اثر دور آبیاری و محلولپاشی کیتوزان بر برخی خصوصیات فیزیولوژیکی و میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی پنیرک معمولی (Malva sylvestris)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 بیوتکنولوژی ،دانشکده کشاورزی،دانشگاه زابل، زابل،ایران

2 زابل- دانشگاه زابل- دانشکده کشاورزی-گروه زراعت

3 علوم باغبانی،دانشکده کشاورزی،دانشگاه زابل،زابل،ایران

4 باغبانی،دانشکده کشاورزی،دانشگاه زابل،زابل،ایران

5 گروه باغبانی،دانشکده کشاورزی،دانشگاه زابل،زابل،ایران

10.22108/ijpb.2019.110063.1084

چکیده

بـه منظـور بررسی اثر دور آبیاری و محلولپاشی کیتوزان بر برخی خصوصیات فیزیولوژیکی و میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی پنیرک معمولی، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک‌های کاملاً تصادفی با سه تکرار در سال 1394 در دانشکده کشاورزی دانشگاه زابل اجرا شد. تیمارهای آزمایشی شامل دور آبیاری (11 و 15 روز) و محلولپاشی کیتوزان (صفر(شاهد)، ۰۵/۰ و ۱ میلی‌گرم در لیتر) بودند. نتایج اثرات متقابل نشان داد که محلولپاشی با یک میلی‌گرم در لیتر کیتوزان طی آبیاری کامل به ترتیب باعث افزایش 27 و 7 درصدی مقدار کلروفیل a و محتوی نسبی آب برگ شد و از طرفی محلولپاشی با یک میلی‌گرم در لیتر کیتوزان طی آبیاری 15 روز باعث افزایش مقدار فنل کل (79 درصدی)، پرولین (68 درصدی) و فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی پراکسیداز(51 درصدی)، اسکوربات پراکسیداز(72 درصدی)، گایاکول پراکسیداز (70 درصدی)، سوپراکسید دیسموتاز (54 درصدی) و کاتالاز(80 درصدی) نسبت به شاهد شد. نتایج همبستگی نشان داد که میزان پرولین با محتوی نسبی آب برگ رابطه مستقیم ولی با رنگیزه‌های فتوسنتزی همبستگی عکس دارد. همچنین بین آنتی اکسیدانت آنزیمی وغیر آنزیمی همبستگی مثبت و معنی داری مشاهده شد. بنابراین نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت یک میلی‌گرم کیتوزان با افــزایش فعالیــت سیســتم دفــاع آنتــی‌اکســیدانی گیاه باعث کــاهش پراکسیداسیون لیپیدها گردیده و با حفظ تعادل آبی سلول، ازکاهش شدید محتوی نسبی آب برگ جلوگیری می‌کند و از این طریق منجر به پایداری ساختار سلول در برابر تنش کم آبی می‌شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of irrigation interval and chitosan spraying on some physiological characteristics and Antioxidant enzymes activity of common Mallow (Malva sylvestris)

نویسندگان [English]

  • Ayoub Mazarie 1
  • Alireza Sirousmehr 2
  • massoumeh broshaki 3
  • zahra babaei 4
  • aliakbar mahmmody 5
1 biotechnology,faculty of agriculture,university of zabol,zabol,iran
2 department of agronomy, faculty og agriculture,university of zabol,zabol,iran
3 horticulture,faculty of agriculture,university of zabol,zabol,iran
4 horticulture,university of zabol,zabol,iran
5 horticulture,faculty of agriculture,university of zabol,zabol,iran
چکیده [English]

In order to evaluate the effects of chitosan spraying and irrigation interval on physiological characteristics and antioxidant enzymes common mallow, a factorial experiment in a completely randomized design with three replications was conducted in 2015 at the Faculty of Agriculture, University of Zabol. The experimental treatments included irrigation interval (Irrigation interval 7 day, Irrigation interval 11 day and irrigation interval 15 day) and foliar chitosan spray (0, 0.5 and 1 mg.l-1). The results of interaction showed that spraying with 1 mg. l -1 chitosan during irrigation increased 27 and 7 % respectively, chlorophyll a and the relative content of leaf water and on the other hand spraying with 1 mg. l -1 chitosan during 15 day irrigation cause increased in total phenol content (79 %),proline (68 %) and Activity of antioxidant enzymes peroxidase (51 %), ascorbate peroxidase (72 %), guaiacol peroxidase (70 %), superoxide dismutase (54 %) and catalase (80 %) relative to the control. The results of correlation showed that proline had significant and positive correlation with RWC, but showed a negative correlation with photosynthetic pigments. Also there was a significant positive correlation between enzyme and non-enzymatic antioxidants.. The results of this study showed that chitisan spraying at the rate of 1 mg. l -1 reduced the lipid peroxidation, through increasing the antioxidant defense system activities of the plant and prevent the relative water content of the leaf through retaining cells’ water balance which, consequently, leads to cells’ structures stability against deficit stress.

