بررسی مقایسه ای تاثیر وانیلین بر ویژگیهای فیزیولوژیک و بیوشیمیایی جلبک سبز-آبی Spirulina platensis در دو محیط کشت غذایی Zarrouk و Johnson

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکدة علوم پایه، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران

2 گروه شیمی، دانشکدة علوم پایه، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران

چکیده

استفاده گسترده از ترکیب فنلی وانیلین در صنایع غذایی و دارویی، احتمال راه یافتن به آبها و اعمال تاثیرات آن بر فیزیولوژی و زیست جلبکهای آبزی را افزایش می‌دهد. به دلیل اهمیت میکروجلبک سبز-آبیSpirulina platensis از نظر غذایی و دارویی، تاثیر وانیلین در طی یک دوره 42 روزه در داخل دو محیط کشت (Z) Zarrouk وJohnson (J)، در روزهای صفر، 21 ، 27 و 33 رشد بر شاخص‌های فیزیولوژیک جلبک مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقدار وزن خشک در محیط کشت Z و سپس Z حاوی وانیلین (ZV) بدست آمد، درحالیکه بیشترین میزان رشد (بر حسب کدورت نوری) در محیط کشت Z و سپس J مشاهده شد. همبستگی مثبت و قوی (R2=0.94, p<0.01) میان میزان کدورت نوری سوسپانسیون در 560 نانومتر و مقدار وزن خشک مشاهده شد. وانیلین سبب کاهش مقدار رشد و بیوماس خشک در کلیه روزهای نمونه‌برداری و بالعکس افزایش مقدار لیپید و پروتئین سلولی در هر دو محیط کشت گردید. مقادیر رنگدانه‌های کلروفیل، کاروتنوئید، فیکوسیانین، آلوفیکوسیانین، فیکواریترین و آستاگزانتین، میزان فنل، کربوهیدرات و MDA درمحیط کشت J فاقد وانیلین، غالبا بیشتر بودند و این محیط، در غالب اوقات بیشینه ترکیبات تولید شده را به خود اختصاص داد. اما محیط کشت Z (در مقایسه با ZV)، در برخی موارد حالت عکس نشان داد. بر اساس نتایج، اگرچه وانیلین می‌تواند سبب کاهش رشد و بیوماس جلبکی گردد، اما در مواردی که افزایش برخی تولیدات ارزشمند سلولهای جلبک نظیر آنتی‌اکسیدان‌ها، رنگدانه‌ها، ترکیبات لیپیدی، پروتئین، کربوهیدرات و فنل در سلولهای جلبکی مد نظر باشد، ممکن است بتوان از اثرات تحریک‌کنندگی آن بهره گرفت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Comparative study of vanillin influence on physiological and biochemical properties of blue-green algae Spiralulina platensis in Zarrouk and Johnson nutritional media

نویسندگان [English]

  • Nahid Pourbozorgi Rudsari 1
  • Maryam Madadkar Haghjou 1
  • Alireza Ghiasvand 2
1 Departement of Biology (Plant Physiology), Faculty of Science, Lorestan University, 5th K Tehran-Khoramabad road, Iran
2 Departement of Chemistry, Faculty of Science, Lorestan University, 5th K Tehran-Khoramabad road, Iran
چکیده [English]

The widespread use of vanillin in food and pharmaceutical industries increases the probability of entering to the waters and its positive or negative effects on growth and life of aquatic algae. Due to the nutritional and medical importance of Spirulina platensis, a blue-green micro-alga, the effect of vanillin on its growth and physiological characteristics was considered in two Zarrouk and Johnson media, on 0, 21, 27 and 33 days of a 42 days period. The highest dry weight was obtained in Zarrouk and then Zarrouk containing vanillin media, whilst the highest growth was observed in Zarrouk and then Johnson media. A positive and strong correlation (R
2
=0.94, p<0.01) was observed between the turbidity of suspension at 560 nm with its dry weight. Vanillin reduced growth and dry biomass in all days of sampling, but in contrast increased the amount of lipid and protein in both media. The amounts of chlorophyll a, carotenoids, phycocyanin, allophycocyanin, phycoerythrin, astaxanthin, phenol, carbohydrate and lipid peroxidation were often higher in Johnson medium (without vanillin). Although, the recent medium in most cases induced the maximum cell productions, but Zarrouk medium, compared to the Zarrouk containing vanillin medium, showed some inverse results. In general, although vanillin led to a reduction in algal growth and biomass, but in cases where valuable products such as antioxidants, pigments, lipid compounds, protein, carbohydrates and phenols are considered, it can be used as an inducing factor of production.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Phenol
  • Johnson medium
  • Lipid
  • Spirulina platensis
  • Vanillin
  • Zarrouk medium

ترکیبات فنلی، گروه بزرگی از ترکیبات آلی با فرمول پایة C6H5OH و محلول در آب‌اند. این ترکیبات در انواع مصنوعی که بشر تولید کرده است و انواع طبیعی (در سلول‌های گیاهی) هستند. انواع صنعتی آنها به‌دلیل داشتن قابلیت‌های فراوان در بسیاری از صنایع مانند تولید نایلون، شوینده‌ها، گندزداها، قارچ‌کش‌ها و صنایع غذایی اهمیت زیادی دارند و به‌دلیل گستردگی استفاده، آلایندگی محیط‌های آبی را موجب شده‌اند (Gimeno et al., 2005; Singh and Singh, 2002; Babich and Davis, 1981). از گروه ترکیبات فنلی، به وانیلین در صنایع غذایی توجه فراوان شده است. وانیلین یا 4- هیدروکسی 3- متوکسی بنزآلدهید (C8H8O3)، به‌طور طبیعی در دانة گیاه Vanilla planifolia یافت می‌شود. وانیلین یکی از محبوب‌ترین ادویه‌های موجود در جهان پس از هل و زعفران است (Gallage et al., 2018; Baqueiro-Peña and Guerrero-Beltrán, 2017; Walton et al., 2000). تقاضای جهانی برای مصرف وانیلین با روند افزایشی سالیانه بیش از 16000 تن در سال معادل 11 تا 12 درصد برآورد شده است (Xu et al., 2007). درحال‌حاضر از وانیلین در مقیاس وسیع برای بهبود طعم غذاها و نیز در عطر‌سازی، پزشکی و صنایع دارویی استفاده می‌شود (Baqueiro-Peña and Guerrero-Beltrán, 2017)؛ زیرا ترکیب فنلی وانیلین خواص ضد‌میکروبی و آنتی‌اکسیدانی قوی دارد (Walton et al., 2003). سازمان غذا و داروی آمریکا (USFDA) وانیلین را برای مصارف آرایشی، عطر و استفاده در طعم‌دهنده‌ها ایمن دانسته است (Jenkins and Erraguntla., 2014)؛ اما آثار ضدتوموری، ضدمتاستازی، آنتی‌اکسیدانی و ضدجهش‌زایی وانیلین نیز در مدل‌های جانوری به اثبات رسیده است که برای آن نقشی در کنترل تعداد و فعالیت سلول پیشنهاد می‌کند (Bezerra et al., 2016). مواردی از تأثیر این ماده بر پیکر موجودات‌زنده بر اثر راه‌یافتن به محیط‌های آبی بررسی شده است. برخی فعالیت‌های زیستی وانیلین در ماهی (Brooke and Anderson, 1984)، بی‌مهرگان آبزی (Källqvist, 1996)، کرم‌های خاکی (Hartenstein, 1982)، مخمر (Fitzgerald et al., 2004) و جلبک‌ها (Miazek, 2012) به‌صورت ممانعت از رشد سلول‌ها شناخته شده است. پژوهش‌ها نشان داده‌اند وانیلین و برخی ترکیبات فنلی بر رشد تعداد زیادی از جلبک‌های سبز مانند Chlorella vulgaris، Dunaliella salina، Platymonas subcordiformis (Scragg, 2006)، Phaeodactylum tricornutum و Skeletonema costatum (Duan et al., 2017) اثر مهاری دارند؛ درحالی‌که در برخی غلظت‌ها رشد جلبک‌های قرمز را تحریک نیز می‌کنند (Fries, 1974). یکی از دلایل احتمالی برای تحریک رشد سلول بر اثر تیمار با وانیلین، استفادة جلبک از فنل به‌صورت منبع غذایی و نیز تجزیة زیستی فنل‌ها و درنتیجه، کاهش مقدار آنها بیان شده است (Al-fawwaz et al., 2016; Samanthakamani and Thangaraju, 2015; El-Sheekh et al., 2012; Klekner and Kosaric, 2008; Semple and Cain, 1996).

Spirulina جلبک چندسلولی و رشته‌ای - مارپیچی از گروه سیانوباکتری‌ها یا جلبک‌های سبز - آبی فتوسنتزکننده است. بین گونه‌های مختلف Spirulina، گونة Spirulina platensis پراکنش وسیع‌تری دارد و ازنظر غذایی بسیار حائز اهمیت است؛ ازاین‌رو پژوهش‌های بسیاری درزمینة صنایع غذایی و دارویی بر آن انجام شده است (Deng and Chow, 2010; Hoseini and Mozafari, 2013). نتایج آنالیز شیمیایی ریزجلبک Spirulina نشان می‌دهند این جلبک سرشار از ریزمغذی‌ها و عناصر لازم برای سلامت انسان مانند پروتئین‌ها، ویتامین‌ها، آمینواسیدهای ضروری، مواد معدنی تغذیه‌ای و اسیدهای چرب ضروری است. گونه‌های جنس Spirulina به‌دلیل داشتن منبع پروتئینی و غذایی و فواید درمانی گسترده مانند بهبود سیستم ایمنی، ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی، ضدسرطانی، ضد‌ویروسی و ضدباکتریایی اهمیت دارد آثار مثبت بر سوء‌ تغذیه، دیابت، سمی‌بودن فلزهای سنگین، مواد شیمیایی، واکنش‌های آلرژیک ضد‌التهابی، آسیب‌های رادیکال‌های آزاد و کم‌خونی هستند(Setyaningsih et al., 2015; Benemann 2013; Hoseini and Mozafari, 2013; Colla et al., 2007a). جلبک Spirulina منبع رنگدانه‌های زیستی فیکو‌بیلی‌پروتئین، مانند فیکوسیانین و آلو‌فیکو‌سیانین است که ارزش غذایی و دارویی دارند (Yaakob et al., 2014). این جلبک همچنین حاوی آستاگزانتین (3، '3-دی هیدروکسی-β، β'-کاروتن – 4، '4 دایون) است که کاروتنوئیدی از نوع گزانتوفیل است و به‌صورت مکمل غذایی مفید حاوی عوامل آنتی‌اکسیدان و ضد توموری استفاده می‌شود (Ambati et al., 2014). Spirulina همچنین حاوی فنل است و پژوهش‌هایی در زمینة افزایش محتوای فنلی این جلبک با تغییر شرایط محیطی مانند شدت نور انجام شده‌اند (Kepekçi and Saygideger, 2012).

