بهینه‌سازی القاء جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم و باززایی گیاهچه در گلابی اروپایی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

2 استاد (هیات علمی)، گروه علوم باغبانی و فضای سبز، دانشکده کشاورزی ، دانشگاه فردوسی مشهد

3 دانشیار(هیات علمی)، گروه بیوتکنولوژی و اصلاح گیاهان زراعی، دانشکده کشاورزی ، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

چکیده

به منظور بررسی القای جنین‌‌زایی سوماتیکی، ریز‌نمونه‌های کوتیلدون بالغ، نابالغ و آندوسپرم ارقام نظنزی، قوسی، درگزی و ویلیامز حاصل از میوه‌های 40 تا 100 روز پس از گرده‌افشانی، در محیط کشت‌‌های MS)، SH و (White حاوی غلظت‌‌های مختلف 2,4-D (3/2، 9 و 18 میکرومولار) کشت شدند. سپس به منظور افزایش بازدهی جنین‌‌زایی، آندوسپرم رقم قوسی به عنوان ریز‌نمونه برگزیده از آزمایش قبل، در محیط کشت MS با تیمار‌های هورمونی شامل 2,4-D (0-2 میکرومولار) و تیدیازورون (0-9 میکرومولار) کشت شد. به منظور جوانه‌زنی و باززایی گیاه، از تیمار‌های شاهد، 150 میلی‌گرم بر لیتر سکوسترین آهن، 2 میلی‌گرم بر لیتر نیترات نقره و 1 میلی‌گرم بر لیتر اسید جیبرلیک استفاده شد. در نهایت، جهت سازگاری گیاهان، دو آزمایش متوالی شامل تاثیر مایکوریزا (Glomus mosseae) (صفر و 25/0 گرم بر کیلوگرم بستر کشت)، سپس دو رویه‌ی کود ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌آبیاری بررسی شد. نتایج آزمایشات نشان داد که تنها آندوسپرم رقم قوسی حاصل‌ از میوه‌های برداشت شده در 50 روز بعد از گرده‌افشانی در محیط کشت MS، جنین‌های سوماتیکی مستقیم ایجاد کرد. 5/0 میکرومولار 2,4-D بالاترین فراوانی تولید جنین‌های سوماتیکی (66/12درصد) را داشت و بالاترین فراوانی تولید جنین هنجار در همین تیمار (71 درصد) و تیمار 5/0 میکرومولار2,4-D + 5/4 میکرومولار تیدیازورون (70 درصد) بدست آمد. بالاترین میزان جوانه‌زنی (66/9 درصد) و باززایی گیاه (12درصد) در سکوسترین آهن بدست آمد. در مرحله‌ی سازگاری، استفاده از مایکوریزا و رویه‌ی دوم کود آبیاری بهترین شناخته شدند. در مجموع، از روش ارائه شده در این تحقیق می‌توان در مطالعات مولکولی این رقم استفاده نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimization of direct somatic embryogenesis induction and plantlet regeneration in European Pear

نویسندگان [English]

  • Atefe Ameri 1
  • Golamhossein Davarynejad 2
  • Nasrin Moshtaghi 3
  • Ali Tehranifar 2
1 Department of Horticultural science and Landscape, Agriculture Faculty, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
2 Prof.,Department of Horticultural science and Landscape, College of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
3 Assoc. Prof، Department of Biotechnology and Plant Breeding, College of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
چکیده [English]

To evaluate somatic embryogenesis (SE) induction, mature, immature cotyledon and endosperm explants of Natanzi, Ghosi, Dar Gazi, and Williams cultivars obtained from 40-100 days after pollination were cultured into the White, SH, and MS media containing (2.3, 9 and 18 µM) 2, 4-D. Then, to enhance the efficiency of direct SE, Ghosi cultivar endosperm, the preferable explant was known in before experiment, was cultured in MS medium with hormonal treatments consisted of 2,4-D (0-2 µM) and TDZ (0-9 µM). To germinate and plant recovery, MS medium with different treatments consisted of control, 150 mg/L Fe-EDDHA, 2 mg/L AgNO3, and 1mg/L GA3 were used. Finally, for plant adaptation, two successive experiments, the effect of mycorrhizae at 0 and 0.25 g/Kg levels and the comparison of two fertigation procedures, were separately carried out. The results revealed, the only endosperm of Ghosi cultivar in MS medium produced direct somatic embryos. 0.5 µM 2,4-D had the highest frequency of somatic embryos production (12.66%). The highest frequency of normal embryo obtained in 0.5 µM 2,4-D (71%) and 0.5 µM 2,4-D + 4.5 µM TDZ (70%). The highest germination (9.66%) and plant recovery (12%) obtained in Fe-EDDHA. In the adaptation phase, the usage of mycorrhizae and the second procedure of fertigation were known preferable. Overall, the method presented in this study can be used in molecular studies of this cultivar.

کلیدواژه‌ها [English]

