القای کالوس و جنین سوماتیک در کشت درون‌شیشه‌ای ریزنمونه‌های برگ، میوۀ نارس و آندوسپرم نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) رقم خضراوی

نویسندگان

گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکدة کشاورزی،‌ دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، خوزستان، ایران

چکیده

در پژوهش حاضر، امکان کالوس‌زایی و جنین‌زایی سوماتیک در نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) رقم خضراوی از ریزنمونة برگ بالغ و نارس، میوة نارس، بذر نارس، آندوسپرم و پریکارپ میوة نارس بررسی شد. در کشت برگ، کالوس در محیط‌کشت حاوی تنظیم‌کننده‌های رشد با ترکیب تیماری 2 و 4 دی‌ کلرو فنوکسی ‌استیک ‌اسید (2,4-D) با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر، بنزیل آمینوپورین (BAP) با غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون (TDZ) با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر در لبة‌ خارجی ریزنمونه‌های برگی؛ با ترکیب تیماری 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر، بنزیل آمینوپورین با غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر در لبة خارجی ریزنمونه‌های برگی و با ترکیب تیماری 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر، بنزیل آمینوپورین با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم در کناره‌های رگبرگ ریزنمونه تشکیل شد. با ریزنمونة میوة نارس در محیط‌کشت مشابه، زمانی‌که دو تنظیم‌‌کنندة رشد تیدیازورون و 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر در محیط‌کشت موجود باشند، کالوس‌زایی و جنین‌زایی رخ می‌دهد. کشت ریزنمونه‌های آندوسپرم با جنین و پریکارپ رقم خضراوی در محیط‌کشت مشابه نیز نشان داد وجود 2,4-D و تیدیازورون با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر برای کالوس‌زایی مفید است. همچنین در کشت آندوسپرم با جنین، جنین‌ها رشد یافتند و ابتدا ریشه‌چه و پس از سه ماه ساقه‌چه مشاهده شد؛ اما در کشت آندوسپرم و کشت پریکارپ میوه در این محیط‌کشت هیچ واکنشی مشاهده نشد. درمجموع، نتایج نشان دادند با کشت ریزنمونه‌های برگ و میوة نارس و نیز استفاده از مقدار مناسب تنظیم‌کننده‌های رشد اکسینی و سیتوکینینی، کالوس و جنین سوماتیک نخل خرما رقم خضراوی به دست می‌آیند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Callus and somatic embryo induction in date palm cv. Khazravi using leaves, immature fruit and endosperm explants

نویسندگان [English]

  • Fateme Farhadi KolahKaj
  • Payam Pour Mohammadi
  • Mohammad Farkhari
  • Khalil0916 AlamiSaied
Department of Plant Production and Genetic, Faculty of Agriculture, Agricultural Sciences and Natural Resources, University of Khuzestan, Khuzestan, Iran
چکیده [English]

The purpose of this study was to check the possibility of callus and somatic embryogenesis in date palm cv. Khazravi using different explants including leaves, green fruit, immature seed, endosperm and green fruit pericarp. In the culture of leaves in the medium contains different plant growth regulators including 2,4-D, BAP and TDZ, highest callus induction was achieved in medium supplemented with, 5 mg.L-1 2,4-D, 2 mg.L-1 BAP and 4 mg.L-1 TDZ, and in treatment with 5 mg.L-1 2,4-D, 1 mg.L-1 BAP and 4 mg.L-1 TDZ. By using explant of immature fruit, found that when two growths regulative, TDZ and 2, 4-D in amount of 5 mg.L-1 are in the culture medium callugenesis and embryogenesis was achieved. The endosperm cultivation with pericarp and embryo in the same medium showed that the presence of two growth regulators 2,4-D and TDZ have been useful for callus production. Also in endosperm with zygotic embryo culture, embryo development and the root and shoot were formed after three months. Endosperm culture, in the culture medium containing various auxins and pericarp culture showed no any reactions. In general, these results showed that in date palm cv. Khazravi, treating the explants of leave and immature fruits with appropriate concentrations of plant growth regulators auxin and cytokinin, can induce callus and embryo.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Date palm
  • auxin
  • cytokinin
  • callogenesis
  • somatic embryogenesis