کلیدواژه‌ها [English]

  • osmotic modulation
  • irrigation interval
  • Antioxidant defense system
  • Spraying

پنیرک معمولی (Malva sylyestris L.) گیاهی بوته‌ای از خانوادة پنیرک (Malvaceae) است که ارتفاع آن متفاوت و بین 5/00 تا 1 متر است که به شرایط محل رویش بستگی دارد. این گیاه، ریشه‌ای کم‌و‌بیش منشعب، مخروطی‌شکل و راست با ضخامت 150 تا 250 سانتی‌متر دارد (Omidbaigi, 2006; Paul, 2016). بین تنش‌ها، خشکی یکی از مهم‌ترین عوامل کاهندة رشد و عملکـرد گیاهـان دارویی و زراعی است؛ به ‌طوری‌ که بر ۴۰ تا ۶۰ درصد زمین‌های کشاورزی جهان اثر می‌گذارد (Sankar et al., 2007; Mazaraie et al., 2017). وقتی پتانسـیل آب خـاک کاهش می‌یابد، گیاهان برای حفظ قدرت جذب آب بایـد پتانسـیل آب درونی را به‌اندازه‌ای کاهش دهند تا به یک شیب مطلوب برسـد. بـرای ایجاد جریان آب از خاک به داخل ریشه‌ها مهم‌ترین سازوکار، تنظیم اسمزی است که بـا هـدف حفـظ تورژسـانس سـلولی، تـداوم جـذب از محـیط ریشـه و پایـداری غشـاها انجام می‌شود (Ma et al., 2006).

مواد تنظیم‌کنندة فشار اسمزی، بیشتر شامل یون‌های غیرآلی (مانند پتاسیم، کلسیم و کلر) و ترکیبات آلی بدون بار (مانند آمینواسیدها، کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها و هورمون‌ها) هستند. پرولین یکی از آمینواسیدهای فعـال در پدیدة تنظیم اسمزی است که در ایجـاد و حفـظ فشـار اسمزی درون گیاه نقش بسـزایی دارد (Martin et al., 1993).

تجمع پرولین آزاد، پاسـخی متـداول بـه تـنش در گیاهـان عـالی است (Vendruscolo et al., 2007). گزارش‌های متعددی مبنی بر وجـود همبسـتگی مثبـت بین تجمع پرولین و سازش به شرایط تنش اسمزی در تـنش‌هـای خشکی و شوری گیاهان وجود دارند (Bohenert and Shen, 1999; Mishra and Dubey, 2006). پرولین در شرایط تنش علاوه‌بر حفظ تعادل اسمزی گیاه؛ نوعی پایدارکنندة پروتئین‌ها، کلات‌کنندة فلزی، مهارکنندة پراکسیداسیون لیپیدی و حذف‌کنندة رادیکال‌های آزاد است (Mishra and Dubey, 2006). در ماریتیغال، لوبیا و سویا با کاهش پتانسـیل آب، افـزایش معنی‌داری در میزان پرولین مشاهده شد (Lazcano-ferrat and Lovatt, 1999; Mazaraie et al., 2017).

یکی از پیامدهای بیوشیمیایی تنش خشکی در گیاهان، تجمع گونه‌های فعال اکسیژن است که محصول اجتناب‌ناپذیر متابولیسم طبیعی سلول است. کلروپلاست و میتوکندری سلول‌های گیاهی از مهم‌ترین اندامک‌های تولید‌کنندة گونه‌های فعال اکسیژن هستند (Naderi et al., 2015). الکترون‌های نشت‌شده از زنجیرة انتقال الکترون ممکن است با اکسیژن مولکولی به‌دست‌آمده از متابولیسم طبیعی گیاه ترکیب شوند و گونه‌های فعال اکسیژن مانند سوپر اکسید، هیدروژن پراکسید و رادیکال‌ هیدروکسیل تولید کنند. این گونه‌های اکسیژن، سمی و بسیار واکنش‌پذیرند و در نبود سازوکارهای حفاظتی متابولیسم طبیعی سلول را به‌میزان زیادی مختل می‌کنند (Sharma and Dubey, 2005). این رادیکال‌ها با پراکسیداسیون لیپیدها و درنتیجه تخریب غشا، تخریب پروتئین‌ها (Moran et al., 1994)، غیرفعال‌کردن آنزیم‌ها، از بین بردن رنگیزه‌های فتوسنتزی و اختلال در عملکرد DNA تنش ثانویة اکسیداتیو ایجاد می‌کند که خسارت‌های جدی به ساختار‌های سلولی و گیاه وارد می‌کند. گیاهان در مقابله با تنش خشکی، سازوکارهای حفاظتی متفاوتی مانند سازوکارهای آنزیمی و غیرآنزیمی دربرابر تنش اکسیداتیو ناشی از خشکی دارند (Tian and Li, 2006).

آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی شامل بتاکاروتن، آسـکوربیک اسید، آلفا توکـوفرول، گلوتاتیون و آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمـی شـامل سوپراکسـید دیسـموتاز، گایـــاکول پراکســـیداز، آســـکوربات پراکســـیداز و کاتالاز هستند (Xu et al., 2006).گیاهان با افزایش فعالیت آنـزیم‌هـای آنتی‌اکسیدانی مانند کاتـالاز، سوپراکسـید دیسـموتاز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز یا تولید بیشتر این آنزیم‌هـا اکسـیژن‌هـای فعـال را خنثی مـی‌کننـد (Zhili et al., 2012). توازن بین تولید گونه‌های اکسیژن فعال و حذف آنها در شرایط تنش با آنتی‌اکسیدان‌ها انجام می‌شود (Harinasut et al., 2003). توانایی سیستم آنتی‌اکسیدانی ممکن است از آسیب ناشی از تنش جلوگیری کند که این مسئله به مقاومت گیاهان به تنش مربوط می‌شود (Malekpoor et al., 2015).

در حال ‌حاضر، برای سیسـتم‌های کشاورزی پیشرفته، استفاده از مواد فعال زیستی و سازگار با محـیط بـرای حفظ گیاهان و همچنین افزایش رشد ضـرورت دارد. یکی از این روش‌ها کـه به‌تازگی توجه پژوهشگران به آن معطوف شده است استفاده از پلیمر زیستی کیتـوزان است. این ماده با داشتن ویژگی‌های زیستی و فیزیولوژیک منحصر‌به‌فرد، کاربردهای متعددی در صنایع متفاوت دارویی، پزشکی و کشاورزی دارد (Bautista-Baños et al., 2006).

کیتوزان‌ها پلیمرهای آلـی زیستی، غیرسمی، طبیعی و تجزیه‌پذیر هستند که در شرایط صنعتی از استیل‌زدایی (حذف گروه عاملی استیل با فرمول شیمیایی COCH3) جزئی کیتین به‌دست‌آمده از پوستة خارجی سخت‌پوسـتانی مانند میگـو و خرچنـگ دریـایی در محیط قلیایی تولید می‌شوند (Rinaudo, 2006). گزارش شده است کیتوزان‌ها به‌دلیل تأثیر بر بیـان ژن‌هـای گیـاهی قادرند بـه برخـی عوامـل نامسـاعد محیطی، مقاومت ایجاد کنند (Demirevska et al., 2009). برای ایـن گـروه از مـواد ویژگی‌های ضد قارچی، ضد باکتریایی، ضد ویروسـی، اصـلاح و تقویـت خاک، بهبود رشد و عملکرد، افـزایش مقـدار متابولیـت‌هـای ثانویـه و فعال‌کردن سازوکارهای دفاعی در گیاهـان گـزارش شـده‌اند (Waseem et al., 2010).

نتایج بررسی‌ها نشان می‌دهند کیتوزان‌ها به‌طور چشمگیری پایداری غشا‌های سلولی را افزایش می‌دهند (Yang et al., 2009) و به‌دلیل افزایش هدایت روزنه‌ای و کاهش مقدار تعرق، افزایش مقدار فتوسنتز را موجب می‌شوند و بر ارتفاع گیاه، طول ریشه‌ها و مقدار زیست‌توده تأثیر می‌گذارند (Boonlertinirun et al., 2008). در آزمایشی محلول‌پاشی با ترکیبات کیتوزانی کاهش مقـدار تولید مالون‌دی‌آلدهید را در سلول‌های گیاهی باعث شد کـه شاخص کـاهش مقدار خسارت در شرایط تنش خشـکی به شمار می‌رود (Abdalla, 2011). افـزایش کارایی مصرف آب (Boonlertinirun et al., 2008)، کاهش صدمة ناشی از تنش خشـکی (Morello et al., 2005)، افزایش مدت مانـدگاری میـوه‌هـا (Iriti and Faoro, 2009) و گل‌ها (Uthairatanakij et al., 2007) و تغییـر فعالیـت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی (Zhili et al., 2012) با مصرف ترکیبـات کیتـوزانی گـزارش شده‌اند. تیمار گیاهان برنج با کیتوزان قبل از تنش خشکی، خسارت تنش خشکی را در این گیاه کاهش داده است. این تأثیر به بسته‌شدن روزنه‌های گیاه به‌دلیل تولید متابولیت‌های ثانویه در برنج و به‌دنبال آن کاهش تعرق نسبت داده شده است (Boonlertnirun et al., 2011). با توجه ‌به روند رو ‌به ‌افزایش کم‌آبی و وقوع خشک‌سالی‌های مداوم در سال‌های گذشته و نقش کیتوزان در کاهش آثار منفی تنش در گیاهان و همچنین اهمیت پنیرک معمولی به‌دلیل داشتن مواد موسیلاژی خلط‌آور و نرم‌کنندة سینه و مجاری تنفسی و فواید آن در درمان التهاب غشاهای مخاطی و برونشیت(Paul, 2016)، پژوهش حاضر برای بررسی اثر تنش خشکی و محلول‌پاشی کیتوزان بر برخی ویژگی‌های فیزیولوژیک و میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی گیاه دارویی پنیرک معمولی انجام شد.

