تاثیر آبسیزیک اسید بر تنش اکسیداتیو در کشت‌های ساقه بادرنجبویه (Melissa officinalis)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد

2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد پژوهشکده زیست فناوری، دانشگاه شهرکرد

3 گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد

چکیده

پاسخ‌های گیاهان به الیسیتورها نتیجه یک سری از تغییرات متوالی تنظیم شده در میزان هورمون‌ها و یا گونه‌های اکسیژن واکنشی (ROS) است. در این تحقیق، شاخص رشد، میزان کلروفیل‌ها و کاروتنوئید، میزان H2O2، میزان پراکسیداسیون لیپیدی غشا، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان (کاتالاز، گایاکول پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز) و میزان پرولین در کشت‌های ساقهM. officinalis که تحت تیمار الیسیتور آبسیزیک اسید بودند، مورد بررسی قرار گرفتند. محیط کشت ساقه‌های ‌ M. officinalis به وسیله غلظت‌های متفاوت آبسیزیک اسید (0، 5، 25، 50 و 100 میکرومولار) تغذیه شدند. و پس از گذشت 7 و 14 روز از تیمار، شاخص‌های مورد نظر اندازه‌گیری شدند. شاخص رشد نمونه‌های تحت تیمار در تمام غلظت‌های آبسیزیک اسید نسبت به نمونه شاهد کاهش نشان داد. میزان کلروفیل a، b و کل نیز در تمام غلظت‌های ABA نسبت به نمونه شاهد کاهش یافت. میزان کاروتنوئید در غلظت‌های 25 و 100 میکرومولار آبسیزیک اسید نسبت به شاهد افزایش نشان داد. الیسیتور ABA باعث افزایش میزان H2O2 در تمام غلظت‌های آبسیزیک اسید نسبت به نمونه شاهد شد. از میان آنزیم‌های آنتی اکسیدان اندازه‌گیری شده، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز و SOD در تمام غلظت‌ها افزایش یافت. میزان پراکسیداسیون لیپید غشا تنها در غلظت 100 میکرومولار ABA نسبت به شاهد افزایش یافت. میزان پرولین در تمامی غلظت‌ها، به جز در غلظت 5 میکرومولار آبسیزیک اسید نسبت به شاهد افزایش نشان داد. بنابراین به نظر می‌رسد که آبسیزیک اسید به عنوان یک مولکول انتقال پیام نقش مهمی در تولید پراکسید هیدروژن و تولید آنزیم‌های آنتی اکسیدان کاتالاز و پراکسیدازها در ساقه‌های کشت شده بادرنجبویه داشته است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of ABA on oxidative stress in Melissa officinalis shoot cultures

نویسندگان [English]

  • Seyedeh Mosoumeh Mousavi 1
  • Leila Shabani 2
  • Neda Mirakhorli 3
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Sciences, Shahrekord University, Shahrekord, Iran Research Institute of Biotechnology, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
3 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord
چکیده [English]

Plant responses to elicitors are the result of a series of highly modulated consecutive changes in hormones or reactive oxygen species (ROS). In the present study, we examined growth index, chlorophylls and carotenoid content, H2O2 content, membrane lipid peroxidation, antioxidant enzymes (CAT, GPX, APX and SOD) activity and proline content in M. officinalis shoots culture that induced through the use of an elicitor, ABA. Mediums of M. officinalis were fed by different concentration of ABA (0, 5, 25, 50 and 100 µM) and 7 and 14 day after elicitation, biochemical and physiological parameters were measured in shoot cultures. Growth index of the treated samples decreased in all concentration of ABA compared to control. Content of chlorophyll a, b and total chlorophyll decreased in all concentrations of ABA compared to control. Content of carotenoid at 25 and 100 µM concentrations of ABA increased compared to control. ABA elicitor increased the amount of H2O2 at all concentration of ABA compared to control. Among the measured antioxidant enzymes APX enzyme and SOD enzyme increased at all concentrations of ABA. Content of lipid peroxidation increased only at 100 µM concentration of ABA compared to control. Content of proline increased at all concentration except at 5 µM concentration of ABA compared to control. ABA as a transmitter molecule seems to play an important role in the production of hydrogen peroxide and the production of antioxidant defense proteins such as catalase and peroxidases in shoot cultures of M. officinalis.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Abscisic acid
  • Antioxidant
  • Elicitor
  • Lipid peroxidation
  • M. officinalis

محرک‌ها، مولکول‌هایی با وزن مولکولی کم هستند که باعث تحریک پاسخ‌های دفاعی در گیاهان می‌شوند؛ این مواد تا حد زیادی ازنظر نوع و ساختار تفاوت دارند و مواد شیمیایی یا عوامل زیستی مختلفی را شامل می‌شوند که تغییرات فیزیولوژیک و تجمع فیتوالکسین‌ها (Phytoalexin) را القا می‌کنند (Zhao et al., 2005). پاسخ‌های گیاهان به محرک‌ها، نتیجۀ تعدادی تغییرات متوالی تنظیم‌شده در میزان هورمون‌ها یا گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) است.

آبسیزیک‌اسید (ABA)، هورمونی تنشی است که شبکه‌های پیچیدۀ پاسخ به تنش را هماهنگ و محتوای آن به‌سرعت در پاسخ به تنش تغییر می‌کند. فیتوهورمون آبسیزیک‌اسید، عامل انتقال پیام در شرایط تنش‌های زنده و غیر‌زنده است؛ همچنین اهمیت بسیاری در فرایندهای مهم فیزیولوژیک ازجمله تنظیم دورۀ خواب بذر و کنترل بیان ژن‌ها در مراحل مختلف نمو دارد. تجمع آبسیزیک‌اسید در بافت‌های مختلف گیاه در اثر تنش‌های زنده و غیرزنده نظیر خشکی، شوری، سرما، تاریکی و عوامل بیماری‌زا، نقش انکار‌ناپذیر آن را به‌عنوان عامل انتقال پیام تأیید می‌کند (Hare et al., 1999)؛ اگرچه سازوکار دقیق این نقش کاملاً روشن نیست، شواهد پژوهشی نشان می‌دهند آبسیزیک‌اسید چنین نقشی را از طریق تنظیم غلظت رادیکال‌های آزاد اکسیژن ایفا می‌کند (Pei et al., 2000).