مقدمه

نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) به‌دلیل سازگاری و تحمل طبیعی زیاد با شرایط نامساعد محیطی مانند خشکی، شوری و درجه حرارت زیاد نقش اقتصادی و اجتماعی مهمی در مناطق بیابانی خاور‌میانه و شمال آفریقا دارد (Bakheet et al, 2008)؛ به‌طوری‌که تقریباً 95 درصد از خرمای جهان در خاور‌میانه تولید می‌شود (Aslam et al., 2011). تکثیر خرما با روش‌های جنسی و رویشی است که تکثیر رویشی با پاجوش و تکثیر جنسی آن با بذر انجام می‌شود. در گیاهان تکثیرشده با روش رویشی، بیماری‌های متعددی مانند بیماری‌های باکتریایی، قارچی، ویروسی و مایکوپلاسمایی تجمع‌ می‌یابد که بهره‌وری را کاهش می‌دهد (Al-Khayri, 2001). همچنین هر درخت تعداد بسیار کمی پا‌جوش (3 تا 8 عدد) در مدت زندگی خود تولید می‌کند و برخی از ژنوتیپ‌ها پاجوش تولید نمی‌کنند و پا‌جوش‌ها مشکلاتی مانند تشکیل‌نشدن ریشه خواهند داشت. تکثیر با بذر نیز محدودیت‌هایی مانند سرعت کم جوانه‌زنی، تنوع در نتاج تولیدی، نیاز به چندین سال برای رسیدن به مرحلة باردهی و تمایزنیافتن درختان نر و ماده از هم تقریباً تا 5 سال پس از کشت دارد (Chand et al, 2004). برای غلبه بر مشکلات تکثیری، حل مشکلات مربوط به هیبریداسیون و حفظ ژرم‌پلاسم، ریز‌ازدیادی در شرایط آزمایشگاهی (جنین‌زایی سوماتیک یا اندام‌زایی) روشی موفقیت‌آمیز است که تکثیر سریع برای تولید تجاری ارقام برگزیده، تکثیر گیاهان باکیفیت و یکسان از لحاظ ژنتیکی، تکثیر در مقیاس وسیع، ذخیره‌کردن طولانی‌مدت (انجماد)، بسته‌بندی، صادرات آسان و سریع، دست‌کاری ژنتیکی، کاهش مدت‌زمان تولید نهال، تولید خارج از فصل و گیاهچه‌های عاری از آلودگی را فراهم می‌کند (Eke, 2005). در کشت‌بافت خرما انتخاب منبع ریز‌نمونه حساس‌ترین تصمیم است. در پژوهش‌های گذشته علاوه‌بر مریستم رأس ساقه، ریزنمونه‌های مختلفی ازجمله برگ‌های آغازین (Hegazy et al., 2009)، برگ‌های جوان پاچوش (Fki et al., 2003; Othmani et al., 2009)، جوانة جانبی (Sharma et al., 1984)، ریشه (Zaid and Tisserat, 1983) و گل‌آذین ماده (Hegazy, 2008) برای کشت‌بافت خرما استفاده شده‌اند. در بسیاری از آزمایشگاه‌های تجاری، نخل خرما با جنین‌زایی از ریز‌نمونة رأس ساقه تولید می‌شود.

علاوه‌بر نوع ریزنمونه، تنظیم‌کننده‌های رشد به‌ویژه اکسین‌ها و سیتوکنین‌ها برای رشدونمو در شرایط کنترل‌شده بسیار حائز اهمیت هستند. بین تنظیم‌کننده‌های رشد، 2 و 4 دی‌ کلرو فنوکسی ‌استیک ‌اسید (2,4-D) با غلظت 10 تا 100 میلی‌گرم بر لیتر به‌تنهایی یا در ترکیب با سیتوکینین (Kin و 2IP) به محیط‌ کشت‌بافت نخل خرما اضافه می‌شود. در بعضی مواقع 2,4-D با نفتالن استیک اسید (NAA) جایگزین می‌شود (Jain, 2007). استفاده از ریزنمونة‌ مریستم انتهایی و محیط‌کشت‌های با اکسین زیاد بسیاری از مشکلات تکنیکی را ازجمله آلودگی‌های درون‌زای باکتریایی، قهوه‌ای‌شدن، تنوع سوماکلونال و مدت‌زمان طولانی (حدود 3 سال) برای تولید باعث می‌شود و این در صورتی انجام‌پذیر است که دستور‌العمل شناخته‌شده‌ای وجود داشته باشد (Abul-Soad, 2011).

هدف پژوهش حاضر، تعیین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی مختلف و نوع ریزنمونه بر جنین‌زایی سوماتیک در خرما است. باتوجه‌به اطلاعات نگارندگان تاکنون هیچ مقاله‌ای دربارة کشت میوة نارس و بالغ در نخل خرما گزارش نشده است و نتایج پژوهش حاضر برای نخستین بار گزارش می‌شوند.

 

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی و ریزنمونه‌ها: در پژوهش حاضر، ریزنمونه‌های مختلف مانند ریز‌نمونه‌های برگ، میوة نارس و آندوسپرم P. dactylifera رقم خضراوی موجود در منبع نگهداری نخل دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان استفاده شد.