برخی آزمایش‌های انجام‌شده نشان داده‌اند مقدار و نوع ترکیبات ارزشمند درون جلبک با تغییر شرایط محیطی و نوع مواد در دسترس جلبک، مانند نیتروژن، فسفر، شوری، اسیدیته و غیره تغییر می‌کنند (Sharma et al., 2012; Battah et al., 2013; Ghobadian et al., 2015 Mazang-Ghasemi et al., 2016; . بر همین اساس، تجمع و تغییر در مقدار لیپیدها، پروتئین‌ها، فنل‌ها و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی جلبک‌ها بر اثر برخی محرک‌ها و عوامل محیطی مشاهده شده‌اند (Colla et al., 2007b; Narayan et al., 2005; Soni et al., 2012). به‌طورکلی، در پژوهش حاضر علاوه‌بر بررسی تأثیر وانیلین به‌عنوان ترکیب فنلی آلاینده بر میزان رشد و زیتودة جلبک، احتمال افزایش تولیدات ارزشمند و متفاوت جلبک Spirulina platensis مانند پروتئین، کربوهیدرات، چربی، فنل و رنگدانه‌ها نیز بر اثر تیمارهای نوع محیط‌کشت (Zarrouk و Johnson) و وانیلین با غلظت 30 میلی‌گرم در لیتر بررسی و مقایسه شد.

 

مواد و روش‌ها

آماده‌کردن محیط‌کشت‌های جلبکی و طراحی تیمارها:جلبک Spirulina platensis از کلکسیون جلبکی دانشگاه لرستان تهیه شد و همة مواد لازم برای تهیة محیط‌کشت‌ها از شرکت‌های سیگما یا مرک تهیه شدند. محیط‌کشت Zarrouk (Raoof et al., 2006) و محیط‌کشت Johnson (Johnson et al., 1968) تغییریافتة Shariati و Lilley (1994) به‌این‌ترتیب آماده شدند. محیط‌کشت Zarrouk حاوی K2HPO4 (5/0 گرم در لیتر)، NaNO3 (5/2 گرم در لیتر)، MgSO4.7H2O (2/0 گرم در لیتر)، K2SO4 (1 گرم در لیتر)، CaCl2.2H2O (04/0 گرم در لیتر)، FeSO4.7H2O (01/0 گرم در لیتر)، EDTA (08/0 گرم در لیتر)، H3BO3 (86/2 گرم در لیتر)، MnCl2.4H2O (81/1 گرم در لیتر)، ZnSO4.4H2O (22/0 گرم در لیتر)، Na2MoO4 (018/0 گرم در لیتر)، CuSO4.5H2O (079/0 گرم در لیتر)، NaCl (1 گرم در لیتر) و NaHCO3 (5/16 گرم در لیتر) و محیط‌کشت Johnson حاوی KH2PO4 (5 میلی‌مولار)، KNO3 (5 میلی‌مولار)، MgSO4 (5 میلی مولار)، CaCl2 (5 میلی‌مولار)، FeCl3 (5 میلی‌مولار)، Na2-EDTA (5 میلی‌مولار)، CoCl2 (1 میلی‌مولار)، MnCl2 (1 میلی‌مولار)،  ZnCl2(1 میلی‌مولار)، (NH4)6MoO7.4H2O (1 میلی‌مولار)، CuCl2 (1 میلی‌مولار)، NaCl (1 گرم در لیتر)، NaHCO3 (6/13 گرم در لیتر) تهیه شدند.

برای اعمال تیمار وانیلین، به هریک از محیط‌کشت‌های Johnson و Zarrouk مقدار 30 میلی‌گرم بر لیتر وانیلین اضافه شد تا به‌ترتیب محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین و محیط‌کشت Zarrouk دارای وانیلین به دست آیند. میزان وانیلین براساس منابع (Miazek, 2012; Akbari and Madadkar Haghjou, 2018a) و نیز برخی آزمایش‌های مقدماتی به‌گونه‌ای انتخاب شد که آثار شدید و کشنده بر سوسپانسیون سلولی نداشته باشد؛ اما آثار تحریک‌کنندگی محتمل آن بر رشد و تغییر مقدار برخی ترکیبات درون‌سلولی جلبک میسر شوند. pH همة محیط‌کشت‌ها روی 0±5/9 تنظیم شد. تودة زیستی جلبکی به‌مقدار 2 گرم بر لیتر وزن تر (50 میلی‌گرم بر لیتر وزن خشک) و با کدورت (Turbidity) 02/0 (در طول‌موج 560 نانومتر) در شرایط استریل به محیط‌کشت‌ها اضافه شد (روز صفر). نمونه‌ها برای رشد، به‌مدت 42 روز در دمای 2 ± 28 درجة سانتی‌گراد، شرایط نوری 100 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه، دورة نوری 16 ساعت روشنایی - 8 ساعت تاریکی و هوادهی قرار گرفتند. ارزیابی کدورت نوری، زیتودة تر (وزن تر) و بیوماس خشک (وزن خشک) جلبک هر 3 روز یک‌بار انجام شدند و برای اندازه‌گیری و ارزیابی شاخص های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی، نمونه برداری‌ها در روزهای 21 (مرحلة صعودی یا لگاریتمی رشد)، روز 27 (ابتدای مرحلة سکون)، و روز 33 (تقریباً انتهای مرحلة سکون) انجام شدند. برای استخراج کامل ترکیبات درون‌سلولی جلبک از روش فریز‌کردن در دمای 20- درجة سانتی‌گراد و آب‌کردن بافت تر و نیز روش سونیکیشن (مدل SONIC 4D، شرکت James، انگلستان) (سه مرتبه، هر بار 5 دقیقه در 80 هرتز) استفاده شد (Moraes et al., 2011).

شاخص‌های رشد و زیتودة جلبک:در پژوهش حاضر، ارزیابی میزان رشد و تکثیر سلولی با روش سنجش کدورت سوسپانسیون جلبکی در طول‌موج 560 نانومتر انجام شد و سنجش وزن تر و وزن خشک جلبک نیز هر سه روز یک‌بار انجام شد. همچنین برخی دیگر از شاخص‌های رشد جلبک برحسب وزن خشک و رابطه‌های مربوطه محاسبه شدند.

ارزیابی تکثیر تودة سلولی جلبک با روش کدورت‌سنجی: میزان رشد با سنجش کدورت سوسپانسیون سلولی S. platensis در طول‌موج 560 نانومتر (Choudhary et al., 2007) هر 3 روز یک‌بار با دستگاه اسپکتروفوتومتر 96 چاهکی (مدل Epoh، شرکت BioTek، انگلستان) ارزیابی شد.

اندازه‌گیری وزن تر و وزن خشک جلبک:برای اندازه‌گیری وزن تر جلبک، مقادیر همگنی از سوسپانسیون سلولی به‌مدت 15 دقیقه در g 6000 سانتریفیوژ شد و برای حذف هرگونه نمک، سطح زیتودة تر جلبک، 2 تا 3 بار با آب دو بار تقطیر شستشو داده شد و پس از خارج‌کردن کامل محلول رویی، توزین شد. برای اندازه‌گیری وزن خشک، زیتودة تر به‌دست‌آمده به‌مدت 8 ساعت در دمای 75 درجة سانتی‌گراد داخل آون، خشک و سپس توزین شد. وزن تر و وزن خشک براساس گرم در لیتر گزارش شدند.

محاسبة برخی دیگر از شاخص‌های رشد جلبک: از رابطه‌های 1، 2 و 3 برای محاسبة شاخص‌های مد نظر استفاده شد.

رابطة 1:                 Px (mg/L/day) = (Xm-Xi)/tm

در رابطة 1، Px، تولیدات سلولی (Cell productivity) برحسب وزن خشک؛ Xm، مقدار بیشینة تودة سلولی برحسب میلی‌گرم وزن خشک در لیتر؛ Xi، مقدار اولیة تودة سلولی برحسب میلی‌گرم وزن خشک در لیتر و tm، سن کشت (روز) را نشان می‌دهد (Madkour et al., 2012).

رابطة 2:  μm (division/day) = ln(x2-x1)/(t2-t1)

در رابطة 2، µm، بیشترین سرعت رشد ویژه (maximum specific growth rate)؛ X1، وزن خشک تودة سلولی در زمان t1 و X2، وزن خشک تودة سلولی در زمان t2 را نشان می‌دهد. زمان‌های t1 و t2 به‌ترتیب، زمان‌های ابتدا و انتهای دوره در فواصل زمانی روز صفر تا روز 21، روز 21 تا روز 27 و روز 27 تا روز 33 هستند (Madkour et al., 2012).

رابطة 3:                   td (/day) = ln2/μ = 0.693/μ

در رابطة 3، td، زمان دو برابر شدن تودة سلولی و μ، بیشترین سرعت رشد ویژة به‌دست‌آمده از رابطة 2 را نشان می‌دهد.

سنجش شاخص‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی

سنجش کلروفیل a: از حلال متانول 95 درصد برای استخراج کلروفیل استفاده شد. بدین‌منظور رسوب جلبکی از سانتریفیوژ سلول‌ها به‌‌مدت 15 دقیقه در g 6000 به دست آمد؛ سپس لولة حاوی نمونه، در حمام آب گرم 60 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 30 دقیقه نگهداری و دهانة لوله برای کاهش تبخیر متانول با پارا‌فیلم بسته شد. لولة مزبور در دمای آزمایشگاه، سرد و به مدت 10 دقیقه در دور g 10000 سانتریفیوژ شد؛ سپس محتوای کلروفیل a براساس جذب نوری عصارة متانولی با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 6405، شرکت JEN WAY، آمریکا) در طول‌موج 665 نانومتر مطابق با روش Bennett و Bogorad (1973) محاسبه و برحسب میلی‌گرم رنگدانه در گرم وزن خشک جلبک گزارش شد.

سنجش کاروتنوئید: برای اندازه‌گیری کاروتنوئید کل، رسوب جلبکی حاصل از سانتریفیوژ سوسپانسیون سلولی به‌مدت 15 دقیقه در دور g 6000، دو تا سه بار با آب‌مقطر شستشو داده شد و سپس با 2 تا 3 میلی‌لیتر استون 85 درصد مخلوط شد. سوسپانسیون دوباره به‌مدت 10 دقیقه در دور g 10000 سانتریفیوژ شد و محلول رویی حاوی رنگدانه برداشت شد. مقدار جذب در طول‌موج 450 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل6405، شرکت JEN WAY، آمریکا) خوانده شد و مقدار کاروتنوئید براساس رابطة 4 محاسبه و برحسب میلی‌گرم رنگدانه در گرم وزن خشک جلبک گزارش شد (Devanathan and Ramanathan, 2013).

