تنوع ژنتیکی جمعیت‌هایی از گونة سپستان (Cordia myxa L.) در ایران با نشانگر مولکولی CDDP

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکدة علوم، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران

2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران

3 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه پیام نور، تهران

چکیده

سپستان (Cordia myxa L.) از تیرة گاوزبانیان (Boraginaceae Juss.)، گونة دارویی و اقتصادی مهمی است که در نواحی جنوبی ایران می‌روید. این گیاه، مقاوم به شوری و خشکی است و نقش مهمی در جلوگیری از فرسایش خاک ایفا می‌کند. تاکنون به‌دلیل نبود مطالعات، از میزان تنوعات ژنتیکی این گونه در ایران اطلاعاتی در دسترس نبوده است؛ بنابراین، هدف پژوهش حاضر ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیت‌هایی از این گونه در ایران با نشانگر مولکولی CDDP است. 25 نمونه از هفت جمعیت از نقاط جنوبی کشور جمع‌آوری شدند و تنوع ژنتیکی آنها با 20 آغازگر CDDP ارزیابی شد. برای تحلیل داده‌ها از نرم‌افزارهای NTSYS، Popegen و GenAlex استفاده شد. از 20 آغازگر، درمجموع، 222 نوار تکثیر شد که 218 نوار و به‌طور میانگین 01/9 درصد برای هر آغازگر، چندشکل (پلی‌مورف) بودند. در تجزیة خوشه‌ای با ضریب تشابه جاکارد با روش UPGMA، نمونه‌ها درسطح تشابه 38درصد در 4 گروه مجزا طبقه‌بندی شدند. بیشترین مقدار میانگین تنوع ژنتیکی (232/0) برای جمعیت شوش به دست آمد. تجزیة واریانس مولکولی نیز نشان داد که تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌ها (70درصد) بیشتر از بین جمعیت‌ها (30درصد) است. پژوهش حاضر توان نشانگر CDDP را برای ازریابی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های گونة C. myxa اثبات کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Study of genetic diversity in some populations of Cordia myxa L. in Iran by using CDDP molecular marker

نویسندگان [English]

  • Elaheh Latifi 1
  • Mehdi Yousefi 2
  • Maryam Haerinasab 3
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Payam Noor University, Tehran, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Sciences, Payam Noor University, Tehran, Iran
3 Department of Biology, Faculty of Sciences, Payam Noor University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Cordia myxa L. (Boraginaceae Juss.) is a valuable medicinal and economic species growing in southern parts of Iran. This plant is resistant to salinity and drought and has an important role in preventing of soil erosion. So far, the amount of genetic variation of this species in Iran was unclear due to the lack of any study. Therefore, this study aims to assessment of genetic diversity of some populations of Cordia myxa in Iran by using CDDP molecular marker. Twenty five samples of 7 populations were collected from southern parts of Iran and were evaluated by 20 CDDP primers. GenAlex, Popgen and NTSYS software were used for data analysis. A total number of 222 bands were produced by 20 primers, from which 218 bands, in average 9.01% bands for each primer, were polymorphic. Based on clustering analysis by using Jaccard coefficient and UPGMA method on the resulted data, the samples were categorized in 4 separate groups at the level of 38% similarity. The highest amount of genetic diversity coefficient (0.232) were obtained for Shoosh population. Molecular Variance Analysis (AMOVA) also showed that intra-population diversity is higher (70%) than inter-population diversity (30%). This study proved the potential of CDDP marker to assess the genetic diversity in Cordia myxa L. populations.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Boraginaceae
  • CDDP Molecular marker
  • Cordia myxa
  • Genetic Diversity
  • Iran

.سپستان، با نام علمی Cordia myxa L.، یکی از گونه‌های مهم و اقتصادی جنس Cordia از تیرة گاوزبانیان (Boraginaceae) است. اغلب جنس‌های تیرة گاوزبانیان علفی‌اند؛ ولی تعداد اندکی از جنس‌های این تیره مانند جنس Cordia درختی و درختچه‌ای هستند (Riedl, 1967; Khatamsaz, 2002). یکی از گونه‌های شناخته‌شدة این جنس، C. myxa است که به‌‌شکل درختچه‌ای تا ارتفاع 3 تا 5 متر رشد می‌کند. آرایش برگ‌های آن متناوب و گاهی تاحدودی متقابل و شکل برگ‌ها تخم‌مرغی پهن تا دایره‌ای است. سطح رویی آنها بدون کرک و سطح زیرین آنها ابتدا پوشیده از کرک‌های ساده یا منشعب است و با کرک‌های ستاره‌ای همراه هستند که به‌تدریج پس از رشد برگ از بین می‌روند. گل‌آذین آن خوشه یا خوشة دیهیمی است. میوه، شفت تخم‌مرغی‌شکل با طول 2 سانتی‌متر است که در جهت رأس، باریک‌تر و به رأس تیز منتهی می‌شود. میوه هنگام رسیدن زردرنگ و در آخر متمایل به سیاه است (Khatamsaz, 2002). گونة C. myxa بومی شبه‌قارة هند است (Bouby et al., 2011) و در مناطق جنوبی ایران، شامل استان‌های فارس (لار)، هرمزگان (بندرعباس و خارک) و سیستان و بلوچستان (مکران، نیک‌شهر و چابهار) کاشته می‌‌شود (Riedl, 1967; Khatamsaz, 2002).

گونة C. myxa گیاهی دارویی با خواص ضدباکتریایی، ضدالتهاب، ضدحساسیت، ضدویروسی و ضدسرطانی است (Ranjbar et al., 2014) و از برگ آن متابولیت‌‌های ثانویه از گروه ترپنوئیدها، فلاونوئیدها، تانن‌ها و لینولئیک اسید و اولئیک اسید جدا و شناسایی شده‌اند (Meghwal et al, 2014; Al-Snafi, 2016).