 

مواد و روش‌ها

بـرای بررسی اثر تنش خشکی و محلول‌پاشی کیتوزان بر برخی ویژگی‌های فیزیولوژیک و میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی در سه تکرار در سال ۱۳۹۴ در مزرعة تحقیقاتی دانشکدة کشاورزی زابل واقع در سد سیستان اجرا شد. قبل از کاشت از خاک مزرعه نمونه‌برداری شد (جدول 1).


جدول 1- تجزیة بستر خاکی استفاده‌شده در کشت پنیرک معمولی

هدایت الکتریکی

pH

نیتروژن

کربن

فسفر

پتاسیم

سدیم

لای

رس

شن

بافت خاک

دسی زیمنس بر سانتی‌متر

درصد

میلی‌گرم در کیلوگرم

درصد

46/1

4/8

05/0

47/0

2/9

115

7/38

27

32

41

لومی - شنی

 

 

تیمارها شامل دور آبیاری (آبیاری با دور 7 روز (شاهد)، آبیاری با دور 11 روز و آبیاری با دور 15 روز) و محلول‌پاشی کیتوزان در سه غلظت (کنترل (بدون محلول‌پاشی)، 5/۰ و ۱ میلی‌گرم در لیتر) بودند. پس از آماده‌کردن کرت‌های آزمایشی با طول 5/3 و عرض 5/2 متر با فاصلة ردیف کاشت ۵۰ سانتی‌متر و فاصلة بوتة روی ردیف ۳۰ سانتی‌متر، بذرکاری در تاریخ 10 اسفند انجام شد. نخستین آبیاری برای همة تیمارها بلافاصله پس ازکاشت انجام شد. پس از استقرار کامل بوته‌ها تیمار‌های تنش خشکی اعمال شد. برای اعمال تیمار‌های تنش و بدون تنشاز دور آبیاری استفاده شد. محلول‌پاشی کیتوزان در دو مرحله در فصل رشد گیاه (نخستین و دومین محلول‌پاشی با کیتوزان به‌ترتیب در روز 63 و 70) انجام شد. محلول‌پاشی در ساعت ۸ صبح در هوای ملایم و با سم‌پاش دستی اعمال شد؛ به ‌طوری ‌که برگ‌های گیاه، کاملاً خیس و برای بهبود جذب برگی کیتوزان از تریتون X 100 با غلظت ۰۱/0 درصد استفاده شد. در زمان برداشت نمونه‌ها، پس از حذف اثر حاشیه از هر کرت، سه گیاه به‌طور تصادفی برداشت و برای اندازه‌گیری صفات فیزیولوژیک و میزان فعالیت آنتی‌کسیدانی استفاده شدند.

انـدازه‌گیـری میـزان پـرولین: بدیـن‌منظـور، مقـدار 1/0 گـرم بافـت برگـی نگهداری‌شده در فریزر در 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسـیلیک اسـید 3/3 درصد ساییده و محلول به‌دست‌آمده از کاغذ صـافی عبـور داده شـد و بـا سرعت 4000 دور در دقیقه در دمای چهار درجة سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ (مدل 5810r، شرکت Eppendorf، آلمان) شد. در لوله‌ای جداگانه به دو میلی‌لیتر از عصاره، دو میلی‌لیتر معرف نین هیدرین (25/1 گرم پودر نین هیدرین اسید در 30 میلی‌لیتر استیک اسید گلاسیال حل شد و 20 میلی‌لیتر فسفریک اسید شش مولار بـه آن اضـافه شد) و دو میلی‌لیتر استیک اسید گلاسیال خالص اضافه شد. لوله‌ها به‌مـدت یک ساعت در بن‌مـاری قـرار گرفتـند و پـس از اضـافه‌کـردن چهـار میلی‌لیتر تولوئن به هرکدام از لوله‌ها، به‌مدت 15 تا 20 ثانیه ورتکس شدند. بخش بالایی رنگی، با دقت جدا و جذب آن در دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis -2100، شرکت Unico، آمریکا) با طول‌موج 520 نـانومتر انـدازه‌گیـری شد. میزان پرولین با نمودار اسـتاندارد و برحسـب میلی‌گـرم بـر گـرم وزن تر محاسـبه شـد (Bates et al., 1973).