گونه‌های فعال اکسیژن شامل رادیکال‌های سوپراکسید (O2˚-)، هیدروکسیل (OH˚)، پراکسید‌هیدروژن (H2O2)، اکسیژن یگانه (O2˚) و پروکسیل (RO2˚) در مقادیر مختلف و به‌واسطۀ متابولیسم طبیعی در همۀ گیاهان تولید می‌شوند؛ ولی افزایش و تجمع بیش از حد آنها به تنش و آسیب اکسیداتیو منجر می‌شود. گونه‌های فعال اکسیژن سبب آسیب به بسیاری از ساختارهای سلولی و ماکرومولکول‌ها نظیر لیپیدها، نوکلئیک‌اسیدها (DNA و RNA) و پروتئین‌ها می‌شوند که تغییر ساختار یا فعالیت یا تخریب آنها را در پی دارد. پراکسیداسیون لیپیدها که فرایندی طبیعی طی متابولیسم سلول‌های گیاهی است، در‌نتیجۀ آسیب‌های اکسیداتیو تشدید می‌شود. آسیب‌های ناشی از تنش اکسیداتیو ممکن است به تجزیه و تخریب بسیاری از متابولیت‌های سلولی منجر شوند. حملۀ گونه‌های فعال اکسیژن به لیپیدهای غشای پلاسمایی سلول‌ها آثار مخربی بر ساختار، سیالیت و نفوذپذیری غشای سلولی دارد. تأثیر گونه‌های فعال اکسیژن بر پروتئین‌ها به تغییر زنجیره‌های جانبی، آمینواسیدها، اکسیداسیون پیوندهای دی‌سولفیدی و رسوب پروتئین‌ها منجر می‌شود (Rotilio et al., 1995). مشخص شده است H2O2 آنزیم‌های چرخۀ کالوین را غیرفعال می‌کند و رادیکال سوپراکسید از طریق واکنش مستقیم با برخی از آنزیم‌ها سبب غیرفعال‌شدن آنها می‌شود (Nakano and Asada, 1987). انفجار اکسیداتیو یا تولید سریع و انباشتگی گونه‌های فعال اکسیژن پاسخی است که گیاهان به تغییر شرایط و عوامل محیطی می‌دهند (Asada, 2006). به‌منظور کاهش آسیب‌های اکسیداتیو وارده در اثر تولید و تجمع گونه‌های فعال اکسیژن، سیستم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی در گیاهان تعبیه شده‌اند که سعی در کنترل سطح گونه‌های فعال اکسیژن در شرایط طبیعی و همچنین در شرایط تنش‌زای محیطی دارند؛ این سیستم‌ها دو بخش آنزیمی و غیرآنزیمی دارند (Moran et al., 1994).

مطالعۀ Guan و همکاران (2000) گویای افزایش پراکسید‌هیدروژن در تیمار آبسیزیک‌اسید است. کاربرد آبسیزیک‌اسید به تشدید فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانی و افزایش غلظت آنزیم سوپراکسید‌دیسموتاز مس- روی و آهن (Kaminaka et al., 1999) و سوپر‌اکسید‌دیسموتاز منگنز (Bueno et al., 1998) منجر می‌شود؛ همچنین محلول‌پاشی آبسیزیک‌اسید به افزایش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربیک‌اسید‌پراکسیداز و گلوتاتیون‌ردوکتاز در بافت‌های گیاهی منجر می‌شود (Gong et al., 1998; Bellaire et al., 2000). نتایج برخی از مطالعه‌ها نشان می‌دهند آبسیزیک‌اسید به‌عنوان مولکول انتقال پیام، نقش مهمی در تولید پراکسید‌هیدروژن، بیان ژن‌ها و فرایند تولید پروتئین‌های دفاعی ازجمله آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان سوپراکسید‌دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربیک ‌اسید‌ پراکسیداز و گلوتاتیون‌ردوکتاز دارد (Kaminaka et al., 1999; Bellaire et al., 2000; Guan et. al., 2000)؛ بر این اساس، به نظر می‌رسد آبسیزیک‌اسید در القای فرایند سیستم دفاعی و آنتی‌اکسیدانی نقش مهمی دارد. اگرچه شواهد نشان می‌دهند آبسیزیک‌اسید و رادیکال‌های فعال اکسیژن به‌عنوان عوامل ثانویه در فرایندهای مهم سلولی دخالت دارند، نوع ارتباط آنها به‌روشنی تعیین نشده است؛ باوجوداین، به نظر می‌رسد آبسیزیک‌اسید با ایجاد تغییرات متابولیک سلولی سبب افزایش سطح رادیکال‌های اکسیژن می‌شود و در پی آن، فعالیت سیستم دفاع آنزیمی افزایش می‌یابد (Guan et al., 2000).

گیاه دارویی بادرنجبویه با نام علمی Melissa officinalis به خانوادۀ نعناعیان (Lamiaceae) تعلق دارد و در زمینه‌های مختلف پزشکی، غذایی، عطرسازی و آرایشی استفاده می‌شود. رایج‌ترین ویژگی‌های درمانی بادرنجبویه عبارتند از: آرام‌بخشی، آنتی‌اکسیدانی، ضد‌باکتری، ضد‌ویروس، ضد‌التهاب، ضد‌حساسیت و ضدرماتیسم و ... . برگ‌های این گیاه ترکیبات پل‌فنولیک نظیر رزمارینیک‌اسید و ترکیبات فلاونوئیدی دارند. رزمارینیک‌اسید خاصیت آنتی‌اکسیدانی زیادی دارد و ارزش غذایی و سیستم دفاعی گیاه را افزایش می‌دهد. با‌توجه‌به اینکه آبسیزیک‌اسید در القای فرایند سیستم دفاعی و آنتی‌اکسیدانی گیاه نقش دارد و تاکنون نقش آن در گیاه بادرنجبویه بررسی نشده است، مطالعۀ حاضر با هدف تعیین نقش آبسیزیک‌اسید بر تنش اکسیداتیو ساقه‌های کشت‌شده در شرایط in vitro بادرنجبویه انجام شد.

 

مواد و روش‌ها.

.کشت بذرهای بادرنجبویه M. officinalis:بذرهای گیاه بادرنجبویه (تهیه‌شده از شرکت پاکان بذر، اصفهان) دو تا سه بار در آب مقطر شستشو و حدود 20 ثانیه در الکل 70 درصد و 8 دقیقه در آب ژاول 20 درصد قرار داده شدند. آب ژاول در دستگاه لامینار ایرفلو خالی شد و بذرها چندین بار با آب مقطر استریل شستشو شدند. تعداد 6 بذر در محیط‌کشت 1/2MS با اسیدیتۀ 7/5، 8 گرم‌‌در‌لیتر آگار، 13 گرم‌در‌لیتر ساکارز و بدون هورمون کشت شدند و ظروف کشت به دستگاه اتاقک رشد (Binder، آلمان) با شرایط 8 ساعت تاریکی، 16 ساعت روشنایی و دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد منتقل شدند. هشت روز بعد، بذرها شروع به جوانه‌زنی کردند و گیاهچه‌ها به‌مدت دو ماه در دستگاه اتاقک رشد نگهداری شدند. گیاهچه‌های دوماهۀ رشد‌یافته در شرایط in vitroبرای انجام آزمایش انتخاب شدند؛ به‌این‌ترتیب که گیاهچه‌ها در دستگاه لامینار ایرفلو از محیط‌کشت خارج و ریشه‌های آنها جدا شدند. ساقه‌های دارای دو گره با وزن 1 گرم به ارلن‌های حاوی محیط‌کشت 1/2MS مایع با غلظت‌های مختلف آبسیزیک‌اسید منتقل شدند (طراحی آزمایش برگرفته از (Lattanzio et al., 2009). با مطالعۀ مقاله‌هایی مانند Gagne و همکاران (2011) و انجام یک آزمایش ابتدایی، غلظت‌های صفر، 5، 25، 50 و 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید برای انجام آزمایش انتخاب شدند.تعداد 15 ارلن حاوی محیط‌کشت 1/2MS مایع تهیه شدند و سپس ارلن‌ها به‌مدت دو هفته در دستگاه شیکر انکوباتور (LabTech، کرۀ جنوبی) با دور 80 دوردردقیقه و دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد، 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. پس‌از گذشت یک هفته از کشت ساقه‌های بادرنجبویه، نمونه‌برداری به‌منظور اندازه‌گیری میزان H2O2، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و میزان مالون‌دی‌آلدئید انجام شد و نمونه‌ها تا انجام آزمایش در فریزر منفی 80 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس‌از گذشت دو هفته (پایان زمان آزمایش)، نمونه‌برداری برای تجزیه‌وتحلیل رشد، میزان رنگیزه‌ها و میزان پرولین انجام شد و نمونه‌ها تا انجام آزمایش در فریزر منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند.