  • 2
  • 4-D
  • Fe-EDDHA
  • Ghosi cultivar
  • Mycorrhizae

معمولاً گلابی‌ در تمام مناطق معتدلۀ جهان پرورش می‌یابد و مهم‌ترین محصول این مناطق پس‌از انگور و سیب است. گونۀ Pyrus communis، گلابی غالب در اروپا، آمریکای شمالی، آمریکای جنوبی، آفریقا و استرالیا محسوب می‌شود و گونۀ P. pyrifolia در مناطق مرکزی و جنوبی ژاپن، چین و جنوب آسیا چنین جایگاهی را دارد (Hancock and Lobos, 2008). در گونه‌‌های درختی که هتروزیگوتی و دورۀ جوانی طولانی سبب می‌شود بهبود ژنتیکی با استفاده از روش‌های مرسوم با مشکل مواجه شود، توسعۀ سیستم‌‌های کارا برای تغییر شکل و دگرگونی این گونه‌ها سبب تسریع فرایند اصلاح می‌شود. موفقیت این روش‌ها به در‌‌دسترس‌بودن روش کارا و تکرار‌پذیر برای القای شاخه‌های نابجا بستگی دارد و در بسیاری از موارد، نبود سیستم‌های باززایی مشکلی عمده برای کاربرد فناوری انتقال ژن در گونه‌های درختان میوه‌دار محسوب می‌شود (Caboni et al., 2002). پاسخ به تیمارهای باززایی عموماً به ژنوتیپ وابسته است و این امر، استقرار روش باززایی برای ژنوتیپ‌های جدید را به فرایندی زمان‌بر تبدیل می‌کند (Caboni et al., 2002)؛ بنابراین، لازم است روش مناسب باززایی بهینه شود. جنین‌‌‌زایی سوماتیکی ابزاری کارا برای مطالعه‌های تغییر شکل ژنتیکی شناخته (Ashwani et al., 2017) و به‌عنوان روشی پایه‌ در علم زیست‌فناوری گونه‌های چوبی استفاده می‌شود (Silvestri et al., 2016). Farhadi Kolahkaj و همکاران (2018) جنین‌زایی سوماتیکی در خرما (رقم خضراوی) را وابسته به ریزنمونۀ برگ و میوۀ نارس و تنظیم غلظت اکسین و سیتوکینین دانسته‌اند. Sabooni و Shekafandeh (2017) جنین‌زایی سوماتیکی را در Blackberry متعلق به خانوادۀ Rosaceae گزارش کرده‌ا‌ند. آنها بهترین شرایط برای جوانه‌زنی جنین‌ها و رشد طبیعی گیاهچه را استفاده از 1/2MS (Murashige and Skoog, 1962) تکمیل‌شده با بنزیل‌آدنین، جیبرلیک‌اسید و نفتالین‌استیک‌اسید دانسته‌اند. Pesce و Rugini (2004) افزایش میزان کلات آهن در محیط‌کشت را سبب افزایش تعداد جنین سوماتیکی در پایۀ Colt (گیلاس) دانسته‌اند. Cheong و Pooler (2004) در مطالعۀ جنین‌زایی سوماتیکی روی Prunus inciseنتیجه گرفته‌اند هورمون‌های بنزیل‌آدنین، جیبرلیک‌اسید و تیدیازورون بازدارنده‌اند و در مقابل، غلظت 3-2 درصد ساکارز و گلوکز مفیدند. مشکلی که در جنین‌زایی سوماتیکی عمدۀ گونه‌ها گزارش شده‌ است، به بلوغ طبیعی آنها مربوط است (Sabooni and Shekafandeh, 2017). تولید اتیلن یکی از موانع رشد‌و‌نمو جنین سوماتیکی است (Kapoor et al., 2018; Zhu et al., 2018). از سوی دیگر، در محیط‌کشت MS آهن به‌شکل کلات آهن در اختیار ریزنمونه قرار می‌گیرد؛ این شکل از آهن پایا نیست و بسیار زود از دسترس خارج می‌شود؛ زیرا به فسفات‌آهن تبدیل می‌شود (Dalton et al., 1983). بسیاری از مسیرهای متابولیکی ازجمله زنجیرۀ انتقال الکترون فتوسنتز و تنفس، بیوسنتز DNA، لیپید، تنظیم‌کننده‌های رشدی مانند اکسین و اتیلن و تثبیت نیتروژن به آهن وابسته‌اند (Curie et al., 2009). جایگزینی کلات آهن با سکوسترین آهن (Fe-EDDHA) بر ریزازدیادی اثر مثبت دارد (Antonopoulos et al., 2007) و Fe-EDDHA در تشکیل شاخۀ نابجا، ریشه‌زایی شاخه‌ها و در فرایند جنین‌زایی مؤثر است (Trejgell et al., 2012). 2,4-D اکسینی است که اغلب در جنین‌زایی سوماتیکی استفاده می‌شود. 2,4-D در القای جنین‌زایی سوماتیکی نقش کلیدی دارد؛ زیرا این تنظیم‌کنندۀ رشد موجب بیان ژن‌های مربوط به تنش می‌شود و سایر محرک‌های جنین‌زایی را تحریک می‌کند. 2,4-D از طریق فعالیت اکسینی قوی خود با نفوذ و تأثیر‌گذاری بر متابولیسم درونی سایر فیتوهورمون‌ها، جنین‌زایی سوماتیکی را به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم تنظیم می‌کند (Quiroz-Figueroa et al., 2006). همچنین مطالعه‌ها مفید‌بودن تیدیازورون در جنین‌زایی سوماتیکی را نشان می‌دهند (Landi and Mezzetti, 2006)؛ علاوه‌بر فعالیت شبه‌سایتوکینینی تیدیازورون، این ماده متعادل‌کنندۀ میزان اکسین درونی معرفی شده است؛ به‌طوری‌که شواهد آزمایشگاهی نشان می‌دهند سنتز مجدد اکسین را از طریق افزایش میزان ایندول‌استیک‌اسید و پیش‌مادۀ آن، تریپتوفان، تحریک می‌کند (Landi and Mezzetti, 2006). تاکنون مطالعه‌های کاملی انجام نشده‌اند که به تولید گیاه به روش جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم در گیاه گلابی (Pyrus communis) منجر شوند. تنها مطالعه‌های انجام‌شده را Mehra و Jaidka (1985) و Qingrong و همکاران (2003) انجام داده‌اند که تنها درصد تشکیل جنین سوماتیکی غیرمستقیم را گزارش کرده‌اند و سیستم کارایی را معرفی نکرده‌اند که به تولید گیاه در گلابی اروپایی منجر شود؛ ازاین‌رو، درﺣﺎل‌ﺣﺎﺿﺮ به‌دست‌آوردن سیستم ﺑﻬﯿﻨﻪ ﺑﺎ ﺗﻮان ﺗﻮﻟﯿﺪ جنین و ﮔﯿﺎهچۀ ﺑﺎززاییﺷﺪه ﺑﺮای جنین‌زایی گلابی گامی در راستای افزایش سرعت تکثیر و فائق‌آمدن بر مشکل بهبود ژنتیکی در این گونه است. ﻫﺪف مطالعۀ ﺣﺎﺿﺮ، ﺑﻬﯿﻨﻪﺳﺎزی شرایط ﮐﺸﺖ ﺑﺎﻓﺖ در ﺑﺎززاﯾﯽ ﮔﯿﺎه گلابی به روش ﺟﻨﯿﻦ‌زاﯾﯽ ﺳﻮﻣﺎﺗﯿﮑﯽ مستقیم از طریق استفاده از ریزنمونۀ مستعد و کاربرد تنظیم‌کننده‌ها در مرحلۀ القا و همچنین بررسی اثر بازدارندۀ عمل اتیلن در مرحلۀ باززایی و جوانه‌زنی جنین سوماتیکی است؛ درنهایت، سازگاری و رشد بعدی گیاهان باززایی‌شده بررسی می‌شود. بهینه‌سازی این دستورعمل ﺑﺮای ﻣﻮﻓﻘﯿﺖﻫﺎی ﺑﻌﺪی در اﻣﺮ اﻧﺘﻘﺎل ژن اﯾﻦ ﮔﯿﺎه ﺑﺴﯿﺎر ﻣﻬﻢ است.

 

مواد و روش‌ها.

مواد گیاهی: آندوسپرم، کوتیلدون نابالغ و بالغ ریزنمونه‌های انتخابی در مطالعۀ حاضر بودند. میوه‌های گلابی اروپایی شامل ژنوتیپ‌های قوسی، نطنزی، درگزی (سه رقم گلابی بومی ایران) و ویلیامز (مهم‌ترین رقم گلابی جهان)، 40، 50، 60، 70، 80 و 100 روز پس‌از گرده‌افشانی جمع‌آوری شدند.

.روش ضدعفونی و انتخاب زمان مناسب برای تهیۀ ریزنمونه: میوه‌ها پس‌از برداشت به‌مدت سه روز در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد، درون دستمال مرطوب و در شرایط تاریکی قرار داده ‌شدند. پس‌از سه روز، میوه‌‌ها به‌مدت 45 دقیقه زیر آب جاری قرار داده ‌شدند و سپس به تیمارهای ضدعفونی (جدول 1) منتقل شدند. درنهایت، زیر هود لامینار سه بار با آب مقطر استریل به‌طور کامل شسته شدند. پس‌ازآن، میوه‌ها برش زده و قسمت‌های کوتیلدون و آندوسپرم جدا شدند. ریزنمونه‌ها در محیط‌کشت استقرار با فرمولاسیون MS (Murashige and Skoog, 1962) و 3 درصد ساکارز کشت شدند. در آزمایش ضدعفونی، درصد و سرعت آلودگی باکتریایی اندازه‌گیری شد.

سرعت آلودگی طبق رابطۀ 1 محاسبه شد:

رابطۀ 1

BCR =∑

BCR: سرعت آلودگی باکتریایی، Ni: تعداد ریزنمونه‌های آلودۀ هر تیمار در هر روز، Di: شمارۀ روز

به‌منظور انتخاب بهترین زمان برای تهیۀ ریز‌نمونه، وجود آندوسپرم وکوتیلدون نابالغ و بالغ در میوه‌های برداشت‌شده در دوره‌های مختلف و زنده‌مانی آنها در محیط استقرار بررسی شد.