محتوای نسبی آب برگ: با روش Levitt (1980) اندازه‌گیری شد. برای اندازه‌گیری محتوای نسـبی آب برگ از هر گلدان پنج عدد دیسک برگی با قطر یک سانتی‌متر تهیـه شد. دیسک‌های برگی پس از تـوزین، در لولـه‌هـای آزمایش محتوی آب مقطر قرار داده شدند. درب لوله‌هـای آزمایش بـا فویـل پوشیده شد و لوله‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای چهار درجة سانتی‌گراد قرارداده شدند تا به بیشترین وزن اشباع خود برسند؛ سپس با ترازوی دقیق (مدل AND GF300، ژاپن)، وزن آماس نمونه‌ها محاسبه شد. دیسک‌ها در آونی (مدل uf30، شرکت MEMMERT، آلمان) با دمای 70 درجـة سانتی‌گراد و به‌مدت 24 ساعت خشک شدند. وزن خشک دیسک هـا بـا ترازویی با دقت 0001/0 به دسـت آمـد. محتـوای نسـبی آب بـرگ درنهایت از رابطة 1 محاسبه شد.

رابطة 1     RWC= (LWF-LWD)/(LWT-LWD)

در رابطة 1؛ RWC، محتوای نسبی آب برگ؛ LWF، وزن تر؛ LWT، وزن آماس و LWD وزن خشک برگ‌ها است.

محتوای کلروفیل a برگ: با روش Prochazka و همکاران (1998) و از رابطة 2 محاسبه شد.

رابطة 2                   Chl a= 12.25A663-2.79A646

در رابطة 2؛ Chl a، مقدار کلروفیل a؛ A663، جذب در طول‌موج 663 نانومتر و A646، جذب در طول‌موج 646 نانومتر است.

سنجش میزان فنل‌ها: مقدار فنل‌ها در نمونه‌های عصارة گیاهی با روش فولین - سیوکالتیو اندازه‌گیری شد (McDonald et al., 2001). در این روش در لولة آزمایش به 1/0 میلی‌لیتر عصارة اتانولی یا محلول اتانولی استاندارد گالیک اسید (غلظت 25 تا 300 میکروگرم و 5/0 میلی‌لیتر معرف فولین - سیوکالتیو رقیق شده با آب مقطر با نسبت ۱ به ۱۰)، 4/0 میلی‌لیتر کربنات سدیم 5/7 درصد اضافه و مخلوط شد. جذب آن با اسپکتروفتومتر در طول‌موج ۷۶۰ نانومتر خوانده شد. مقدار فنل کل عصاره با نمودار استاندارد براساس میلی‌گرم گالیک اسید در گرم عصاره محاسبه شد.

 

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

برای تهیة عصارة آنزیمی، 5/0 گرم از نمونة برگی در هاون چینی کاملاً سرد و نیتروژن مایع هموژن شد و سپس به آن 5 میلی‌لیتر از بافر فسفات سرد با pH برابر با 5/7 محتوی EDTA 5/0 میلی‌مولار اضافه شد. نمونه‌ها پس از انتقال به لوله‌های آزمایش با سرعت 15000 دور در دقیقه و در دمای 4 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند (Sairam andSaxena, 2002).

آنزیم کاتالاز: برای اندازه‌گیری آنزیم کاتالاز، ۵۰ میکرولیتر عصارة آنزیمی، ۶۰۰ میکرولیتــر بافر ســدیم فســفات (7=pH)، ۱۵/۰ میکرولیتر EDTA و ۸۵/۵۴۹ میکرولیتر آب‌مقطر در تیوب ریخته و ۵/۳۸۲ میکرولیتـر آب‌اکسیژنه به آن اضافه شد (۵/۳۸۲ میکرولیتر آب‌اکسیژنه در 5/2 میلی‌لیتر آب‌مقطر ریخته شد که آب‌اکسیژنة 75/0 مولار به دست آید؛ سپس ۳۰ میکرولیتر در مخلوط واکنش ریخته شد تا آب‌اکسیژنة ۱۵ میلی‌مولار به دست آید)؛ سپس جذب آن با اسپکتروفتومتر در طـول‌مـوج ۲۴۰ نـانومتر ثبـت و پــس از یک دقیقه دوباره میزان جذب یادداشت شد (Beers and Sizer, 1952).

آنزیم آسکوربات پراکسیداز: برای اندازه‌گیری آنزیم آسکوربات‌ پراکسـیداز، ۵۰ میکرولیتـر عصارة آنزیمی، ۵/۳۷ میکرولیتر آسکوربات و ۸۵/۱۱۱۸ میکرولیتـر آب در تیوب ریخته شد و ۱۵۳ میکرولیتر آب‌اکسیژنه به آن اضـافه و سپس در دستگاه اسپکتروفتومتر با طول‌موج ۲۹۰ نانومتر میـزان جذب آن یادداشت و فعالیت آنزیمی برحسـب واحـد در گـرم وزن تر بیان شد (Nakano et al., 1981).