برای تهیة ریزنمونه، برگ‌های سبز درحال‌رشد در مرکز پاجوش از ساقه‌چه جدا و استفاده شدند (شکل 1- A)؛ سپس 1 سانتی‌متر از ابتدا و انتهای برگچه‌ها برش داده شد و در اندازة 1 تا 2 سانتی‌متر قطعه‌قطعه شدند (شکل1- B). ریزنمونه‌ها قبل از استریل‌شدن با آب جاری، با چند قطره مایع شوینده به‌مدت 30 دقیقه شستشو و سپس با اتانول 70 درصد اسپری شدند و زیر هود لامینار انتقال یافتند. برای استریل‌کردن ریزنمونه‌ها قطعات برگی در سدیم هیپو‌کلریت 25/5 درصد به‌مدت 10 دقیقه قرار داده شدند و پس از آن 3 بار به‌مدت 10 دقیقه با آب مقطر اتوکلاو‌شده شستشو داده شدند؛ سپس برای حذف سلول‌های مرده دوباره ابتدا و انتهای هر قطعه برش داده و در محیط‌کشت‌های تهیه‌شده قرار داده شدند (شکل 1- C). برگچه‌های نخل از محل رگبرگ میانی خود تا می‌خورند که قبل از کشت باز شدند. ریزنمونه‌ها به‌صورت افقی و همه از سمت پشت برگچه در سه تکرار کشت شدند. در هر تکرار 2 تا 3 ریزنمونه کشت شدند و درب شیشه‌های کشت‌شده با پارافیلم مسدود شد تا احتمال آلودگی کاهش یابد و کشت‌ها به اتاق رشد با دمای 2 ± 25 درجة سانتی‌گراد و تاریکی مطلق منتقل شدند. در هر تکرار در هفتة یازدهم پس از کشت، تعداد ریزنمونه‌هایی که کالوس تولید کرده بودند یادداشت شدند.

 

 

شکل1- تهیة برگ P. dactylifera رقم خضراوی از پاجوش (A)، برش برگ‌ها به قطعاتی با طول 1 تا 2 سانتی متر (B) و کشت آنها در محیط‌کشت (C)

 

در بخش دیگر، آزمایش در دو مرحله با کشت ریزنمونة میوة نارس که مراحل رشد مختلفی داشتند انجام شد. در بخش اول، گل‌آذین مادة تازه لقاح‌یافته برداشت و به قطعاتی با 2 تا 3 میوة ریز تقسیم شد (شکل 3- A) و شستشو به‌مدت 20 دقیقه با آب شهری و با چند قطره مایع شوینده انجام شد؛ سپس میوه‌ها به‌مدت 15 دقیقه در سدیم هیپو‌کلریت 25/5 درصد قرار داده و پس از آن 3 بار با آب مقطر، استریل و هربار به‌مدت 10 دقیقه شستشو داده شدند. برای بررسی واکنش ریزنمونه‌ها روی محیط‌کشت، آنها روی محیط‌کشت با تنظیم‌کننده‌های رشد (جدول 1) قرار گرفتند (شکل 3- B).

 

 

جدول 1- ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد 2 و 4 دی ‌کلرو فنوکسی ‌استیک ‌اسید(2,4-D)، بنزیل آمینوپورین(BAP) و تیدیازورون(TDZ)در محیط‌کشت ریزنمونه‌های P. dactylifera رقم خضراوی

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

شمارة تیمار

10

5

10

10

10

10

10

10

5

5

5

5

5

5

10

5

0

10

5

0

2,4-D (mg/L)

0

0

2

1

0

2

1

0

2

1

0

2

1

0

0

0

0

0

0

0

BAP (mg/L)

0

0

4

4

4

2

2

2

4

4

4

2

2

2

10

10

10

5

5

5

TDZ (mg/L)

 

 

در بخش دوم، میوة نارس پس از گذشت یک ماه از زمان نمونه‌برداری اول برداشت (شکل 5- A) و پس از ضد‌عفونی‌کردن سطحی با روش ذکر‌شده، آندوسپرم با جنین در شرایط استریل جدا (شکل 5- B) و در محیط‌کشت با تنظیم‌کننده‌های رشد (جدول 1) کشت شدند. در هر تکرار تعداد ریزنمونه‌هایی که کالوس تولید کرده بودند، در هفتة چهارم پس از کشت ریزنمونة میوه و آندوسپرم، یادداشت شدند.

محیط‌کشت و ترکیبات تیماری: محیط‌کشت پایة MS (Murashige and Skoog, 1962) با ترکیب مختلفی از تنظیم‌کننده‌های رشد 2 و 4 دی‌ کلرو فنوکسی ‌استیک ‌اسید (2,4-D)، بنزیل آمینوپورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) (براساس جدول 1)؛ زغال فعال با غلظت 1 گرم بر لیتر و آگار با غلظت 8 گرم بر لیتر تهیه شد. نوع محیط‌کشت و تنظیم‌کننده‌های رشد براساس پژوهش‌های Othmani و همکاران (2009) و Al-Khayri و Al-Bahrany (2004) انتخاب شدند. pH محیط‌های کشت با سدیم هیدروکسید و هیدروکلریک اسید در حدود 7/5 تنظیم شد؛ سپس محیط‌های کشت به‌مدت 20 دقیقه و در دمای 121 درجة سانتی‌گراد با اتوکلاو (مدل A 121، شرکت ایران تولید، ایران) استریل شدند. در محیط‌کشت اولیه برای مقابله با ترکیبات فنلی، آنتی‌اکسیدان‌های آسکوربیک اسید و سیتریک اسید هریک با غلظت 75 میلی‌گرم بر لیتر به محیط‌کشت اضافه شدند (Khan and Bi Bi, 2012). ازآنجاکه تیدیازورون و آنتی‌اکسیدان‌ها نسبت به حرارت حساس هستند با فیلتر با قطر منافذ 22/0 میکرومتر استریل شدند و پس از اتوکلاو به محیط‌های کشت اضافه شدند.

