزن مولکولی، تراکم و شدت متفاوت بودند. با تجزیة خوشه‌ای، ژنوتیپ‌های مدنظر دسته‌بندی شدند و میزان قرابت ژنتیکی بین آنها بررسی شد. نتایج SDS-PAGE نشان دادند ژنوتیپ‌های نوید و بک‌کراس روشن زمستانه، همة پلی‌پپتیدهای ایجادشده بین ژنوتیپ‌های مطالعه‌شده را داشتند. ژنوتیپ‌های زارع و بک‌کراس روشن زمستانه بیشترین تعداد باند را (23 باند) داشتند و ژنوتیپ پیشگام کمترین تعداد باند (13 باند) را داشت. براساس دندروگرام داده‌های الکتروفورزی و نمودار حاصل از تجزیه به محورهای اصلی، ژنوتیپ‌های بزوستایا و نوید بیشترین اختلاف و فاصلة ژنتیکی را داشتند. نتایج پژوهش حاضر می‌توانند برای برنامه‌های اصلاحی گندم نان مفید باشند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of allelic diversity using SDS-PAGE technique in leaf tissues of bread wheat

نویسنده [English]

  • mehdi kakaei
Department of Agriculture, Payame Noor University, Tehran, Iran
چکیده [English]

The present study was performed with the purpose of evaluating the genetic relationship between bread wheat genotypes based on leaf protein electrophoresis using the SDS-PAGE technique. In this study, soluble protein electrophoresis patterns were investigated in 16 genotypes of bread wheat. The concentration of the total leaf soluble proteins was determined using the Bradford and spectrophotometric methods. After staining using Coomassie blue R-250, in order to analyze the electrophoresis data, the presence and absence of the protein bands were scored one and zero, respectively. The similarity matrix was calculated and cluster analysis was performed based on Jaccard coefficient using UPGMA. The comparison of banding patterns of leaf soluble protein electrophoresis samples showed that not only were the protein bands on gels different in terms of location and molecular weight, but they also showed difference in terms of density and intensity. The studied genotypes were classified using cluster analysis and the genetic relationship between them was investigated. According to SDS-PAGE analysis, backcross roshan zemestaneh and Navid genotypes possessed all the polypeptides generated among the studied genotypes. Zare and backcross roshan zemestaneh genotypes had the highest number of protein bands (23 bands) and pishgam genotype had the lowest number of bands (13 bands). Based on the dendrogram of electrophoretic data and plot of the principal axis analysis, Bezostaya and Navid were the most different and genetically distanced genotypes. The results of this study could be useful in bread wheat breeding programs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biodiversity
  • Wheat
  • leaf protein
  • protein markers

گندم (Triticum aestivum L.) مهم‌ترین غله و منبع غذایی در جهان است. گندم ازنظر ویژگی‌های مختلف کمّی و کیفی، سازگاری با عوامل محیطی و انواع مقاومت‌ها تنوع‌ژنتیکی وسیعی دارد (Naroei Rad and Farzanjoo, 2006). اصلاح‌نباتات بر پایة تنوع و گزینش بنا نهاده شده است و تنوع‌ژنتیکی زمینة فعالیت و انتخاب اصلاح‌گر را برای گزینش و دیگر عملیات اصلاحی افزایش می‌دهد (Abozari Gazafroodi et al., 2006). وجود تنوع‌ژنتیکی برای انتخاب والدین در برنامه‌های به‌نژادی اهمیت بسیار دارد. از روش‌های بررسی تنوع‌ژنتیکی می‌توان به روش‌های مورفولوژیک، مولکولی و بیوشیمیایی اشاره کرد. اطلاع دربارة تنوع و ارتباط ژنتیکی بین ژنوتیپ‌ها کمک بزرگی در تعیین راهبردهای توسعة محصولات به شمار می‌رود (Kakaei et al., 2009). یکی از روش‌های بررسی تنوع‌ژنتیکی ژنوتیپ‌های گیاهی، استفاده از روش الکتروفورز پروتئین است (Kakaei et al., 2010). پروتئین‌ها به‌طور مستقیم با نوکلئیک اسیدها کدگذاری می‌شوند؛ بنابراین از لحاظ ژنتیکی، اختلاف در پروتئین‌ها باید در تغییر رفتار الکتروفورزی نمایان شود (Mahmoudzadeh et al., 2003). الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید برای تعیین وزن مولکولی پروتئین‌ها، روشی رایج و مهم در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی است. این روش ضمن ساده‌بودن، به مقدار اندکی نمونه برای انجام آزمایش نیاز دارد و قدرت تفکیک مناسب برای شناسایی و تعیین خلوص پروتئین‌ها دارد. مطالعة تنوع‌ ژنتیکی با روش SDS-PAGE برای به دست آوردن تنوع و فاصلة ژنتیکی، از اندام‌های مختلف گیاهان موضوع بسیاری از پژوهش‌های علوم زیستی مانند تحقیقات Kakaeiو همکاران (2009) بر کلزا، Salehiو همکاران (2015) بر بومادران، Mossavi و همکاران (2010) بر جمعیت‌های گندم وحشی، Seyedi و همکاران (2010) بر جمعیت‌های پستة‌ وحشی و Mirjalili (2016) بر جمعیت مریم‌گلی دارویی بوده است. بررسی تنوع‌ژنتیکی گندم، متخصصان اصلاح‌نباتات را در شناسایی ظرفیت ژنتیکی صفات مرتبط با اهداف اصلاحی مهم این گیاه یاری می‌کند و مطالعة الگوپذیری تنوع‌ژنتیکی از تنوع جغرافیایی و اقلیمی ژنوتیپ‌ها نشان‌دهندة سازگاری‌های احتمالی آنها با محیط‌های متفاوت است (Romesburg, 1990). بیشتر صفات گیاهی که اهمیت اقتصادی فراوانی دارند به‌صورت کمّی به ارث می‌رسند. این صفات، وراثت‌پذیری نسبتا پایینی دارند و گزینش مستقیم آنها در مزرعه با مشکلاتی همراه است. همچنین انجام‌دادن عملیات اصلاحی دربارة این صفات مشکل است. پژوهشگران اصلاح‌نباتات همیشه به‌دنبال یافتن نشانگرهای ژنتیکی و بیوشیمیایی‌اند که با این صفات پیوستگی داشته باشد تا بتوان از این نشانگرها برای معیارهای غیرمستقیم گزینش استفاده کرد. Razavizadeh و Ehsanpour (2013) در مطالعة پروتئین بذر هفت رقم سویا با روش SDS-PAGE بیان کردند 11 باند پلی‌مورفیک برای تشخیص تنوع‌ژنتیکی شناسایی شده‌اند و ارقام دارای بیشترین و کمترین شباهت را شناسایی کرده‌اند. Ashrafi و همکاران (2012) در مطالعة تنوع پروتئین‌های ذخیره‌ای دانة گونه‌های مختلف جنس Papaver ابراز کردند تنوع مطلوبی از این نظر بین گونه‌های یادشده وجود دارد. همچنین همبستگی معنی‌داری بین صفات زراعی مورفولوژیک و فیزیولوژیک با داده‌های حاصل از روش SDS-PAGE مشاهده و گزارش کردند.