 

 

جدول 1- تیمارهای ضدعفونی به‌کاررفته در آزمایش

شماره تیمار

تیمارهای ضدعفونی

1

هیپوکلریت‌سدیم 5 درصد به‌مدت 10 دقیقه بدون استفاده از کلرید‌جیوه

2

هیپوکلریت‌سدیم 5 درصد به‌مدت 10 دقیقه، کلرید‌جیوه (1/0درصد) به‌مدت 2 دقیقه

3

هیپوکلریت‌سدیم 5 درصد به‌مدت 10 دقیقه، کلرید‌جیوه (1/0 درصد) به‌مدت 5 دقیقه

4

هیپوکلریت‌سدیم 5 درصد به‌مدت 10 دقیقه، کلرید‌جیوه (1/0 درصد) به‌مدت 8 دقیقه

5

شاهد

6

کلرید‌جیوه (1/0 درصد) به‌مدت 2 دقیقه

7

کلرید‌جیوه (1/0 درصد) به‌مدت 5 دقیقه

8

کلرید‌جیوه (1/0 درصد) به‌مدت 8 دقیقه

9

5 درصد هیپوکلریت‌سدیم به‌مدت 2 دقیقه بدون استفاده از کلریدجیوه

10

5 درصد هیپوکلریت‌ سدیم به‌مدت 2 دقیقه، کلرید‌جیوه (1/0 درصد) به‌مدت 2 دقیقه

 


.انتخاب ریزنمونۀ مستعد و محیط‌کشت در القای جنین‌زایی مستقیم: آندوسپرم، کوتیلدون نابالغ (50 روز پس‌از گرده‌افشانی) و بالغ (100 روز پس‌از گرده‌افشانی) چهار رقم گلابیاروپایی شامل نطنزی، قوسی، درگزی و ویلیامز به‌منظور شناسایی ریزنمونۀ مستعد جنین‌‌زایی مستقیم پس‌از ضدعفونی در بهترین تیمار ضدعفونی مشخص‌شده در آزمایش پیش، در محیط‌‌کشت‌‌های MS (Murashige and Skoog, 1962)، SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) و White (White, 1954) که با تیمار‌های تنظیم‌کنندۀ رشدی، ساکارز 3 درصد، کازئین‌هیدرولیزات 1/0 درصد و آگار 6/0 درصد تکمیل شده بودند در پتری‌دیش‌های 6 سانتی‌متری کشت داده ‌شدند. تیمارهای تنظیم‌کنندۀ رشدی شامل 2,4-D با غلظت‌های (3/2، 9 و 18 میکرومولار) بودند. اسیدیتۀ محیط پیش‌از اتوکلاو روی 8/5 تنظیم و محیط به‌مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجۀ سانتی‌گراد اتوکلاو شد. کشت‌‌ها در دمای 1±23 درجۀ سانتی‌گراد و شرایط تاریکی نگهداری شدند؛ در این مرحله از آزمایش، درصد جنین‌‌زایی سوماتیکی پس‌از 30 روز ثبت شد.

بهینه‌سازی تنظیم‌کنندۀ رشدی در القای جنین‌زایی مستقیم: آزمایش بار دیگر بر اساس بهترین ریزنمونه و محیط‌کشت مشخص‌شده از آزمایش پیش با تیمارهای تنظیم‌کنندۀ رشدی تکرار شد. به‌ این منظور، ریزنمونۀ آندوسپرم رقم قوسی در محیط‌کشت MS دارای تیمارهای تنظیم‌کنندۀ رشدی شامل 2,4-D (صفر، 5/0، 1، 5/1 و 2 میکرومولار) و تیدیازورون (صفر، 5/4، 5/5 و 9 میکرومولار)کشت شد. تیدیازورون استریل و پس‌از اتوکلاو به محیط‌کشت اضافه شد. کشت‌ها در دمای 1±23 درجۀ سانتی‌گراد و شرایط تاریکی نگهداری شدند. شاخص‌‌های اندازه‌گیری‌شده در این آزمایش شامل درصد جنین‌زایی مستقیم و درصد تولید جنین هنجار پس‌از 30 روز ثبت شدند (ساختار‌هایی که نکروزه نشده و توسعه یافته بودند، جنین هنجار در نظر گرفته شدند).

باززایی گیاه از جنین‌های سوماتیکی: پس‌از القای جنین‌‌های سوماتیکی مستقیم، آنها به محیط‌کشت جوانه‌زنی و باززایی منتقل شدند. محیط MS (Murashige and Skoog, 1962)، محیط‌کشت جوانه‌زنی و باززایی گیاه بود که با تیمارهای باززایی، ساکارز 3 درصد و آگار 8/0 درصد تکمیل شد. تیمارهای باززایی شامل 150 میلی‌گرم‌برلیتر سکوسترین ‌آهن، 2 میلی‌گرم‌برلیتر نیترات‌نقره، 1 میلی‌گرم‌بر‌لیتر جیبرلیک‌اسید و همچنین MS بدون تیمار (شاهد) بودند. این تیمار‌ها بر اساس مطالعه‌های گذشته (Pesce and Rugini, 2004; Montero-Cortés et al., 2010; Sadeghi et al., 2015) انتخاب شدند. جیبرلیک‌اسید و نیترات‌نقره استریل و پس‌از اتوکلاو‌شدن به محیط‌کشت اضافه شدند. پتری‌دیش‌‌ها به شرایطی با دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. میزان شدت نور روی 40 میکروانیشتن بر مترمربع در ثانیه تنظیم شد. دو هفته بعد، جوانه‌زنی جنین‌ها اتفاق افتاد و برای رشد بهتر به لولۀ آزمایش منتقل شدند. شاخص‌های درصد جوانه‌‌زنی، درصد باززایی گیاه و وضعیت عمومی گیاه (به‌شکل چشمی) در این آزمایش مطالعه شدند.

سازگاری گیاهان باززایی‌شده: گیاهان باززایی‌شده پس‌از دو ماه رشد در محیط‌کشت باززایی به بستر کشت‌های حاوی مخلوط کوکوپیت:پرلیت (2:1) (v/v) منتقل شدند. پیش‌از انتقال، ریشه‌های گیاهان زیر شیر آب شسته شدند تا محیط‌کشت روی ریشه‌ها باقی نماند و باعث آلودگی نشود. در این مرحله، دو آزمایش متوالی شامل تأثیر مایکوریزا (صفر و 25/0 گرم‌بر‌کیلوگرم بستر کشت) و سپس دو رویۀ کود‌آبیاری به‌طور جداگانه بررسی شدند. به‌منظور بررسی اثر مایکوریزا بر سازگار‌شدن گیاه، در زمان انتقال و پس‌از شستشوی ریشه‌ها، 25/0 گرم مایکوریزا (Glomus mosseae) به‌ازای هر کیلوگرم بستر کشت کوکوپیت:پرلیت در تماس با ریشه قرار گرفت و در تیمار شاهد از مایکوریزا استفاده نشد. گیاهان به‌مدت یک هفته، سه روز یک‌بار با 20 میلی‌لیترآب شیر آبیاری شدند و سپس از کود‌آبیاری استفاده شد. به‌منظور آزمایش کودآبیاری، گیاهانی که در مدت یک هفته بهتر رشد کرده بودند (برگ‌ها شاداب‌تر و سبزتر بودند و برگ‌های جدید رشد کرده بودند) انتخاب و به دو گروه تقسیم شدند. هر گروه شامل 10 گیاه بود. دو رویه در این آزمایش به کار گرفته شد: رویۀ اول شامل کودآبیاری با 1/4MS؛ رویۀ دوم شامل کودآبیاری به‌مدت دو هفته با کودی با فرمولاسیون (N: P2O5: K2O) (10: 52: 10) و پس‌از دو هفته، کود‌آبیاری با کودی با فرمولاسیون 20 N-20 P2O5-20 K2O. در آزمایش اول، تعداد برگ‌های جدید رشد‌یافته و میزان رشد جدید (میلی‌متر) و در آزمایش دوم، درصد سازگاری وضعیت عمومی گیاه و میزان رشد جدید (میلی‌متر) بررسی شد.