تحلیل آماری: همة آزمایش‌ها به‌صورت طرح کاملاً تصادفی (CRD) در سه تکرار انجام شدند. پس از انجام چندین واکشت در هر آزمایش، نتایج به‌دست‌آمده بررسی شدند. تغییرات مشاهده‌شده به‌صورت تعداد ریزنمونة واکنش‌داده به تعداد کل ریزنمونه‌ها برای هر تکرار از ترکیبات تیماری ثبت شدند و تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار SPSS انجام شد. مقایسة میانگین داده‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن (LSR) در سطح احتمال 1 و 5 درصد انجام شد و نمودار‌ها با نرم‌افزار Excel رسم شدند.

 

نتایج

بین همة ریزنمونه‌های استفاده‌شده تنها کالوس‌زایی از ریزنمونة برگ و ریزنمونة‌ میوة نارس مشاهده شد. در ریزنمونة برگ، تجزیة واریانس داده‌های به‌دست‌آمده از تعداد ریزنمونه‌هایی که کالوس تولید کرده بودند در هر تکرار نشان داد بین تیمارهای مختلف تنظیم‌کنندة رشد اختلاف معنی‌داری وجود دارد (05/0P≤) (جدول 2).

 

جدول 2- تجزیة واریانس تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، تیدیازورون و بنزیل آمینوپورین در کالوس‌زایی از ریز‌نمونة برگ P. dactylifera رقم خضراوی

میانگین مربعات (MS)

درجة آزادی

منبع تغییر

٭ 876/3

19

تنظیم‌کنندة رشد

933/1

40

خطای آزمایش

32

̶

ضریب تغییرات

(درصد)

* بیان‌کنندة معنی‌داری در سطح 05/0P≤ است.

مقایسة میانگین (شکل 2) با آزمون دانکن (Duncan, 1955) در سطح احتمال 5 درصد نشان داد بین غلظت‌های مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D، بنزیل آمینوپورین و تیدیازورون اختلاف معنی‌داری وجود دارد و با افزایش 2,4-D تا غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر تولید کالوس از ریزنمونة برگی افزایش ولی با افزایش غلظت به 10 میلی‌گرم بر لیتر دوباره کاهش یافت. همچنین میزان کالوس‌زایی در غلظت صفر 2,4-D کاهش معنی‌داری در مقایسه با سایر غلظت‌ها نشان داد. علاوه‌بر‌این هنگامی‌که غلظت متوسطی از هردو سیتوکینین تیدیازورون و بنزیل آمینوپورین در محیط‌کشت وجود داشت میزان کالوس‌زایی تقویت شد.

در ترکیب تیماری 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر، تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر و بنزیل آمینوپورین با غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر که بیشترین میزان کالوس‌زایی به دست آمد و تودة کالوس زردرنگ و مشخصی تشکیل شد، کالوس‌زایی به‌صورت تورم‌هایی در لبة خارجی ریزنمونه‌ها پدیدار شد. همچنین همة ریزنمونه‌های ترکیب تیماری 2,4-D باغلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر ، تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر و بنزیل آمینوپورین با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر، کالوس‌های واضحی در کناره‌های رگبرگ مرکزی ریزنمونة برگی تولید کردند.

در آزمایش تأثیر تیمار تنظیم‌کنندة رشد برکالوس‌زایی میوة نارس نخل خرما 4 ترکیب تیماری به‌دلیل آلودگی حذف شدند که عبارتند از: 1- تیدیازورون با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر؛ 2-

 

 

شکل 2- تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد مختلف 2 و 4 دی‌ کلرو فنوکسی ‌استیک ‌اسید (2,4-D)، بنزیل آمینوپورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) در کالوس‌زایی از ریز‌نمونة برگ P. dactylifera رقم خضراوی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P≤ با آزمون دانکن هستند.

 

 

2,4-D با غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر؛ 3- 2,4-D با غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر، بنزیل آمینوپورین با غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر با تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر و 4- 2,4-D با غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر. داده‌های تیمارهای باقیمانده تحلیل شدند. تجزیة واریانس (جدول 3) داده‌های به‌دست‌آمده از این آزمایش نشان دادند بین ترکیبات تیماری مختلف تنظیم‌کنندة رشد تفاوت بسیار معنی‌داری وجود دارد.

همچنین براساس مقایسة میانگین انجام‌شده بهترین ترکیب تیماری شامل 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر بود که در آن سه هفته پس از کشت میو‌ه‌های نارس، کالوس مشاهده شد (شکل 3- C). جنین‌زایی مستقیم روی میوة نارس (شکل 3- D) نیز در ترکیب تیماری 12 شامل 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر، بنزیل آمینوپورین با غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر مشاهده شد (شکل 4).