آنزیم گایـاکول پراکسـیداز: بـرای سـنجش فعالیـت آنـزیم گایـاکول پراکسـیداز، 50 میکرولیتر عصارة آنزیمی، 800 میکرولیتر بافر سـدیم، 2/0 میکرولیتـر EDTA، 50 میکرولیتر گایاکول و 8/799 میکرولیتر آب به لولة آزمـایش اضـافه شد و 765 میکرولیتر آب‌اکسیژنه به آن اضافه و بلافاصـله، جذب آن در طول‌مـوج 470 نـانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (Urbanek et al., 1991).

آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز براساس روش Beauchamp و Fridovich (1971) اندازه‌گیری شد. بدین‌منظور، 50 میکرولیتر عصارة آنزیمی با 5/1 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات (50 میلی‌مولار با 8/7 pH=)، 800 میکرولیتر بافر سـدیم فسفات، 1/0 میلی‌مولار EDTA، نیتروبلوتترازولیوم 75 میلی مولار، ریبوفلاوین (2 میلی‌مولار) و متیونین (13 میلی‌مولار) به لولة آزمـایش اضـافه شدند و سپس جذب آن در طول‌موج 470 نـانومتر با دستگاه اسپکتوفتومتر خوانده شد.

آنزیم پراکسـیداز: فعالیت آنزیم پراکسیداز براساس روش Holy (1972) انجام شد. بدین‌منظور، ابتدا 2 میلی‌لیتر استات 2/0 مولار (5 pH=)، 2/0 میلی‌لیتر آب‌اکسیژنة 3/0 درصد و 1/0 میلی‌لیتر بنزیدین 20/0 مولار محلول در متانول 50 درصد در حمام یخ مخلوط شدند؛ سپس 1/0 میلی‌لیتر از عصارة آنزیمی برگ به این مخلوط واکنش اضافه و سپس میزان جذب آن در دستگاه اسپکتوفتومتر با طول‌مـوج 530 نـانومتر خوانده شد.

تحلیل آماری: پس از اندازه‌گیری ترکیبات فنلی کل، میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، مقدار پرولین و محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی، داده‌های به‌دست‌آمده برای تحلیل آماری نرمال شدند. در مرحلة اول، تجزیة واریانس داده‌ها (ANOVA) انجام شد؛ سپس داده‌های به‌دست‌آمده از تجزیة واریانس و میانگین‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح پنج درصد مقایسه شدند. بدین‌منظور، از نرم‌افزار SAS نسخة 1/9 استفاده شد. برای رسم شکل‌ها از نرم‌افزار Excel سال 2007 استفاده شد.

 

نتایج و بحث

مقدار کلروفیل a: براساس نتایج به‌دست‌آمده از تجزیة واریانس داده‌ها (جدول 2) تأثیر دور آبیاری، محلول‌پاشی کیتوزان و اثر متقابل آنها بر میزان کلروفیل a در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار شد. نتایج آثار متقابل نشان دادند محلول‌پاشی 1 میلی‌گرم در لیتر کیتوزان در دور آبیاری کامل (7 روز) افزایش 27 درصدی کلروفیل a را نسبت به شاهد سبب شد (شکل 1).

 

 

شکل 1- اثر متقابل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر میزان کلروفیل a پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

ns، * و ** به‌ترتیب عدم تفاوت معنی‌دار و تفاوت معنی‌دار را در سطح 5 و ۱ درصد نشان می‌دهند.

ضریب تغییرات (٪)

خطا

دور آبیاری × کیتوزان

کیتوزان

دور آبیاری

بلوک

تیمارها

جدول 2- نتایج تجزیة واریانس برخی صفات پنیرک معمولی بر اثر تیمارهای دور آبیاری و محلول‌پاشی کیتوزان

 

16

4

2

2

2

درجة آزادی

65/5

0071/0

** 0075/0

** 011/0

** 046/0

* 0037/0

کلروفیل a

57/4

057/0

083/0

** 43/22

** 921/0

ns 0035/0

پرولین

77/3

0053/0

** 0427/0

** 188/0

** 661/0

ns 0081/0

محتوای نسبی آب برگ

38/4

0092/0

** 08/0

** 2/0

** 746/0

* 002/0

کاتالاز

07/3

0003/0

** 023/0

** 428/0

** 195/0

* 001/0

گایاکول پراکسیداز

046/4

0073/0

** 0029/0

** 114/0

** 273/0

** 0027/0

پراکسیداز

67/3

00038/0

** 03/0

** 265/0

** 238/0

** 0033/0

آسکوربات

پراکسیداز

051/2

005/0

** 013/0

** 139/0

** 345/0

** 0029/0

سوپراکسید دیسموتاز

33/4

015/0

** 237/0

** 39/13

** 46/0

ns 0064/0

فنل

 


میزان کلروفیل در گیاهان زنده یکی از عوامل مهم حفظ ظرفیـت فتوسـنتزی اسـت. تنش خشکی، پیری زودرس و شکسته‌شدن کلروپلاست و کاهش میزان کلروفیل را در گیاهان باعث می‌شود (Jiang and Huang, 2001). در بررسی حاضر، بر اثر افزایش دور آبیاری، میزان کلروفیل a نسبت به شاهد حدود 60 درصد کمتر شد.