به‌تازگی پیشرفت‌ها در زمینة زیست‌شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی، ابزار قدرتمندی برای پژوهش‌های ژنتیک گیاهان عالی ازجمله گیاهان زراعی فراهم کرده‌اند. شاید اساسی‌ترین و مفیدترین این ابزارها نشانگرهای مولکولی باشند. با این نشانگرها در هر مرحله‌ای از رشد گیاه می‌توان گیاهان مطلوب را به‌طور مستقیم براساس ژنوتیپ به‌جای فنوتیپ انتخاب کرد که این مسئله دورة اصلاحی را کوتاه‌تر می‌کند و صرفه‌جویی را در وقت و هزینه موجب می‌شود (Kardavan Ghabel et al., 2013). وجود تنوع‌ژنتیکی برای انتخاب والدین در برنامه‌های به‌نژادی اهمیت زیادی دارد. از روش‌های مطالعة تنوع‌ژنتیکی می‌توان به روش‌های بیوشیمیایی و مولکولی اشاره کرد. برای بهره‌وری مؤثرتر، از خزانة ‌ژنی، ارزیابی تنوع‌ژنتیکی احتمالی در جمعیت‌های گندم لازم است؛ بنابراین، اهداف پژوهش حاضر عبارتند از: 1) بررسی میزان تنوع‌ژنتیکی و پروتئینی بافت برگ در ژنوتیپ‌های گندم کشت‌شده در ایران و 2) گروه‌بندی ژنوتیپ‌های مدنظر با تجزیة خوشه‌ای و با نشانگرهای پروتئینی (SDS-PAGE).

 

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی: در پژوهش حاضر، از 16 ژنوتیپ T. aestivum تهیه‌شده از بخش غلات مرکز تحقیقات کشاورزی استان همدان استفاده شد (جدول 1).

 

 

جدول 1- اسامی ژنوتیپ‌های مطالعه‌شده

ردیف

ژنوتیپ

ردیف

ژنوتیپ

ردیف

ژنوتیپ

1

بزوستایا

7

امید

13

سرداری

2

پیشگام

8

نوید

14

الوند

3

سایسون

9

بک‌کراس روشن زمستانه

15

الموت

4

DN-11

10

زارع

16

زرین

5

شاهپسند

11

Sara/Thb/vee

 

 

6

میهن

12

شهریار

 

 

 


.استخراج پروتئین بافت برگ در مرحلة شروع ساقه‌دهی: برای استخراج پروتئین‌های بافت برگ، برگ‌ها در مرحلة شروع ساقه‌دهی از مزرعة دانشگاه پیام‌نور اسدآباد جمع‌آوری و بلافاصله در ازت مایع منجمد شدند. نمونه‌ها تا زمان استخراج در فریزر 70- درجة سانتی‌گراد قرار گرفتند. هنگام استخراج، برگ‌ها در هاون چینی قرار داده شدند و در یخ و در حضور ازت مایع پودر شدند؛ سپس از پودر برگ به‌دست‌آمده برای استخراج پروتئین استفاده شد؛ بدین‌منظور 100 میلی‌گرم از پودر به‌دست‌آمده از برگ هر ژنوتیپ با 2 میلی‌لیتر بافر استخراج حاوی DTT–TCA-Acetone مخلوط شد و مخلوط حاصل سه ساعت در فریزر 20- درجة سانتی‌گراد قرار گرفت؛ سپس در سانتریفیوژ یخچال‌دار در دمای 4 درجة سانتی‌گراد با دور g 13000 به‌مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ و با مخلوط مادة شستشو (TCA and Acetone)، شستشو شد. درنهایت از پودر نسبتا سفیدرنگ برای الکتروفورز استفاده شد (Kakaei et al., 2010).