تجزیه‌وتحلیل رشد: پیش ‌از قرار‌دادن ساقه‌ها در محیط‌کشت MS، وزن تر اولیۀ آنها یادداشت شد. پس‌از اتمام مدت زمان تیمار آبسیزیک‌اسید، گیاهان از محیط‌کشت خارج شدند و پس‌از خشک‌کردن آب اضافی آنها روی کاغذ صافی، وزن تر ثانویۀ نمونه‌ها با ترازوی آزمایشگاهی سه رقم اعشار بر حسب گرم اندازه‌گیری شد. به‌منظور محاسبۀ شاخص رشد نسبی ساقه‌ها، وزن تر ساقه‌های تیمار‌شده با آبسیزیک‌اسید بر وزن تر ساقه‌های شاهد تقسیم شد.

.سنجش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی: اندازه‌گیری کلروفیل به روش Arnon (1949) و کاروتنوئید به روش Lichtenthaler (1987) انجام شد. ابتدا 05/0 گرم از بافت تازۀ برگ وزن و سپس با استفاده از حلال استون 80 درصد درون هاون چینی و روی یخ ساییده شد. حجم عصارۀ به‌دست‌آمده با استون 80 درصد به 5 میلی‌لیتر رسانده شد؛ سپس عصارۀ حاصل به‌مدت 3 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد و با سرعت 4000 دوردردقیقه سانتریفوژ شد و بی‌درنگ مقداری از عصاره به کوت منتقل و جذب محلول با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 6300، شرکت GENWAY، انگلیس) در طول موج‌های 645، 663 و 470 نانومتر خوانده شد.

سنجش میزان H2O2: به‌منظور اندازه‌گیری H2O2 از روش Alexieva و همکاران (2001) استفاده شد. برای عصاره‌گیری، 05/0 گرم بافت فریزرشدۀ برگ با 75/0 میلی‌لیتر تری‌کلرو‌استیک‌اسید (TCA) 1/0 درصد در هاون سردشده ساییده شد. عصارۀ تهیه‌شده به‌مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد و با سرعت 12000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. برای به‌دست‌آوردن منحنی استاندارد H2O2، رقت‌های صفر، 001/0، 01/0 و 1/0 میلی‌مولار تهیه شدند. 500 میکرولیتر از استانداردها و عصاره‌ها با 500 میکرولیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) و 1 میلی‌لیتر محلول یدید‌پتاسیم 1 مولار ترکیب شد و جذب نوری آن در 390 نانومتر خوانده شد. بر اساس منحنی استاندارد پراکسیدهیدروژن، غلظت H2O2 در نمونه‌ها بر حسب میکرومول‌بر‌گرم وزن تر برگ محاسبه شد. محلول TCA 1/0 درصد به‌عنوان بلانک استفاده شد.

سنجش مالون‌دی‌آلدئید در کل برگ: 1/0 گرم از بافت فریزرشدۀ برگ وزن و درون هاون قرار داده شد و 2 میلی‌لیتر اتانول 80 درصد به آن اضافه شد. بافت‌های عصاره‌گیری‌شده به‌مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد و دور 5000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند؛ سپس 1 میلی‌لیتر از محلول حاوی تیوباربیتوریک‌اسید- تری‌کلرواستیک‌اسید- هیدروکلریک‌اسید به آنها اضافه شد و به‌مدت 30 ثانیه ورتکس شدند؛ پس‌از اینکه نمونه‌ها 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند، 5 دقیقه با سرعت 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند؛ مایع رویی به فالکون جدید منتقل و 10 میکرولیتر هیدروکسی‌تولوئن بوتیله‌شده به آن اضافه شد و سپس به‌مدت 15 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 92 تا 93 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد؛ سپس نمونه‌ها به‌مدت 5 دقیقه روی یخ گذاشته شدند و جذب آنها در 532 نانومتر خوانده شد (Ertan et al., 2002).

سنجش میزان پرولین: اندازه‌گیری میزان پرولین به روش Troll و Lindsley (1955) انجام شد. ابتدا 05/0 گرم از بافت تازۀ گیاه در هاون سرد‌شده با 1 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد ساییده شد. عصارۀ حاصل پس‌از قرار‌گرفتن به‌مدت 24 ساعت در 4 درجۀ سانتی‌گراد، 5 دقیقه در 14000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. 25 میکرو‌لیتر از محلول رویی با 470 میکرو‌لیتر اتانول 70 درصد و 1 میلی‌لیتر مخلوط واکنش (15 میلی‌لیتر استیک‌اسید، 5 میلی‌لیتر اتانول 100 درصد، 25/0 گرم نین‌هیدرین و 5 میلی‌لیتر آب مقطر که دور از نور نگهداری شد) رقیق و محلول حاصل برای سنجش میزان پرولین استفاده شد. برای تهیۀ منحنی استاندارد پرولین، غلظت‌های صفر، 5/0، 25/0 و 125/0 میلی‌مولار پرولین تهیه و مانند عصاره‌ها رقیق شدند؛ سپس عصاره‌ها و استانداردها به‌مدت 1 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد و با سرعت 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. پس‌از سانتریفیوژ، عصاره‌ها و استاندارها به‌مدت 20 دقیقه در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد در حمام آب گرم قرار گرفتند و سپس جذب نوری آنها در طول موج 520 نانومتر خوانده شد.

.سنجش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان: به‌منظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌ها، 05/0 گرم بافت تازۀ برگ‌های شاهد و ‌تیمارشده پس‌از وزن‌شدن درون هاون چینی از‌پیش‌سرد‌شده قرار داده شد و برای استخراج پروتئین محلول از بافت‌ها، 75/0 میلی‌لیتر محلول بافر عصاره‌گیری سالین فسفات با اسیدیتۀ 8/7 به‌تدریج به آن افزوده شد. عصاره‌های حاصل به‌مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد و با دور 13000 دوردردقیقه سانتریفوژ شدند؛ محلول رویی برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان استفاده شد. مطالعه‌های کمّی با اسپکتروفتومتر (مدل Ultrospec 3100، شرکت GE Healthcare Life Sciences، آمریکا) انجام شدند.

فعالیت آنزیم کاتالاز:یک واحد از فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس سرعت مصرف یک میکرومول در دقیقه آب‌اکسیژنه در دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد و طول موج 240 نانومتر با استفاده از روش (Aebi, 1984) بیان شد.

فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز: اندازه‌گیری فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز مطابق روش Lin و Kao (1999) انجام شد. یک واحد فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز به‌عنوان مقدار آنزیمی تعریف شد که باعث تشکیل 1 میکرومولار تتراگایاکول در دقیقه می‌شود. کینتیک جذب در طول موج 470 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر در طول 1 دقیقه اندازه‌گیری شد.

فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز: فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز به روش Nakano و Asada (1987) در طول موج 290 نانومتر اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 7، آسکوربیک‌اسید 5/0 میلی‌مولار، محلول 2/0 میلی‌مولار EDAT و محلول 250 میلی‌مولار H2O2 بود.

فعالیت آنزیم سوپراکسید‌دیسموتاز:سنجش فعالیت این آنزیم به روش Beyer و Fridovich (1987) انجام شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات‌ پتاسیم 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 8/7)، متیونین (9/9 میلی‌مولار)، تریتون X-100 (025/0 درصد)، نیتروبلوتترازولیوم (75 میکرومولار) و 20 میکرولیتر عصارۀ آنزیم به همراه 10 میکرولیتر ریبووفلاوین (004/0 درصد) بود. افزایش جذب به‌واسطۀ تشکیل فورمازان در طول موج 560 نانومتر خوانده شد.

آزمایش‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار اجرا شدند. پنج غلظت آبسیزیک‌اسید (صفر، 5، 25، 50 و 100 میکرومولار) به‌عنوان تیمار در نظر گرفته شدند. تجزیه‌و‌تحلیل آماری با نرم‌افزار SAS انجام و مقایسه میانگین‌ها با آزمون حداقل تفاوت معنادار (LSD) (05/0P<) مشخص شد. نمودارها با نرم‌افزار Excel رسم شدند.

 

نتایج

گیاهچه‌های M. officinalisدر شرایط in vitro و در پنج سطح از غلظت‌های آبسیزیک‌اسید (صفر، 5، 25، 50 و 100 میکرومولار) قرار گرفتند (شکل 1). مطابق جدول 1، آبسیزیک‌اسید در تمام غلظت‌ها شاخص رشد نسبی ساقه‌ها را به‌طور معناداری کاهش داد و بیشترین کاهش رشد در غلظت 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید مشاهده شد.

 

 

 

شکل 1- تأثیر غلظت‌های متفاوت آبسیزیک‌اسید بر ساقه‌های کشت‌شدۀ گیاه بادرنجبویه در شرایط in vitro

 

جدول 1- تأثیر غلظت‌های مختلف آبسیزیک‌اسید بر شاخص رشد نسبی، میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئید ساقه‌های کشت‌شدۀ بادرنجبویه

تیمار

آبسیزیک اسید (میکرومولار)

شاخص رشد نسبی ساقه‌ها

a کلروفیل

(میلی‌گرم‌برگرم وزن تر)

b کلروفیل

(میلی‌گرم‌برگرم وزن تر)

کلروفیل کل

(میلی‌گرم‌برگرم وزن تر)

کاروتنوئید

(میلی‌گرم‌برگرم وزن تر)

شاهد

0±100a

06/1±05/0a

69/0±05/0a

76/1±02/0a

05/0±002/0bc

ABA 5

33/74±8/5b

79/0±12/0b

39/0±09/0b

19/1±22/0b

03/0±02/0c

ABA 25

22/72±3/9b

58/0±18/0bc

3/0±009/0b

89/0±17/0b

08/0±004/0a

ABA 50

88/60±7/4bc

57/0±16/0bc

44/0±09/0b

09/1±25/0b

07/0±01/0ab

ABA 100

66/51±4/8c

52/0±01/0c

34/0±04/0b

86/0±06/0b

08/0±007/0a

 

 

مطابق نتایج جدول 1، تیمار 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید به کاهش معنادار کلروفیل a به میزان 04/2 برابر در مقایسه با شاهد منجر شد. میزان کلروفیل b و کلروفیل کل نیز با افزایش غلظت آبسیزیک‌اسید روند رو به کاهش را نشان دادند. بیشترین مقدار کاروتنوئید در غلظت‌های 25، 50 و 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید مشاهده شد؛ هرچند این افزایش معنادار نبود.میزان H2O2 در تیمار ساقه‌ها با 5، 25، 50 و 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید به‌ترتیب 39/9، 73/7، 90/6 و 38/5 درصد نسبت به شاهد افزایش یافت (شکل 2). بر اساس نتایج شکل 3، میزان پراکسیداسیون لیپید فقط در غلظت 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید نسبت به شاهد افزایش یافت. نتایج شکل 4 نشان می‌دهند غلظت‌های 25، 50 و 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید مقدار پرولین گیاه را در مقایسه با شاهد افزایش دادند. تأثیر غلظت‌های مختلف آبسیزیک‌اسید بر فعالیت آنزیم کاتالاز در غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار معنادار بود. طبق شکل 5، A افزایش نُه برابری فعالیت آنزیم کاتالاز در غلظت 50 میکرومولار نسبت به شاهد مشاهده شد؛ اما در غلظت‌های 5 و 25 میکرومولار آبسیزیک‌اسید تفاوت معنا‌داری نسبت به شاهد دیده نشد. تأثیر غلظت‌های مختلف آبسیزیک‌اسید بر فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز معنادار بود؛ طبق شکل 5، B در غلظت‌های 5، 25، 50 و 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید میزان فعالیت این آنزیم به‌ترتیب 52/49، 32/48، 22/25 و 74/13 درصد کاهش یافت.تأثیر غلظت‌های مختلف آبسیزیک‌اسید بر فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز معنادار بود؛ طبق شکل 5، C میزان فعالیت این آنزیم در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید نسبت به شاهد افزایش نشان داد. تأثیر غلظت‌های مختلف آبسیزیک‌اسید بر فعالیت آنزیم سوپراکسید‌دیسموتاز معنادار بود؛ طبق شکل 5، D آبسیزیک‌اسید سبب افزایش فعالیت این آنزیم در تمام غلظت‌ها نسبت به نمونۀ شاهد شد.

 

 

 

شکل 2- تأثیر غلظت‌های متفاوت آبسیزیک‌اسید بر میزان H2O2 ساقه‌های کشت‌شدۀ M. officinalis. مقادیر، میانگین 3 تکرار±SE و حروف یکسان بیان‌کنندۀ عدم‌اختلاف معنادار با استفاده از آزمون LSD هستند.

 

 

شکل 3- تاثیر غلظت‌های متفاوت آبسیزیک‌اسید بر میزان پراکسیداسیون لیپید در ساقه‌های کشت‌شدۀ M. officinalis. مقادیر، میانگین 3 تکرار±SE و حروف یکسان بیان‌کنندۀ عدم‌اختلاف معنادار با استفاده از آزمون LSD هستند.

 

شکل 4- تأثیر غلظت‌های متفاوت آبسیزیک‌اسید بر میزان پرولین ساقه‌های کشت‌شدۀ M. officinalis. مقادیر، میانگین 3 تکرار±SE و حروف یکسان بیان‌کنندۀ عدم‌اختلاف معنادار با استفاده از آزمون LSD هستند.

 

   
   

 شکل 5- تأثیر غلظت‌‌های متفاوت آبسیزیک‌اسید بر فعالیت آنزیم کاتالاز (A)، گایاکول‌پراکسیداز (B)، آسکوربات‌پراکسیداز (C) و سوپراکسیددیسموتاز (D) در ساقه‌های کشت‌شدۀ M. officinalis. مقادیر، میانگین 3 تکرار±SE و حروف یکسان بیان‌کنندۀ عدم‌اختلاف معنادار با استفاده از آزمون LSD است.