به نظر می‌رسد ایـن کـاهش بر اثر تنش خشکی، به‌علت افزایش تولید رادیکال‌های اکسیژن باشد که این رادیکال‌های آزاد پراکسیداسیون (Wise and Naylor, 1989) و درنتیجه، تجزیة این رنگیزه را باعث می‌شود (Schutz and Fangmeir, 2001). این مسئله ممکن است به‌دلیل افزایش فعالیـت کلروفیلاز هنگام تنش خشکی باشد (Boyer, 1987)؛ در حالی که Balaguer و همکاران (2002) معتقدند کاهش مقدار کلروفیل هنگام تنش کمبود آب ممکن است به‌دلیل تحریک آنزیم بیوسنتز پرولین یعنی گلوتامیل کیناز در تغییرات میزان نسبی آب کم باشد که با نتایج همبستگی منفی بین کلروفیل و پرولین در پژوهش حاضر هم‌خوانی دارد.

با افزایش تبدیل گلوتامات به پرولین در تنش خشکی، درواقع گلوتامات که پیش‌ساز کلروفیل نیز است از دسترس خارج و سنتز کلروفیل‌ها نقصان پیدا می‌کند. کاهش میزان کلروفیل در پنیرک معمولی بـا نتـایج به‌دست‌آمده از سیاه‌دانه (Ariafar and Sirousmehr, 2015)، کتان (Movahhedi Dehnavi et al., 2017)، رزماری (Sanchez-Blanco et al., 2006) و آویشن باغی (Askary et al., 2017) در تنش خشکی مطابقت دارد.

Agrawal و همکاران (2002) بیان کردند کیتوزان با فعال‌کردن تعدادی از آنزیم‌ها مانند فیتواکسـین‌هـا و کیتینازها، مقاومت گیاه را دربرابـر شـرایط نامسـاعد محیطـی و تنش‌ها افزایش می‌دهد. در پژوهشی که اثر کیتوزان را بر گیاه بادرنجبویه بررسی و گزارش کردند، میزان رنگیزه‌های کلروفیل و کاروتنوئید بر اثر کیتوزان افزایش یافت (Khajeh and Naderi, 2014). نتایج بررسی حاضر نشان دادند محلول‌پاشی با کیتوزان افزایش میزان کلروفیل را سبب شد که با نتایج Gornik و همکاران (2008) مطابقت دارد . آنها بیان کردند کاربرد کیتوزان کاهش اثر تنش خشکی را بر کلروفیل و افزایش رنگیزه‌های فتوسنتزی را باعث می‌شود. ازسویی نتایج آزمایش بر باقلا (Sheikha and AL-Malki, 2009)، ماریتیغال (Aghighi Shahverdi et al., 2017) و بادرنجبویه (Khajeh and Naderi, 2014) نشان دادند مصرف کیتوزان افزایش کلروفیل را در باقلا و بادرنجبویه باعث می‌شود که تأییدی بر نتایج بررسی حاضر است. همچنین نتایج پژوهش حاضر، در راستای نتایج به‌دست‌آمده از بررسی‌های Khan و همکاران (2002) و El-Tantawy (2009) هستند که با به کار بردن کیتوزان، افزایش چشمگیری در میزان کلروفیل سویا و گندم مشاهده کردند. با توجه به وجود عنصر نیتروژن در محرک کیتوزان و نقش ساختاری این عنصر در حلقه‌های تتراپیرولی کلروفیل، چنین افزایشی توجیه‌پذیر است. از سوی دیگر، مصرف کیتوزان احتمالاً با تأثیر بر ژن‌های مسئول سازندة کلروفیل، تولید آن را افزایش داده است (Emami bastegani et al., 2016; Malekpoor et al., 2015)؛ بنابراین کیتـوزان با افـزایش محتـوای کلروفیل و افزایش فتوسنتز و تأثیر بر بیان ژن در کلروپلاسـت، تغییراتی در اندازه و توسعة کلروپلاست برگ گیاهان را باعث می‌شود و این تغییرات ممکن است تحریک‌کنندة رشد گیاهان باشند (Limpanavech et al., 2008).

مقدار پرولین: با توجه به نتایج تجزیة واریانس داده‌ها اثر دور آبیاری‌های مختلف، محلول‌پاشی کیتـوزان و اثـر متقابل تنش خشکی و کیتوزان بر مقدار پرولین برگ در سطح 1 درصد معنی دار شد ( جدول 2). مقایسة میانگین آثار متقابل نشان داد با افزایش مقادیر آبیاری و غلظت محلول‌پاشی بر میزان پرولین افزوده شد؛ به طوری که محلول‌پاشی با غلظت 1 میلی‌گرم در لیتر کیتوزان در دور آبیاری 15 روز، میزان پرولین را نسبت به شاهد، 68 درصد افزایش داد (شکل 2).