رابطة 4:               Car = (D×V×F)/(2500×100)

در رابطة 4، D، جذب نوری در طول‌موج 450 نانومتر؛ V، حجم عصارة استخراج‌شده و F، ضریب رقت را نشان می‌دهد.

سنجش فیکوبیلی‌پروتئین‌ها:فیکوبیلی‌پروتئین‌ها از رسوب جلبکی به‌دست‌آمده از سانتریفیوژ سوسپانسیون سلولی در g 6000 به‌مدت 15 دقیقه، با افزودن بافر نمکی فسفات (M 05/0) با 7=pH استخراج شدند (Moraes et al., 2011). پس از سانتریفیوژ، جذب محلول رویی در طول‌موج‌های مندرج در رابطه‌های 5 تا 8 با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) خوانده شد و مقدار رنگدانه‌های فیکوبیلین شامل فیکوسیانین (Phycocyanin)، آلوفیکوسیانین (Allophycocyanin)، فیکواریترین (Phycoerythrin) و فیکوبیلی‌پروتئین کل (Total phycobiliprotein) با رابطه‌های 5 تا 8 برحسب میکروگرم بر میلی‌لیتر محاسبه شدند؛ سپس با رابطة 9 برحسب میلی‌گرم رنگدانه در گرم وزن خشک جلبک (Pan-Utai et al., 2017) گزارش شدند (Bennett and Bogorad, 1973).

رابطة 5:   PC (μg/ml)=(OD615-0.474×OD652)/5.34

رابطة 6:   APC (μg/ml)=(OD652-0.208×OD615)/5.09

رابطة 7:   PE (μg/ml)=((OD562)-(2.41×PC)-(0.849×APC))/9.62

رابطة 8:

Total phycobiliprotein (μg/ml) =PC+APC+PE

رابطة 9:         Pigment (mg/g) =

در رابطه‌های 5 تا 8، OD، جذب در طول‌موج خاص؛ PC، فیکوسیانین؛ APC، آلوفیکوسیانین و PE، فیکواریترین را نشان می‌دهد.

سنجش آستاگزانتین:برای اندازه‌گیری آستاگزانتین، پس از افزودن محلول دی متیل سولفوکسید (DMSO) به 50 میلی‌گرم رسوب خشک جلبک، نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم 60 درجة سانتی‌گراد قرار گرفتند و چندین بار به‌شدت ورتکس (مدل Vortex 2، شرکت IKA، انگلستان) و سپس 5 دقیقه با سرعت 4600 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی برداشت شد و پس از افزودن استون به‌مدت 5 دقیقه با سرعت 3500 دور بر دقیقه دوباره سانتریفیوژ شد؛ سپس محلول در g 6000 به‌مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و میزان جذب محلول مد نظر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 6405، شرکت JEN WAY، آمریکا) در طول‌موج 482 نانومتر خوانده شد. مقدار آستاگزانتین براساس روش Régnier و همکاران (2015) و با احتساب ضریب خاموشی 105 × 25/1 لیتر بر مول بر سانتی‌متر، محاسبه و برحسب میکرو‌گرم رنگدانه بر گرم وزن خشک جلبک گزارش شد.

سنجش کربوهیدرات کل:اندازه‌گیری کربوهیدرات کل برمبنای روش Albalasmeh و همکاران (2013) انجام شد و پس از افزودن اسید سولفوریک به سوسپانسیون همگن جلبکی، محلول بدست آمده به سرعت مخلوط و ورتکس شد و پس از افزایش دمای آن، سپس محلول به‌سرعت روی یخ سرد شد و تغییرات جذب نوری محلول با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) در 315 نانومتر خوانده شد. از D-گلوکز برای رسم نمودار استاندارد استفاده شد و نتایج برحسب درصد در وزن خشک جلبک ارائه شدند.

سنجش پروتئین محلول: پروتئین محلول برمبنای روش Bradford (1976) با کوماسی برلیانت بلو و خواندن جذب نمونه در طول‌موج 595 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) اندازه‌گیری شد. برای ترسیم نمودار استاندارد از سرم آلبومین گاوی (BSA) استفاده شد و نتایج برحسب درصد در وزن خشک گزارش شدند.

سنجش لیپید کل:برای استخراج محتوای لیپیدی، از محلول 2:1 (حجمی - حجمی) کلروفرم:متانول استفاده شد. پس از انجام ورتکس و عمل سونیکیشن زیتودة جلبکی (3 بار، هربار به‌مدت 5 دقیقه و در 80 هرتز)، مقدار 5/2 میلی‌لیتر کلروفرم دوباره به محلول اضافه و ورتکس انجام شد. پس از صاف‌کردن محلول، مقدار 5/2 میلی‌لیتر آب مقطر، اضافه و در g 1000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد؛ سپس مایع رویی آن جدا و در آون، خشک و توزین شد. مقدار لیپید، پس از کاستن مقدار وزن رنگدانه‌های محلول در فاز آلی، مانند کلروفیل و کاروتنوئید، برحسب میکرو‌گرم در گرم وزن خشک جلبک محاسبه و گزارش شد (Bligh and Dyer, 1959).

سنجش محتوای فنل کل:استخراج و اندازه‌گیری فنل کل براساس روش Lee و همکاران (2012) انجام شدند. پس از مخلوط‌کردن نمونة جلبکی با معرف فولین - سیوکالتیو، محلول سدیم کربنات 20 درصد به نمونه اضافه و به‌خوبی ورتکس شد؛ سپس نمونه‌ها در تاریکی و دمای آزمایشگاه به‌مدت 2 ساعت نگهداری شدند. میزان جذب آنها در طول‌موج 765 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) خوانده شد. برای رسم نمودار استاندارد از گالیک اسید استفاده شد و نتایج برحسب درصد فنل در مادة خشک گزارش شدند.

سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی:میزان پراکسیداسیون لیپیدی با ارزیابی مقدار مالون‌دی‌آلدهید سنجیده شد. پس از سانتریفیوژ سوسپانسیون همگن جلبکی در g 6000 به‌مدت 15 دقیقه و خارج‌کردن مایع رویی، افزودن محلول آب:اتانول با نسبت 80:20 حجمی – حجمی به رسوب جلبکی انجام شد. نمونه در g 6000 به‌مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و سپس تیوباربیتوریک اسید 6/0 درصد به مایع رویی اضافه شد. نمونه به‌شدت ورتکس شد و در حمام آب گرم در دمای 95 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 25 دقیقه قرار گرفت. پس از سردکردن نمونه روی یخ، دوباره سانتریفیوژ انجام شد. میزان جذب در طول‌موج‌های440، 532 و 600 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) خوانده شد و مقدار مالون‌دی‌آلدهید براساس روش Hodges و همکاران (1999) محاسبه و برحسب درصد مالون‌دی‌آلدهید در تودة خشک گزارش شد.

سنجش فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلول (درصد مهار 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل): فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلول برمبنای روش Shanab و Shalaby (2013) سنجش شد. برای استخراج، رسوب جلبکی پس از سانتریفیوژ با حلال متانول:اتانول با نسبت 1:10 (حجمی – حجمی) مخلوط شد؛ سپس به 5/1 میلی‌لیتر محلول جلبکی، 250 میکرولیتر محلول 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل (DPPH) در متانول اضافه شد. پس از انکوباسیون در دمای اتاق به‌مدت 30 دقیقه، جذب در طول‌موج 520 نانومتر با اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) اندازه‌گیری و فعالیت آنتی‌اکسیدانی با رابطة 9 برحسب درصد محاسبه شد.

رابطة 9 Activity (%) =Ac-At/Ac × 100

در رابطة 9، Activity، فعالیت برحسب درصد مهارکنندگی 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل؛ At، جذب نمونة عصاره و Ac، جذب محلول 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل متانولی بدون عصاره (نمونة بلانک) را نشان می‌دهد.

در ارزیابی شاخص‌ها برای اطمینان از تخلیة مواد و ترکیبات درون‌سلولی از چندین بار فریز‌کردن نمونه در دمای 20- درجة سانتی‌گراد و گرم‌کردن دوبارة آن و نیز سونیکیشن با سه بار تکرار و هربار 5 دقیقه در 80 هرتز استفاده شد.

تحلیل آماری: آزمون‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی در دو نوع محیط‌کشت و چهار زمان به‌صورت فاکتوریل در 3 تکرار انجام شدند. محاسبات داده‌ها و ترسیم نمودارها با نرم‌افزار Excel نسخة 2016 انجام شد. تحلیل آماری داده‌ها به‌صورت آنالیز واریانس یک‌طرفه و با نرم‌افزار SPSS نسخة 20 انجام شد. میزان همبستگی با آزمون همبستگی (Correlation) و ضریب پیرسون محاسبه شد و مقایسة میانگین‌ها براساس آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 05/0P≤ انجام شد.

 

نتایج

تغییرات رشد سوسپانسیون سلولی جلبک S. platensis براساس میزان کدورت و تغییرات مقدار وزن خشک در دورة 42 روزه: شکل 1-A تغییرات میزان کدورت سوسپانسیون سلولی جلبک S. platensis را براساس جذب در طول‌موج 560 نانومتر در دو محیط‌کشت Johnson و Zarrouk بدون تیمار وانیلین (شاهد) و نیز دارای وانیلین با غلظت 30 میلی‌گرم در لیتر نشان می‌دهد. در دورة 42 روزه، میزان کدورت سوسپانسیون سلولی از مقدار حداقل در آغاز دوره در هر چهار محیط‌کشت به‌تدریج افزایش یافت و پس از تقریباً 27 روز به بیشترین مقدار خود رسید. پس از این زمان، مرحلة ایستایی رشد آغاز شد و سپس از حدود روز 33 کاهش تدریجی مقدار کدورت سلولی مشاهده شد. براساس نتایج آنالیز واریانس (جدول1)، تفاوت آثار اصلی و متقابل نوع محیط‌کشت و نیز تیمار وانیلین بر شاخص کدورت نوری معنی‌دار بود (01/0 P≤) و محیط‌کشت Zarrouk و پس از آن محیط‌کشت Johnson در مدت بیشتری از دوره، بیشترین رشد را موجب شدند. محیط‌کشت‌های حاوی وانیلین، رشد کم را نسبت به محیط‌کشت‌های بدون وانیلین نشان دادند و کمترین میزان رشد در محیط‌کشت Johnson حاوی وانیلین به دست آمد.