 

جدول 3- تجزیة واریانس تأثیر تیمار تنظیم‌کنندة رشد برکالوس‌زایی میوة نارس P. dactylifera رقم خضراوی

میانگین مربعات (MS)

درجة آزادی

منبع تغییر

٭٭ 617/10

15

تنظیم‌کنندة رشد

083/2

32

خطای آزمایش

36

̶

ضریب تغییرات

(درصد)

** بیان‌کنندة معنی‌داری در سطح 01/0 P≤ است.

 

 

 

شکل 3- جداکردن خوشة میوة نارس P. dactylifera رقم خضراوی (A)، کشت میوه‌های نارس (B)، افزایش حجم کالوس در محیط‌کشت حاوی 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 5 میلی گرم بر لیتر (C)، تشکیل جنین در محیط‌کشت حاوی تیدیازورون با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر (D)

 

 

شکل 4- تأثیر تیمارهای تنظیم‌کنندة رشد 2 و 4 دی‌ کلرو فنوکسی ‌استیک ‌اسید (2,4-D)، بنزیل آمینوپورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) در کالوس‌زایی میوة نارس P. dactylifera رقم خضراوی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0 P≤ با آزمون دانکن هستند.

 

 

در بخش دیگری از این آزمایش، میوة نارس پس از گذشت یک ماه از زمان نمونه‌بردای اول برداشت شد و آندوسپرم با جنین، جدا و در محیط‌کشت MS با تنظیم‌کننده‌های رشد کشت شد. تجزیة واریانس (جدول 4) نشان داد بین ترکیبات تیماری مختلف تنظیم‌کنندة رشد تفاوت معنی‌داری وجود دارد.

 

جدول 4- تجزیة واریانس تأثیر تیمار‌های تنظیم‌کنندة رشد برکالوس‌زایی آندوسپرم P. dactylifera رقم خضراوی

میانگین مربعات (MS)

درجة آزادی

منبع تغییر

٭ 468/8

19

تنظیم‌کنندة رشد

95/3

20

خطای آزمایش

49

̶

ضریب تغییرات

(درصد)

* بیان‌کنندة معنی‌داری در سطح 05/0P≤ است.

نتایج مقایسة میانگین نشان دادند برای کالوس‌زایی از آندوسپرم خرما (شکل 5- D) باید حداقل سیتو‌کینین با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر با 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر وجود داشته باشد (شکل 6). همچنین تشکیل ریشه‌چه و ساقه‌چه (شکل 5- D) در ترکیب تیماری 12 شامل 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر، بنزیل آمینوپورین با غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر؛ ترکیب تیماری 10 شامل 2,4-D با غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر و ترکیب تیماری 17 شامل 2,4-D با غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر، بنزیل آمینوپورین با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر و تیدیازورون با غلظت 4 میلی‌گرم بر لیتر مشاهده شد (شکل 6).

 

 

 

شکل 5- جداکردن خوشة میوة نارس P. dactylifera رقم خضراوی (A)، آندوسپرم جداشده از پریکارپ میوه (B)، تشکیل کالوس از کشت آندوسپرم (C) تشکیل ساقه‌چه (D)

 

 

 

شکل 6- تأثیر تیمارهای تنظیم‌کننده‌های رشد 2 و 4- دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D)، بنزیل آمینوپورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) در کالوس‌زایی آندوسپرم P. dactylifera رقم خضراوی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیارند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌داردر سطح 05/0 P≤ با آزمون دانکن هستند.

 


بحث

در آزمایش حاضر مشخص شد برای کالوس‌زایی مناسب در ریزنمونه‌های برگ، میوة نارس و آندوسپرم خرما نیاز به مقدار متوسطی از تنظیم‌کنندة رشد 2,4-D (5 میلی‌گرم بر لیتر) است. بین اکسین‌ها 2,4-D به‌طور گسترده در کشت‌بافت خرما استفاده می‌شود؛ به‌طوری‌که مؤثر‌ترین اکسین در کشت‌بافت خرما است. در کشت‌بافت ارقام نخل خرمای امسکشی (Sane et al., 2006)، جیحل و بوستامی‌نویر (Zouine and El Hadrami, 2007)، دگلت‌نور (Fki et al., 2003) و دگلت‌بی (Othmani et al., 2009) مشخص شد 2,4-D برای القای جنین‌زایی سوماتیک از ریزنمونة برگ لازم است؛ اما غلظت 2,4-D لازم برای ارقام مختلف خرما متفاوت است. El Hadrami و Baziz (1995) گزارش کردند 2,4-D آثار مفیدی در القای ظرفیت جنین‌زایی کالوس دارد. دقیقاً مشخص نشده است 2,4-D چگونه کالوس‌زایی نخل خرما را تقویت می‌کند؛ اما به‌دلیل سرکوب تجمع مواد سمی فنلی و همچنین تکمیل کمبود اکسین درون‌زا، در کالوس‌زایی مؤثر است (Smith and Street, 1974).