بررسی تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتی گونه‌های گیاهی، به‌ویژه گونه‌های زراعی، دارویی و صنعتی اهمیت زیادی دارد و یافته‌های حاصل از آن برای تاکسونومی، کشف روابط تکاملی و بوم‌شناختی این گونه‌ها به کار می‌رود. درحال‌حاضر، با نشانگرهای مولکولی مبتنی بر واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) امکان بررسی مستقیم تنوع ژنتیکی در سطح DNA فراهم شده و روش‌های مرتبط با آن بسیار توسعه یافته است .(Agarwal et al., 2008; Grover and Sharma, 2016). با آغاز استفاده از نشانگرهای اختصاصی متصل‌شونده به ژن‌های خاص، سیستم نشانگری جدیدی موسوم به چندشکلی DNA حفاظت‌شده (Conserved DNA-Derived Polymorphism). یا به اختصار، CDDP برای ارزیابی تنوع ژنتیکی گونه‌های گیاهی مختلف استفاده شده است. نخستین بار Collard و Mackill (2009) نشانگر CDDP را معرفی کردند. از پژوهش‌های انجام‌شده بر گیاهان مختلف با نشانگر CDDP می‌توان به پژوهش Poczai و همکاران (2011) بر Solanum dulcamara (تاجریزی پیچ)، مطالعة Li و همکاران (2013) بر تنوع ژنتیکی Chrysanthemum mosifolium (گل داوودی)، پژوهش Wang و همکاران (2014) با هدف تحلیل روابط ژنتیکی در Paeonia suffruticosa (گل صدتومانی)، پژوهش Hajibarat و همکاران (2015) برای ارزیابی تنوع ژنتیکی Cicer arietinum (نخود زراعی) و مطالعة Eghbalneghad و همکاران (2017) بر تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های Rosa hybrid (گل رز) اشاره کرد. نشانگرCDDP مبتنی بر مناطق حفاظت‌شده است که در آن از یک آغازگر واحد، برای آغازگرهای پیشرو و پسرو استفاده می‌شود. همچنین این نشانگر، آغازگرهای با طول بیشتر دارد و با دماهای اتصال 50 تا 70 درجة سانتی‌گراد طراحی شده است که افزایش تکرارپذیری آن را باعث می‌شود (Collard and Mackill, 2009). در این روش مانند روش‌های RAPD و ISSR، طراحی آغازگرها براساس توالی ابتدا و انتهای قطعات DNA انجام می‌شود. با این تفاوت که در این روش، ناحیة محافظت‌شده، یک ژن خاص است (Poczai et al., 2011). این نشانگر به‌ راحتی می‌تواند نشانگرهای کاربردی (FM) مربوط به یک فنوتیپ گیاهی را تولید کند که در بسیاری از بررسی‌های ژنتیکی سودمند هستند (Williams et al., 1990). این روش بر مناطق ژنی متمرکز است و اطلاعات کاملی از ژنوم در مقایسه با نشانگر RAPD که نشانگر تصادفی است به ما می‌دهد (Hajibarat et al., 2015). از مزایای روش CDDP می‌توان به ساده‌بودن، تکرارپذیری زیاد، نیاز به امکانات آزمایشگاهی کم و نیاز به DNA الگوی بسیار کمتر نسبت به سایر روش‌ها اشاره کرد. معمولا محدودة اندازة این نشانگر بین 200 تا 1500 جفت باز (bp) است (Poczai et al., 2011).

چندین پژوهشگر، تنوع ژنتیکی را درون و بین جمعیت‌های مختلف گونة C. myxa گزارش کرده‌اند. بیشتر این بررسی‌ها بر جمعیت‌های کشور هندوستان، خاستگاه اصلی این گونه، و براساس صفات ریخت‌شناختی انجام شده‌اند (Saini et al., .2002; Malik et al., 2010; Nagar et al., 2013; Nagar et al., 2015). Sivalingam و همکاران (2012) در راجستان هند برای نخستین بار با نشانگر RAPD به بررسی 17 ویژگی ریخت‌شناختی گونة C. myxa در 22 نمونه پرداختند و تنوع ژنتیکی زیادی بین نمونه‌ها نشان دادند. در ایران تاکنون پژوهشی بر تنوع ریخت‌شناختی و ژنتیکی جمعیت‌های گونة C. myxa انجام نشده است. هدف از پژوهش حاضر بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌هایی از گونة C. myxa در ایران با نشانگر CDDP و تعیین میزان تنوعات درون و بین جمعیتی در این گونه بود. در پژوهش حاضر کوشش شده است ضمن بررسی تنوع ژنتیکی، کارایی نشانگر مولکولی در گونةC. myxa اثبات شود. بررسی تنوع ژنتیکی گونة C. myxa با نشانگر مولکولی CDDP، نخستین گزارش در جهان برای این گونه و نیز جنس Cordia است.

 

مواد و روش‌ها

در پژوهش حاضر 25 فرد از 7 جمعیت گونة C. myxa در ماه‌های فروردین تا خرداد جمع‌آوری شدند (شکل 1 و جدول 1). نمونه‌ها با منابع فلور ایران (Riedl, 1967) و فلور ترکیه (Davis, 1978) و مقایسه با تصویر نمونة تیپ آن (JSTOR Glubal Plants, 2017) شناسایی و در هرباریوم دانشگاه پیام نور اصفهان نگهداری شدند.

 

 

 

شکل 1- موقعیت 7 جمعیت از گونة C. myxa در نوار جنوبی ایران

 

جدول 1- نمونه‌های بررسی‌شده، محل جمع‌آوری و مختصات جغرافیایی 7 جمعیت مختلف گونة C. myxa در نوار جنوبی ایران

ردیف

نمونه

جمعیت

محل جمع‌آوری

ارتفاع از سطح دریا (متر)