.الکتروفورز پروتئین استخراج‌شده از بافت برگ: در پژوهش حاضر برای الکتروفورز پروتئین از روش SDS-PAGE (الکتروفورز در ژل پلی‌اکریل‌آمید در حضور سدیم دودسیل‌سولفات) استفاده شد. SDS-PAGE در ژل جداکنندة 5/12 درصد و ژل متراکم‌کنندة 5 درصد با روش Laemmli (1970) انجام شد. پس از استخراج پروتئین‌های برگ، مقدار غلظت پروتئین محلول نمونه‌ها مطابق روش Bradford (1976)، با استاندارد آلبومین سرم گاوی با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل CECIL CE7250، شرکت Unired kingdom، انگلستان) اندازه‌گیری شد. ژل آماده‌شده در تانک الکتروفورز کوچک (مدل VU-80، شرکت مهندسی پزشکی نوژن پارس، ایران) قرار گرفت و تانک بالایی و پایینی از بافرهای مربوطه پر شد. برای نمونه‌گذاری پس از آماده‌کردن نمونه‌ها در بافر الکتروفورز، مقدار 17 میکرولیتر از هر نمونه با غلظت یکسان (از پروتئینی با غلظت 45/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) در چاهک‌های ژل قرار گرفت؛ سپس مجموعه‌ای از پروتئین‌های استاندارد نیز در چاهک ژل نشانده شد. الکتروفورز با ولتاژ 50 ولت در ژل متراکم‌کننده به‌مدت 30 دقیقه و با ولتاژ 150 ولت در ژل جداکننده به‌مدت 5/1 ساعت انجام شد. با رسیدن رنگ نشانه به لبة پائینی ژل، جریان قطع شد.

.رنگ‌آمیزی و رنگ‌بری ژل پلی‌اکریل آمید: پس از الکتروفورز، رنگ‌آمیزی ژل با کوماسی بریلیانت بلو R-250 انجام شد (Chen et al., 1993). در این روش مراحل ثبوت و رنگ‌آمیزی پروتئین‌ها به‌طور هم‌زمان انجام شدند. پس از 5/1 ساعت قرارگرفتن ژل در محلول رنگ، رنگ‌بری آن با محلول رنگ‌بر (متانول، استیک اسید گلاسیال و آب مقطر) تا روشن‌شدن زمینة ژل ادامه یافت و سپس ژل اسکن شد. پس از این مرحله، با وزن مولکولی پروتئین‌های نمونة استاندارد، Rf (نسبت فاصلة باند پروتئین تا چاهک به فاصلة انتهای ژل از چاهک) مربوط به هر پروتئین محاسبه و باتوجه‌به آن، رابطة بین Rf و وزن مولکولی ارزیابی شد؛ سپس Rf نمونة مجهول در رابطة ایجاد‌شده در نمودار استاندارد در شکل 1 قرار داده و وزن مولکولی نمونة مجهول محاسبه شد. مقدار Rf از رابطة 1 به دست آمد (Gomori, 1955).

 

رابطة 1

(فاصلة نقطة مرجع از نقطة مبدأ)/(فاصلة طی‌شدة پروتئین از مبدأ)Relative mobility=


 


تحلیل آماری: باندها براساس حضور و نبودن در هر نمونه امتیازدهی شدند. برای تعیین فاصلة ژنتیکی، ماتریس دو‌طرفة ارقام و متغیرها براساس صفر و 1 تشکیل شد و سپس تحلیل داده‌ها ازجمله تجزیه به محورهای اصلی با نرم‌افزار NTSYS pc نسخة 2.02e انجام شد. تجزیة خوشه‌ای براساس ضریب تشابه جاکارد انجام شد (Kakaei et al., 2009) و درنهایت دندروگرام براساس الگوریتم UPGMA ترسیم شد.

 

 

شکل 1- نمودار Rf در مقابل لگاریتم وزن مولکولی پروتئین‌های نمونة استاندارد برای تعیین وزن مولکولی پروتئین‌ها در روش SDS-PAGE

 


نتایج و بحث

در پژوهش حاضر، SDS-PAGE، روش اصلی انتخاب شد. شکل‌های 3 و 4 به‌ترتیب الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های محلول برگ را در ژنوتیپ‌های 1 تا 10 و 11 تا 16 نشان می‌دهند. براساس شکل‌های 3 و 4، تراکم و میزان باندهای حاصل در ژنوتیپ‌ها، بسیار شبیه به همدیگر هستند؛ اما برخی از باندهای پروتئینی ازنظر محل قرارگرفتن روی ژل، وزن مولکولی، تراکم و شدت با یکدیگر اختلاف نشان دادند. برای 16 ژنوتیپ مطالعه‌شده بیشترین تعداد باند مربوط به ژنوتیپ 10 و کمترین تعداد مربوط به ژنوتیپ 2 بود که به‌ترتیب 22 و 11 باند داشتند. شکل 3، ژنوتیپ شمارة 1 تا 10، و شکل 4، ژنوتیپ شمارة 11 تا 16 را نشان می‌دهد. ژنوتیپ 7، 9 و 10 بیشترین تعداد باند و ژنوتیپ 2 کمترین تعداد باند را بین ژنوتیپ‌های بررسی‌شده داشتند. برخی از باندها در همة ژنوتیپ‌ها یکسان بودند که احتمالا پروتئین‌های اختصاصی گندم باشند؛ هرچند پروتئین‌های اختصاصی نیز بین ژنوتیپ‌ها موجود بودند. علامت پیکان روی تصویر ژل SDS-PAGE به باندهای حذف‌شده اشاره دارد.