 

 

 

 

شکل 1- روند تغییرات کدورت (Turbidity) سوسپانسیون سلولی جلبک Spirulina platensis براساس جذب در طول‌موج 560 نانومتر (A) و روند تغییرات وزن خشک جلبک (B) در محیط‌کشت‌های Johnson (J)، Zarrouk (Z)، Johnson دارای وانیلین (JV)، و Zarrouk وانیلین (ZV) در یک دورة رشد 42 روزه- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 05/0 P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

 

جدول 1- میانگین مربعات جدول تجزیة واریانس شاخص‌های ارزیابی‌شدة جلبک S. platensis بر اثر نوع محیط‌کشت استفاده‌شده (Zarrouk یا Johnson)، تیمار وانیلین و زمان یا روز نمونه‌برداری در مدت دورة رشد (روزهای صفر، 21، 27، 33): PC (فیکوسیانین)، APC (آلوفیکوسیانین)، PE (فیکواریترین)، PBP (فیکوبیلین کل) و MDA (مالون‌دی‌آلدهید)

منبع تغییرات

درجة آزادی

وزن خشک

کدورت

کلروفیل a

کاروتنوئید

آستاگزانتین

PC

APC

محیط‌کشت

1

**988/0

**058/0

**887/4

**799/5

**001/0

**3/145

**7/474

وانیلین

1

**27/0

**125/0

**924/2

**988/6

ns09-E9/7

**1/25

**9/96

روز

3

**943/4

**694/1

**366/6

**39/15

**003/0

**7/314

**4/640

محیط‌کشت×روز

3

**131/0

**006/0

**033/1

**85/3

**001/0

**0/28

**2/57

وانیلین×روز

3

**065/0

*018/0

**648/0

**906/2

**001/0

**1/24

**7/127

محیط‌کشت×

وانیلین

1

*060/0

**004/0

**706/1

**717/1

**001/0

*3/16

**4/152

محیط‌کشت×

وانیلین×روز

3

ns009/0

**001/0

**281/0

**969/0

**001/0

**9/18

**4/47

خطا

25

014/0

05-E3/5

047/0

045/0

06-E31/1

522/2

508/4

جمع کل

41

 

 

 

 

 

 

 

 

منبع تغییرات

PE

PBP

لیپید

کربوهیدرات

پروتئین

فنل

MDA

درصد مهار DPPH

محیط‌کشت

**0/71

**5/1787

**022/0

**4/110547

**052/0

**8/2788

**006/0

**4/3688

وانیلین

*2/7

**6/307

**049/0

**7/6075

*031/0

**3/3394

**003/0

*74/76

روز

**5/635

**8/4539

**114/0

**8/26718

**402/0

**4/34778

**009/0

**7/1980

محیط‌کشت-روز

**6/8

**0/239

**009/0

**1/17440

**073/0

**7/5385

**001/0

**7/857

وانیلین-روز

**1/2

**0/295

**01/0

**7/6779

*044/0

**9/4158

**002/0

**5/1012

محیط‌کشت-وانیلین

**5/43

**8/528

**001/0

**3/9539

**003/0

**2/6294

**002/0

**1/50

محیط‌کشت-وانیلین-روز

**7/16

**3/211

**007/0

**6/6261

**064/0

**7/1211

**001/0

**2/355

خطا

524/1

3/13

05-E93/5

2/285

002/0

354/109

05-E8/4

2/18

جمع کل

 

 

 

 

 

 

 

 

*، ** و ns به‌ترتیب بیان‌کنندة معنی‌داری در سطح احتمال 5 و 1 درصد و معنی‌دارنبودن هستند.

 

 

براساس شکل 1- B و مشابه با تغییرات شاخص کدورت، در هر چهار محیط‌‌کشت، روند افزایشی وزن خشک از روز آغاز آزمون تا تقریباً روز 27 دوره مشاهده شد و پس از آن، روند افزایش وزن خشک مقداری کند شد؛ اما برخلاف روندی که در کدورت مشاهده شد، کاهشی تا انتهای دوره در مقدار وزن خشک ملاحظه نشد؛ حتی مقدار آن به‌آرامی افزایش یافت. وزن خشک سلول‌ها در محیط‌کشت Zarrouk با اختلاف چشمگیری در کل دورة 42 روزه، بیشتر از وزن خشک سلول‌ها در سایر محیط‌ها بود و محیط‌کشت Zarrouk دارای وانیلین در رتبة بعدی ازنظر تأثیر القایی بر افزایش وزن خشک سلول‌ها قرار داشت. رابطة همبستگی معنی‌دار (01/0P≤ و 94/0=R2) و مثبت میان کدورت سوسپانسیون سلولی با مقدار وزن خشک جلبک در مدت 42 روز به دست آمد (شکل 2).

 

 

 

 

شکل 2- رابطة همبستگی (با ضریب پیرسون) بین میزان کدورت سوسپانسیون سلولی جلبک Spirulina platensis در 560 نانومتر و زیتودة خشک (میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) در محیط‌کشت‌های Johnson (J)، Zarrouk (Z)، Johnson دارای وانیلین (JV) و Zarrouk دارای وانیلین (ZV) در مدت دورة رشد 42 روزه

 

 

بیشترین مقدار وزن خشک برحسب گرم بر لیتر سوسپانسیون سلولی در سه دورة صفر تا 21، 21 تا 27 و 27 تا 33 روز در جدول 2 آمده است. نتایج مقایسة تیمارها براساس آزمون دانکن عبارتند از: 1- بیشترین میزان وزن خشک در همة تیمارها در دورة آخر نمونه‌برداری (27 تا 33 روز) به دست آمد؛ 2- بین تیمارها محیط‌کشت Zarrouk بیشترین مقدار وزن خشک (01/0 ± 89/1 گرم بر لیتر) را موجب شد و 3- محیط‌کشت‌های Zarrouk دارای وانیلین، Johnson و درنهایت، Johnson دارای وانیلین به‌ترتیب در رتبه‌های بعدی قرار دارند.

مقایسة سایر شاخص‌های رشد جلبک، ازجمله تولیدات سلولی (Px)، بیشترین سرعت رشد ویژه (µm) و زمان دو برابر شدن تودة سلولی جلبک (td) بین تیمارهای مختلف (جدول 2) نشان دادند شاخص تولیدات سلولی،‌ در محیط‌کشت Zarrouk و پس از آن در محیط‌کشت Zarrouk دارای وانیلین بیشتر از دو تیمار دیگر بودند. شاخص بیشترین سرعت رشد ویژه همواره بین روزهای 21 تا 27 رشد که مرحلة لگاریتمی رشد است، در هر چهار محیط‌کشت، مساوی و بیشتر از دو فاصلة زمانی دیگر بود؛ اگرچه این شاخص در دورة سوم نمونه‌برداری در محیط‌کشت Johnson همچنان زیاد بود. زمان دو برابر شدن تعداد سلول‌ها در هر چهار تیمار در بیشتر مواقع در فاصله‌های زمانی روزهای 21 تا 27 و 27 تا 33 کمترین بود؛ اما رشد در مدت دورة آخر یا سوم در محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین نسبت به سایر تیمارها کند شد.

 

 

جدول 2- بیشترین مقدار وزن خشک (Xm)، تولیدات سلولی (Px)، بیشترین سرعت رشد ویژه (µm)، مدت دو برابر شدن تودة سلول‌های جلبک Spirulina platensis (td)، در دوره‌های رشد صفر تا 21 روز (A)، 21 تا 27 روز (B) و 27 تا 33 روز (C) در محیط‌کشت‌های Johnson (J)، Zarrouk (Z)، Johnson دارای وانیلین (JV) و Zarrouk دارای وانیلین (ZV)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 05/0 P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

تیمار – محیط‌کشت

Xm (gr.l-1)

Px (mg.l-1d-1)

µm (div day-1)

td (Day-1)

J-A

03/0 ± 77/0 h

93/0 ± 62/40c

002/0 ± 31/0 c

013/0 ± 20/2 a

J-B

03/0 ± 13/1 f

013/0 ± 98/0 a

009/0 ± 70/0 c

J-C

04/0 ± 37/1 d

039/0 ± 91/0 a

032/0 ± 77/0 c

Z-A

08/0 ± 27/1 e

27/1 ± 59/56a

003/0 ± 34/0 c

018/0 ± 04/2 a

Z-B

03/0 ± 78/1 b

036/0 ± 04/1 a

023/0 ± 67/0 c

Z-C

01/0 ± 89/1 a

100/0 ± 77/0 b

128/0 ± 92/0 c

JV-A

03/0 ± 73/0 b

83/1 ± 74/32d

002/0 ± 31/0 c

013/0 ± 22/2 a

JV-B

03/0 ± 03/1 g

028/0 ± 95/0 a

022/0 ± 73/0 c

JV-C

06/0 ± 17/1 e

236/0 ± 63/0 b

517/0 ± 23/1 b

ZV-A

03/0 ± 03/1 g

46/0 ± 75/43b

001/0 ± 33/0 c

009/0 ± 10/2 a

ZV-B

03/0 ± 38/1 d

0004/0 ± 98/0a

0001/0 ± 71/0 c

ZV-C

02/0 ± 47/1 c

079/0 ± 73/0 b

104/0 ± 96/0 c

 


تغییرات رنگیزه‌های فتوسنتزی: شکل‌های 3 و 4 تغییرات مقدار رنگدانه‌ها را در سلول‌های جلبک Spirulina در تیمارها نشان می‌دهند. براساس جدول آنالیز واریانس (جدول1)، بجز تأثیر اصلی تیمار وانیلین بر رنگدانة آستاگزانتین و نیز تأثیر متقابل وانیلین و زمان (روز نمونه‌برداری) بر رنگدانة فیکواریترین، سایر آثار اصلی و متقابل تیمارهای محیط‌کشت، وانیلین و زمان بر شاخص‌های رنگدانه معنی‌دار بوده‌اند (05/0 و 01/0 P≤). باتوجه‌به شکل 3-A، مقدار کلروفیل a در اواخر دورة رشد (روز 33) نسبت به روزهای ابتدایی در همة تیمارها کاهش ولی مقدار کاروتنوئیدها (شکل 3-B) افزایش یافت. محیط‌کشت Johnson در روز 21 رشد، تأثیر القایی چشمگیری در افزایش مقدار کلروفیل داشت که پس از آن در مدت دورة رشد کاهش یافت. تیمار محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین تأثیر مثبت کمتری بر مقدار کلروفیل گذاشت. مقدار کاروتنوئید کل، تفاوت‌های بیشتری بین تیمارها نشان داد و در روزهای پایانی (روز 33) بیشترین مقادیر، تنها مربوط به تیمارهای بدون وانیلین بودند. مقدار آستاگزانیتن در مدت دورة رشد نسبت به روز شروع آزمون کاهش یافت؛ بااین‌حال در بیشتر مواقع به‌ویژه در محیط‌کشت‌های Zarrouk مقدار بیشتری داشت (شکل 3-C). مجموعة رنگدانه‌های فیکوبیلینی فیکوسیانین، آلوفیکوسیانین و فیکواریترین (شکل‌های 4-A تا C) تغییرات افزایشی از ابتدا تا انتهای دوره با برخی نوسانات نشان دادند و مقدار آنها و درنتیجه فیکوبیلین کل (شکل 4-D) در انتهای دورة رشد به بیشینه رسید. بیشترین مقدار هر سه رنگدانه در تیمار با محیط‌کشت Johnson و پس از آن در تیمار محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین مشاهده شد.