طول جغرافیایی

عرض جغرافیایی

کد هرباریوم

1

S1

شوش

خیابان ادیب

2/89

N´15 48°

E´12 32°

16060

2

S2

شوش

خیابان ادیب

2/89

N´15 48°

E´12 32°

16061

3

S3

شوش

خیابان ادیب

2/89

N´15 48°

E´12 32°

16063

4

S4

شوش

خیابان دستغیب

7/71

N´14 48°

E´11 32°

16062

5

S5

شوش

خیابان مصطفی خمینی

1/72

N´14 48°

E´11 32°

16064

6

S6

شوش

خیابان امام خمینی

6/71

N´14 48°

E´11 32°

16065

7

G1

بندر گناوه

بلوار امام حسین

7/1

N´30 50°

E´34 29°

16074

8

G2

بندر گناوه

خیابان چمران

7/1

N´30 50°

E´34 29°

16067

9

G3

بندر گناوه

روستای قلعه حیدر

7/1

N´30 50°

E´34 29°

16070

10

G4

بندر گناوه

روستای قلعه حیدر

7/1

N´30 50°

E´34 29°

16071

11

A1

اهواز

خیابان گلستان

1/17

N´38 48°

E´18 31°

16072

12

A2

اهواز

خیابان بهارستان

14

N´37 48°

E´16 31°

16073

13

A3

اهواز

خیابان سعدی

23

N´43 48°

E´21 31°

17077

14

A4

اهواز

فرهنگ شهر

18

N´39 48°

E´17 31°

17078

15

A5

اهواز

شهرک برق

3/16

N´38 48°

E´17 31°

17079

16

C1

چابهار

بلوار فردوسی

8/15

N´37 60°

E´18 25°

16069

17

C2

چابهار

خیابان حرنگ

16

N´37 60°

E´18 25°

16059

18

C3

چابهار

خیابان توحید

9/20

N´38 60°

E´18 25°

16068

19

C4

چابهار

خیابان شهید نوروزی

1/21

N´37 60°

E´18 25°

16075

20

C5

چابهار

دانشگاه دریانوردی

23

N´38 60°

E´17 25°

17076

21

B1

بندرعباس

کنارگذر غدیر

5/1

N´18 60°

E´10 25°

17080

22

B2

بندرعباس

کنارگذر غدیر

5/1

N´18 60°

E´10 25°

17081

23

K

کرمان

جیرفت

7/711

N´44 57°

E´42 28°

17082

24

I1

ایرانشهر

خیابان آزادی

1/569

N´41°60

E´12 27°

16066

25

I2

ایرانشهر

خیابان آزادی

1/569

N´41 60°

E´12 27°

16067


استخراج DNA: DNA ژنومی از برگ‌های کامل و سالم 7 جمعیت مختلف گونة C. myxa استخراج شد. استخراج DNA از این جمعیت‌ها با روش Doyle و Doyle (1987) با CTAB (Cethyl Trimethyl Ammonium Bromide) با فرمول 20میکرومول هیدروکلریک اسید Tris با pH برابر با 8، 1/0مول EDTA، 4/1مول سدیم کلرید و CTAB 2درصد انجام شد. کیفیت DNA ژنومی استخراج‌شده با الکتروفورز (مدل SH503، شرکت اختریان، ایران) روی ژل آگارز (کد 116801، Merck، آلمان) 8/0 درصد ارزیابی شد. در پژوهش حاضر به پیروی از روش Collard و Mackill (2009)، از 20 آغازگر CDDP (شرکت Metabion International، آلمان) استفاده شد (جدول 2).

اجزاء واکنش PCR (Polymerase Chain Reaction) در حجم 15 میکرولیتر شامل 5/7 میکرولیتر مستر میکس (شرکت Ampliqon، دانمارک) حاوی آنزیم Taq polymerase، dntp و منیزیم کلرید؛ 3/5 میکرولیتر آب مقطر؛ 1 میکرولیتر DNA و 2/1 میکرولیتر آغازگر است. واکنش PCR با دستگاه ترموسایکلر (مدل MyCycler، شرکت Biorad، آمریکا) انجام شد و مراحل چرخة PCR عبارتند از: یک چرخة واسرشت‌کردن به‌مدت 4 دقیقه در دمای 94 درجة سانتی‌گراد؛ مرحلة اتصال آغازگر با 35 بار تکرار در دماهای 94 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه، 50 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه و 72 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 2 دقیقه و در‌نهایت، یک چرخة بسط آغازگر در دمای 72 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه. الکتروفورز محصولات تکثیر‌شده روی ژل آگارز 2 درصد و بافر TAE با ولتاژ 80 ولت، به‌مدت 45 تا 60 دقیقه انجام و با دستگاه ژل داک (مدل Universal Hood II، شرکت Bio Rad، آمریکا) عکس‌برداری شد.

تحلیل آماری: اطلاعات به‌دست‌آمده از ژل‌ها در الکتروفورز در قالب ماتریسی از صفر و یک تنظیم شدند. بدین‌صورت‌که برای نوارهایی که وضوح بهتری داشتند، حضور نوار با کد 1، وجودنداشتن نوار با کد صفر و وجودنداشتن نوار در همة نمونه‌ها با کد 999 نشان داده شد. برای رسم دندروگرام، آزمون منتل برای ضرایب تشابه SM(Simple Matching)، Jacard و Dice انجام شد. بیشترین مقدار به‌دست‌آمده مربوط به ضریب تشابه جاکارد بود و بر این اساس برای رسم دندروگرام و تجزیه به مختصات اصلی از ضریب تشابه جاکارد و روش UPGMA با نرم‌افزار NTSYS نسخة 02/2 استفاده شد. محتوای اطلاعات چندشکلی آغازگرها (PIC=Polymorphism Information Content).. با رابطة 1 محاسبه شد.

رابطة 1

PIC=1-∑pi2(محتوای اطلاعات چندشکلی آغازگرها)

در این رابطه، Pi برابر با آلل iام هر جایگاه ژنی برای همة ژنوتیپ‌ها است.

همچنینشاخصنشانگر (MI= Marker Index) برایهمةآغازگرها از رابطة 2 محاسبهشد.

رابطة 2

β×N×PIC=MI (شاخص نشانگر)

که PIC، محتوای اطلاعات چندشکلی؛ N، تعدادکلنوارها و β، درصد چندشکلی برای هر آغازگر است.

مقدارRP (Resolving Power) نیز برای هر آغازگر از رابطة 3 محاسبه شد.

رابطة 3

RP= ∑Ib

میزان Ib در رابطة 3 نیز از رابطة 4 محاسبه شد.

رابطة 4

Ib= 1-(2|0.5-Pi|)

در این رابطه، Pi درصد فراوانی یک آلل از هر نوار است (Pawell et al., 1996).

همچنین ماتریس فاصله براساس تحلیل نی انجام شد (Nei, 1973). در این ارزیابی تعداد آلل‌های مشاهده‌شده (Na)، تعداد آلل‌های موثر (Ne)، شاخص تنوع ژنتیکی نی (H) و شاخص شانون (I: Shanon's Information Index) برای هریک از جمعیت‌ها با نرم‌افزار GenAlex نسخة 3/6 محاسبه شد. تجزیه به مختصات اصلی (PCO:Principal Coordinate Analysis) و تحلیل واریانس مولکولی (AMOVA) با نرم‌افزار GenAlex نسخة 3/6 انجام شد.