 

 

بحث

نتایج پژوهش حاضر نشان دادند آبسیزیک‌اسید سبب کاهش شاخص رشد، میزان کلروفیل‌ها و افزایش میزان کاروتنوئید در ساقه‌های کشت‌شدۀ بادرنجبویه می‌شود (جدول 1). آبسیزیک‌اسید به افزایش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات‌پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و کاهش فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز در ساقه‌های کشت‌شدۀ بادرنجبویه منجر می‌شود (شکل 5) که با افزایش میزان پراکسید‌هیدروژن و پراکسیداسیون لیپید ساقه‌ها مطابقت دارد (شکل‌های 2 و 3)؛ همچنین تیمار آبسیزیک‌اسید سبب افزایش مقدار پرولین در کشت‌های ساقه می‌شود (شکل 4).

القای تنش اکسیداتیو در گیاهان در معرض تنش به افزایش انباشته‌شدن گونه‌های فعال اکسیژن به‌ویژه H2O2 و O2˚- در کلروپلاست‌ها، میتوکندری‌ها و پراکسیزوم‌‌ها منجر می‌شود؛ این رادیکال‌های آزاد اکسیژن مسئول بیشتر آسیب‌های اکسیداتیو شامل شکسته‌شدن DNA، پراکسیداسیون لیپید، اکسیداسیون آمینواسید و پروتئین در سیستم‌های زیستی هستند و درنتیجه سبب اختلال در متابولیسم طبیعی سلول، اختلال در فرایندهای مهم تنفس و فتوسنتز و کاهش رشد می‌شوند (Mishra et al., 2006)؛ همچنین توسعۀ سلول‌ها و به دنبال آن، رشد و باروری گیاهان را کاهش می‌دهند و در ادامه سبب تجمع آبسیزیک‌اسید و افزایش اسمولیت‌هایی مانند پرولین می‌شوند.

آبسیزیک‌اسید، هورمونی است که تولید آن در گیاهان طی رویارویی با تنش‌های محیطی افزایش می‌یابد. این هورمون با افزایش نسبت ریشه به اندام هوایی و جذب بهتر آب در شرایط کمبود، تحمل به تنش خشکی را بهبود می‌بخشد. Maleki و همکاران (2011) در بررسی گیاه زعفران نشان دادند با تیمار غلظت 1 میلی‌مولار آبسیزیک‌اسید، ارتفاع اندام هوایی و تعداد برگ کاهش می‌یابد؛ در‌حالی‌که اعمال این تیمار موجب افزایش طول ریشه می‌شود. Dongfeng و همکاران (2012) نشان دادند با تیمار آبسیزیک‌اسید (200 میکرومولار) در کشت ریشۀ موئینۀ Salvia miltiorrhiza، رشد گیاه کاهش می‌یابد.

در پژوهش حاضر، آبسیزیک‌اسید سبب کاهش وزن تر شد؛ به‌طوری که در غلظت 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید، بیشترین کاهش وزن تر (48/48 درصد) در مقایسه با شاهد مشاهده شد. کاهش وزن تر مشاهده‌شده در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید احتمالاً به‌علت کاهش رشد ناشی از تجمع گونه‌های فعال اکسیژن است؛ در پژوهش حاضر، همبستگی منفی و معنادار (96/0R2=) میان وزن تر و تجمع H2O2 مشاهده شد.

مطابق شکل 3، میزان کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل با افزایش غلظت آبسیزیک‌اسید روند کاهشی نشان دادند؛ به‌طوری‌که بیشترین کاهش میزان کلروفیل a در غلظت 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید مشاهده شد؛ ولی با افزایش غلظت آبسیزیک‌اسید، میزان کاروتنوئید در غلظت‌های 25 و 100 میکرومولار تیمار افزایش یافت.

کلروفیل نقش مهم و اثرگذاری در زندگی گیاهان عالی دارد و ازآنجاکه تجزیۀ کلروفیل و کاروتنوئید پاسخی عمومی به تنش است، می‌توان نتیجه گرفت تغییرات میزان کلروفیل و کاروتنوئید و نسبت رنگیزه‌ها شاخص مهم تنش محیطی هستند و تحمل گونه‌ها به تنش را توصیف می‌کنند. یکی از نشانه‌های رایج تنش اکسیداتیو، کاهش محتوای رنگیزه‌هاست که نتیجۀ سنتز کندتر یا تجزیۀ سریع‌تر آنهاست (Smirnoff, 1993). باتوجه‌به اینکه هر دو شاخص کلروفیل و پرولین از پیش‌مادۀ گلوتامات ساخته می‌شوند، می‌توان گفت افزایش سنتز پرولین طی تنش‌ها به کاهش سنتز کلروفیل منجر می‌شود (Rabiei, 2003). Amirian و همکاران (2015) بیان کردند میزان کلروفیل a با کاربرد 50 میلی‌لیتر محلول 5/2 مولار آبسیزیک‌اسید در دو تیمار آبسیزیک‌اسید و شاهد گیاه Sporobolus stapfianus، کاهش 20 درصدی کلروفیل a توسط آبسیزیک‌اسید را نشان می‌دهد.

اگرچه با افزایش غلظت تیمار آبسیزیک‌اسید، میزان کاروتنوئید در گیاهچه‌های M. officinalis افزایش یافت (جدول 1)، این افزایش معنادار نبود؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان کاروتنوئید در غلظت‌های 25، 50 و 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید مشاهده شد.

کاروتنوئید در چند سطح باعث حفاظت سیستم فتوسنتزی در برابر فوتون‌های اضافی نور و تنش اکسیداتیو می‌شود که ازجملۀ آنها می‌توان به واکنش کاروتنوئید با کلروفیل برانگیخته به‌منظور ممانعت از تشکیل رادیکال‌های فعال اکسیژن اشاره کرد؛ درحقیقت، کاروتنوئیدها در برابر تنش اکسیداتیو القا می‌شوند و به‌عنوان سیستم حفاظتی از بین می‌روند.

طبق گزارش Gu و همکاران (2010)، با کاربرد غلظت‌های 150 و 300 پی‌پی‌ام آبسیزیک‌اسید در کاهو هیچ تفاوت معناداری در میزان کلروفیل کل و کلروفیل a نسبت به شاهد دیده نمی‌شود، ولی میزان کلروفیل b و کاروتنوئید کل نسبت به شاهد افزایش درخور توجهی نشان می‌دهد. Navabpour (2012) گزارش کرد در برگ جو زراعی تیمارشده با آبسیزیک‌اسید، میزان کاروتنوئید در زمان‌های 5، 10، 20 و 40 ساعت پس‌از محلول‌پاشی با افزایش غلظت آبسیزیک‌اسید (صفر، 50، 200 و800 میکرومولار) افزایش نشان می‌دهد. طبق گزارش Jiang و Zhang (2001)، آبسیزیک‌اسید به میزان درخور توجهی محتوای کلروفیل و کاروتنوئید را در برگ‌های نهال ذرت افزایش می‌دهد.