تأثیر تیمارها بر مقدار کربوهیدرات، لیپید، فنل، مالون‌دی‌آلدهید، فعالیت آنتی‌اکسیدانی و مقدار پروتئین: مطابق با جدول آنالیز واریانس (جدول 1)، بجز تأثیر متقابل محیط‌کشت و وانیلین بر مقدار پروتئین و فعالیت آنتی‌اکسیدانی، همة آثار اصلی و متقابل تیمارهای محیط‌کشت، وانیلین و زمان بر مقدار کربوهیدرات، لیپید، فنل، پروتئین، مالون‌دی‌آلدهید و فعالیت آنتی‌اکسیدانی خاموش‌کردن 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل معنی‌دار (05/0 و 01/0 P≤) بودند.

براساس شکل 5-A تأثیر تیمارها بر میزان کربوهیدرات جلبک در روزهای 21 و 27 کشت، تا اندازة زیادی به نوع محیط‌کشت بستگی داشت؛ به‌طوری‌که محیط‌کشت Johnson در حضور و نبود وانیلین افزایش چشمگیر مقدار کربوهیدرات را سبب شد؛ درحالی‌که افزایش کمتری در مقدار کربوهیدرات‌ها در محیط‌کشت Zarrouk (در حضور یا نبود وانیلین) مشاهده شد. تیمار محیط‌کشت Johnson بدون وانیلین، بیشترین اثر القایی افزایشی را در روزهای 21 و 27 رشد موجب شد و در روز 33 بیشترین مقدار کربوهیدرات، تنها در محیط‌کشت Johnson حاوی وانیلین مشاهده شد.

تأثیر القایی محیط‌کشت Johnson بدون وانیلین بر افزایش میزان لیپید (شکل5-B)، فنل (شکل 5-C)، مالون‌دی‌آلدهید (شکل 6-A) و فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها (شکل 6-B) تا اندازه‌ای مشابه با تأثیر آن بر مقدار کربوهیدرات بود؛ یعنی پس از افزایش چشمگیر نسبت به روز صفر با روندی کاهشی تا انتهای دوره ادامه یافت؛ برعکس، تأثیر آن بر میزان پروتئین (شکل 6-C) روند افزایشی تا انتهای دوره (روز 33) داشت.

 

 

 

 

 

شکل 3- مقادیر کلروفیل (A)، کاروتنوئید (B) و آستاگزانتین (C) در سلول‌های Spirulina platensis در محیط‌کشت‌های Johnson (J)، Zarrouk (Z)، Johnson دارای وانیلین (JV)، و Zarrouk دارای وانیلین (ZV) در روزهای صفر، 21، 27 و 33- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 05/0 P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

 

محیط‌کشت Johnson حاوی وانیلین در بیشتر مواقع، افزایش بیشتری در شاخص‌های نام‌برده‌شده نسبت به محیط‌کشت Zarrouk حاوی وانیلین یا بدون آن سبب شد و در برخی موارد مانند مقدار کربوهیدرات (شکل 5-A)، لیپید (شکل 5-B) و پروتئین (شکل 6-C)، بیشترین مقدار را بین مجموعة تیمارها به‌ویژه در روزهای 21 و 27 موجب شد. در روز 33 رشد، مقدار لیپید (شکل 5-B)، فنل (شکل 5-C)، مالون‌دی‌آلدهید (شکل 6-A) و فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها (شکل 6-B) نسبت به روزهای قبلی در همة تیمارها کاهش یافتند.

محیط‌کشت Zarrouk دارای وانیلین و بدون آن، مقدار کربوهیدرات را به میزان مشابه با محیط‌کشت Johnson افزایش نداد و بجز افزایش اندک در روز 21، مقدار آن تا انتهای دوره نسبت به روز صفر بی‌تغییر ماند؛ برعکس، مقدار لیپید سلول‌ها، بر اثر محیط‌کشت Zarrouk افزایش یافت که این افزایش بر اثر محیط‌کشت Zarrouk دارای وانیلین، بیشتر از سایر تیمارها بود. در نمونه‌های تیمارشده با محیط‌کشت‌های Zarrouk بدون وانیلین و دارای وانیلین، مقدار مالون‌دی‌آلدهید در روز 21 مقداری افزایش اما پس از آن کاهش یافت. بررسی میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل براساس خاموش‌کردن 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل نیز نشان داد مقدار فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها بر اثر تیمار با محیط‌کشت Zarrouk نیز مساوی یا کمتر از روز صفر بود؛ ولی مقدار پروتئین، مشابه با تأثیر تیمار محیط‌کشت Johnson، در نمونه‌های تیمار‌شده با محیط‌کشت‌های Zarrouk بدون وانیلین و دارای وانیلین افزایش یافت و در انتهای دورة رشد به بیشترین مقدار رسید. به‌طور‌کلی مقدار بیشتر شاخص‌های گفته‌شده، در انتهای دورة رشد کاهش یافت؛ درحالی‌که مقدار پروتئین سلول‌ها افزایش نشان داد.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4- مقادیر PC (فیکوسیانین) (A)، APC (آلوفیکوسیانین) (B)، PE (فیکواریترین) (C) و Total PBP (فیکوبیلین کل) (D) در سلول‌های Spirulina platensis در محیط‌کشت‌های Johnson (J)، Zarrouk (Z)، Johnson دارای وانیلین (JV)، و Zarrouk دارای وانیلین (ZV) در روزهای صفر، 21، 27 و 33- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 05/0 P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

 

 

 

شکل 5- مقادیر کربوهیدرات کل (A)، لیپید (B) و فنل (C) در سلول‌های Spirulina platensis در محیط‌کشت‌های Johnson (J)، Zarrouk (Z)، Johnson دارای وانیلین (JV)، و Zarrouk دارای وانیلین (ZV) در روزهای صفر، 21، 27 و 33- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 05/0 P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

 

 

 

شکل 6- مقادیر MDA (مالون‌دی‌آلدهید) (A)، درصد مهار 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل (DPPH) (B) و پروتئین کل (C) در سلول‌های Spirulina platensis در محیط‌کشت‌های Johnson (J)، Zarrouk (Z)، Johnson دارای وانیلین (JV)، و Zarrouk دارای وانیلین (ZV) در روزهای صفر، 21، 27 و 33- مقادیر، میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 05/0 P≤ براساس آزمون دانکن هستند.


بحث

افزایش تقاضا برای تغذیه و تهیة برخی مکمل‌های غذایی گیاهی، اهمیت دوچندان جنس Spirulina را به‌صورت غذای ایدئال یا غذای آینده سبب شده است و این جلبک به دلیل داشتن ارزش تغذیه‌ای زیاد در صنایع غذایی، دارویی و تشخیصی به کار می‌رود (Raoof et al., 2006). از سوی‌دیگر برخی ترکیبات آلاینده که در سال‌های اخیر به مقدار زیاد مصرف شده است؛ مانند ترکیب فنلی وانیلین بر رشد و عملکرد جلبک‌ها آثار متفاوتی می‌گذارند (Miazek et al., 2013; Akbari and Madadkar Haghjou, 2018b).

اگرچه در منابع، محیط‌کشت Zarrouk، محیط‌کشت اولیه و اصلی برای رشد بهینة جلبک Spirulina یاد شده است (Dineshkumar et al., 2016; Usharani et al., 2012; Zarrouk, 1966)، پژوهش‌ها نشان داده‌اند مجموعة عناصر در دسترس جلبک مانند ریز‌مغذی‌ها و درشت‌مغذی‌ها بر نحوة پاسخگویی جلبک به شرایط محیطی ازجمله ترکیبات آلایندة موجود در محیط‌های آبی مانند ترکیب فنلی وانیلین تأثیر می‌گذارند (Madkour et al., 2012; Miazek et al., 2013;). ازآنجاکه محیط‌کشت Johnson در پژوهش‌هایی بر جلبک‌هایی مانند Dunaliella و Tetraflagellochloris sp. رشد را به‌خوبی تحریک و تولیدات ارزشمند آنها را القا کرد (Johnson et al, 1968; Barsanti et al., 2013; Akbari and Madadkar Haghjou, 2018a)، در پژوهش حاضر نیز استفاده شد.

براساس نتایج به‌دست‌آمده از پژوهش حاضر، محیط‌کشت Zarrouk بیشترین میزان رشد را برحسب سنجش میزان کدورت سوسپانسیون جلبکی در طول‌موج 560 نانومتر موجب شد (شکل 1)؛ ازاین‌رو رشد در محیط‌کشت Zarrouk بیشتر از رشد جلبک در محیط‌کشت Johnson بود. افزودن وانیلین (30 میلی‌گرم بر لیتر)، مقدار رشد جلبک را در هر دو محیط‌کشت کاهش داد؛ بنابراین کمترین میزان رشد برحسب کدورت، در محیط‌کشت‌های Zarrouk حاوی وانیلین و Johnson حاوی وانیلین مشاهده شد. این برخلاف نتایج به‌دست‌آمده از پژوهش‌های Akbari و Madadkar Haghjou (b2018) بود که وانیلین به مقدار 25 تا 40 میلی‌گرم بر لیتر، افزایش رشد سلول‌های جلبک Dunaliella salina را به‌ویژه پس از مرحلة لگاریتمی رشد سبب شد. این آثار متفاوت ممکن است به نوع جلبک بررسی‌شده نسبت داده شوند؛ چنان‌که تیمار وانیلین در جلبک sp. Chlorell، افزایش رشد (Miazek et al., 2013) و تیمار دیاتومه‌ها و Scenedesmus obliquus با وانیلین، کاهش رشد را موجب شده است (Vanilin, 1996).