.طرح آزمایشی و تجزیه‌وتحلیل داده‌ها: به‌منظور تجزیه‌وتحلیل داده‌ها از آزمون‌های t- student و F استفاده شد.آزمون t- student برای مقایسۀ میانگین در آزمایش انتخاب ریزنمونۀ مستعد و محیط‌کشت و آزمایش‌های مربوط به سازگاری گیاهان باززایی‌شده (تأثیر مایکوریزا و کود‌آبیاری) با نرم‌افزار SPSS.16 انجام شد. آزمون F برای تجزیه واریانس آزمایش‌های انتخاب زمان مناسب برای تهیۀ ریزنمونه، ضدعفونی، بهینه‌سازی تنظیم‌کننده‌های رشدی در القای جنین‌زایی و باززایی گیاه در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار با نرم‌افزار SAS 9.1 انجام شد. ﻣﻘﺎﯾﺴـۀ ﻣﯿـﺎﻧﮕﯿﻦ داده‌های تحلیل‌شده با آزمون F ﺑـﻪ روش آزمون چند‌دامنه‌ای دانکن (LSR) اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. arcsin √x برای نرمال‌کردن دادهﻫـﺎیی اﺳــﺘﻔﺎده ﺷــﺪ که به‌شکل درﺻﺪ بودند.
نتایج و بحث

روش ضدعفونی: طبق جدول 2، استفاده از 5 درصد هیپوکلریت‌سدیم به‌مدت 10 دقیقه و سپس به‌کار‌بردن 1/0 درصد کلرید‌جیوه به‌مدت 8 دقیقه بهترین تیمار ضدعفونی بود. در این تیمار، کمترین میزان آلودگی باکتریایی و سرعت آلودگی مشاهده شد. آلودگی قارچی در هیچ‌یک از تیمارها مشاهده نشد.

 

جدول 2- مقایسۀ میانگین بین تیمارهای ضدعفونی در صفت‌های درصد آلودگی باکتریایی و سرعت آلودگی

سرعت آلودگی

آلودگی باکتریایی (درصد)

شماره تیمار

16/0  ± 003/0d

g 62/0±46/34

1

08/0 ± 003/0 f

46/0±79/22 i

2

27/0  ± 007/0b

±50/47 38/0 c

3

043/0 ± 003/0g

54/16 ± 1/0 j

4

5  ± 0a

90 0±a

5

21/0± 020/0c

56/53 ±53/0 b

6

11/0±007/0g

83/39  89/0 ±f

7

21/0±006/0c

34/42 51/0±  e

8

20/0±006/0c

02/45 ± 5E15- d

9

053/0±003/0g

89/28  ± 23/0h

10

مقادیر، میانگین 3 تکرار±خطای استاندارد هستند. حرف‌های متفاوت، تفاوت معنادار با آزمون دانکن در سطح P<0.05 را نشان می‌دهند.

 

انتخاب زمان مناسب برای تهیۀ ریزنمونه: ابتدا زمان‌های مختلف برداشت میوه برای تهیۀ ریزنمونه ازنظر وجود آندوسپرم و کوتیلدون نابالغ و بالغ بررسی شدند، سپس برای انتخاب زمان دقیق تهیۀ ریزنمونه، زنده‌مانی کوتیلدون نابالغ، بالغ و آندوسپرم در محیط‌کشت مطالعه شد. نتایج تجزیه واریانس نشان دادند زمان‌های مختلف برداشت بر زنده‌مانی ریزنمونه‌ها در محیط اختلاف معناداری دارند (P<0.01). در زمان‌های 40 و 80 روز پس‌از گرده‌افشانی، پاسخی در هیچ‌کدام از ریزنمونه‌ها مشاهده نشد؛ بنابراین، این زمان‌ها در تجزیه‌وتحلیل داده‌ها استفاده نشدند (جدول 3). در بین زمان‌های مورد‌مطالعه، 50 روز پس‌از گرده‌افشانی بهترین زمان برای نمونه‌گیری بود (جدول 3)؛ زیرا تشریح میوه‌ها مشخص کرد در این مرحله از رشد میوه، آندوسپرم بخش عمدۀ بذر را تشکیل می‌دهد. از سوی دیگر، آندوسپرم و کوتیلدون نابالغ در این زمان به‌خوبی در محیط‌کشت رشد کردند؛ به‌طوری‌که به‌خوبی متورم شدند و کمترین میزان مواد فنولی را داشتند. 66/33 درصد ریزنمونۀ بالغ کوتیلدونی که در 100 روز پس‌از گرده‌افشانی برداشت شده بود، در محیط استقرار زنده ماند؛ بنابراین، ریزنمونۀ بالغ کوتیلدونی از میوه‌های برداشت‌شده در 100 روز پس‌از گرده‌افشانی انتخاب شد.

 

 

جدول 3- ارزیابی پاسخ‌های موردبررسی در انتخاب زمان مناسب برای تهیۀ ریزنمونه

ویژگی‌های بررسی‌شده

تعداد روز پس‌از گرده‌افشانی

50

60

70

100

وجود آندوسپرم در بذر

+

+

-

-

وجود کوتیلدون نابالغ در بذر

+

+

+

-

وجود کوتیلدون بالغ در بذر

-

-

-

+

زنده‌مانی کوتیلدون نابالغ در محیط (درصد)

95 a

63 b

0 c

0

زنده‌مانی کوتیلدون بالغ در محیط (درصد)

0b

0b

0b

66/33 a

زنده‌مانی آندوسپرم در محیط (درصد)

a66/96

0b

0b

0

پاسخ مربوط به داده‌های کیفی به‌شکل مثبت (وجود بافت) یا منفی (‌وجودنداشتن بافت) در نظر گرفته شده است. حرف‌های متفاوت، تفاوت معنادار با آزمون دانکن در سطح P<0.05 را نشان می‌دهند.

 

 

در کشت کوتیلدون‌های نابالغ از میوه‌های برداشت‌شده در 50 روز پس‌از گرده‌افشانی استفاده شد. در دولپه‌ای‌ها، آندوسپرم پایدار نیست و با بلوغ بذر جذب کوتیلدون‌ها می‌شود؛ درنتیجه، بذر نابالغ برای کشت آندوسپرم در دولپه‌ای‌ها ازجمله دانه‌داران استفاده می‌شود. این مسئله در بسیاری از مطالعه‌ها ازجمله گیاهان Azadirachta indica  (Chaturvedi et al., 2003) و Malus domestica (Wallin et al.,1995) عنوان شده است. 50 روز پس‌از گرده افشانی، آندوسپرم قسمت اعظم بذر سیب است (Wallin et al., 1995)؛ این نتیجه با نتایج مطالعۀ حاضر مطابقت دارد. در آزمایش‌های ابتدایی کشت تکه‌های کوتیلدونی مشخص شد زمانی که تکه‌های کوتیلدونی از هر قسمتی از کوتیلدون به‌طور تصادفی برداشت ‌شوند، پاسخ‌های متفاوتی در تکرار‌های یک تیمار مشاهده می‌شوند؛ بنابراین برای کاهش میزان خطا در کشت ریزنمونۀ کوتیلدونی (همان‌طور که در شکل 1 مشخص است) از قسمت‌‌های تعیین‌شده استفاده شد. علت پاسخ متفاوت تکه‌های کوتیلدونی به وجود قطبیت در گیاه نسبت داده می‌شود. قطبیت گیاهی به توزیع نامتقارن استعداد سلولی در امتداد محوری خاص در سلول اشاره می‌کند و برای بسیاری از فرایندها نظیر ارتباط‌های درون‌سلولی، تقسیم سلولی، ریخت‌زایی سلولی و تمایز ضروریست (Dettmer and Friml, 2011). پدیدۀ قطبیت در گیاه به توزیع نامتقارن پروتئین داخل یا روی غشای پلاسمایی بر‌می‌گردد. آنچه انتشار قطبی اکسین را سبب می‌شود، وجود حامل‌های انتشار اکسین از خانوادۀ پروتئین PIN است و ورود اکسین نیز با پروتئین‌های AUX1/LAX تسهیل می‌شود.

 

 

 

شکل 1- ریزنمونه‌های به‌دست‌آمده از میوه‌های برداشت‌شده در 50 روز پس‌از گرده‌افشانی شامل Cot. قسمت‌های کوتیلدونی انتخابی، EN. آندوسپرم

 

 

توزیع نامتقارن اکسین در غشای پلاسمایی به تجمع آن در آپوپلاست منجر می‌شود. وجود پروتئین‌های حساس به اکسین (ABP1) با فعال‌شدن Rho-GTPase همراه است و آنها نقش مخالفی در تنظیم ریخت‌زایی در سلول‌های مجاور دارند؛ به‌این‌ترتیب، پروتئین‌های یادشده قطبیت را در گیاه ایجاد می‌کنند (Dettmer and Friml, 2011).