در پژوهش حاضر، کاهش محتوای کلروفیل ساقه‌های کشت‌شدۀ بادرنجبویه در تیمار با آبسیزیک‌اسید پاسخی به شرایط تنش است که ممکن است به‌علت کاهش وزن تر یا سنتز کندتر، تجزیۀ سریع‌تر این رنگیزه یا نقص در سیستم فتوسنتزی طی تیمار آبسیزیک‌اسید رخ دهد. از سوی دیگر، باتوجه‌به شکل 4 مشاهده می‌شود در تیمار آبسیزیک‌اسید، میزان پرولین افزایش می‌یابد؛ بنابراین احتمال دارد علت دیگر کاهش محتوای کلروفیل‌ها، افزایش میزان پرولین باشد. در پژوهش حاضر، همبستگی منفی و معناداری (83/0R2=) میان میزان کلروفیل و تجمع پرولین مشاهده شد.

طبق نتایج پژوهش حاضر (شکل 2)، میزان H2O2 در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید نسبت به شاهد افزایش نشان می‌دهد. یکی از تغییرات بیوشیمیایی که در گیاه در معرض تنش ایجاد می‌شود، تجمع گونه‌های فعال اکسیژن است که محصول اجتناب‌ناپذیر متابولیسم طبیعی سلول هستند. این رادیکال‌ها تنش ثانویۀ اکسیداتیو را از طریق پراکسیداسیون لیپیدها و در‌نتیجه تخریب غشا، تخریب پروتئین‌ها، غیر‌فعال‌کردن آنزیم‌ها، از‌بین‌بردن رنگیزه‌ها و اختلال در عملکرد DNA ایجاد می‌کنند که خسارت‌های جدی به ساختارهای سلولی و گیاه را در پی دارد (Sandalio et al., 2001). H2O2 در گیاهان ممکن است از دو مسیر احتمالی تولید شود: دیسموتاسیون O2˚- توسط SOD و از طریق اکسیدازهایی مانند NADPH اکسیداز، آمین‌اکسیداز، اگزالات‌اکسیداز و اکسیدازهای حاوی فلاوین (Jajic et al., 2015). مدت‌هاست نقش H2O2 در آسیب القا‌شده توسط تنش مشخص شده است، اما امروزه به‌طور‌کلی پذیرفته شده است H2O2 یکی از اجزای کامل آبشارهای پیام‌دهی سلول و پیک ثانویۀ ضروری در تنش‌های زیستی و غیرزیستی است (Pastori and Foyer, 2002)؛ همچنین در فرایندهای پیام‌دهی وابسته به هورمون، رشد و تقسیم دیوارۀ سلولی و پیام‌رسانی در سلول‌های نگهبان از طریق تنظیم بسته‌شدن روزنه مؤثر است (Schroeder et al., 2001). یکی دیگر از نقش‌های پیام‌دهی H2O2 در فرایندهای فیزیولوژیکی مختلف در شرایط تنش است؛ این فرایندها شامل تنظیم فرایند پیری، حفاظت در برابر حملۀ بیماری‌زا‌ها، کاهش شدت تنش در نور کم و اثر گذاشتن روی بیان صدها ژن است (Jajic et al., 2015).

طبق گزارش‌های Tsai و Kao (2004)، H2O2 در فعالیت آنزیم‌های گلوتاتیون‌ردوکتاز (GR) و آسکوربات‌پراکسیداز (APX) ناشی از آبسیزیک‌اسید در ریشه‌های برنج درگیر است. Mohd Hafiz وHawa  (2013) اظهار داشتند H2O2 در گیاه Orthosiphone stamineus با افزایش غلظت آبسیزیک‌اسید (0 تا 6 میکرومولار) افزایش می‌یابد. Lin و Kao (2001) نیز نشان دادند آبسیزیک‌اسید تولید H2O2 و O2˚- را در نهال‌های برنج افزایش می‌دهد. در پژوهش حاضر، افزایش میزان H2O2 (احتمالاً به‌علت نشت الکترون از زنجیرۀ انتقال الکترون) و ترکیب‌شدن آن با اکسیژن مولکولی به تولید بیشتر گونه‌های فعال اکسیژن در مقایسه با نمونۀ شاهد منجر شد و درنتیجه، میزان آن افزایش یافت.

نتایج پژوهش حاضر (طبق شکل 3) افزایش چشمگیر میزان پراکسیداسیون لیپید را تنها در تیمار 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید نسبت به شاهد نشان می‌دهند. در شرایط تنش‌زا، فرایندهای مخرب غشا فعال و به پراکسیداسیون لیپیدهای غشا منجر می‌شوند؛ برای نمونه، رادیکال‌های آزاد تنش اکسیداتیو حاصل از شرایط محیطی نامناسب باعث آسیب‌رساندن به لیپیدها و اسیدهای چرب غشایی می‌شوند و رادیکال‌های لیپید و پراکسی و هیدروکسی‌پراکسی تولید می‌کنند. رادیکال‌های جدید تولید‌شده واکنش‌های اکسیداسیون لیپیدها را تسریع می‌کنند. مالون‌دی‌آلدئید شاخص مناسبی برای پراکسیداسیون لیپید غشا محسوب می‌شود. Moraghebi و همکاران (2007) گزارش کردند گیاهچه‌های ذرت تیمارشده با آبسیزیک‌اسید به‌طور معناداری سطح MDA کمتری نسبت به تیمارهای بدون آبسیزیک‌اسید دارند؛ همچنین کلسیم‌کلرید همراه آبسیزیک‌اسید موجب تخفیف تنش گرما و کاهش مقدار MDA در گیاهچه‌ها در مقایسه با تیمار آبسیزیک‌اسید می‌شود.

در پژوهش حاضر، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تنها در غلظت 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید نسبت به نمونۀ شاهد افزایش یافت که این مشاهده با‌توجه‌به افزایش H2O2 در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید قابل‌توجیه است. درحقیقت، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا به‌واسطۀ تولید اکسیژن‌های فعال در حضور بیشترین غلظت آبسیزیک‌اسید افزایش می‌یابد.

بررسی‌های انجام‌شده در پژوهش حاضر (طبق شکل 5) نشان دادند فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار آبسیزیک‌اسید افزایش معناداری نسبت به شاهد دارد. فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید نسبت به شاهد کاهش یافت. فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید نسبت به نمونۀ شاهد افزایش نشان داد. طبق شکل 5، فعالیت آنزیم سوپراکسید‌دیسموتاز در تمام تیمارها افزایش معناداری نسبت به شاهد داشت.

در سال‌های اخیر مشخص شده است انواع تنش‌های محیطی به تنش اکسیداتیو منجر می‌شوند. افزایش مقاومت به تنش اغلب با فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در گیاهان رابطه دارد. آنزیم‌های کاتالاز (CAT)، آسکوربات‌پراکسیداز (APX) و سوپر‌اکسید‌دیسموتاز (SOD) نقش مهمی در سیستم‌های آنتی‌اکسیدان گیاهان دارند و مقدار این آنزیم‌ها با تیمار آبسیزیک‌اسید افزایش می‌یابد (Moraghebi et al., 2007). مشخص شده است آبسیزیک‌اسید باعث القای بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدان و افزایش ظرفیت سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدان ازجمله ترکیبات آنزیمی و غیرآنزیمی می‌شود (Jiang and Zhang, 2001)؛ القای فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، راهکاری برای سازگاری کلی گیاهان به‌منظور غلبه بر تنش‌های اکسیداتیو است. مشخص شده است آبسیزیک‌اسید نسخه‌برداری ژن‌های CAT2 و CAT3 در جنین ذرت را افزایش می‌دهد (Knight, 2000).