بیشترین وزن خشک و تولیدات سلولی برحسب وزن خشک جلبک (جدول 2) نیز با مقادیر به‌ترتیب 89/1 گرم بر لیتر و 59/56 میلی‌گرم بر لیتر بر روز دوباره در محیط‌کشت Zarrouk به دست آمدند؛ همان‌طورکه سلول‌ها در این محیط‌کشت، بیشترین کدورت را نیز داشتند. در پژوهش حاضر، میزان رشد برحسب کدورت و مقدار وزن خشک سلول‌ها در مجموعة چهار تیمار، رابطة همبستگی معنی‌دار مثبت و نسبتاً قوی (01/0 P≤ و 94/0 = R2) نشان دادند. در بررسی رابطة همبستگی به‌طور مجزا، R2 برای هریک از تیمارهای محیط‌کشت Johnson، محیط‌کشت Zarrouk، محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین و محیط‌کشت Zarrouk دارای وانیلین به‌ترتیب، 915/0، 972/0، 907/0 و 948/0 به دست آمده است که مؤید افزایش هماهنگ رشد و تکثیر سلولی با مقدار زیتودة خشک سلول‌ها در هر چهار تیمار ولی با بیشترین همبستگی در محیط‌کشت Zarrouk است.

محیط‌کشت‌های Zarrouk دارای وانیلین، Johnson و Johnson دارای وانیلین به‌ترتیب در رتبه‌های بعدی ازنظر شاخص‌های بیشترین مقدار وزن خشک و تولیدات سلولی قرار گرفتند که کاهش مقدار وزن خشک بر اثر وانیلین را نشان می‌دهد. زمان دو برابر شدن وزن خشک سلول‌ها که با میزان رشد ویژه رابطة عکس دارد، در نخستین مرحلة رشد یعنی از ابتدای آزمون تا روز 21، بیشترین مقدار را یعنی حدود 1/2 روز داشت و در هر چهار تیمار از سایر مراحل طولانی‌تر بود. این مسئله ممکن است به‌دلیل انجام تقسیمات سریع سلولی در مرحلة لگاریتمی رشد باشد که فرصت انباشته‌کردن وزن خشک را نمی‌دهد (Jimenez and Niell, 1991).

براساس آزمایش‌های Goksan و همکاران )2006) بیشترین مقدار وزن خشک به میزان 99/0گرم بر لیتر درون محفظة شیشه‌ای بزرگ به دست آمد. Danesi و همکاران (2011) نیز با تغییر مقدار نور و دما در حضور پتاسیم نیترات که منبع نیترات محیط‌کشت است، به شاخص تولیدات سلولی به مقدار 5/96 میلی‌گرم بر لیتر بر روز دست یافتند. این نتایج با نتایج محیط‌کشت Johnson در پژوهش حاضر مقایسه می‌شود که منبع نیترات از نوع پتاسیم نیترات دارد و مقدار تولیدات سلولی در آن معادل 62/40 میلی‌گرم بر لیتر بر روز بوده است. گفتنی است محیط‌کشت Zarrouk، سدیم نیترات دارد. به نظر می‌رسد وجود برخی تفاوت‌ها در شرایط آزمون Danesi و همکاران (2011) مانند مدت دورة آزمون (14 روز)، مقدار دما (27 تا 33 درجة سانتی‌گراد) و نیز شدت نور (60 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) با شرایط آزمایش حاضر تفاوت در مقادیر به‌دست‌آمده را موجب شده است.

بررسی تغییرات مقادیر رنگدانه‌های کلروفیل a و کاروتنوئیدها نشان می‌دهد در روز 21 که در فاز لگاریتمی رشد قرار دارد، مقدار رنگدانة کلروفیل a در سلول‌های جلبکی در محیط‌کشت Johnson به‌طور چشمگیری افزایش یافت؛ ولی در سایر تیمارها افزایش مشاهده نشد؛ بااین‌حال مقدار کلروفیل a تا انتهای دورة رشد کاهش یافت. کاهش مقدار کلروفیل همگام با افزایش سن سلول‌ها و کشت در برخی پژوهش‌ها بر سایر گیاهان نیز گزارش شده است (Estak, 1963).

در پژوهش‌های Fitzgerald و همکاران (2004) مقادیر 10 تا 40 میلی‌مولار (حدوداً 1 تا 6 گرم بر لیتر) وانیلین در باکتری‌های Lactobacillus plantarum و Escherichia coli که مشابه با جلبک Spirulina از نوع سلول‌های پروکاریوتی هستند، توقف کامل تنفس و بر هم خوردن هموستازی pH را سبب شد. این پژوهشگران نشان دادند وانیلین به یکپارچگی و سلامت غشای سیتوپلاسمی صدمه می‌زند و بنابراین نشت یونی آرام و بر هم خوردن تعادل یون‌ها را در دو سمت غشا سبب می‌شود؛ اما در پژوهش حاضر بر جلبک Spirulina افزایش شاخص مالون‌دی‌آلدهید که علامت اکسیداسیون غشاء و صدمه به سلامت آن است در مرحلة لگاریتمی و روز 21 رشد در تیمارهای حاوی وانیلین نسبت به محیط‌های بدون وانیلین کمتر مشاهده شد. در ضمن، مقدار مالون‌دی‌آلدهید در محیط‌کشت Johnson و نیز محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین از سایرین بیشتر بود. به نظر می‌رسد در این شرایط، بررسی آنتی‌اکسیدانی سلول نیاز است.

بررسی وضعیت پتانسیل آنتی‌اکسیدانی کل در مهار 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل (شکل 6-B)، افزایش مقدار پتانسیل آنتی‌اکسیدانی را در برخی از تیمارها، نه همة آنها نشان می‌دهد. شاید برخی ترکیبات آنتی‌اکسیدانی که با روش قابلیت احیای آهن (FRAP) یا سایر روش‌های ارزیابی پتانسیل آنتی‌اکسیدانی ارزیابی‌شدنی هستند نیز در خنثی‌کردن رادیکال‌های آزاد مشارکت داشته‌اند. در برخی پژوهش‌ها تفاوت در روش ارزیابی پتانسیل آنتی‌اکسیدانی سلول (مانند روش‌های 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل (DPPH)، روش قابلیت احیای آهن (FRAP) و ...) و مقدار آن گزارش شده است (Pisoschi and Negulescu, 2011). به‌هرحال افزایش مقدار مالون‌دی‌آلدهید و پتانسیل آنتی‌اکسیدانی در تیمارهایی مانند محیط‌کشت Johnson حاوی وانیلین یا بدون آن، نشان‌دهندة وقوع تنش اکسیداتیو و مقابلة سیستم آنتی‌اکسیدانی با آن است. در واقع، منطقی است که دلیل این افزایش به مجموعه‌ای از عناصر موجود در محیط‌کشت Johnson و تفاوت آنها با محیط‌کشت Zarrouk ( نه عاملی منفرد) نسبت داده شود؛ بااین‌حال ازآنجاکه تعداد بیشتری از ترکیبات محیط‌کشت Johnson به شکل کلراید وجود دارند، ممکن است برای برخی از جلبک‌ها مطلوب نباشند و در القای درجاتی از تنش دخالت داشته باشند و افزایش مقدار مالون‌دی‌آلدهید و القای فعالیت آنتی‌اکسیدانی را سبب شوند؛ زیرا گزارش‌هایی دربارة برخی آثار نامطلوب ترکیبات کلر بر جلبک‌ها وجود دارند (Junli et al., 1997; Heng et al., 2008).

به‌دلیل افزایش چشمگیر مقدار ظرفیت آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها در محیط‌کشت Johnson تا حدود دو برابر سلول‌های تیمارشده در سایر تیمارها، استفاده از این محیط‌کشت برای پرورش سلول‌های جلبک Spirulina برای تولید مکمل‌های غذایی حاوی آثار آنتی‌اکسیدانی (Wu et al., 2005) پیشنهاد می‌شود.

با افزایش سن کشت، مقدار مالون‌دی‌آلدهید و نیز ظرفیت اکسیدانی سلول کاهش یافتند؛ ولی در محیط‌کشت Johnson حاوی وانیلین، بیشتر از سایر تیمارها باقی ماندند که بیان‌کنندة تأثیر منفی تیمار وانیلین وابسته به نوع محیط‌کشت بر زیاد باقی‌ماندن مقدار مالون‌دی‌آلدهید پس از گذشت مرحلة لگاریتمی و فعال رشد است؛ اگرچه کاهش تدریجی مالون‌دی‌آلدهید و به‌دنبال آن فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلول با گذشت زمان ممکن است به‌دلیل تجزیه‌شدن احتمالی و تدریجی فنل در جلبک باشد.

رنگدانه‌های فیکوبیلین که رنگدانه های کمکی مشارکت‌کننده در فتوسنتز در Spirulina هستند، ارزش اقتصادی زیادی دارند. این رنگدانه‌ها به‌صورت رنگ‌های طبیعی و خوراکی با خواص آنتی‌اکسیدانی در صنایع غذایی و دارویی کاربرد دارند (Walter et al., 2011)؛ بنابراین افزایش مقدار این رنگدانه ها بر ارزش اقتصادی Spirulina به‌صورت مکمل غذایی می‌افزاید.

برخلاف مقدار کلروفیل a و آستاگزانتین که با پیر‌شدن کشت کاهش یافتند، فیکوبیلین‌ها مانند کاروتنوئید کل با افزایش سن کشت افزایش پیداکردند و به بیشترین مقدار در روز 33 و در محیط‌کشت Johnson رسیدند. براساس نظر قبادیان و همکاران (1394) اگر مواد مغذی لازم برای سنتز هردو کلروفیل و فیکوبیلی‌پروتئین‌ها تا اندازه‌ای یکسان باشند، دو مادة یادشده در رقابت هستند و با کاهش یکی، دیگری باید افزایش یابد. سلول‌های Spirulina در محیط‌کشت Johnson در همة روزهای نمونه‌برداری، بیشترین مقدار هر سه فیکوبیلین (فیکوسیانین، آلوفیکوسیانین و فیکواریترین) و بنابراین فیکوبیلین کل را داشتند. ازآنجاکه رنگدانه‌های فیکوبیلین به‌دلیل وجود باندهای دوگانة موجود در کروموفور خاصیت آنتی‌اکسیدانی دارند (Walter et al., 2011)، ممکن است افزایش آنها همگام با افزایش سن کشت به پایداری و مقابله با رادیکال‌های آزاد برای جلوگیری از وقوع اکسیداسیون در سوسپانسیون سلولی کمک کند. Seo و همکاران (2013) با اندازه‌گیری میزان فعالیت عصارة فیکوبیلینی در خاموش‌کردن 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل، میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی آن را وابسته به سلامت و یکپارچگی کمپلکس کروموپروتئین و دست‌نخوردگی رنگدانه‌ها هنگام استخراج دانستند. در پژوهش حاضر، اندازه‌گیری مهار و خاموش‌کردن 1 و 1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل در روزهای انتهایی آزمون (روز 33) افزایشی همگام با افزایش مقدار فیکوبیلین‌ها نشان نداد که احتمالاً به‌دلیل صدمه به سلامت و یکپارچگی کروموپروتئین (رنگدانه - پروتئین) هنگام استخراج رنگدانه‌ها است که ممکن است بخشی از خواص آنتی‌اکسیدانی کمپلکس سالم را تغییر دهد (Seo et al., 2013).