.انتخاب ریزنمونۀ مستعد و محیط‌کشت در القای جنین‌زایی مستقیم: نتایج آزمون T معناداری اثر محیط‌کشت (P<0.01)را بر جنین‌زایی مستقیم نشان دادند. در تجزیه‌وتحلیل داده‌ها تنها از پاسخ‌های ریز‌‌نمونۀ آندوسپرم رقم قوسی به محیط‌‌کشت‌های مختلف تکمیل‌شده با 3/2 میکرومولار 2,4-D استفاده شد و دیگر ارقام، ریزنمونه‌ها و تیمارهای هورمونی به‌علت پاسخ‌ندادن در نظر گرفته نشدند (جدول 4). این ریزنمونه در محیط‌کشت MS تکمیل‌شده با تیمار هورمونی 3/2 میکرومولار 2,4-D، پتانسیل جنین‌زایی (23/2 درصد) را از خود نشان داد. هیچ پاسخ جنین‌زایی در دیگر محیط‌کشت‌های استفاده‌شده و غلظت‌های بیشتر 2,4-D مشاهده نشد. انتخاب ریزنمونه با پتانسیل ژنتیکی برای جنین‌زایی نخستین گام در مسیر جنین‌‌زایی سوماتیکی است. در مطالعۀ حاضر، ریزنمونه‌‌های کوتیلدون بالغ، نابالغ و نیز آندوسپرم برای شناسایی ریزنمونۀ مستعد جنین‌زایی استفاده شدند. گرچه پاسخ کوتیلدون بالغ در محیط استقرار کم بود، بررسی جنین‌زایی آن ضروری بود. از بین ریزنمونه‌های استفاده‌شده در ارقام موردبررسی، توانایی القای جنین مستقیم سوماتیکی فقط در آندوسپرم رقم قوسی مشاهده شد؛ از‌این‌رو، تنها این ریز‌نمونه مستعد جنین‌زایی مستقیم شناخته شد، زیرا توانست سیگنال‌های خارجی محرک جنین‌زایی را دریافت کند و پاسخ دهد. پیش‌از‌این، باززایی گیاهچه از آندوسپرم در چندین گیاه شامل قهوه (Raghuramulu, 1989)، کیوی (Kin et al., 1990)، Morus alba (Thomas et al., 2000) و گونه‌های دیگر انجام شده است. Pierik (1997) بخش‌هایی از گل، جنین زیگوتی، بساک، دانۀ گرده و بافت آندوسپرم را شروع‌کنندۀ مناسبی برای جنین‌زایی سوماتیکی دانسته است؛ نتایج آزمایش حاضر با مطالعه‌های یادشده مطابقت دارند.

 

.جدول 4- مقایسۀ دو محیط‌کشت بر القای جنین‌زایی مستقیم از آندوسپرم گلابی رقم قوسی با آزمون t- student

جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم (درصد)

محیط‌کشت

23/2 ± 120/0*

MS

088/0 ± 006/0

SH

مقادیر، میانگین 3 تکرار±خطای استاندارد هستند. * معنادار در سطح P<0.01 در قیاس با SH

 

.بهینه‌سازی تنظیم‌کنندۀ رشدی در القای جنین‌زایی مستقیم: نتایج تجزیه واریانس معناداری اثر تنظیم‌کنندۀ ‌رشدی (P<0.01) را بر جنین‌زایی مستقیم و تولید جنین مستقیم هنجار نشان دادند (جدول 5). به‌منظور افزایش بازدهی جنین‌زایی سوماتیکی بر اساس نتایج به‌دست‌آمده از مرحلۀ اول، ریزنمونۀ مستعد جنین‌زایی مستقیم و محیط‌کشت مناسب برای آن انتخاب شد؛ بر این اساس، آندوسپرم رقم قوسی به‌عنوان ریز‌نمونۀ مستعد در محیط‌کشت MS تکمیل‌شده با تیمار‌های القای جنین‌زایی مستقیم کشت داده شد. پاسخ جنین‌زایی تنها در تیمارهای 2,4-D (5/0، 1 و 2 میکرومولار) به‌تنهایی و 5/0 میکرومولار 2,4-D در ترکیب با 5/4 میکرومولار تیدیازورون مشاهده شد و بنابراین در تجزیه‌وتحلیل داده‌ها از تیمارهای هورمونی بدون پاسخ استفاده نشد. سه هفته پس‌از کشت در محیط‌کشت‌های القا، تورم در ریز‌نمونه‌های کشت‌شده مشاهده شد. پس‌از‌آن، ساختارهای مات و کروی‌شکلی بدون واسطۀ کالوس در محیط‌کشت‌های تکمیل‌شده با 2,4-D (5/0، 1 و 2 میکرومولار) به‌تنهایی و 5/0 میکرومولار 2,4-D در ترکیب با 5/4 میکرومولار تیدیازورون مشاهده شدند (شکل 2، شکل 3- a و b). ساختارهای ایجاد‌شده روی ریزنمونه به‌تدریج رشد یافتند و به مرحلۀ کوتیلدونی رسیدند که این مرحله از رشد جنین در تیمارهای 2,4-D (5/0 و 1 میکرومولار) و نیز ترکیب 5/0 میکرومولار 2,4-D و 5/4 میکرومولار تیدیازورون مشاهده شد (شکل 2). ساختارهایی که رشد یافتند و بزرگ شدند به‌عنوان جنین هنجار ثبت شدند؛ اما جنین‌های تولید‌شده در 2 میکرومولار 2,4-D به بلوغ نرسیدند، نکروزه شدند و از بین رفتند. ساختارهای جنینی مشاهده‌شده در مطالعۀ حاضر (شکل 3- a و b) مطابق با تعریف ارائه‌شدۀ Raemakers و همکاران (1995) بودند. این پژوهشگران در مطالعۀ خود بیان کردند جنین‌ها در جنین‌زایی مستقیم حدوداً از مرحلۀ بلوغ و در جنین‌زایی غیرمستقیم حدوداً از مرحله‌ای پیش‌از گلبولی‌شکل توسعه می‌یابند.

 

جدول 5- تجزیه واریانس میانگین مربعات جنین‌زایی مستقیم و جنین مستقیم هنجار رقم قوسی در آزمایش تنظیم‌کنندۀ ‌رشدی

جنین مستقیم هنجار

جنین‌زایی مستقیم

درجۀ آزادی

منبع تغییرات

33/3399**

96/38**

3

تنظیم‌کننده رشدی

83/38

517/0

8

خطا

*معنادار در سطح احتمال 5 درصد، ** معنادار در سطح احتمال 1 درصد، ns بدون ‌تفاوت معنادار

 

 

شکل 2- مقایسۀ میانگین تنظیم‌کننده‌های رشدی بر جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم (درصد) و تولید جنین ‌سوماتیکی هنجار (درصد)؛ مقادیر، میانگین 3 تکرار±خطای استاندارد هستند. حرف‌های متفاوت بیان‌کنندۀ تفاوت معنادار با آزمون دانکن در سطح P<0.05 هستند. PGR1: TDZ (4.5 µM)+2, 4-D (0.5 µM)، PGR2: 2, 4-D (0.5 µM)، PGR3: 2, 4-D (1 µM)، PGR4: 2, 4-D (2 µM)

 

 

شکل 3- القای جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم و باززایی گیاه؛ A و B. القای جنین سوماتیکی و رسیدن به مرحلۀ بلوغ )دارای شاخص متریک 1 میلی‌متر)، C. جوانه‌زنی جنین سوماتیکی گیاه (دارای شاخص متریک 5 میلی‌متر)، D. باززایی گیاه (دارای شاخص متریک 1 سانتی‌متر)

 

 

تاکنون نقش 2,4-D در القای جنین‌زایی به‌خوبی اثبات شده‌ است (Hazra et al., 1989). نتایج آزمایش حاضر با یافته‌های MahendranوBai (2016) و Hazra و همکاران (1989) مطابقت دارند. نتایج MahendranوBai (2016) نشان می‌دهند غلظت‌های کم 2,4-D جنین‌زایی بهتری را در گیاه Malaxis densifloraالقا می‌کنند. در بادام‌زمینی نیز افزایش غلظت 2,4-D سبب کاهش جنین‌زایی می‌شود (Hazra et al.,1989). 2,4-D از طریق فعالیت اکسینی قوی خود با نفوذ و تأثیرگذاری در متابولیسم درونی سایر فیتوهورمون‌ها، جنین‌زایی سوماتیکی را به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم تنظیم می‌کند (Quiroz-Figueroa et al., 2006). نقش مثبت تیدیازورون در فرایند جنین‌زایی سوماتیکی گزارش شده است (Landi and Mezzetti, 2006) که در راستای نتایج مطالعۀ حاضر است.