در گیاهان، ایزوفرم‌های آسکوربات‌پراکسیداز با حداقل چهار محل در سلول (تیلاکوئیدها، میتوکندری، سیتوزول و پراکسی‌زوم) مرتبط هستند. Talaei و Shahpiri (2015) گزارش کردند فعالیت آنزیمی آسکوربات‌پراکسیداز در لایۀ آلرون بذر جو تیمار‌شده با آبسیزیک‌اسید طی 6 تا 72 ساعت انکوباسیون، روند افزایشی نشان می‌دهد؛ در این تیمار بر‌خلاف آلرون‌های کشت‌شده در محیط بدون هورمون، میزان فعالیت آنزیمی آسکوربات‌پراکسیداز در آلرون‌های انکوبه‌شده به‌مدت 72 ساعت به‌طور درخور توجهی بیش از فعالیت آنزیمی آسکوربات‌پراکسیداز در آلرون‌هایانکوبه‌شده به‌مدت 48 ساعت است. فعالیت زیاد آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز نقش آن را در سم‌زدایی H2O2 نشان می‌دهد (Zhou et al., 2008)؛ بنابراین در پژوهش حاضر، افزایش فعالیت این آنزیم بیان‌کنندۀ نقش آن در سم‌زدایی H2O2 است.

آنزیم گایاکول‌پراکسیداز، اکسیداسیون پیش‌مادۀ وابسته به پراکسیدهیدروژن را کاتالیز می‌کند. گایاکول‌پراکسیداز بیوسنتز لیگنین را تحریک می‌کند و قادر به ایجاد سد فیزیکی در برابر فلزات سنگین سمی است که به موجب آن، بافت‌ها را علیه رادیکال‌های آزاد فعالی که به سلول‌ها آسیب می‌رسانند، تقویت می‌کند (Hegedus et al., 2001)؛ همچنین این آنزیم از غشای سلولی در برابر اکسیدان‌های فعال حفاظت و گیاهان را در کاهش آثار تنش یاری می‌کند. کاهش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان ممکن است به‌علت شکسته‌شدن مولکول‌های آنزیم توسط رادیکال‌های آزاد اکسیژن باشد (Sandalio et al., 2001).

توانایی برخی گیاهان در غلبه بر تنش اکسیداتیو تا حدی به القای فعالیت SOD و متعاقباً افزایش بیان آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان پایین‌دست تکیه دارد. مشخص شده است آبسیزیک‌اسید نسخه‌برداری ژن‌های SOD3.1، SOD3.2، SOD3.3 و SOD3.4 در مزوکوتیل ذرت را افزایش می‌دهد (Knight, 2000). مطالعه‌های Mahmoodzadeh و Esparham (2011) نشان دادند استفاده از آبسیزیک‌اسید در نهال لوبیا، تولید APX، CAT و SOD را به‌طور درخور توجهی افزایش می‌دهد؛ علاوه‌بر‌این، شواهد گویای اینست که آبسیزیک‌اسید بیان ژن‌هایی را القا می‌کند که Fe-SOD، Mn-SOD، Cu, Zn-SOD (Kaminaka et al., 1999) و CAT (Guan et al., 2000) را کد می‌کنند.

در پژوهش حاضر، آنزیم‌های آسکوربات‌پراکسیداز و سوپراکسید‌دیسموتاز در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید افزایش معنا‌داری نسبت به شاهد داشتند؛ ولی درمورد آنزیم کاتالاز، تنها در غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار افزایش معنا‌دار در مقایسه با شاهد دیده شد که با افزایش میزان H2O2 در این دو غلظت همخوانی دارد. کاهش فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز در تمام غلظت‌های آبسیزیک‌اسید می‌تواند به‌علت شکسته‌شدن مولکول‌های آنزیم توسط رادیکال‌های آزاد اکسیژن باشد.

 

جمع‌بندی

فیتوهورمون‌ها محرک‌های ویژه و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی هستند که به‌طور وسیع برای تحریک تولید برخی از متابولیت‌های ثانویۀ مهم در گیاهان استفاده می‌شوند. مشخص شده است آبسیزیک‌اسید باعث تنش اکسیداتیو در گیاهان می‌شود و غلظت‌های زیاد آن، تولید زیاد گونه‌های فعال اکسیژن را به دنبال دارد و به آسیب اکسیداتیو در سلول‌های گیاه منجر می‌شود. این محرک می‌تواند پاسخ‌های سلولی بی‌شماری را از طریق آبشارهای انتقال پیام پیچیده در گیاه ایجاد کند. با‌توجه‌به نتایج پژوهش حاضر به نظر می‌رسد در ساقه‌های بادرنجبویه تیمارشده با غلظت‌های مختلف آبسیزیک‌اسید، این هورمون به‌عنوان مولکول انتقال پیام نقش مهمی در تولید پراکسیدهیدروژن و فرایند تولید پروتئین‌های دفاعی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاتالاز و پراکسیدازها دارد. کاربرد آبسیزیک‌اسید در این گیاه به تشدید فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانی و افزایش غلظت آنزیم‌های سوپراکسیددیسموتاز و آسکوربات‌پراکسیداز به‌منظور کاهش آثار ایجاد‌شده توسط تنش اکسیداتیو ناشی از کاربرد اگزوژن آبسیزیک‌اسید منجر می‌شود.

 

سپاسگزاری

پژوهش حاضر در قالب پایان‌نامۀ دانشجویی و با حمایت معاونت محترم پژوهشی دانشگاه شهرکرد انجام پذیرفته است و به ‌این وسیله از گرنت با شمارۀ 95GRN1M1032 سپاسگزاری می‌شود.

Aebi, H. (1984) Catalase in vitro. Methods Enzymology 105: 121-126.

Amirian, H., Ghasempour, H., Ghorbanli, M., Vanaee, S. and Ghasemi, H. (2015) Investigation of abscisic acid on increasing drought tolerance of Sporobolus stapfianus in comparison with Sporobolus pyramidalis. Journal of Iranian Plant Ecophysiological Research 9: 1-11 (in Persian).

 

Asada, K. (2006) Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions. Plant Physiology 141(2): 391-396.

Alexieva, V., Sergiev, I., Mapelli, S. and Karanov, E. (2001) The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant, Cell & Environment 24(12): 1337-1344.

Arnon, D. I. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology 24(1): 1-15.

Bellaire, B. A., Carmody, J., Braud, J., Gossett, D. R., Banks, S. W., Lucas, M. C. and Fowler, T. E. (2000) Involvement of abscisic acid-dependent and- independent pathways in the upregulation of antioxidant enzyme activity during NaCl stress in cotton callus tissue. Free Radical Research 33: 531-545.

Beyer, W. F. and Fridovich, I. (1987) Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequences of minor change in condition. Analytical Biochemistry 161(2): 559-566.

Bueno, P., Piqueras, A., Kurepa, J., Savouré, A., Verbruggen, N., Van Montagu, M. and Inzé, D. (1998) Experssion of antioxidant enzymes in response to abscisic acid and high osmoticum in tobacco BY-2 cell cultures. Plant Science 138: 27-34.