افزودن وانیلین به هریک از دو محیط‌کشت، بروز تغییرات متفاوت را در مقدار فیکوبیلین‌ها سبب شد؛ به‌طوری‌که در محیط‌کشت Johnson، کاهش و در محیط Zarrouk، افزایش اندک آنها را سبب شد. این مسئله نیز تأثیر متقابل معنی‌دار نوع محیط‌کشت و وانیلین را بر مقدار ترکیبات و تولیدات سلولی نشان می‌دهد (Akbari and Madadkar Haghjou, 2018a; Akbari and Madadkar Haghjou, 2018b). مقدار پروتئین‌ها در روزهای 21 و 27 نمونه‌برداری به‌ویژه در محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین نسبت به محیط‌کشت Johnson بدون وانیلین افزایش نشان داد. این مسئله ممکن است به‌دلیل تلاش سلول برای مقابله با آثار منفی وانیلین به‌ویژه در مرحلة تقسیمات سلولی شدید باشد.

برخی پژوهش‌ها به‌دلیل امکان استفادة جلبک‌های سبز آب شیرین مانند Chlamydomonas reinhardtii، Chlorella vulgaris Beyerinck و Scenedesmus quadricaudaو جلبک‌های سبز – آبی Anabaena ambigua، Nostoc muscorum ، Oscillatoria animalis، Oscillatoria sancta، Spirulina maxima و Spirulina platensis از فنل و تجزیة آن به‌صورت منبع کربنی، بر محیط‌کشت آگار انجام شده‌اند. همة جلبک‌ها بجز S. platensis وS. maxima توانستند تجزیة زیستی فنل را در مدت چند روز انجام دهند (Samanthakamani and Thangaraju, 2015). در سایر پژوهش‌ها جلبک‌های Ankistrodesmus braunii و Scenedesmus quadricauda توانایی تخریب بیش از 70 درصد فنل‌ها را در مدت 5 روز (Pinto et al., 2002) و جلبک Chlorella vulgaris تجزیة 90 درصدی فنل را پس از 7 روز (El-Sheekh et al., 2012) موجب شدند؛ اما نتایج حاصل از پژوهش حاضر نشان می‌دهند مقدار کربوهیدرات‌ها و لیپید تولید‌شده در سلول‌های کشت‌شده در محیط‌کشت Johnson دارای وانیلین حتی در روز 33 کشت بیشتر از محیط‌کشت Johnson بدون وانیلین است؛ بنابراین ممکن است جلبک وانیلین را به‌صورت منبع کربن ولی در مدت طولانی‌تری استفاده و تجزیه کند. در پژوهشی که در بررسی تأثیر فنل بر چهار ریزجلبک دریایی سبز انجام شد، کاهش رنگدانة کلروفیل و تعداد سلول‌ها با افزایش تعداد قطرات چربی همراه بود که به سم‌زدایی فنل نسبت داده شد (Duan et al., 2017).

مقدار فنل که ترکیب آنتی‌اکسیدانی بسیار مهم است، در جلبک Spirulina تقریباً 5 برابر مقدار آن در جلبک Chlorella است (Colla et al., 2007a; Wu et al., 2005). در پژوهش حاضر، بیشترین مقدار فنل در محیط‌کشت Johnson و روز 21 کشت مشاهده شد؛ اما افزودن وانیلین به محیط‌کشت Johnson آن را کاهش و افزودن آن به محیط‌کشت Zarrouk در بیشتر مواقع، آن را افزایش داد. این مسئله تغییرات مقدار فنل وابسته به نوع محیط‌کشت و نیز زمان را نشان می‌دهد. Colla و همکاران (a2007) نیز تغییر در مقدار فنل وابسته به تغییر در برخی شرایط دیگر مانند مقدار منبع نیتروژن و حرارت محیط را نشان داده‌اند.

 

جمع‌بندی

مقادیر متفاوت شاخص‌ها و ترکیبات ارزیابی‌شدة جلبک Spirulina در پژوهش حاضر به نوع محیط‌کشت استفاده‌شده، وجود یا نبود تیمار وانیلین و نیز روز نمونه‌برداری یا سن کشت بستگی دارند. دو محیط‌کشت Zarrouk و Johnson ازنظر القای رشد سلول‌ها و نیز القای سوسپانسیون سلولی برای تولید ترکیبات مختلف آثار با شدت‌های متفاوت و گاه آثار متضاد داشتند. باتوجه‌به ارزان‌تر‌بودن و کمتر‌بودن هزینة تهیة محیط‌کشت Johnson نسبت به Zarrouk و نیز اثر القایی مثبت آن در تولید برخی ترکیبات مهم مانند فنل، کربوهیدرات، پروتئین، فیکوبیلی‌پروتئین‌ها و لیپید، این محیط برای تحریک تولید شاخص‌های مزبور توصیه می‌شود.

پاسخ سلول‌ها به تیمار وانیلین نیز وابسته به نوع محیط‌کشت بود. اگرچه افزودن وانیلین، مقدار رشد جلبک Spirulina platenis و برخی شاخص‌ها را در هردو محیط‌کشت کاهش داد، افزایش مقدار برخی شاخص‌های مهم مانند لیپید، پروتئین و کربوهیدرات را سبب شد؛ ازاین‌رو با‌توجه‌به تأثیر‌ متقابل نوع محیط‌کشت بر پاسخ سلول‌های Spirulina به مادة وانیلین (ضمن لحاظ‌کردن آثار منفی وانیلین)، ممکن است در شرایطی که تولید ماده و ترکیب خاصی مد نظر است، از تیمار وانیلین در هریک از این محیط‌کشت‌ها استفاده شود.

 

سپاسگزاری

بدین‌وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه لرستان به‌سبب پشتیبانی مالی از پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌شود.

Akbari, F. and Madadkar Haghjou, M. (2018a) Improvement of nutritional values of two Dunaliella (green microalgae) species, by changing in medium factors. Journal of Fisheries 70(3): 243-261.

Akbari, F. and Madadkar Haghjou, M. (2018b) Increase in biomass and growth of Dunaliella microalga under vanillin treatment. Journal of Plant Process and Function 7(24): 211-228.

Al-fawwaz, A. T., Jacob, J. H. and Al-wahishe, T. E. (2016) Bioremoval capacity of phenol by green micro-algal and fungal species isolated from dry environment. International Journal of Scintific and Technology Research 5: 155-160.

Albalasmeh, A. A, Berhe, A. A. and Ghezzehei, T. A. (2013) A new method for rapid determination of carbohydrate and total carbon concentrations using UV spectrophotometry. Carbohydrate Polymers 97: 253-261.

Ambati, R. R., Phang, S. M., Ravi, S. and Aswathanarayana, R. G. (2014) Astaxanthin: sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applications-A review. Marine Drugs 12: 128-152.

Baqueiro-Peña, I. and Guerrero-Beltrán, J. Á. (2017) Vanilla (Vanilla planifolia Andr.), its residues and other industrial by-products for recovering high value flavor molecules: A review. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants 6: 1-9.

Barsanti, L., Frassanito, A. M., Passarelli, V., Evangelista, V., Etebari, M., Paccagnini, E., Lupetti, P., Lenzi, P., Verni, F. and Gualtieri, P. (2013) Tetraflagellochloris mauritanica gen.et sp. nov. (Chlorophyceae), a new flagellated alga from the Mauritanian desert: Morphology, ultrastructure, and phylogenetic framing. Journal of Phycology 49: 178-193.

Battah, M., El-Ayoty, Y., Abomohra, A. E., El-Ghany, S. and Esmael, A. (2013) Optimization of growth and lipid production of the Chlorophyte microalga Chlorella vulgaris as a feedstock for biodiesel production. World Applied Sciences Journal 28: 1536-1543.

Benemann, J. (2013) Microalgae for biofuels and animal feeds. Energies 6: 5869-5886.

Bennett, A. and Bogorad, L. (1973) Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology 58: 419-435.

Bezerra, D. P., Soares, A. K. N. and de Sousa, D. P. (2016) Overview of the role of vanillin on redox status and cancer development. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016(Article ID 9734816): 1-9.

Babich, H. andDavis, D. L. (1981) Phenol: A review of environmental and health risks. Regulatory Toxicology and Pharmacology 1(1): 90-109.

Bligh, E. G. and Dyer, W. J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37: 911-917.

Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-Dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

Brooke, L. T. and Anderson, C. H. (1984) Acute toxicities of organic chemicals to fathead minnows (Pimephales promelas). vol. 1. Center for Lake Superior Environmental Studies, University of Wisconsin-Superior, Washington.

 

Choudhary, M., Jetley, U. K., Khan, M. A., Zutshi, S. and Fatma, T. (2007) Effect of heavy metal stress on proline, malondialdehyde, and superoxide dismutase activity in the cyanobacterium Spirulina platensis-S5. Ecotoxicology and Environmental Safety 66: 204-209.

Colla, L. M., Furlong, E. B., Costa, J. A. V., Alberto, J. and Costa, V. (2007a) Antioxidant properties of Spirulina (Arthospira) platensis cultivated under different temperatures and nitrogen regimes. Brazilian Archives of Biology and Technology 50: 161-167.

Colla, L. M., Oliveira Reinehr, C., Reichert, C., Costa, J. A. V., Reinehr, C. O., Reichert, C., Alberto, J. and Costa, V. (2007b) Production of biomass and nutraceutical compounds by Spirulina platensis under different temperature and nitrogen regimes. Bioresource Technology 98: 1489-1493.

Danesi, E. D. G., Rangel-Yagui, C. O., Sato, S. and de Carvalho, J. C. M. (2011) Growth and content of Spirulina platensis biomass chlorophyll cultivated at different values of light intensity and temperature using different nitrogen sources. Brazilian Journal of Microbiology 42: 362-373.

Deng, R. and Chow, T. J. J. (2010) Hypolipidemic, antioxidant, and antiinflammatory activities of microalgae Spirulina. Cardiovascular Therapeutics 28: 33-45.

Devanathan, J. and Ramanathan, N. (2013) Utilization of seawater as a medium for mass production of Spirulina platensis-A novel approach. International Journal of Recent Scientific Research 4: 597-602.