باززایی گیاه از جنین‌های سوماتیکی: نتایج تجزیه واریانس معناداری اثر تیمارهای باززایی (P<0.01) را بر جوانه‌زنی جنین مستقیم و باززایی گیاه نشان دادند (جدول 6). تیمارهای مختلفی برای جوانه‌زنی جنین‌ها استفاده شدند. کاربرد سکوسترین آهن (150 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) بیشترین درصد جوانه‌زنی (66/9 درصد) را در پی داشت؛ اما استفاده از نیترات‌نقره (2 میلی‌گرم‌برلیتر) و جیبرلیک‌اسید (1 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) بدون پاسخ بود. جنین‌ها در محیط‌کشت MS نیز به میزان 83/4 درصد جوانه‌زنی داشتد (شکل C3). استفاده از جیبرلیک‌اسید (1 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) و نیترات‌نقره (2 میلی‌گرم‌برلیتر) برای رشد و باززایی جنین‌های جوانه‌زده اثر مثبتی در پی نداشت؛ به‌طوری‌که کاربرد این تیمارها سبب از‌بین‌رفتن گیاهان جوانه‌زده شد (جدول 7).

در تیمار نیترات‌نقره به‌تدریج برگ گیاهچه قهوه‌ای شد و در‌نهایت، گیاهچه از بین رفت. در باززایی با تیمار جیبرلیک‌اسید نیز رشد گیاهچه‌ها متوقف شد و گیاهچه‌ها به‌شکل سبز خشک شدند (جدول 7). تیمار سکوسترین ‌آهن (150 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) بهترین تیمار برای رشد و باززایی گیاهان جوانه‌زده در این آزمایش بود؛ به‌طوری‌که 12 درصد گیاهان جوانه‌‌زده در این تیمار رشد کردند (جدول 7).

 

 

جدول 6- تجزیه واریانس آثار تیمارهای جوانه‌زنی جنین‌های سوماتیکی مستقیم بر فاکتورهای بررسی‌شده

باززایی گیاه از جنین مستقیم

جوانه‌زنی جنین‌ سوماتیکی مستقیم

درجۀ آزادی

منبع تغییرات

83/106**

24/64 **

3

تیمار

002/1

1041/0

8

خطا

*معنادار در سطح احتمال 5 درصد، ** معنادار در سطح احتمال 1 درصد، ns بدون تفاوت معنادار

 

جدول 7- مقایسۀ میانگین تیمارهای مختلف روی جوانه‌زنی جنین‌های سوماتیکی و باززایی گیاه

وضعیت عمومی گیاه

گیاه باززایی شده (درصد)

جوانه زنی جنین سوماتیکی (درصد)

تیمار

برگ‌ها سبز و شاداب

2/0±057/0b

83/4±166/0b

شاهد

برگ‌ها سبز و شاداب

12±154/1a

66/9±333/0a

Fe-EDDHA

برگ‌ها قهوه‌ای شدند و گیاه از بین رفت

0 ±0b

0± 0c

نیترات‌نقره

برگ‌ها سبز خشک شدند و گیاه از بین رفت

0 ±0b

0 ±0c

جیبرلیک‌اسید

غلظت ترکیبات استفاده‌شده: 150میلی‌گرم‌بر‌لیتر Fe-EDDHA، 2 میلی‌گرم‌بر‌لیتر نیترات‌نقره، 1 میلی‌گرم‌بر‌لیتر جیبرلیک‌اسید؛ مقادیر، میانگین 3 تکرار± خطای استاندارد هستند. حرف‌های متفاوت تفاوت معنادار با آزمون دانکن در سطح P<0.05 را بیان می‌کنند.

 

میزان جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم در Rosa hybrid 25 درصد و میزان باززایی گیاه از این جنین‌ها 20 درصد گزارش شده است (Kim et al., 2003)، میزان جوانه‌زنی در جنین‌های سوماتیکی بلوط 6 تا 11 درصد (Chalupa, 1990) و در Pinus patula وابسته به ژنوتیپ معرفی شده است؛ به‌طوری‌که در سه ژنوتیپ مطالعه‌شده 18، 29 و 43 درصد گزارش شده است (Malabadi and Van Staden, 2005). گزارش‌های یادشده فراوانی کم جنین‌زایی سوماتیکی را در بسیاری از مطالعه‌ها تأیید می‌کنند که در راستای نتایج مطالعۀ حاضر است. در پژوهش حاضر، بهترین نتیجه در محیط‌های بدون هورمون حاصل شد که مطابق با نتایج Hazra و همکاران (1989) است؛ آنها گزارش کرده‌اند جوانه‌زنی جنین سوماتیکی در گیاه بادام‌زمینی در محیط بدون هورمون اتفاق می‌افتد. Rai و همکاران (2008) گزارش کرده‌اند پروتئین‌های ذخیره‌ای تجمع‌یافته در جنین‌های سوماتیکی به نمو جنین به گیاه در گونۀ Psidium guajava کمک می‌کنند (Rai et al.,2008). شاید به‌علت وجود این پروتئین‌های ذخیره‌ای در جنین سوماتیکی است که در مرحلۀ جوانه‌زنی و باززایی گیاه از جنین سوماتیکی به هورمون نیازی نیست. معمولاً این نظریه مطرح است که تولید اتیلن یکی از موانع رشد‌و‌نمو جنین سوماتیکی است (Kapoor et al., 2018; Zhu et al., 2018)؛ ازاین‌رو، یکی از بازدارنده‌های عمل اتیلن به نام نیترات‌نقره در پژوهش حاضر به کار گرفته شد. در مطالعۀ حاضر، کاربرد 2 میلی‌گرم‌بر‌لیتر نیترات‌نقره به‌عنوان بازدارندۀ عمل اتیلن مؤثر نبود؛ البته غلظت‌های کمتر نیز همین پاسخ را داشتند (در مطالعۀ حاضر در نظر گرفته نشدند). نقش تحریک‌کنندگی اتیلن در چندین گونه ازجمله Pinus sylvestris (Lu et al., 2011) و Coffea canephora (Hatanaka et al., 1995) مشاهده شده است که مطابق نتایج آزمایش حاضر است. کاربرد سکوسترین‌ آهن نتایج خوبی در جوانه‌زنی و باززایی گیاهچه در پی داشت. Trejgell و همکاران (2012) استفاده از این نوع آهن را در جنین‌زایی مفید دانسته‌اند که در راستای نتایج آزمایش حاضر است. بر اساس نتایج یادشده، آندوسپرم رقم قوسی ریزنمونۀ مستعد در مطالعۀ حاضر است و بنابراین می‌توان گفت اتیلن در ژنوتیپ قوسی به‌عنوان بازدارندۀ توسعۀ جنین سوماتیکی مطرح نیست؛ زیرا با به‌کاربردن بازدارندۀ آن جنین‌ها از بین رفتند. جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم در مقایسه با غیرمستقیم روش مطلوب‌تری برای دست‌یافتن به باززایی گیاه است؛ زیرا جنین مستقیماً از خود ریزنمونه منشأ می‌گیرد و درنتیجه، شبیه به سلول مادری خواهد بود.