همچنین در بررسی حاضر مشخص شد علاوه‌بر اکسین 2,4-D که حضور آن در محیط‌کشت برای کالوس‌زایی ضروری است، وجود تنظیم‌کنندة‌های رشد سیتوکینینی نیز برای بهبود کالوس‌زایی ضروری هستند. سیتوکینین‌ها بیشتر برای تحریک رشدونمو در بافت‌های کشت‌شده به کار می‌روند. این هورمون‌ها به‌ویژه اگر با یک اکسین اضافه شوند، تقسیم سلولی را تحریک می‌کنند (Bohm, 1961). اثر سیتوکینین‌ها گاهی شبیه اثر نور است و جذب پتاسیم را تحریک می‌کند (Green and Muir, 1979). اکسین‌ها در سلول، تنظیم‌کنندة پدیده‌هایی هستند که به نسخه‌برداری از DNA منجر می‌شوند؛ درحالی‌که سیتوکینین‌ها تنظیم‌کنندة پدیده‌هایی هستند که تقسیم میتوز را موجب می‌شوند؛ درنتیجه در حضور اکسین نسخه برداری از DNA انجام می‌شود؛ ولی سلول‌ها تقسیم نمی‌شوند، مگر اینکه سیتوکینین هم اضافه شود. به‌همین‌دلیل، در حضور سیتوکینین، تنها سلول‌هایی تقسیم می‌شوند که قبلاً DNA آنها نسخه‌برداری شده است (Jouanneau and Tandeau de Marsac, 1973). برای تشکیل کالوس و نیز تقسیم سلولی به سیتوکینین‌ها نیاز است؛ اما کاربرد مقادیر متعادلی از دو تنظیم‌کنندة رشد اکسین و سیتوکینین تشکیل کالوس را باعث می‌‌شود (Rout, 2004). بنزیل آمینوپورین فعال‌ترین، ارزان‌ترین و تنها سیتوکینینی است که اتوکلاوشدنی است؛ بنابراین در ریزازدیادی تجاری که هزینه و سادگی کار اهمیت دارد بیشترین کاربرد را دارد (Thomas and Blakesley, 1987) و گزارش‌های متعددی وجود دارند که نشان می‌دهند در ترکیب با اکسین بر جنین‌زایی سوماتیک در تعداد زیادی از گیاهان مؤثر است (Junaid et al., 2007). Eshraghi و همکاران (2005) نشان دادند اثر تنظیم‌کننده‌های رشد 2,4-D و بنزیل آمینوپورین در القای کالوس و جنین سوماتیک به رقم بستگی دارد. درواقع در رقم خنیزی، کالوس‌های جنین‌زا روی محیط‌کشت حاوی بنزیل آمینوپورین با غلظت 6/4 میلی‌گرم بر لیتر و 2,4-D با غلظت 4/3 میلی‌گرم بر لیتر تشکیل شدند؛ درمقابل در رقم مردار سنگ، غلظت‌های بیشتر 2,4-D (154 میلی‌گرم بر لیتر) برای القای کالوس‌های جنین‌زا ضروری هستند (Eshraghi et al., 2005).

نتایج نشان دادند در کشت میوة نارس، تنظیم‌کنندة رشد تیدیازورون با 2,4-D به تشکیل ساختارهای جنین‌مانند منجر می‌شوند. براساس پژوهش‌های Cupelle و همکاران (1983) تیدیازورون با افزایش انباشتگی و سنتز سیتوکینین‌های پورینی، تبدیل آدنین را به آدنوزین افزایش می‌دهد (Cupelle et al., 1983). بررسی‌های Victor و همکاران (1999) نشان دادند تیدیازورون کارکرد دوگانه‌ای در القای جنین سوماتیک دارد؛ فعالیت شبه‌سیتوکینینی آن تقسیم سلولی را افزایش می‌دهد؛ اندکی فعالیت شبه‌اکسینی دارد که به نظر می‌رسد برای القای جنین بسیار مهم است (Victor et al., 1999).؛ باززایی مستقیم جنین‌‌های سوماتیک را از ریزنمونة رأس ساقه تحریک می‌کند و در القای جنین‌زایی سوماتیک در ریزنمونه‌ها یا گیاهچه‌های بذری در انواع گونه‌های گیاهی سرسخت مؤثر است (Sidky and Zaid, 2011)؛ بااین‌حال‌ برای باززایی جنین‌های سوماتیک در نخل روغنی زیان‌آور است (Rajesh et al., 2003). در پژوهش‌های Sidky و Zaid (2011) کاربرد غلظت‌های مساوی از تنظیم‌کننده‌های رشد تیدیازورون و 2,4-D و همچنین غلظت دو برابر 2,4-D نسبت به تیدیازورون به بیشترین کالوس‌زایی در ریزنمونة مریستم انتهایی نخل خرما منجر شد. 2,4-D تنها در مرحلة انگیزش جنین‌زایی لازم است و گاهی 2,4-D و دیگر اکسین‌ها از جنین‌زایی سوماتیک ممانعت می‌کنند (Norgaard and Krogstrup, 1991). در سایر بررسی‌ها بیشترین تولید جنین سوماتیک در نخل خرما در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون (Aslam et al., 2011) و 1/0 میلی گرم بر لیتر 2,4-D (Othmani et al., 2009) مشاهده شد.