 

 

 

جدول 2- اطلاعات مربوط به آغازگرهای استفاده‌شده در بررسی تنوع ژنتیکی 7 جمعیت مختلف گونة C. myxa از نواحی جنوبی ایران

ردیف

نام آغازگر

توالی آغازگر

Tm °C*

CG**

1

WRKY-R1

5`- GTG GTT GTG CTT GCC -3`

49

0/60

2

WRKY-R2

5`- GCC GTC GTA SGT SGT -3`

52

7/66

3

WRKY-R3

5`- GCA SGT GTG CTC GCC -3`

54

3/73

4

MADS-4

5`- CTS TGC GAC CGS GAG GTG -3`

63

2/72

5

ABP1-1

5`- ACS CCS ATC CAC CGC -3`

54

3/73

6

ABP1-2

5`- ACS CCS ATC CAC CGG -3`

54

3/73

7

ABP1-3

5`- CAC GAG GAC CTS CAGG -3`

56

8/68

8

WRKY-F1

5`- TGG CGS AAG TAC GGC CAG -3`

61

7/66

9

ERF2

5`- GCS GAG ATC CGS GAC CC -3`

62

5/76

10

ERF3

5`- TGG CTS GGC ACS TTC GA -3`

57

7/64

11

KNOX-1

5`- AAG GGS AAG CTS CCS AAG -3`

58

1/61

12

WRKY-R2B

5`- TGS TGS ATG CTC CCG -3`

52

7/66

13

WRKY-R3B

5`- CCG CTC GTG TGS ACG -3`

54

3/73

14

MYB1

5`- GGC AAG GGC TGC CGC -3`

57

0/80

15

MYB2

5`- GGC AAG GGC TGC CGG -3`

57

0/80

16

ERF1

5`- CAC TAC CGC GGS CTS CG -3`

62

5/76

17

KNOX-2

5`- CAC TGG TGG GAG CTS CAC -3`

61

7/66

18

KNOX-3

5`- AAG CGS CAC TGG AAG CC -3`

57

7/64

19

MADS-1

5`- ATG GGC CGS GGC AAG GTG C -3`

66

7/73

20

MADS-2

5`- ATG GGC CGS GGC AAG GTG G -3`

66

7/73

CG** و Tm°C* به‌ترتیب نشان‌دهندة محتوای سیتوزین - گوانین برحسب درصد و دمای اتصال برحسب درجة سانتی‌گراد هستند.

 

 

 

نتایج و بحث

آغازگرهای CDDP درمجموع، 222 نوار مناسب امتیازدهی را تولید کردند (شکل 2 و جدول 3). از این تعداد، 218 نوار (63/97درصد) به‌صورت چندشکل بودند. آغازگر 12 با تولید 7 نوار و آغازگرهای 3، 6 و 18 هریک با تولید 8 نوار، کمترین تعداد نوار را ایجاد کردند. آغازگر 7 با تولید 19 نوار، مکان های ژنی بیشتری را نسبت به سایر آغازگرها شناسایی کرده است. کمترین میزان چندشکلی مربوط به آغازگر 3 و 18 با 5/87 درصد بود و 16 آغازگر چندشکلی 100درصد داشتند. به‌طور متوسط هر آغازگر 01/9 درصد نوار چندشکل تولید کرده است. در بررسی تنوع ژنتیکی گونة C. myxa با نشانگر CDDP، دامنة نوارهای چندشکل ایجادشده بین 300 تا 1600 جفت باز است که بیشترین تعداد نوارها مربوط به آغازگر 7 با bp 2000 و کمترین نوار مربوط به آغازگر 13 با bp 150 است (جدول 4). درمجموع، 17 آغازگر، هریک بین 1 تا 3 نوار منحصربه‌فرد (اختصاصی) تولید کردند. درواقع هریک از این 17 آغازگر 76/0±85/0 یا به‌طور میانگین 02/4±47/4درصد نوار منحصربه‌فرد تولید کرده است. از این نوارهای اختصاصی می‌توان در شناسایی این جنس و برای طراحی آغازگرهای نشانگر CDDP استفاده کرد.

مقدار شاخص محتوای چندشکلی (PIC) به‌طور میانگین برابر با 04/0±45/0 بود که آغازگر 19 با 25/0، کمترین مقدار و آغازگر 2 با 53/0، بیشترین مقدار آن را دارد. شاخص محتوای چندشکلی (PIC)، یکی از شاخص‌های مهم مقایسة نشانگرهای مختلف ازنظر قدرت تمایز آنها است. مقادیر زیاد این شاخص، دلیل بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه دارد که در تفکیک و تمایز افراد نقش بسزایی دارد (Thimmappaiah et al., 2009). مقادیر اطلاعات چندشکلی از صفر تا یک متغیر هستند و هرچه اعداد به‌دست‌آمده بزرگ‌تر باشند، بیان‌کنندة فراوانی بیشتر چندشکلی برای آن جایگاه در نمونه‌های بررسی‌شده است (Wei et al., 2005). Botstein و همکاران (1980) بیان کردند شاخص محتوای چندشکلی بزرگتر از 5/0 (5/0PIC>) نشان‌دهندة نشانگری بسیار کارآمد، شاخص محتوای چندشکلی بین 25/0 تا 5/0 نشان‌دهندة نشانگری کارا و شاخص محتوای چندشکلی کمتر از 25/0 (PIC<0.25) نشان‌دهندة نشانگری با کارایی کم است؛ بنابراین می‌توان از آغازگر 2 (WRKY-R2) با بیشترین مقدار شاخص محتوای چندشکلی برای تجزیة مجموعة ژرم‌پلاسم دیگر تاکسون‌های C. myxa در پژوهش‌های بعدی استفاده کرد؛ اما آغازگر 19 (MADS-1) با کمترین میزان شاخص محتوای چندشکلی توانایی پذیرفتنی در جداکردن تاکسون‌ها ندارد.

بهترین شاخص برای انتخاب آغازگر مناسب، شاخص قدرت تفکیک (Rp) است؛ زیرا هم از تعداد افراد دارای نوار و هم از تعداد آلل تأثیر می‌پذیرد. قدرت تفکیک، شاخصی است که توانایی تفکیک آغازگرهای انتخابی را نشان می‌دهد (Kayis et al., 2010). شاخص قدرت تفکیک (Rp) در آغازگر 7 با 54/10، بیشترین مقدار و در آغازگر 6 با 69/1، کمترین مقدار را داشت و به‌طور میانگین برابر با 61/1±24/5 بود (جدول 3)؛ بنابراین آغازگر 7 نسبت به سایر آغازگرها قدرت تفکیک بهتری دارد. همسویی زیاد مقادیر Rp و تعداد نوارهای چندشکلی نشان داد آغازگر 7 (ABP1-3) از سایر آغازگرها کارآمدتر است. شاخص نشانگر (MI) در آغازگر 7 با 50/9، بیشترین مقدار و به‌طور میانگین برابر با 51/1±96/4 بود (جدول 3). شاخص نشانگر (MI) برآوردی مناسب از کارایی آغازگرها است که به تعداد نوارهای چندشکلی به‌دست‌آمده و به پوشش زیاد ژنوم با نشانگر نسبت داده می‌شود (Milbourne et al., 1997). زیادبودن شاخص نشانگر، بیان‌کنندة فراهم‌کردن اطلاعات بیشتر، از ژنوم باتوجه‌به تولید تعداد بیشتر نوار چندشکلی است. در پژوهش حاضر، شاخص نشانگر در آغازگر 7 با 50/9، بیشترین مقدار بود که نشان‌دهندة قدرت تفکیک بسیار خوب این آغازگر است و به‌طور میانگین میزان شاخص نشانگر برابر با 51/1±96/4 بود. مقادیر Rp و MI نشان می‌دهد آغازگر 7 بهترین عملکرد را بین آغازگرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر دارد (جدول 3).