سازگاری گیاهان باززایی‌شده: مطالعۀ سازگاری گیاهان جایگاه خاصی در کشت بافت دارد و در پژوهش حاضر، طی دو آزمایش متوالی و جداگانه به مطالعۀ آن پرداخته شد. مایکوریزا اثر مثبت و معنا‌داری بر میزان رشد جدید (P<0.01) و تعداد برگ جدید (P<0.05) گیاهان انتقال‌یافته به کوکوپیت و پرلیت داشت؛ به‌طوری‌که میزان رشد جدید (31/32 میلی‌متر) گیاهانی که در زمان انتقال آنها از مایکوریزا استفاده شد بیشتر از گیاهانی بود که در زمان انتقالشان از این قارچ همزیست استفاده نشد (جدول 8).

.جدول 8- مقایسۀ میانگین سطوح مایکوریزا (Glomus mosseae) بر رشد گیاهان سازگار‌شده با آزمون t- student

تعداد برگ‌های جدید

میزان رشد دوباره (میلی‌متر)

مایکوریزا (گرم‌برکیلوگرم)

33/3±33/0*

31/32±57/2*

25/0

33/1 ± 33/0

59/17±18/1

صفر (شاهد)

مقادیر، میانگین 3 تکرار±خطای استاندارد هستند. * معنادار در سطح احتمال P<0.05 در قیاس با شاهد

 

قارچ‌های مایکوریزا باعث افزایش جذب عناصر غذایی (عمدتاً فسفر) (Smith et al., 2010; Orujei et al., 2013)، تغییر ریخت‌شناسی ریشه، افزایش جذب آب و جلوگیری از بروز برخی بیماری‌های ریشه می‌شوند (Auge, 2001). نقش مایکوریزا در افزایش جذب به این مسئله بر‌می‌گردد که هیف‌های قارچ مایکوریزا به منافذ بسیار ریزی وارد می‌شوند که حتی تارهای کشنده قادر به نفوذ در آنها نیستند و باعث افزایش میزان جذب آب می‌شوند (Tisdall, 1991)؛ از دیگر نقش‌های قارچ‌های مایکوریزایی بر رشد گیاه، تولید هورمون‌های محرک رشد گیاه مانند اکسین‌ها و جیبرلین است؛ همچنین آنها قادر به کاهش غلظت آبسیزیک‌اسید هستند (Liu et al., 2000).

اثر مثبت مایکوریزا در مطالعۀ حاضر را می‌توان به نقش‌های یادشده نسبت داد. آزمایش کود‌آبیاری پس‌از سنجش نقش مایکوریزا در سازگاری گیاهان کشت بافتی انجام شد. نتایج آزمون T نشان دادند کود‌آبیاری اثر معناداری بر میزان رشد جدید (P<0.01) گیاهان دارد. یک هفته پس‌از انتقال، کودآبیاری با دو رویۀ مختلف انجام شد: رویۀ اول شامل کودآبیاری با 1/4MS باعث نکروزه‌شدن برگ‌ها و مریستم گیاه، توقف رشد و ازبین‌رفتن گیاه شد؛ رویۀ دوم شامل استفاده ازکودی با فرمولاسیون 10: 52: 10 (N: P2O5: K2O) به‌مدت دو هفته و سپس کود‌آبیاری با فرمولاسیون 20 N-20 P2O5-20 K2O بود که باتوجه‌به حساسیت گیاهان در مرحلۀ سازگاری بهترین نتیجه را در پی داشت؛ به‌طوری‌که میزان رشد جدید به 66/45 میلی‌متر رسید و برگ گیاهان سبز و شاداب بودند (جدول 9، شکل D3).

 

 

جدول 9. مقایسۀ میانگین رویه‌های مختلف کودآبیاری بر گیاهان سازگار‌شده با آزمونt- student

وضعیت عمومی گیاه

درصد سازگاری

میزان رشد جدید (میلی‌متر)

رویه‌های کود‌آبیاری

برگ‌ها نکروزه و گیاه بدون رشد

0

0±0

رویۀ اول

برگ‌ها سبز و شاداب بودند و گیاه رشد جدید داشت

62±1*

66/45±05/4*

رویۀ دوم

رویۀ اول: کود‌آبیاری با 1/4MS، رویۀ دوم: ابتدا استفاده از کودی با فرمولاسیون ( N: P2O5: K2O) 10: 52: 10 به‌مدت دو هفته و سپس، کودآبیاری با فرمولاسیون 20 N-20 P205-20 K 20؛ مقادیر، میانگین 3 تکرار±خطای استاندارد هستند. * معنادار در سطح احتمال P<0.05 در قیاس با رویۀ اول

 


جمع‌بندی.

انتخاب ریز‌نمونۀ مستعد در روش القای مستقیم جنین‌زایی اهمیت دارد. آنچه در این فرایند درخور تأمل و بحث‌برانگیز است، پژوهش دربارۀ بلوغ و جوانه‌زنی جنین‌های سوماتیکی و تمرکز بر آنست. آنچه از یافته‌‌های مطالعه‌های جنین‌زایی در سایر گونه‌های گیاهی درک می‌شود، عبارتست از: نقش پررنگ اتیلن در توسعه و نمو جنین‌های سوماتیکی که در برخی گونه‌ها بازدارنده و در دیگر گونه‌های گیاهی محرک است و توصیه به حذف اکسین در مراحل پس‌از ظهور جنین. در مطالعۀ حاضر مشخص شد کاربرد بازدارندۀ اتیلن نقشی در توسعۀ جنین سوماتیکی ندارد، بلکه باعث از‌بین‌رفتن و زوال آن می‌شود. با‌توجه‌به نقش منفی نیترات‌نقره نتیجه‌گیری می‌شود اتیلن در جنین‌زایی سوماتیکی گلابی نقش مثبت دارد. ازآنجاکه پژوهش حاضر فرضیه‌های کلی و مطرح‌شده در جنین‌زایی سایر گونه‌های گیاهی را در گیاه گلابی بررسی کرد، برخی تیمارهای آزمایشی بازدهی کمی داشتند یا بدون پاسخ بودند؛ درنتیجه، پژوهش‌های بیشتری دربارۀ نقش اتیلن در افزایش بازدهی جنین‌زایی گلابی نیاز است. به‌طور‌کلی، در جنین‌زایی سوماتیکی مستقیم گلابی رقم قوسی به هورمون اکسین (5/0 میکرومولار 2,4-D) تا مرحلۀ القا نیاز بود و پس‌از‌آن، جوانه‌زنی با حذف اکسین و در محیط‌کشت MS بدون هورمون انجام شد؛ البته با به‌کاربردن 150 میلی‌گرم‌بر‌لیتر سکوسترین آهن فراوانی جوانه‌زنی دو برابر شد و باززایی گیاه بهبود یافت. در سازگاری گیاهان، استفاده از مایکوریزا در زمان انتقال گیاه و کودآبیاری با فرمولاسیون کودی دارای فسفر بیشتر برای رشد ریشه (10 N:52 P2O5:10 K2O) و سپس  20 N-20 P2O5-20 K2O توصیه می‌شود.

Antonopoulos, C., Dimassi, K., Therios, I., Chatzissavvidis, C. and Papadakis, I. (2007) The effect of Fe–EDDHA and of ascorbic acid on in vitro rooting of the peach rootstock GF-677 explants. Acta Physiologiae Plantarum 29: 559-561.

Ashwani, S., Ravishankar, G. A. and Giridhar, P. (2017) Silver nitrate and 2-(N-morpholine) ethane sulphonic acid in culture medium promotes rapid shoot regeneration from the proximal zone of the leaf of Capsicum frutescens Mill. Plant Cell, Tissue and Organ Culture129(1): 175-180.

Auge, R. M. (2001) Water relations, drought and vesicular-arbuscular mycorrhizal symbiosis. Mycorrhiza 3: 11-42.

Caboni, E., D'angeli, S., Chiappetta, A., Innocenti, A. M., Van Onckelen, H. and Damiano, C. (2002) Adventitious shoot regeneration from vegetative shoot apices in pear and putative role of cytokinin accumulation in the morphogenetic process. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 70(2): 199-206.

Chalupa, V. (1990) Plant regeneration by somatic embryogenesis from cultured immature embryos of oak (Querem robur L.) and linden (Tilia cordata Mill.). Plant Cell Reports 9(7): 398-401.