شکل 2، پروتئین محلول کل ژنوتیپ‌های گندم بررسی‌شده را نشان می‌دهد. ژنوتیپ‌های نوید، سایسون و پیشگام بیشترین و ژنوتیپ‌های سرداری و Sara/Thb/vee کمترین مقدار پروتئین محلول کل را داشتند.

هرچه فاصلة ژنتیکی جمعیت‌ها و والدین بیشتر باشد، هتروزیس بیشتری می‌توان مشاهده کرد. همچنین برای کاهش تعداد داده‌ها، افراد مشابه در گروه‌های مختلف دسته‌بندی می‌شوند و این مسئله از ضروریات مطالعات در کشاورزی است (Osmani and Siosemardeh, 2009).

 

 

 

شکل 2– پروتئین محلول کل ژنوتیپ‌های گندم مطالعه‌شده

 

 

 

شکل 3- الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های محلول بافت برگ در ژنوتیپ‌های شمارة 1 تا 10- اسامی ژنوتیپ‌ها عبارتند از: 1 (بزوستایا)، 2 (پیشگام)، 3 (سایسون)، 4 (DN-11)، 5 (شاهپسند)، 6 (میهن)، 7 (امید)، 8 (نوید)، 9 (بک‌کراس روشن زمستانه) و 10 (زارع). پروتئین‌های اوترانسفرین (78 کیلو دالتون)، آلبومین گاوی (66 کیلودالتون)، اوآلبومین (45 کیلودالتون)، اکتینیدین (29 کیلودالتون)، بتا - لاکتوگلوبولین (18 کیلودالتون) و لیزوزیم (14 کیلودالتون) نشانگر در ژل بودند. علامت پیکان به باندهای تشکیل‌نشده اشاره دارد.

 

 

شکل 4- الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های محلول بافت برگ در ژنوتیپ‌های شمارة 11 تا 16- اسامی ژنوتیپ‌ها عبارتند از: 11 (Sara/Thb/vee)، 12 (شهریار)، 13 (سرداری)، 14 (الوند)؛ 15 (الموت) و 16 (زرین). پروتئین‌های اوترانسفرین (78 کیلو دالتون)، آلبومین گاوی (66 کیلودالتون)، اوآلبومین (45 کیلودالتون)، اکتینیدین (29 کیلودالتون)، بتا - لاکتوگلوبولین (18 کیلودالتون) و لیزوزیم (14 کیلودالتون) نشانگر در ژل بودند. علامت پیکان به باندهای تشکیل‌نشده اشاره دارد.

 

 

جدول 2، تنوع نوارهای پروتئینی بافت برگ ژنوتیپ‌های مختلف گندم نان را با وزن مولکولی تقریبی برحسب کیلودالتون و حرکت نسبی آنها نشان می‌دهد. براساس این جدول، ژنوتیپ‌های 7، 9 و 10، همة پلی‌پپتیدهای ایجاد‌شده را (نسبت به سایر ژنوتیپ‌ها) داشتند؛ ولی سایر ژنوتیپ‌ها پلی‌پپتیدهای حذف‌شده و ایجادشده داشتند. پلی‌پپتیدهای 04/133، 97/112 و 49/95 کیلودالتون در ژنوتیپ‌های شمارة 1، 2، 8 و 14 ایجاد نشده‌اند؛ درحالی‌که در سایر ژنوتیپ‌ها این پلی‌پپتیدها شناسایی‌پذیر هستند. ژنوتیپ‌های 1 تا 6 نیز پلی‌پپتید 62/31 و 30/26 کیلودالتونی را ندارند. ژنوتیپ‌های شمارة 2 و 8 نیز پلی‌پپتید 48/15، 48/13، 58/12 و 91/8 کیلودالتونی را ندارند. این اختلاف در تشکیل باند پروتئینی نشان‌دهندة تنوع بین ژنوتیپ‌های بررسی‌شده است؛ زیرا این ژنوتیپ‌ها ویژگی‌های مورفولوژیک، فیزیولوژیک و ... متفاوتی دارند که در این مطالعه از منظر پلی‌پپتید (باند پروتئینی ایجادشونده) اختلاف ژنوتیپ‌ها نمایان شده است. ازسویی به‌‌دلیل‌اینکه زمان تولید و ایجاد این ژنوتیپ‌ها یکسان نبوده است و در سالیان متوالی این ژنوتیپ‌ها آزاد شده‌اند و اهداف اصلاحی ویژة خود را نیز داشته‌اند؛ بنابراین، اختلافات و تنوع در صفات موجود در این ژنوتیپ‌ها مانند نوع تولید پلی‌پپتید یا پلی‌پپتیدهای ویژه دور از انتظار نیست.

Amini و Ehsanpour (2009) در مطالعة برگ گیاه Lycopersicon esculentum cv. Isfahani با روش SDS-PAGE ابراز کردند در تنش شوری در گوجه‌فرنگی رقم اصفهانی بیان پروتئین‌های 40، 91 و 110 کیلودالتونی برگ کاهش و بیان پروتئین‌های 26، 20 و 50 کیلودالتونی ساقه و 30 و 75 کیلودالتونی افزایش یافت.