در بیشتر پژوهش‌های مربوط به کشت‌بافت خرما از ریزنمونة مریستم انتهایی استفاده می‌شود که جداکردن آن بسیار سخت و زمان‌بر است و به ازبین‌رفتن درخت منجر می‌شود. ریزنمونه‌های استفاده‌شده در آزمایش حاضر به‌دلیل ازبین‌نرفتن کامل گیاه و سهولت کشت نسبت به مریستم انتهایی برتری دارند. در نخستین بررسی، Zaid در سال 1981 با ریز‌نمونه‌های برگ درختان بالغ خرما، پاجوش‌ها، گیاهچه‌های بذری و گیاهچه‌های غیر‌جنسی نشان داد تنها کالوس‌های به‌دست‌آمده از واکشت‌ برگ از گیاهچه‌های بذری و گیاهچه‌های غیر‌جنسی کشت‌داده‌شده ریشه‌ تولید می‌کنند وکالوس از برگ‌های جوان 4 تا 8 ماهه تشکیل می‌شود. Othmani و همکاران (2009) از برگ‌های جوان رأس پاجوش رقم دگلت‌بی، با 10 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D در مدت 8 ماه سوسپانسیون جنین‌زا به‌دست آوردند. Gueye و همکاران (2009) قطعات برگ به طول 5 سانتی‌متر را از گیاهچه‌های بذری رقم احمر برای کالوس‌زایی در محیط حاوی 54 میکرومول نفتالن استیک اسید کشت کردند. بررسی تغییرات سیتولوژیک کالوس‌های تولید‌شده در مدت 63 روز نشان داد پس از 5 روز تغییراتی در سلول‌های مزوفیل پهنک برگ رخ دادند و سلول‌هایی با هسته‌های حجیم تولید شدند. این سلول‌های تمایزنیافته توانایی زیادی برای تقسیم داشتند و در روز نهم، خوشه‌ای از سلول‌ها تشکیل دادند که پس از 12 تا 14 روز مشخص شد کالوس‌ هستند (Gueye et al., 2009).

 

سپاسگزاری

نگارندگان از دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان بابت فراهم‌کردن امکانات پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌کنند.

Abul-Soad, A. A. (2011) Micropropagation of date palm using inflorescence explants. In: Date Palm Biotechnology (Eds. Jain, S. M., Al-Khayri, J. M. and Johnson, D. V.) 91-118. Springer, Dordrecht.

Al-Khayri, J. M. (2001) Optimization of biotin and thiamine requirements for somatic embryogenesis of date palm (Phoenix dactylifera L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 37: 453-456.

Al-Khayri, J. M. and Al-Bahrany, A. M. (2004) Genotype-dependent in vitro response of date palm (Phoenix dactylifera L.) cultivars to silver nitrate. Scientia Horticulturae 99: 153-162.

Aslam, J., Ahmad Khan, S., Cheruth, A. J., Mujib, A., Sharm, M. P. and Srivastava, P. S. (2011) Somatic embryogenesis, scanning electron microscopy, histology and biochemical analysis at different developing stages of embryogenesis in six date palm (Phoenix dactylifera L.) cultivars. Saudi Journal of Biological Sciences 18: 369-380.

Bakheet, S. A., Taha, H. S., Hanafy, M. S. and Solliman, M. E. (2008) Morphogenesis of sexual embryos of date palm cultured in vitro and early identification of sex type. Journal of Applied Science Research 4: 345-352.

Bohm, H. (1961) The formation of secondary metabolites in plant tissue and cell cultures. International Review of Cytology 11: 183-208.

Chand, S. and Singh, A. J. (2004) In vitro shoot regeneration from cotyledonary node explants of a multipurpose leguminous tree, Pterocarpus marsupium roxb. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 40: 167-170.

Cupelle, S. C., Mor, D. W. S., Kirschnet, S. C. and Mok, M. C. (1983) Effect of thidiazuron on cytokinin autonomy and the metabolism of N6-(Δ2-isopentenyl) [18-C14] adenosine in callus tissues of phaseolus L. Plant Physiology 73: 696-802.

Duncan, D. B. (1955) Multiple range and multiple F test. Biometrics 11: 1-42.

Eke, C. R., Akomeah, O. and Asemota, P. (2005) Somatic embryogenesis in date palm (Phoenix dactylifera L.) from apical meristem tissues from ‘Zebia’ and ‘Loko’ landraces. African Journal of Biotechnology 42: 244-246.

El Hadrami, I. and Baaziz, M. (1995) Somatic embryogenesis and analysis of peroxidases in Phoenix dactylifera L. Biologia Plantarum 37(2): 197-203.

Eshraghi, P., Zarghami, R. and Mirabdulbaghi, M. (2005) Somatic embryogenesis in two Iranian date palm cultivars. African Journal of Biotechnology 4(11): 1309-1312.

 

Fki, L., Drira, M. R. and Rival, A. N. (2003) An optimised protocol for plant regeneration from embryogenic suspension cultures of date palm, Phoenix dactylifera L., cv Deglet Nour. Plant Cell Reports 21: 517-524.