Dongfeng, Y., Dongfeng, S., Qimei, D., Xiao, L., Zongsuo, L. and Yan, L. (2012) PEG and ABA trigger the burst of reactive oxygen species to increase tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy roots. Plant Growth Regulation 31: 579-587.

Ertan, T., Soran, A., Kocer, B. and Cengiz, O. (2002) Oxidative stress in hemorrhagic shock: Prospective clinical study. Nagoya Medical Journal 45(2): 43-54.

Gagne, S., Cluzet, S., Merillon, J. M. and Geny, L. (2011) ABA initiates anthocyanin production in grape cell cultures. Journal of Plant Growth Regulation 30: 1-10.

Gong, M., Li, Y. J. and Chen, S. Z. (1998) Abscisic acid-induced thermotolerance in maize seedlings is mediated by calcium and associated with antioxidant systems. Journal of Plant Physiology 153: 488-496.

Gu, L., Li, Z., Zhao, X. and Sandhu, A. (2010) Effects of exogenous abscisic acid on yield, antioxidant capacities, and phytochemical contents of greenhouse grown Lettuces. Journal of Agriculture Food Chemistry 58: 6503-6509.

Guan, L., Zhao, J. and Scandalios, J. G. (2000) Cis-elements and trans-factors that regulate expression of the maize Catl antioxidant gene in response to ABA and osmotic stress: H2O2 is the likely intermediary signaling molecule for the response. Plant Journal 22: 87-95.

Hare, P. O., Cress, W. A. and Van Staden, J. (1999) Proline synthesis and degradation: a model system for elucidating stress-related signal transduction. Journal of Experimental Botany 50: 413-434.

Hegedus, A., Erdei, S. and Horvath, G. (2001) Comparative studies of H2O2 detoxifying enzymes in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant Science 160(6): 1085-1093.

Jajic, I., Sarna, T. and Strzalka, K. (2015) Senescence, Stress, and Reactive Oxygen Species. Plants 4(3): 393-411.

Jiang, M. and Zhang, J. (2001) Effect of abscisic acid on active oxygen species, antioxidative defence system, and oxidative damage in leaves of maize seedlings. Plant Cell Physiology 42: 1265-1273.

Kaminaka, H., Morita, S., Tokumoto, M., Masumura, T. and Tanaka, K. (1999) Differential gene expression of rice superoxide dismutase isoforms to oxidative and environmental stresses. Free Radical Research 31: 219-225.

Knight, H. (2000) Calcium signalling during abiotic stress in plants. International Review of Cytology 195: 269-324.

Lattanzio, V., Cardinali, A., Ruta, C., Fortunato, I. M., Lattanzio, V. M. T., Linsalata, V. and Cicco, N. (2009) Relationship of secondary metabolism to growth in oregano (Origanum vulgare L.) shoot cultures under nutritional stress. Environmental and Experimental Botany 65: 54-62.

Lichtenthaler, H. K. (1987) Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology 148: 350-382.

Mahmoodzadeh, H. and Esparham, E. (2011) Changes in hydrogen peroxide content and antioxidant enzymes in abscisic acid induced antioxidant defense in leaves of bean seedlings. International Journal of Botany 7: 195-199.

Maleki, M., Ebrahimzade, H., Gholami, M. and Niknam, V. (2011) The effect of drought stress and exogenouse abscisic acid on growth protein content and antioxidative enzyme activity in saffron (Crocus sativus L.). African Journal of Biotechnology 10(45): 9068-9075.

Mishra, S., Srivastava, S., Tripathi, R. D., Govindarajan, R., Kuriakose, S. V. and Prasad, M. N. V. (2006) Phytochelatin synthesis and response of antioxidants during cadmium stress in Bacopa monnieri L. Plant Physiology and Biochemistry 44(1): 25-37.

Mohd Hafiz, I. and Hawa, Z. E. (2013) Abscisic acid induced changes in production of primary and secondary metabolites, photosynthetic capacity, antioxidant capability, antioxidant enzymes and lipoxygenase inhibitory activity of Orthosiphon stamineus Benth. Molecules 18: 7957-7976.

Moraghebi, F., Madani, A. and Ghasemi, M. (2007) The effect of abscisic acid on the induced thermotolerance in the maize seedlings and its relationship with calcium ion and antioxidant systems. Plant and Ecosystem 7: 49-67 (in Persian).

Moran, J. F., Becana, M., Iturbe-Ormaetxe, I. A., Frechilla, S., Klucas, R. V. and Aparicio-Tejo, P. (1994) Drought induces oxidative stress in pea plant. Planta 194(3): 346-352.

Nakano, Y. and Asada, K. (1987) Purification of ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts; its inactivation in ascorbate-depleted medium and reactivation by monodehydroascorbate radical. Plant and Cell Physiology 28(1): 131-140.

Navabpour, S. (2012) Effect of abscisic acid application on enzymatic and non-enzymatic activity in barley (Hordeum vulgare L.). Cereal Research 1: 39-51 (in Persian).

Pastori, G. M. and Foyer, C. H. (2002) Common components, networks, and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of “redox” and abscisic acid-mediated controls. Plant Physiology 129(2): 460-468.

Pei, Z. M., Murata, N., Benning, O., Thomine, S., Klusener Allen, G. J., Grill, E. and Schroeder, J. I. (2000) Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells. Nature 406: 731-734.

Rabiei, V. (2003) Physiological and morphological reaction of some grapes varieties to drought stress. PhD thesis, Tehran University, Tehran, Iran.

Rotilio, G., Rossi, L., De Martino, A., Da Costa Ferreira, A. M. and Ciriolo, M. R. (1995) Free radicals, meta ions and oxidative stress: chemical mechanisms of damage and protection in living system. Journal of the Brazilian Chemical Society 6(3): 221-227.

Sandalio, L. M., Dalurzo, H. C., Gomez, M., Romero-Puertas, M. C. and Del Rio, L. (2001) Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants. Journal of Experimental Botany 52(364): 2115-2126.

Schroeder, J. I., Kwak, J. M. and Allen, G. J. (2001) Guard cell abscisic acid signaling and engineering drought hardiness in plants. Nature 410(6826): 327-330.

Smirnoff, N. (1993) The role of active oxygen in the response of plants to water deficit and desiccation. New Phytologist 52: 27-58.

Talaei, N. and Shahpiri, A. (2015) Analysis of gene expression and enzymatic activity of ascorbate peroxidase in aleurone layers treated with gibberellic acid, abscisic acid and salicylic acid hormones. Journal of Plant Process and Function 3(10): 39-46 (in Persian).

Troll, W. and Lindsley, J. (1955) Aphotometric method for the determination of prolin. Journal Biology Chemistry 215: 655-660.

Tsai, Y. C. and Kao, C. H. (2004) The involvement of hydrogen peroxide in abscisic acid-induced activities of ascorbate peroxidase and glutathione reductase in rice roots. Plant Growth Regulation 43: 207-212.

Lin, C. C. and Kao, C. H. (1999) NaCl induced changes in ionically bound peroxidase activity in roots of rice seedling. Plant and Soil 216(1-2): 147-153.

Zhao, J., Davis, L. C. and Verpoorte, R. (2005) Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnology Advances 23: 283-333.

Zhou, Z. S., Wang, S. J. and Yang, Z. M. (2008) Biological detection and analysis of mercury toxicity to alfafa (Medicago sativa) plants. Chemosphere 70(8): 1500-1509.