Dineshkumar, R., Narendran, R. and Sampathkumar, P. (2016) Cultivation of Spirulina platensis in different selective media. Indian Journal of Geo Marine Sciences 45(12): 1749-1754.

Duan, W., Meng, F., Lin, Y. and Wang, G. (2017) Toxicological effects of phenol on four marine microalgae. Environmental Toxicology and Pharmacology.

El-Sheekh, M., Ghareib, M. M. and Abou-el-souod, G. W. (2012) Biodegradation of phenolic and polycyclic aromatic compounds by some algae and cyanobacteria. Bioremediation and Biodegradation 3: 1-9.

Estak, Z. (1963) Changes in the chlorophyll content as related to photosynthetic activity and age of leaves. Photochemistry and Photobiology2: 101-110.

Fitzgerald, D. J., Stratford, M. and Gasson, M. J. (2004) The potential application of vanillin in preventing yeast spoilage of soft drinks and fruit juices. Journal of Food Protection 67: 391-395.

Fries, L. (1974) Growth stimulation of axenic red algae by simple phenolic compounds. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 15: 1-9.

Gallage, N. J., Jorgensen, K., Janfelt, C., Nielsen, A. J., Naake, T., Dunski, E., Dalsten, L., Grisoni, M. and Moller, B. L. (2018) The intracellular localization of the vanillin biosynthetic machinery in pods of Vanilla planifolia. Plant and Cell Physiology 59(2): 304-318.

Ghobadian, S., Gangidoost. H., Ayatee, B. and Soltani, N. (2015) Investigating the effect of aeration and aqueous factors on quantitative and qualitative indices of Spirulina microalgae biomass as a candidate for treatment of sewage. Journal of Aquatic Ecology 5(2): 87-99.

Gimeno, O., Carbajo, M., Beltrán, F. J. and Rivas, F. J. (2005) Phenol and substituted phenols AOPs remediation. Journal of Hazardous Materials 119: 99-108.

Goksan, T., Zekeriyaoglu, A. and Ülknur, A. K. (2006) The growth of Spirulina platensis in different culture systems under greenhouse condition. Turkish Journal of Biology 31: 47-52.

Hartenstein, R. (1982) Effect of aromatic compounds, humic acids and lignins on growth of the earthworm Eisenia foetida. Soil Biology and Biochemistry 14: 595-599.

Heng, L., Yanling, Y., Weijia, G., Xing, L. and Guibai, L. (2008) Effect of pretreatment by permanganate/chlorine on algae fouling control for ultrafiltration (UF) membrane system. Desalination 222(1-3): 74-80.

Hodges, D. M., DeLong, J. M., Forney, C. F. and Prange, R. K. (1999) Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Plantae 207: 604-611.

Hoseini, S. M. and Mozafari, M. R. (2013) Nutritional and medical applications of Spirulina. Microalgae. Mini Review in Medicinal Chemistry 13(8): 1231-1237.

Jenkins, A. and Erraguntla, N. K. (2014) Vanillin. In: Encyclopedia of Toxicology (Ed. Wexler, P.) 912-914. Academic Press, Oxford.

Jimenez, C. and Niell, F. X. (1991) Growth of Dunaliella viridis Teodoresco: effect of salinity, temperature and nitrogen concentration. Journal of Applied Phycology 3: 319-327.

Johnson, M. K., Johnson, E. J., Macelroy, R. D., Speer, H. L. and Bruff, B. S. (1968) Effects of salts on the halophilic alga Dunaliella viridis. Journal of Bacteriology 95: 1461-1468.

Junli, H., Li, W., Nenqi, R., Li,  L. X.,Fun, S. R. and Guanle, Y. (1997) Disinfection effect of chlorine dioxide on viruses, algae and animal planktons in water. Water Research 31(3): 455-460.

Källqvist, T. 1996. Effect of vanillin on the reproduction of Daphnia magna. NIVA (Norwegian Institute for Water Research), Report no. G001/1a, Norway.

Kepekçi, R. A. and Saygideger, S. D. (2012) Enhancement of phenolic compound production in Spirulina platensis by two-step batch mode cultivation. Journal of Applied Phycology 24: 897-905.

Klekner, V. and Kosaric, N. (2008) Degradation of phenols by algae. Environmental Technology 13: 493-501.

Lee, W. C., Mahmud, R., Pillai, S., Perumal, S., Lee, W. C., Mahmud, R., Pillai, S., Perumal, S. and Ismail, S. (2012) Antioxidant activities of essential oil of Psidium Guajava L. leaves. APCBEE Procedia 2: 86-91.

Madkour, F. F., Kamil, A. E. W. and Nasr, H. S. (2012) Production and nutritive value of Spirulina platensis in reduced cost media. Egyptian Journal of Aquatic Research 38: 51-57.

Mazang-Ghasemi, S., Einali, A., Valizadeh, J. and Noroozifar, M. (2016) Tolerance induction to stress caused by lavender (Lavandula angustifolia) extracts in the microalga Dunaliella salina through metabolic modifications and β-carotene production. Iranian Journal of Plant Biology 8(27): 63-80.

Miazek, K. (2012) The effect of vanillin on Chlorella growth.W: Technical University of Lodz, Department of Bioprocess Engineering, Wolczanska 213, Lodz, Poland.

Miazek, K., Goffin, D., and Richel, A. (2013) Growth of Chlorella in vanillin enriched medium. 6th International Conference on Green and Sustainable Chemistry, Nottingham, England.

Moraes, C. C., Sala, L., Cerveira, G. P. and Kalil, S. J. (2011) C-Phycocyanin extraction from Spirulina platensis wet biomass. Brazilian Journal of Chemical Engineering 28: 45-49.

Narayan, M. S., Manoj, G. P., Vatchravelu, K., Bhagyalakshmi, N. and Mahadevaswamy, M. (2005) Utilization of glycerol as carbon source on the growth, pigment and lipid production in Spirulina platensis. International Journal of Food Sciences and Nutrition 56: 521-528.

Pan-Utai, W., Kahapana, W. and Iamtham, S. (2017) Extraction of C-phycocyanin from Arthrospira (Spirulina ) and its thermal stability with citric acid. Journal of Applied Phycology 30(1): 231-242.

Pinto, G., Pollio, A., Previtera, L. and Temussi, F. (2002) Biodegradation of phenols by microalgae. Biotechnology Letters 24: 2047-2051.

Pisoschi, A. M. and Negulescu, G. P. (2011) Methods for total antioxidant activity determination: A review. Biochemistry and Analytical Biochemistry 1: 1-10.

Raoof, B., Kaushik, B. D. and Prasanna, R. (2006) Formulation of a low-cost medium for mass production of Spirulina. Biomass and Bioenergy 30: 537-542.

Régnier, P., Bastias, J., Rodriguez-Ruiz, V., Caballero-Casero, N., Caballo, C., Sicilia, D., Fuentes, A., Maire, M., Crepin, M., Letourneur, D., Gueguen, V., Rubio, S. and Pavon-Djavid, G. (2015) Astaxanthin from Haematococcus pluvialis prevents oxidative stress on human endothelial cells without toxicity. Marine Drugs 13: 2857-2874.

Samanthakamani, D. and Thangaraju, N. (2015) Potential of freshwater microalgae for degradation of phenol. Indian Journal of Scientific Research and Technology 3: 9-12.

Seo, Y. C., Choi, W. S., Park, J. H., Park, J. O., Jung, K. H. and Lee, H. Y. (2013) Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Science 14(1): 1778-1787.

Scragg, A. H. (2006) The effect of phenol on the growth of Chlorella vulgaris and Chlorella VT-1. Enzyme and Microbial Technology 39: 796-799.

Semple, K. T. and Cain, R. B. (1996) Biodegradation of phenols by the alga Ochromonas danica. Applied and Environmental Microbiology 62: 1265-1273.

Setyaningsih, I., Bintang, M. and Madina, N. (2015) Potentially antihyperglycemic from biomass and phycocyanin of Spirulina fusiformis voronikhin by in vivo test. Procedia Chemistry 14: 211-215.

Shalaby, E. A. and Shanab, S. M. M. (2013) Comparison of DPPH and ABTS assays for determining antioxidant potential of water and methanol extracts of Spirulina platensis. Indian Journal of Geo-Marine Sciences 42: 556-564.

Shariati, M. and Lilley, R. M. (1994) Loss of intracellular glycerol from Dunaliella by electroporation at constant osmotic pressure: subsequent restoration of glycerol content and associated volume changes. Plant, Cell and Environment 17: 1295-1304.

Sharma, K. K., Schuhmann, H. and Schenk, P. M. (2012) High lipid induction in microalgae for biodiesel production. Energies 5: 1532-1553.

Singh, N. and Singh, J. (2002) An enzymatic method for removal of phenol from industrial effluent. Preparative Biochemistry and Biotechnology 32: 127-133.

Soni, S. K., Agrawal, K., Srivastava, S. K., Gupta, S. and Pankaj, C. K. (2012) Growth performance and biochemical analysis of Spirulina platensis under different culture conditions. Journal of Algal Biomass Utilization 3(1): 55-58.

Usharani, G., Saranraj, P. and Kanchana, D. (2012) In vitro cultivation of Spirulina platensis using rice mill effluent. International Journal of Pharmaceutical and Biological Archives 3(6): 1518 -1523.

Vanilin, O. S. (1996) Forward introduction. UNEP Publications.

Walter, A., de Carvalho, J. C., Soccol, V. T., de Faria, A. B. B., Ghiggi, V. and Soccol, C. R. (2011) Study of phycocyanin production from Spirulina platensis under different light spectra. Brazilian Archives of Biology and Technology 54(4): 675-682.

Walton, N. J., Mayer, M. J. and Narbad, A. (2003) Vanillin. Phytochemistry 63: 505-515.

Walton, N. J., Narbad, A., Faulds, C. B. and Williamson, G. (2000) Novel approaches to the biosynthesis of vanillin. Current Opinion in Biotechnology 11: 490-496.

Wu, L. C., Ho, J. A., Shieh, M. C. and Lu, I. W. (2005) Antioxidant and antiproliferative activities of Spirulina and Chlorella water extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(10): 4207-4212.

Xu, P., Hua, D. and Ma, C. (2007) Microbial transformation of propenylbenzenes for natural flavour production. Trends in Biotechnology 25: 571-576.

Yaakob, Z., Ali, E., Zainal, A., Mohamad, M. and Takriff, M. S. (2014) An overview : biomolecules from microalgae for animal feed and aquaculture. Journal of Biological Research (Thessalon) 21: 1-10.

Zarrouk, C. (1966) Contribution to the study of cyanobacteria, influence of various physical and chemical factors on growth and photosynthesis is Spirulina maxima. PhD thesis, University of Paris, Paris, France.