در برنامه‌های به‌نژادی و گروه‌بندی ذخایر ژنتیکی گندم، از نشانگرهای مختلف مورفولوژیک پروتئینی و DNA استفاده شده است (Fahima et al., 1998). شکل 5، دندروگرام داده‌های الکتروفورزی حاصل از تحلیل داده‌های الکتروفورزی براساس باندهای پروتئین‌های ذخیره‌ای بافت برگ ژنوتیپ‌های گندم نان را با روش UPGMA نمایش می‌دهد. خط برش در مقیاس 79/0 ژنوتیپ‌ها را به سه گروه تقسیم کرده است. ژنوتیپ‌های شمارة 1، 5 و 14 در گروه اول، ژنوتیپ‌های 3، 4، 6، 7، 9، 10، 12، 11، 13، 15 و 16 در گروه دوم و ژنوتیپ‌های شمارة 2 و 8 در گروه سوم قرار گرفتند که براساس این گروه‌بندی، ژنوتیپ‌های شمارة 1 و 8 بیشترین اختلاف را داشتند. از این تنوع و فاصلة به‌دست‌آمده بین ژنوتیپ‌های یادشده (ژنوتیپ‌های شماره 1 و 8) می‌توان در برنامه‌های به‌نژادی برای تلاقی و به دست آوردن هتروزیس برتر بهره‌برداری کرد؛ البته برای دستیابی به این نتیجه، مطالعة صفات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و نیز سایر صفات مؤثر دیگر و انطباق این صفات با داده‌های حاصل از مطالعة SDS-PAGE بافت برگ پیشنهاد می‌شود. Zargani و همکاران (2014) در پژوهشی بر برخی لاین‌های دابل‌هاپلوئید گندم نان با نشانگر ریزماهواره و با روش‌های مطالعة گروه‌بندی در تجزیة خوشه‌ای (مانند الگوریتم UPGMA و با ضرایب تشابه)، ژنوتیپ‌های مطالعه‌شده را در سه گروه دسته‌بندی و بیان کردند نشانگرهای ریزماهواره، نشانگرهای بسیار مناسبی برای تفکیک لاین‌ها و ژنوتیپ‌های گندم هستند.

 

 

جدول 2- تنوع نوارهای پروتئینی بافت برگ ژنوتیپ‌های مختلف گندم نان با وزن مولکولی تقریبی برحسب کیلودالتون و حرکت نسبی آنها

نوار

Rf

 

لگاریتم وزن مولکولی

آنتی‌لگاریتم وزن مولکولی

شمارة ژنوتیپ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

 

1

1/0

124/2

04/133

0

0

1

1

0

1

1

0

1

1

1

1

1

0

1

1

 

2

15/0

053/2

97/112

0

0

1

1

0

1

1

0

1

1

1

1

1

0

1

1

 

3

20/0

98/1

49/95

0

0

1

1

0

1

1

0

1

1

1

1

1

0

1

1

 

4

26/0

89/1

62/77

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

5

31/0

82/1

06/66

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

6

35/0

76/1

54/57

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

7

37/0

73/1

70/53

1

1

1

0

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

8

39/0

7/1

11/50

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

 

9

40/0

69/1

97/48

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

10

42/0

66/1

70/45

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

11

48/0

58/1

01/38

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

12

50/0

55/1

48/35

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

13

53/0

5/1

62/31

0

0

0

0

0

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

14

57/0

45/1

18/28

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

15

59/0

42/1

30/26

0

0

0

0

0

0

1

0

1

1

1

0

0

1

1

1

 

16

65/0

33/1

37/21

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

0

1

0

1

1

1

 

17

68/0

29/1

49/19

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

18

71/0

25/1

78/17

1

1

1

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

0

1

1

 

19

75/0

19/1

48/15

1

0

1

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

 

20

79/0

13/1

48/13

1

0

1

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

 

21

82/0

1/1

58/12

1

0

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

22

92/0

95/0

91/8

1

0

1

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

23

96/0

89/0

76/7

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

 

ترتیب اسامی ژنوتیپ‌ها براساس جدول 1 است. اعداد 1 و صفر به ترتیب بیان‌کنندة وجود و نبودن نوار پروتئینی ویژه‌ای است.

 

 

نتایج حاصل از نمودار تجزیه به محورهای اصلی که براساس پروتئین‌های ذخیره‌ای بافت برگ ژنوتیپ‌های گندم نان ترسیم شده است (شکل 6)، منطبق بر نتایج به‌دست‌آمده از تجزیة خوشه‌ای است. براساس شکل 6، ژنوتیپ شمارة 2 و 8 در گروه اول، ژنوتیپ شمارة 1 و 14 در گروه دوم و سایر ژنوتیپ‌ها در گروه سوم قرار گرفتند. بر این اساس اختلاف ژنوتیپ شمارة 1 و 8 کاملا مشهود است. در این راستا Atri و همکاران (2012) در مطالعة پروتئین‌های بذر Artemisia spicigera L. از تجزیة خوشه‌ای و تجزیة PCA در راستای مطالعة تنوع‌ژنتیکی استفاده کردند. Seyedi و همکاران (2010) در مطالعه‌ای با عنوان کاربرد پروتئین‌های ذخیره‌ای بذر در مطالعة تنوع درون‌گونه‌ای جمعیت‌های پستة وحشی، با تجزیة خوشه‌ای با روش Ward، جمعیت‌های پستة وحشی را در سه گروه آماری طبقه‌بندی کردند و آن را روشی مناسب برای تفکیک جمعیت‌های مطالعه‌شده دانستند. در پژوهشی دیگر Mirjalili (2016) در مطالعة تنوع‌ژنتیکی جمعیت‌های مریم گلی دارویی با روش SDS-PAGE، پنج جمعیت مطالعه‌شده را در دو گروه آماری تقسیم‌بندی و ابراز کردند تحلیل خوشه‌بندی، داده‌هایی فراهم می‌کند که بررسی روابط فیلوژنتیک را بین گونه‌ها و جمعیت‌ها امکان‌پذیر می‌کند.