Chaturvedi, R., Razdan, M. K. and Bhojwani, S. S. (2003) An efficient protocol for the production of triploid plants from endosperm callus of neem, Azadirachta indica A. Juss. Journal of Plant Physiology 160(5): 557-564.

Cheong, E. J. and Pooler, M. R. (2004) Factors affecting somatic embryogenesis in Prunus incisa cv. February Pink. Plant Cell Reports 22(11): 810-815.

Curie, C., Cassin, G., Couch, D., Divol, F., Higuchi, K., Le Jean, M., Misson, J., Schikora, A., Czernic, P. and Mari. S. (2009) Metal movement within the plant: contribution of nicotianamine and yellow stripe 1-like transporters. Annals of Botany 103: 1-11.

Dalton, C. C., Iqbal K. and Turver, D. A. (1983) Iron phosphate precipitation in Murashige and Skoog media. Physiologia Plantarum 57: 472-476.

Dettmer, J. and Friml, J. (2011) Cell polarity in plants: when two do the same, it is not the same ... Current Opinion in Cell Biology 23(6): 686-696.

 

Farhadi Kolahkaj, F., Pour Mohammadi, P., Farkhari, F. and Alami Saied, Kh. (2018) Callus and somatic embryo induction in date palm cv. Khazravi using leaves, immature fruit and endosperm explants. Iranian Journal of Plant Biology 10(2): 88-101 (in Persian).

Hancock, J. F. and Lobos, G. A. (2008) Pears. In: Temperate fruit crop breeding (Ed. Hancock, J. F.) 299-336. Springer, New York.

Hatanaka, T., Sawabe, E., Azuma, T., Uchida N. and Yasuda, T. (1995) The role of ethylene in somatic embryogenesis from leaf discs of Coffea canephora. Plant Science 107(2): 199-204.

Hazra, S., Sathaye, S. S. and Mascarenhas, A. F. (1989) Direct somatic embryogenesis in peanut (Arachis hypogea). Nature Biotechnology 7(9): 949-951.

Kapoor, K., Mira, M. M., Ayele, B. T., Nguyen, T. N., Hill, R. D. and Stasolla, C. (2018) Phytoglobins regulate nitric oxide-dependent abscisic acid synthesis and ethylene-induced program cell death in developing maize somatic embryos. Planta1-15.

Kim, S. W., Oh, S. C. and Liu, J. R. (2003) Control of direct and indirect somatic embryogenesis by exogenous growth regulators in immature zygotic embryo cultures of rose. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74(1): 61-66.

Kin, M. S., Fraser, L. G. and Harvey, C. F. (1990) Initiation of callus and regeneration of plantlets from endosperm of Actinidia interspecific hybrids. Scientia Horticulturae 44: 107-117.

Landi, L. and Mezzetti, B. (2006) TDZ, auxin and genotype effects on leaf organogenesis in Fragaria. Plant Cell Reports 25(4): 281-288.

Liu, R., Li, M. and Meng, X. (2000) Effects of AM fungi on endogenous hormones in corn and cotton plants. Mycosystem 19: 91-96.

Lu, J., Vahala, J. and Pappinen, A. (2011) Involvement of ethylene in somatic embryogenesis in Scots pine (Pinus sylvestris L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 107(1): 25.

Mahendran, G. and Bai, V. N. (2016) Direct somatic embryogenesis of Malaxis densiflora (A. Rich.) Kuntze. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 14(1): 77-81.

Malabadi, R. B. and Van Staden, J. (2005) Somatic embryogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula. Tree Physiology 25(1): 11-16.

Mehra, P. N. and Jaidka, K. (1985) Experimental induction of embryogenesis in pear. Phytomorphology 35: 1-10.

Montero-Cortés, M., Sáenz, L., Córdova, I., Quiroz, A., Verdeil, J. L. and Oropeza, C. (2010) GA3 stimulates the formation and germination of somatic embryos and the expression of a KNOTTED-like homeobox gene of Cocos nucifera (L.). Plant Cell Reports 29(9): 1049-1059.

Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3): 473-497.

Orujei, Y., Shabani, M., Sharifi Tehrani, M., Aghababaei, F. and Enteshari Sh. (2013) Dual effects of two mycorrhizal fungi on production of glycyrrhizin total phenolic and total flavonoids compounds in roots of Glycyrrhiza glabra L. Iranian Journal of Plant Biology 10: 75-89 (in Persian).

Pesce, P. G. and Rugini, E. (2004) Influence of plant growth regulators, carbon sources and iron on the cyclic secondary somatic embryogenesis and plant regeneration of transgenic cherry rootstock Colt'(Prunus avium× P. pseudocerasus). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 79(2): 223-232.

Pierik, R. L. M. (1997) In vitro culture of higher plants. Kluwer academic publishers, Dordrecht.

Qingrong, S., Qingzhong, L. and Ruihua, Z. (2003) Somatic embryo genesis from in vitro leaves of pear. Acta Horticulturae Sinica 30(1): 85-86.

Quiroz-Figueroa, F. R., Rojas-Herrera, R., Galaz-Avalos, R. M. and Loyola-Vargas, V. M. (2006) Embryo production through somatic embryogenesis can be used to study cell differentiation in plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 86(3): 285.

Raemakers, C. J. J .M., Jacobsen, E. and Visser, R. G. F. (1995) Secondary somatic embryogenesis and applications in plant breeding. Euphytica 81(1): 93-107.

Raghuramulu, Y. (1989) Anther and endosperm culture of coffee. Journal of Coffee Research 19: 71-81.

Rai, M. K., Jaiswal, V. S. and Jaiswal, U. (2008) Effect of ABA and sucrose on germination of encapsulated somatic embryos of guava (Psidium guajava L.). Scientia Horticulturae 117(3): 302-305.

Sabooni, N. and Shekafandeh, A. (2017) Somatic embryogenesis and plant regeneration of blackberry using the thin cell layer technique. Plant Cell, Tissue and Organ Culture130(2): 313-321.

Sadeghi, F., Yadollahi, A., Kermani, M. J. and Eftekhari, M. (2015) Optimizing culture media for in vitro proliferation and rooting of Tetra (Prunus empyrean 3) rootstock. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 13(1): 19-23.

Schenk, R. U. and Hildebrandt, A. C. (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany 50(1): 199-204.

Silvestri, C., Cristofori, V., Ceccarelli, M., Caceres, M. E., Escribà-Lacuesta, J. and Rugini, E. (2016) Adventitious shoot organogenesis from leaf and petiole explants of European hazelnut. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 126(1): 59-65.

Smith, S. E., Facelli, E., Pope, S. and Smith, F. A. (2010) Plant performance in stressful environments: interpreting new and established knowledge of the roles of arbuscular mycorrhizas. Plant and Soil 326: 3-20.

Thomas, T. D., Bhatnagar, A. K. and Bhojwani, S. S. (2000) Production of triploid plants of mulberry (Morus alba L.) by endosperm culture. Plant Cell Reports 19(4): 395-399.

Tisdall, J. M. (1991) Fungal hyphae and structural stability of soil. Soil Research 29(6): 729-743.

Trejgell, A., Libront, I. and Tretyn, A. (2012) The effect of Fe-EDDHA on shoot multiplication and in vitro rooting of Carlina onopordifolia Besser. Acta Physiologia Plantarum 34(5): 2051-2055.

Wallin, A., Nyman, M. and Svensson, M. (1995) Somatic embryogenesis in apple (Malus). In: Somatic embryogenesis in woody plants (Eds. Jain, S., Gupta, P. and Newton, R.) 445-460. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

White, R. P. (1954) The cultivation of animal and plant cells. The Ronald Press Co., New York.

Zhu, H. G., Cheng, W. H., Tian, W. G., Li, Y. J., Liu, F., Xue, F., Zhu, Q. H., Sun, Y. Q. and Sun, J. (2018) iTRAQ-based comparative proteomic analysis provides insights into somatic embryogenesis in Gossypium hirsutum L. Plant Molecular Biology 96: 89-102.