 

 

 

شکل 2- الگوی نوارهای تکثیرشده با آغازگرهای 5، 9 و 14 نشانگر CDDP در 25 فرد از 7 جمعیت C. myxa

 

 

ارزیابی تنوع ژنتیکی گیاهان با اطلاعات ریخت‌شناختی همواره با محدودیت‌هایی همراه بوده است. پژوهشگران برای رفع این محدودیت‌ها استفاده از نشانگرهای مولکولی را توصیه کرده‌اند (Mohammadzadeh Jalali et al., 2013). به‌همین‌دلیل برای ارزیابی تنوع ژنتیکی گونه‌هایی از جنس Cordia، پژوهش‌های دیگری با نشانگرهای مولکولی انجام شده‌اند. Nandedkar و Mulani (2016) در بررسی تنوع ژنتیکی گونة C.dichotoma با 5 آغازگر نشانگر RAPD، درصد نوارهای چندشکلی را 86/67 درصد بیان کردند. Abdelrahim و همکاران (2015) در 4 نمونه از گونة C.africana با نشانگر RAPD نیز از 64 نوار امتیازدهی‌شده 45 نوار، چندشکلی (به‌طور میانگین 5/14 نوار چندشکل در هر آغازگر) نشان دادند. Sivalingam و همکاران (2012) در پژوهش انجام‌شده بر 22 نمونه از گونة C. myxa با نشانگر RAPD، نوارهای چند‌شکل ایجادشده را به‌طور میانگین 8/69 درصد اعلام کردند. Abayneh (2011) در بررسی 22 فرد از گونة C.africana درصد نوارهای چندشکلی را 7/85 درصد با نشانگر AFLP گزارش کرد. نتایج پژوهش حاضر با نتایج پژوهش‌های انجام‌شده بر تنوع ژنتیکی جنس Cordia باتوجه‌به تعداد نمونه‌های استفاده‌شده و تفاوت در نوع نشانگر و تعداد آغازگرهای استفاده‌شده مطابقت دارند.

دندروگرام حاصل از تحلیل خوشه‌ای با ضریب تشابه جاکارد براساس روش UPGMA در شکل 3 نشان داده شده‌است. برای رسم دندروگرام تجزیة خوشه‌ای از آزمون منتل برای انتخاب بهترین ضریب تشابه استفاده شد. ضریب تشابه جاکارد با 894/0r =بهترین بود. کم‌بودن ضریب تشابه 38 درصد نشان‌دهندة تنوع ژنتیکی زیاد در پژوهش حاضر است. نمونه‌ها سه خوشة اصلی را تشکیل داده‌اند. خوشة الف متشکل از نمونه‌هایی از جمعیت‌های شوش (S1-S6)، اهواز (A1-A5) و گناوه (G1-G4) است. یک نمونه از جمعیت چابهار (C5) نیز در این گروه قرار گرفته‌است. کمترین ضریب همبستگی این نمونه‌ها 66/0 است؛ بنابراین سه جمعیت شوش، اهواز و گناوه شباهت ژنتیکی زیادی به هم دارند. گروه ب متشکل از نمونه‌های جمعیت‌های بندرعباس (B1-B2)، ایرانشهر و کرمان (K) است. کمترین ضریب همبستگی این نمونه‌ها 79/0 است. نمونة کرمان همبستگی کمتری با نمونه‌های دو جمعیت دیگر دارد. خوشة ج دربردارندة نمونه‌های جمعیت چابهار (C1-C4) است. کمترین ضریب همبستگی این نمونه‌ها 73/0 است (شکل 3).

باتوجه‌به موقعیت جغرافیایی و شرایط اقلیمی منطقة چابهار که گرمای شدید مهم‌ترین پدیدة مشهود اقلیمی آن است و نیز میزان تبخیر زیاد آن (به‌طور متوسط 4 میلی‌متر در روز) به‌علت زیادبودن متوسط دما و وزش بادهای موسمی (IMO, 2017)، می‌توان تفاوت ژنتیکی ایجادشده در افراد این جمعیت را از تنش‌های محیطی و اقلیم ناشی دانست. بخش‌هایی از خوشه‌بندی حاصل از دندروگرام، بیان‌کنندة آن است که تنوع ژنتیکی نمونه‌های C.myxa بررسی‌شده، با منشأ جغرافیایی آنها گاهی مطابقت دارد؛ اما در بیشتر مواقع مطابقت ندارد. نمونه‌های چابهار متعلق به شرقی‌ترین بخش جنوبی کشور، خوشه مجزایی تشکیل داده‌اند. نمونه‌های جمعیت‌های بندرعباس، ایرانشهر و کرمان نیز قرابت بیشتری نشان دادند. نمونه‌های جمعیت‌های شوش، اهواز و گناوه نیز که موقعیت غربی‌تری نسبت به سایر جمعیت‌ها دارند در یک خوشه قرار گرفته‌اند. قرارگیری نمونه‌های با منشأ جغرافیایی متفاوت، در دندروگرام در کنار یکدیگر نشان می‌دهد آلل‌های مشترکی بین آنها وجود دارند. انطباق‌نداشتن داده‌های مولکولی و مناطق جغرافیایی ممکن است از پدیدة جریان ژنی بین جمعیت‌ها یا تفاوت شرایط اقلیمی بین این مناطق ناشی باشد. ساختار ژنتیکی هر گونه، متأثر از تعدادی عوامل تکاملی مانند سیستم گرده‌افشانی، جریان ژنی، پراکندگی دانه، نوع تولید‌مثل و انتخاب طبیعی است (Lin et al., 2010; Seyedimoradi et al., 2016). به‌این‌ترتیب، نتایج حاصل از گروه‌بندی تجزیة خوشه‌ای تا حد زیادی نبود ارتباط را بین تنوع ژنتیکی و تنوع جغرافیایی نشان می‌دهند. گرده‌افشانی در گاوزبانیان بیشتر به‌صورت دگرگشنی رایج است؛ اما خودگشنی نیز وجود دارد (Weigend et al., 2016). Meghwal و همکاران (2014) گونة C. myxa را گونه‌ای دگرگشن معرفی کرده‌اند. در گونه‌های دگرگشن، به‌علت جریان ژنی زیاد، فاصلة ژنتیکی جمعیت‌ها کم می‌شود و در عوض، تنوع ژنتیکی در جمعیت‌ها افزایش می‌یابد. در جمعیت دگرگشن، فرصت برای سازگاری و تکامل در آن جمعیت ایجاد می‌شود (Bussell, 1999).