جدول 3 ماتریس تشابه جاکارد را بر اساس نشانگر پروتئینی بافت برگ ژنوتیپ‌های گندم نان نشان می‌دهد. ژنوتیپ 8 با 3 کمترین تشابه (5217/0) را دارند؛ اگرچه ژنوتیپ 2 در گروه آماری دوم قرار دارد؛ ولی دوباره توانسته است در دندروگرام، فاصلة خود را با ژنوتیپ 8 حفظ کند و ژنوتیپ‌های 5 با 1؛ 6 با 4، 9، 10؛ 11 با 7؛ 10 و 11 با 9؛ 11 با 10؛ 13 با 11؛ 16 با 15 بیشترین تشابه را دارند. Zargani و همکاران (2014) بیشترین میزان تشابه را بین لاین‌های مطالعه‌شدة گندم نان با باندهای ایجادشده با نشانگر ریزماهواره (97/0) و کمترین میزان تشابه (89/0) گزارش و بیان کردند این ضریب تشابه زیاد، نشان‌دهندة شباهت فراوان موجود بین مجموعة لاین‌های بررسی‌شده است و نیز افزودند این شباهت تحت اثر تعداد ژنوتیپ مورد مطالعه و تعداد آغازگر به‌کاررفته است. در پژوهش حاضر بیشترین میزان تشابه مشاهده‌شده 95/0 تا 1 درصد و کمترین مقدار این تشابه 5/0 بود که با نتایج به‌دست‌آمده از مطالعة Zargani و همکاران (2014) همسو است. همة ژنوتیپ‌هایی که در گروه آماری اول (1، 5 و 14) قرار دارند با همة ژنوتیپ‌های قرارگرفته در گروه آماری سوم (2 و 8) ازنظر فاصله در دندروگرام، دورترین فاصله را دارند و در جدول تشابه جاکارد نیز این فاصله (تشابه‌نداشتن) مشخص است. برای نمونه، ژنوتیپ‌های 1 با 8، 1 با 2، 5 با 2، 5 با 8، 14 با 2 و 14 با 8 نسبت به سایر داده‌های جدول، تشابه کمتری داشتند که نشان‌دهندة فاصلة بیشتر آنها است. ژنوتیپ‌هایی که تشابه دارند ازلحاظ نزدیکی ژنتیکی نسبت به هم، قابلیت تلاقی و انتخاب را برای نقش والد ندارند؛ ولی ژنوتیپ‌هایی که تشابه کمتری دارند یا به‌عبارتی اختلاف دارند، شایستگی انتخاب‌شدن برای نقش والد و درنهایت، تلاقی را برای ایجاد نتاج مطلوب‌تر در طرح‌های تلاقی دارند. Tajdoost و همکاران (2012) نیز استفاده از روش ماتریس تشابه را در اکوتیپ‌های سس زراعی مطالعه کرده و آن را روشی مناسب برای تعیین فاصلة ژنتیکی یافته‌اند. Osmani و Siosemardeh (2009)، در مطالعة اکوتیپ‌های گندم سرداری از ضریب تشابه جاکارد استفاده کردند. Mohamadi و همکاران (2014) و Roz و همکاران (2010) نیز از ضرایب تشابه جاکارد در برخی ژنوتیپ‌های گندم نان با نشانگر ریزماهواره استفاده کردند. Calagari و Salehi-shanjani (2010)، Mohammadi و همکاران (1999) و Ahmed و همکاران (2008) با ارزیابی پروتئین‌های محلول با روش SDS-PAGE به‌ترتیب، گونه‌های مطالعة‌شدة پده، گندم نان و گندم را گروه‌بندی کردند.

 

 

 

شکل 5- دندروگرام داده‌های الکتروفورزی حاصل از تحلیل داده‌های الکتروفورزی براساس باندهای پروتئین‌های ذخیره‌ای بافت برگ ژنوتیپ‌های گندم نان با روش UPGMA- اعداد 1 تا 12 شمارة ژنوتیپ‌های گندم مطابق جدول شمارة 1 هستند.

 

 

شکل 6- نمودار حاصل از تجزیه به محورهای اصلی براساس پروتئین‌های ذخیره‌ای بافت برگ ژنوتیپ‌های مطالعه‌شدة گندم نان- اعداد 1 تا 12 شمارة ژنوتیپ‌های گندم مطابق جدول شمارة 1 هستند.

 

 

جدول3- ماتریس تشابه ضرایب جاکارد بر اساس نشانگر پروتئینی بافت برگ ژنوتیپ‌های گندم نان

 

بزوستایا (1)

پیشگام

(2)

سایسون

(3)

DN-11

(4)

شاهپسند

(5)

میهن

(6)

امید

(7)

نوید

(8)

1

1

 

 

 

 

 

 

 

2

7222/0

1

 

 

 

 

 

 

3

7619/0

5238/0

1

 

 

 

 

 

4

8095/0

5714/0

8571/0

1

 

 

 

 

5

1

7222/0

7619/0

8095/0

1

 

 

 

6

8095/0

5714/0

8571/0

1

8098/0

1

 

 

7

7826/0

5652/0

8260/0

8695/0

7826/0

8695/0

1

 