Green, J. F. and Muir, R. M. (1979) Analysis of the role of potassium in the growth effects of cytokinin, light and abscisic acid on cotyledon expansion. Physiologia Plantarum 56: 19-24.

Gueye, B., Morcillo, F., Collin, M., Gargani, D., Overvoorde, P., Bertossi, F. A., Taranbargar, T. J., Sane, D., Tregear, J. W., Borgell, A. and Verdeil, J. L. (2009) Acquisition of callogenic capacity in date palm leaf tissues in response to 2,4-D treatment. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 99: 35-45.

Hegazy, A. E. (2008) Micropropagation of Egyptian date palm cv. Selmy through floral buds culture. Journal of Agricultural Sciences 33(4): 2803-2815.

Hegazy, A. E., Nasr, M. I., Ibrahim, I. A. and El-Bastawissy, H. H. (2009) Micropropagation of date palm cv. Malakaby through embryogenesis: 3- Effect of tryptone, yeast extract, casein hydrolysate and pineapple extract. Journal of Agricultural Sciences 34: 1561-1576.

Jain, S. M. (2007) Recent advances in date palm tissue culture and mutagenesis. Acta Horticulturae 736: 205-211.

Jouanneau, J. P. and Tandeau de Marsac, N. (1973) Stepwise effects of cytokinin activity and DNA synthesis upon mitotic cycle events in partially synchronized tobacco cells. Experimental Cell Research 77: 167-174.

Junaid, A., Mujib, A., Sharma, M. P. and Tang, W. (2007) Growth regulators affect primary and secondary somatic embryogenesis in Madagaskar periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don) at morphological and biochemical levels. Plant Growth Regulation 51(3): 271-281.

Khan, S. and Bi Bi, T. (2012) Direct shoot regeneration system for date palm (Phoenix dactylifera L.) cv. Dhakki as a means of micropropagation. Pakistan Journal of Botany 44: 1965-1971.

Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bio-assays with Tobacco tissue cultures. Physiologia Plantrum 15: 473-497.

Norgaard, J. V. and Krogstrup, P. (1991) Cytokinin induced somatic embryogensis from immature embryos of Abies nordmaniana Lk. Plant Cell Reports 9: 509-513.

Othmani, A., Bayoudh, C., Drira, N. and Trifi, M. (2009) In vitro cloning of date palm Phoenix dactylifera L. Cv. Deglet Bey by using embryogenic suspension and temporary immersion bioreactor (TIB). Journal of Biotechnology and Biotechnological Equipment 23: 1181-1185.

Rajesh, M. K., Radha, E., Karun, A. and Parthasarathy, V. A. (2003) Plant regeneration from embryo-derived callus of oil palm-the effect of exogenous polyamines. Plant Cell Tissue and Organ Culture 75: 41-47.

Rout, G. R. (2004) Effect of cytokinins and auxin on micropropagation of Clitoria ternatea L. Biology Letters 41(1): 21-26.

Sane, D., Aberlenc-Bertossi, F., Gassama-Dia, Y. K., Sagna, M., Trouslot, M. F., Duval, Y. and Borgel, A. (2006) Histological analysis of callogenesis and somatic embryogenesis on cell suspension of date palm (Phoenix dactylifera L.). Annals of Botany 98: 301-308.

Sharma, D. R., Sunita, D. and Chowdhury, J. R. (1984) Somatic embryogenesis and plant regeneration in date palm (Phoenix dactylifera L.) cv. ‘Khadravi’ through tissue culture. Indian Journal of Experimental Biology 22: 596-598.

Sidky, R. A. and Zaid, Z. E. (2011) Direct production of somatic embryos and plant regenartion using TDZ and CPPU of date palm (Phoenix dactylifere L.). International Journal of Academic Research 3(2): 792-796.

Smith, S. and Street, H. E. (1974) The decline of embryogenic potential as callus and suspension cells of carrot (Daucas carota L.) were serially subcultured. Annals of Botany 38: 223-241.

Thomas, T. H. and Blakesley, D. (1987) Practical and potential uses of cytokinins in agriculture and horticulture. Plant Growth Regulators 14: 69-83.

Victor, J. M. R., Murch, S. J., Krishna, R. S. and Saxena, P. K. (1999) Somatic embryogenesis and organogenesis in peanut: The role of thidiazuron and N.6-benzylaminopurine in the induction of plant morphogenesis. Plant Growth Regulators 28(1): 9-15.

Zaid, A. (1981) Rapid propagation of the date palm through tissue culture. MSc thesis, Date and Citrus Station, Indio, California, U. S. A.

Zaid, A. and Tisserat, B. (1983) Morphogenetic responses obtained from a variety of somatic explant tissues of date palm. The Botanical Magazine 96: 67-73.

Zouine, J. and El Hadrami, I. (2007) Effect of 2,4-D, glutamin and BAP on embryogenic suspension culture of date palm (phoenix dactylifera L.). Scientia Horticulturae 112: 221-226.