تجزیه براساس مختصات اصلی (PCA) پراکنش و توزیع نمونه‌ها را براساس 2 محور اول و دوم ارائه می‌کند. نتایج این آزمون، نتایج حاصل از تجزیة خوشه‌ای را تأیید می‌کنند و تاکسون‌هایی که در تجزیة خوشه‌ای در یک گروه قرار گرفتند در نمودار حاصل از تجزیه براساس محورهای مختصات اصلی (PCA) نیز در کنار هم قرار می‌گیرند.

نتایج تحلیل واریانس (جدول 4) نشان دادند از میزان کل واریانس مشاهده‌شده، درمجموع، 30 درصد مربوط به تنوع بین جمعیت‌ها و 70 درصد مربوط به تنوع درون جمعیت‌ها است (جدول 5). Hamrick و Godt (1996) بیان کردند در گیاهان چوبی تنوع ژنتیکی تا حدودی بیشتر و اختلافات درون‌جمعیتی، کمتر از گونه‌های غیرچوبی هستند. همچنین گونه‌هایی که میزان جریان ژنی در آنها محدودتر است، تمایز بیشتری بین جمعیت‌های آنها اتفاق می‌افتد و درمقابل هرقدر میزان جریان ژنی بین جمعیت‌ها بیشتر باشد، همگن‌ترشدن جمعیت‌ها و نبود تمایز ژنتیکی را بین آنها باعث می‌شود. جریان ژنی بین جمعیت‌های مجاور از دو روش مهاجرت دانة گرده و انتقال بذر انجام می‌شود. درواقع این دو سازوکار بر میزان تنوع و تمایز ژنتیکی جمعیت‌های گیاهی تأثیر بسزایی دارند. باتوجه‌به‌ زراعی و کاشته‌شده‌‌بودن گونة C.myxa، می‌توان گفت جریان ژنی با انتقال بذر انجام می‌شود و به‌این‌ترتیب درمجموع، سهم تنوع درون جمعیت‌ها از تنوع بین آنها بیشتر است و تنوع ژنتیکی زیادی درون جمعیت‌ها مشاهده شد.

شاخص‌های تنوع ژنتیکی محاسبه شدند. میانگین آلل‌های مشاهده‌شده (Na) برابر با 524/0±938/0 بود که بیشترین تعداد آن در جمعیت بندر گناوه (G) با 964/1 آلل و کمترین مقدار آن در نمونة جمعیت کرمان (K) با 266/0 آلل مشاهده شد. میانگین آلل‌های مؤثر (Ne) یعنی آلل‌هایی که فراوانی برابر و توزیع خوبی دارند برابر با 135/0±188/1 بود و در جمعیت شوش (S) با 414/1 آلل، بیشترین و در نمونة جمعیت کرمان (K) با مقدار 1 کمترین بود. میزان تنوع در جمعیت شوش (S) با شاخص شانون و شاخص نی به‌ترتیب 232/0H=و340/0I= بود که بیش از سایر جمعیت‌ها است. این جمعیت، تنوع‌پذیری و همچنین میزان پراکندگی بیشتری نسبت به سایر جمعیت‌ها دارد و نمونة جمعیت کرمان کمترین تنوع‌پذیری و میزان پراکندگی را دارد (جدول 5). بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‌ها به‌دلیل تفاوت‌های موجود در افراد تشکیل‌دهندة جمعیت‌ها پیچیدگی‌هایی دارد. این پژوهش‌ها به تعداد افراد بررسی‌شده در هر جمعیت، تعداد مکان‌های آللی در هر جمعیت، موقعیت آللی و ژنوتیپی جمعیت، نوع تلاقی و اندازة جمعیت بستگی دارد (Weir, 1990).

 

 

جدول 3- شاخص‌های مولکولی اندازه‌گیری‌شده در آغازگرهای نشانگر CDDP در بررسی 7 جمعیت از گونةC. myxa

آغازگر

TNB

NPB

PPB

NSB

PSB

Rp

PIC

MI

دامنة تولید باند (bp)

1

9

9

100

0

0

67/4

45/0

05/4

1800-400

2

11

11

100

2

52/10

24/6

53/0

83/5

1700-200

3

8

7

5/87

2

52/10

60/2

42/0

57/2

1500-300

4

10

10

100

0

0

66/6

51/0

10/5

1600-200

5

13

13

100

0

0

77/7

43/0

59/5

1600-200

6

8

8

100

3

78/15

69/1

46/0

68/3

1600-900

7

19

19

100

1

26/5

54/10

50/0

50/9

2000-200

8

18

18

100

3

78/15

95/8

48/0

64/8

1600-200

9

10

10

100

0

0

11/5

45/0

50/4

1500-200

10

11

11

100

1

26/5

18/5

49/0

39/5

1700-250

11

15

15

100

1

26/5

31/7

47/0

05/7

1500-200

12

7

7

100

0

0

55/4

52/0

64/3

1500-300

13

14

14

100

0

0

13/5

40/0

60/5

1600-150

14

9

8

8/88

0

0

67/4

40/0

84/2

1500-300

15

14

14

100

1

26/5

30/4

51/0

11/7

1600-300

16

9

9

100

1

26/5

35/5

47/0

23/4

1500-200

17

10

10

100

1

26/5

32/5

43/0

30/4

1600-200

18

8

7

5/87

0

0

58/3

51/0

12/3

1500-500

19

9

8

8/88

0

0

10/2

25/0

77/1

1500-300

20

10

10

100

1

26/5

23/3

47/0

70/4

1500-300

مجموع

222

218

63/97

17

-

-

-

-

-

میانگین

1/11

9/10

01/9

85/0

47/4

24/5

45/0

96/4

2000-150

SD

6/2±

8/2±

 

76/0±

02/4±

61/1±

04/0±

51/1±

 

TNB (تعداد کل نوارها)، NPB (تعداد نوارهای چندشکلی)، PPB (درصد نوارهای چندشکل)، NSB (تعداد نوارهای اختصاصی)، PSB (درصد نوارهای اختصاصی)، Rp (قدرت تفکیک)، PIC (محتوای اطلاعات چندشکلی)، MI (شاخص نشانگر) و SD (انحراف معیار)

 

 

شکل 3- دندروگرام حاصل از نرم‌افزار NTSYS و ضریب تشابه جاکارد مربوط به خوشه‌بندی 25 فرد از 7 جمعیت C. myxa

جدول 4- تحلیل واریانس مولکولی (AMOVA) داده‌های حاصل از نشانگر CDDP مربوط به 7 جمعیت گونه C. myxa