8

6842/0

8/0

5/0

5454/0

6842/0

5454/0

6086/0

1

9

7826/0

5652/

8260/0

8695/0

7826/0

8695/0

1

6086/0

10

7826/0

5652/0

8260/0

8695/0

7826/0

8695/0

1

6086/0

11

7826/0

5652/0

8260/0

8695/0

7826/0

8695/0

1

6086/0

12

8181/0

5909/0

8636/0

9090/0

8181/0

9090/0

9565/0

6363/0

13

7391/0

5217/0

7826/0

8260/0

7391/0

8260/0

9565/0

5652/0

14

8421/0

5789/0

6363/0

6818/0

8421/0

6818/0

7391/0

7222/0

15

7391/0

5218/0

8636/0

8260/0

7391/0

8260/0

9565/0

5652/0

16

7391/0

5218/0

8636/0

8260/0

7391/0

8260/0

9565/0

5652/0

 

ادامة جدول 3

 

بک کراس روشن زمستانه

(9)

زارع

(10)

Sara/Thb/vee

(11)

شهریار

(12)

سرداری

(13)

الوند

(14)

الموت

(15)

زرین

(16)

9

1

 

 

 

 

 

 

 

10

1

1

 

 

 

 

 

 

11

1

1

1

 

 

 

 

 

12

9565/0

9565/0

9130/0

1

 

 

 

 

13

9565/0

9565/0

1

9130/0

1

 

 

 

14

7391/0

7391/0

7727/0

7727/0

7727/0

1

 

 

15

9565/0

9565/0

9130/0

9130/0

9130/0

6956/0

1

 

16

9565/0

9565/0

9130/0

9130/0

9130/0

6956/0

1

1


 


جمع‌بندی

روش‌های سنتی به‌نژادی به‌تدریج تنوع‌ژنتیکی را کاهش می‌دهند و این کاهش می‌تواند برای آیندة برنامه‌های اصلاحی خطرآفرین باشد (Morales Corts and Crespo Martinez, 2009). کاهش تنوع‌ژنتیکی آسیب‌پذیری شدید محصولات زراعی را دربرابر تنش‌های محیطی، آفات، بیماری‌ها و درنتیجه کاهش عملکرد را موجب می‌شود (Osmani and Siosemardeh, 2009). درحال‌حاضر نشانگرهای مولکولی متعددی برای برآورد تنوع‌ژنتیکی وجود دارند؛ ولی الکتروفورز پروتئین‌ها همواره روشی ساده و مرسوم برای برآورد تنوع‌ژنتیکی در گیاهان به شمار رفته است؛ زیرا ارتباط آنها با بخش فعال مادة ژنتیکی (ژن‌های ساختاری) بیشتر از اغلب نشانگرهای مبتنی بر DNA است (Morales Corts and Crespo Martinez, 2009). منطبق‌بودن نتایج تجزیة خوشه‌ای با نتایج تجزیه به محورهای اصلی نشان می‌دهد گروه‌بندی درست انجام شده است. پلی‌پپتیدهای ایجاد‌شده و حذف‌شده در برخی ژنوتیپ‌ها نشان‌دهندة تنوع پلی‌پپتیدی و درنتیجه تنوع‌ژنتیکی بین همة مواد آزمایش مطالعه‌شده است. الگوی الکتروفورزی پروتئین‌ها قادر است باند را شناساگر مولکولی معرفی کند. الگوی باندهای پروتئینی و سطح بیان پروتئین‌های ذخیره‌ای مشابه با گزارش حاضر می‌تواند در شناسایی ژنوتیپ‌ها و برنامه‌های به‌نژادی استفاده شود. همچنین ازآنجاکه تلاقی ژنوتیپ‌هایی که ازنظر ژنتیکی دورتر هستند تنوع بیشتری می‌تواند ایجاد کند و براساس نتایج پژوهش حاضر، نشانگرهای بیوشیمیایی مانند SDS-PAGE برای تفکیک و شناسایی ژنوتیپ‌های مختلف گندم مناسب هستند. از این نشانگر در گروه‌بندی ژنوتیپ‌های گندم و در شناسایی ژنوتیپ‌های مختلف متحمل به تنش‌های زیستی و غیرزیستی می‌توان بهره‌برداری کرد. پیشنهاد می‌شود به استفاده از این روش و سایر روش‌های مولکولی برای تفکیک مطلوب ژنوتیپ‌ها در برنامه‌ریزی اصلاحی برای ایجاد جمعیت‌های متنوع‌تر توجه شود. ازسویی با مقایسة نتایج پژوهش‌های مشابه با نتایج ارزیابی SDS-PAGE بر ارقام وحشی، در آینده می‌توان روند انتقال و جریان ژنی را از ارقام وحشی به ارقام زراعی ارزیابی کرد.

 

سپاسگزاری

از همکاری جناب آقای مهندس مهرداد چایچی برای در اختیار قرار دادن برخی از مواد پژوهشی حاضر، همکاری دکتر علی مصطفایی و سایر افراد سپاسگزاری می شود.

 

Abozari Gazafroodi, A., Honarneghad, R., Fotokian, M. and Alami, A. (2006) The correlation and path analysis of agronomic traits in rice. Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 2: 99-106 (in Persian).

Ahmed, K., Ahmed, A., Abbas, Z., Gulfraz, M., Shahid Masood, M. and Kisana, N. S. (2008) Genetic diversity in wheat (Triticum aestivum L.) as revealed by SDS-PAGE analysis. International Journal of Applied Agricultural Research 3(1): 1-8.

Amini, F. and Ehsanpour, A. A. (2009) Study of protein changes in tomato (Lycopersicon esculentum) under salt stress using two dimensional electrophoresis. Iranian Journal of Plant Biology 1(1-2): 13-24 (in Persian).