منابع تغییرات

درجة آزادی

میانگین مربعات

انحراف معیار

درصد

درون‌جمعیتی

18

23/817

40/45

70

بین جمعیتی

5

017/598

108/19

30

کل

23

25/1415

510/64

100

 

جدول 5- شاخص‌های تنوع ژنتیکی مربوط به 7 جمعیت از گونة C. myxa

جمعیت‌ها

تعداد افراد

Na

Ne

I

He

شوش (S)

6

347/1

414/1

340/0

232/0

گناوه (G)

4

964/1

238/1

133/0

158/0

اهواز (A)

5

338/1

387/1

323/0

220/0

جابهار (C)

5

365/0

109/1

080/0

053/0

بندرعباس (B)

2

721/0

108/1

093/0

063/0

کرمان (K)

1

266/0

00/1

00/0

00/0

ایرانشهر (K)

2

568/0

064/1

054/0

037/0

میانگین و انحراف معیار

63/1±57/3

524/0±938/0

135/0±188/1

105/0±146/0

080/0±109/0

 

 

در ارزیابی ماتریس فاصلة 7 جمعیت از گونة C. myxa بیشترین شباهت با فاصلة 608/0 بین جمعیت‌های بندرعباس (B) و چابهار (C) دیده می‌شود و جمعیت‌های شوش (S) و اهواز (A) با میزان فاصلة 917/0 بیشترین تفاوت را بین جمعیت‌های بررسی‌شده نشان دادند (جدول6).

 

 

جدول 6- ماتریس فاصلة بین 7 جمعیت بررسی‌شدة C. myxa

جمعیت

شوش

بندرگناوه

اهواز

چابهار

بندرعباس

کرمان

ایرانشهر

شوش (S)

1

           

بندرگناوه (G)

883/0

1

         

اهواز (A)

917/0

857/0

1

       

چابهار (C)

754/0

651/0

720/0

1

     

بندرعباس (B)

696/0

661/0

705/0

608/0

1

   

کرمان (k)

697/0

640/0

699/0

755/0

798/0

1

 

ایرانشهر (I)

677/0

659/0

676/0

637/0

853/0

774/0

1

 

 

پژوهش حاضر برای ارزیابی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیت‌های گونة C. myxa با نشانگر مولکولی CDDP انجام شد. این پژوهش برای نخستین بار در ایران و جهان به توصیف تنوع ژنتیکی گونة C. myxa با نشانگر CDDP پرداخته است. با 20 آغازگر از نشانگر CDDP، میانگین نوارهای چندشکل، 63/97 درصد به دست آمد. تاکنون از نشانگر مولکولی CDDP برای ارزیابی تنوع ژنتیکی تاکسون‌های زیادی استفاده شده است (Tomar and Malik, 2015; Seyedimoradi et al., 2016). نتایج این بررسی‌ها نشان دادند نشانگر CDDP نوارهای چندشکلی بیشتری ایجاد می‌کند و در مقایسه با روش‌های مشابه، تنوع ژنتیکی جمعیت‌های گیاهی را بهتر ارزیابی می‌کند. نتایج ما دربارة گونة C. myxa نیز مؤید این مطلب هستند.

اطلاعات دقیقی از تاریخچة کشت گونة C. myxa در مناطق جنوب کشور وجود ندارند. باتوجه‌به اهمیت و ارزش دارویی این گونه که از زمان قدیم شناخته‌شده بوده است، احتمالا پایه‌هایی از آن در شهرهای دارای شرایط مناسب توسط افراد محلی کاشته شده باشد. منشأ احتمالی این پایه‌ها (یا بذر آنها) نامشخص است. براساس نتایج پژوهش حاضر مبنی بر وجود تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌ها، بیشتر جمعیت‌های بررسی‌شده نمی‌توانند منشأ یکسانی داشته باشند. با انجام پژوهش‌های دیرینه‌شناختی، به‌ویژه لایه‌نگاری دانة گرده می‌توان پی‌برد این جمعیت‌ها، خودرو یا انسان‌کاشت هستند.

 

سپاسگزاری

نگارندگان از همکاری آزمایشگاه تحصیلات تکمیلی دانشگاه پیام نور اصفهان بابت در اختیار قراردادن امکانات آزمایشگاهی سپاسگزاری می‌کنند.

Abayneh, D. O. G. R. F. (2011) Maintenance of genetic diversity in Cordia africana Lam., a declining forest tree species in Ethiopia. Tree Genetics and Genomes 7: 1-9.             

Abdelrahim, Y. M., Babiker, H. A., Abdelgader, M. A., Abdelrahman, E. E. and El Gaali, E. E. (2015) Assessment of genetic variations in Cordia africana Lam. in Sudan using random amplified polymorphic DNA marker. Sudan Academy of Sciences Journal 10: 33-72.

Agarwal, M., Shrivastava, N. and Padh, H. (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Reports 27(4): 617-631.

Al-Snafi, A. E. (2016) The Pharmacological and therapeutic importance of Cordia myxa- A review. International Organization of Scientific Research Journal of Pharmacy 6(93): 47-57.

Botstein, D., White, R. L., Skolnick, M. and Davis, R.W. (1980) Construction of genetic linkage map in man using restriction length polymorphisms. American Journal of Human Genetics 32: 314-331.

Bouby, L., Bouchette, A. and Figuerial, I. (2011) Sebesten fruits (Cordia myxa L.) in Gallia Narbonensis (Southern France): a trade item from the Eastern Mediterranean? Vegetation History and Archaeobotany 20(5): 397-404.

Bussell, J. D. (1999) The distribution of random amplified polymorphic DNA (RAPD) diversity amongst populations of Isotom petraea (Lobeliaceae). Molecular Ecology 8: 775-789.

Collard, B. C. Y. and Mackill, D. J. (2009) Conserved DNA-derived polymorphism (CDDP): A simple and novel method for generating DNA markers in plants. Plant Molecular Biology Reporter 27(4): 558-562.

Davis, P. H. (Ed.) (1978) Flora of Turkey and the East Aegean Islands. vol. 6. Edinburgh.

Doyle, J. J. and Doyle, J. L. (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11-15.

Eghbalneghad, Y., Saidi, A. and Beiramizadeh, E. (2017) Evaluation of genetic diversity Rose genotypes (Rosa hybrid Vill) using CDDP and RAPD markers. Journal of Agricultural Biotechnology 9(2): 1-14 (in Persian).

 

Grover, A. and Sharma, P. (2016) Development and use of molecular markers: past and present. Critical Reviews in Biotechnology36(2): 290-302.

Hajibarat, Z., Saidi, A. and Talebi, R. (2015) Characterization of genetic diversity in chickpea using SSR markers, Start Codon Targeted Polymorphism (SCOT) and conserved DNA-derived polymorphism (CDDP). Physiology and Molecular Biology of Plants. 21(3): 365-373.