Ashrafi, R., Najaphy, A., Shaban, M. and Fathi, M. (2012) Evaluation of diversity seed storage proteins and some morphological traits in various species of Papaver. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 28(3): 385-398 (in Persian).

Atri, M., Chehregani Rad, A. and Yousefi, S. (2012) Study of floristic-ecologic diversity and electrophoresis pattern of seed storage proteins in Artemisia spicigera L. in the North-West of Iran using D.S.S. method. Journal of Plant Biology 12(4): 37-50 (in Persian).

 

 

 

Bradford, M. M. (1976) A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

Calagari, M. and Salehi-Shanjani, P. (2010) Study of genetic variation in Populus euphratica Oliv. by evaluating soluble proteins through SDS-PAGE. Iranian Journal of Forest 2(3): 253-261 (in Persian).

Chen, H. Y., Cheng, H. and Bjerknes, M. (1993) One-Step coomassie brilliant blue R-250 staining of proteins in polyacrylamide gel. Analytical Biochemistry 212(1): 295-296.

Fahima, T., Roder, M., Grama, A. and Nevo, E. (1998) Microsatellite DNA polymorphism divergence in Triticum dicoccoides accessions highly resistant to yellow rust. Theoretical and Applied Genetics 96: 187-195.

Gomori, G. (1955) Preparation of buffers for use in enzyme studies. Methods in Enzymology 1: 138-146.

Kakaei, M., Zebarjadi, A. R. and Mostafaie, A. (2009) Comparison of genetic and morpho-physiological distance via SDS-PAGE marker in some rapeseed genotypes. Agriculture Biotechnology 2: 79-93 (in Persian).

Kakaei, M., Zebarjadi, A. R. and Mostafaie, A. (2010) Study of protein pattern in Brassica napus genotypes under non-stress and drought stress conditions. Agricultural Biotechnology 9(2): 49-57 (in Persian).

Kardavan Ghabel, V., Bagher Bagherieh Najjar, M., Alishah, O. and Soltanloo, H. (2013) Correlation analysis of agronomic, fiber traits and AFLP markers in hybrid cotton (Gossypium Hirsutum × Gossypium Barbadense). Journal of Crop Breeding 5(12): 63-74.

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

Mahmoudzadeh, A., Haidari, R. and Jamalomidi, M. (2003) Estimation of genetic distance among tea varieties using protein electrophoresis and polymorphism for esterase. Journal of Agriculture Scinces Natural Research 10: 73-80 (in Persian).

Mirjalili, S. A. (2016) Assessment of genetic diversity among some accessions of sage (Salvia officinalis L.) using electrophoresis of seed storage proteins. Iranian Journal of Plant Biology 8(28): 79-107.

Mohammadi, V., Ahmadian-tehrani, P., Abd-Mishani, S. and Ghannadha, M. R. (1999) Study on genetic diversity in wild diploid wheat (Triticum tauschii) using seed storage proteins electrophoresis. Iranian Journal of Agriculture Science 30(1): 55-64 (in Persian).

Mohamadi, M., Mirfakhraee, S. R. G. and Abbasi, A. R. (2014) Genetic diversity in bread wheat (Triticum aestivum L.) as revealed by microsatellite markers and association analysis of physiological traits related to spring cold stress. Genetic New Journal 9(3): 279-288.

Morales Corts, M. R. and Crespo Martinez, M. C. (2009) Variation of PGM and IDH isozymes sor identification of alfalfa varieties. Euphytica 112: 137-143.

Mossavi, Z., Tahernezhad, Z., Zamani, M. J. and Emam jomeh, A. (2010) Studying of glutenin subunits diversity in Aegilops tauschii accessions by SDS-PAGE method. Journal of Agriculture and Plant Breeding 6(1): 65-73 (in Persian).

Naroei Rad, M. and Farzanjoo, M. (2006) Genetic diversity and factor analysis of morphological traits of wheat landraces of Sistan and Baluchestan. Research and Development Journal 73: 50-57.

Osmani, G. and Siosemardeh, A. (2009) Study of genetic diversity of sardari wheat ecotypes using AFLP marker and agronomic traits. Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 13(47): 301-319.

Razavizadeh, R. and Ehsanpour, A. A. (2013) Application of seed storage protein marker for identification of seven soybean (Glycine max) cultivars. Journal of Cell and Tissue 3(4): 319-326.

Romesburg, H. C. (1990) Cluster Analysis for Researchers. Malabar, Florida: Robert E. Krieger Publishing Co. (Reprint of 1984 edition.) Charles Romesburg, Utah State University.

Roz, M., Ahmadi, J., Garoosi, Gh. and Biki, A. H. (2010) Genetic variation of some tolerant and susceptible genotypes of bread wheat using microsatellite markers ISSR. Genetic New Journal 5(4): 69-76.

Salehi, H., Chehregani Rad, A. K., Atri, M. and Mohsen zadeh, F. (2015) Study of biodiversity using DSS method and seed storage protein comparison of populations in two species of Achillea (L) in West of Iran. Taxonomy and Biosystematics 5(16): 55-68 (in Persian).

Seyedi, N., Ali Jalali, S. G., Moghaddam, M., Tabari, M. and Mohammadi, S. A. (2010) Application of seed storage protein in intra-specific variation in three population of Pistacia atlantica Desf. Journal of Plant Biology 2(6): 1-14 (in Persian).

Tajdoost, S., Khavari-Nejad, R. A., Meighani, F., Zand, E. and Noormohammadi, Z. (2012) Assessment of genetic diversity in Cuscuta campestris yunker ecotypes based on their molecular and protein markers. Environmental Sciences 93-108 (in Persian).