Hamrick, J. L. and Godt, M. J. W. (1996) Effects of life history traits on genetic diversity in plant species. Philosophical Transactions of the Royal Society B 351: 1291-1298.

IMO, Islamic Republic of Iran Meteorological Organization (2017) The climate of Sistan and Baluchestan province. Retrieved from http://www.irimo.ir/far/services/climate/806. On: 27 April 2017 (in Persian).

JSTOR Global Plants. Retrieved from http://plants.jstor.org/stable/10.5555/al.ap.specimen.s-g-10028. On: 27 April 2017.

Kayis, S. A., Hakki, E. E. and Pinarkara, E. (2010) Comparison of effectiveness of ISSR and RAPD markers in genetic characterization of seized marijuana (Cannabis sativa L.) in Turkey. African Journal of Agricultural Research 5(21): 2925-2933.

Khatamsaz, M. (2002) Boraginaceae. In: Flora of Iran (Eds. Assadi, M., Khatamsaz, M. and Maassoumi, A. A.) vol. 39. Tehran, Iran (in Persian).

Li, T., Guo, J. E., Li, Y., Ning, H., Sun, X. and Zheng, C. (2013) Genetic diversity assessment of chrysanthemum germplasm using conserved DNA-derived polymorphism markers. Scientia Horticulturae 162: 271-277.

Lin, X. C., You, Y. F., Liu, J., Peng, J. S., Liao, G. L. and Fang, W. (2010) Crossbreeding of Phyllostachys species (Poaceae) and identification of their hybrids using ISSR markers. Genetics and Molecular Research 9(3): 1398-1404.

Malik, S. K., Chaudhury, R., Dhariwal, O. P. and Bhandari, D. C. (2010) Genetic resources of tropical underutilized fruits in India. NBPGR, New Delhi.

Meghwal, P. R., Singh, A., Kumar, P. and Morwal, B. R. (2014) Diversity, distribution and horticultural potential of Cordia myxa L.: a promising underutilized fruit species of arid and semi arid regions of India. Genetic Resources and Crop Evolution 61(80): 1633-1643.

Milbourne, D., Meyer, R., Bradshaw, J. E., Baird, E., Bonar, N., Provan, J., Powell, W. and Waugh, R. (1997) Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. Molecular Breeding 3: 127–136.

Mohammadzadeh Jalaly, H., Valizadeh, M., Moghaddam, M. and Ahmadi, M. (2013) Interrelationships of quantitative traits and isozymic markers in alfalfa half-sib families. Iranian Journal of Plant Biology 5(18): 133-141 (in Persian).

Nagar, B. L., Fagerra, M. S. and Pareek, S. (2013) Genetic variation for physicochemical characteristics in Lehsua (Cordia myxa L.). African Journal of Agricultural Research 8(40): 5047-5050.

Nagar, B. L., Fagerra, M. S. and Sarolia, D. K. (2015) Correlation and path analysis in Lehsua (Cordia myxa L.) in Thar Desert. Periodic Research 4(1): 25-27.

Nandedkar, P. H. and Mulani, R. M. (2016) Morphological and molecular diversity of Cordia dichotoma G. Frost populations from Nanded district in Maharashtra, India. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 5(6): 135-143.

Nei, M. (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences 70(12): 3321-3323.

Pawell, W., Morganet, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogel, J., Tingey, S. and Rafalaski, A. (1996) The comparision of RFLP, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2: 225-238.

Poczai, P., Varga, I., Bell, N. E. and Hyvönen, J. (2011) Genetic diversity assessment of bittersweet (Solanum dulcamara, Solanaceae) germplasm using conserved DNA-derived polymorphism and intron-targeting markers. Annals of Applied Biology 159: 141–153.

Ranjbar, M., Najafzadeh Vaziry, H., Sabbagh, A., Blooki, A. and Sazmand, A. (2014) Study on analgesic and anti-inflammatory properties of Cordia myxa fruit hydro-alcohlic extracts. Pakistan Journal of Biological Sciences 16(24): 2066-2069.

Riedl, H. (1967) Boraginaceae Juss. In: Flora Iranica (Ed. Rechinger, K. H.) vol. 48. Akademisch Druck-und Verlagsanstalt, Graz, Austria.

Rohlf, F. J. (1998) NTSYS-PC numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.02. Exeter software, Setauket, New York.

Saini, R. S., Kaushik, R. A. and Singh, S. (2002) Research note on the evaluation of lasora (Cordia myxa L.) germplasm for vegetative growth characters under semi-arid conditions. Haryana Journal of Horticulture Sciences 31(1/2): 62–63.

Seyedimoradi, H., Talebi, R. and Fayaz, F. (2016) Geographical diversity pattern in Iranian landrace durum wheat (Triticum turgidum) accessions using start codon targeted polymorphism and conserved DNA-derived polymorphism markers. Environmental and Experimental Biology14: 63–68.

Sivalingam, P., Singh, D. and Chauhan, S. (2012) Morphological and molecular diversity of an underutilized fruit crop-Cordia myxa L. germplasm from the arid region of Rajasthan, India. Genetic Resources and Crop Evolution 59(2): 305-316.

Thimmappaiah, W., Santhosh, G., Shobha, D. and Melwyn, G. S. (2009) Assessment of genetic diversity in cashew germplasm using RAPD and ISSR markers.Scientia Horticulturae 120(3): 411-417.

Tomar, P. and Malik, C. (2015) CDDP and CBDP as novel markers. International Journal of Life Sciences 4(2): 85-89.

Wang, X., Fan, H., Li, Y., Sun, X., Sun, X., Wang, W. and Zheng, C. (2014) Analysis of genetic relationships in tree peony of different colors using conserved DNA-derived polymorphism markers. Scientia Horticulturae 175: 68-73.

Wei, Y. M., Hou, Y. C., Yan, Z. H., Wu, W., Zhang, Z. Q., Liu, D. C. and Zhang, Y. L. (2005) Microsatellite DNA polymorphism divergence in Chinese wheat landraces highly resistant to Fusarium head blight. Theoretical and Applied Genetics 46: 3-9.

Weigend, M., Selvi, F., Thomas, D. C. and Hilger, H. H. (2016) Boraginaceaein. In: The families and genera of vascular plants (Eds. Kadereit, J. W. and Bittrich, V.) 41-102. Springer International Publishing, Switzerland.

Weir, B. S. (1990) Genetic data analysis. Methods for discrere population genetic data. Sinauer Associates, Inc., Sanderland.

Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A. and Tingey, S. C. (1990) DNA polymorphsims amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18: 6531–6535.