 

شکل 2- اثر متقابل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر میزان پرولین پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

پرولین، مـاده‌ای محلـول است که تنظیم فشار اسمزی، کـاهش از دسـت دادن آب از سلول و نگهداری آماس را سبب می‌شود. یکی از خواص فیزیکـی پرولین، زیاد حلال‌بودن آن است. مولکول پرولین شامل قسمت‌هـای آب‌دوسـت و آب‌گریـز است. پـرولین محلول بر حلالیت پـروتئین‌هـای مختلـف اثر بگذارد و از غیرطبیعی‌شدن آلبومین جلوگیری کند. این ویژگی پرولین به این دلیل است که رابطة متقابـل بین پرولین و سطح پروتئین‌های آب‌گریز برقرار می‌شود و به‌علت افزایش سطح کل مولکول‌های پروتئین آب‌دوسـت، پایداری آن‌ها افزایش می‌یابد و از تغییر ماهیت آنها جلوگیری می‌شود. این سازوکار پرولین بر آنزیم‌ها نیز به‌دلیل ساختمان پروتئینی‌شان اثر می‌گذارد و از ساختار آنها محافظت می‌کند (Kuznetsov and Shevykova, 1999).

 

در پژوهش حاضر، افزایش 11/32 درصـدی پـرولین بر اثر دور آبیاری 15 روز، در تطابق با افزایش تولید پـرولین در گیاه ماریتیغال در مواجهه با تنش خشکی است (Mazaraie et al., 2017) که نتیجة تجزیة پروتئین‌ها و همچنین کاهش استفاده از آنها به‌دلیل کاهش رشد گیاه است (Movahhedi Dehnavi et al., 2011).

براساس نتایج بررسی حاضر، همبستگی مثبت و معنی‌داری بین میزان پرولین و محتوای نسبی آب برگ مشاهده شد (جدول 3) و براساس نتایج پژوهش Kaphi و همکاران (2010) پرولین، ماده‌ای محلول است که تنظیم فشار اسمزی، کاهش هدررفتن آب از سلول، حفظ آماس سلولی، جلوگیری از تجزیة پروتئین‌ها، افزایش پایداری برخی از آنزیم‌های سیتوپلاسمی و میتوکندری و پایداری شکل طبیعی پروتئین را سبب می‌شود.

کیتوزان تقریباً بر بیشتر واکنش‌های متابولیسمی گیاه تأثیر دارد و تغییراتی در آنها موجب می‌شود. این تغییرات، تحمل و سازگاری گیاهان را دربرابر عوامل محیطی افزایش می‌دهند (Yang et al., 2009). Naderi و همکاران (2015) گزارش کردند کیتوزان ممکن است تنظیم‌کنندة کلیدی پاسخ‌های گیاه به تنش‌های محیطی باشد و با افزایش میزان پرولین که به‌نوعی در گیاه تنظیم اسمزی ایجاد می‌کند، آثار منفی تنش خشکی را کمتر کند. براساس نتایج پژوهش Mahdavi و Safari (2016) به نظر می‌رسد کیتوزان با افزایش محتوای تنظیم کننده‌های اسمزی مانند پرولین، پایداری ساختار سلول را دربرابر تنش خشکی سبب می‌شود و با این روش، کاهش آثار سوء تنش را سبب می‌شود که با نتایج Malekpoor و همکاران (2015) مطابقت دارد.

محتوای نسبی آب برگ: نتایج تجزیة واریانس داده‌ها نشان دادند اثر دور آبیاری، محلول‌پاشی کیتوزان و اثـر متقابل آنها بر محتوای نسبی آب برگ در سطح یک درصد معنی‌دار شدند ( جدول 2). مقایسة میانگین آثار متقابل غلظت‌های کیتوزان در هر مقدار آبیاری نشان داد بیشترین محتوای نسبی آب برگ مربوط به دور آبیاری کامل با محلول‌پاشی 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان بود (شکل 3).

کاهش محتوای رطوبت نسبی (RWC) برگ‌ها از بارزترین علائم فیزیولوژیک کمبـود رطوبـت خاک است (Nautical et al., 2002).محتوای نسبی آب زیاد، توانایی گیاهان را برای تنظیم اسمزی و حفظ رشدشان نشان می‌دهد. کاهش محتوای آب نسبی در شرایط تنش در بسیاری از گیاهان گزارش شده است (Kerepesi and Galiba, 2000). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند دور آبیاری 15 روز کاهش 60/57 درصدی محتوای نسبی آب برگ را سبب شد که با نتایج Babaei (2011) در ریحان و ماریتیغال (Mazarie et al., 2017) هم‌خوانی دارد. Khan و همکاران (2007) بیان کردند آبسیزیک اسید تولیدشده در ریشه در تنش خشکی با تجمع در سلول‌های روزنه‌ای، بسته‌شدن سلول‌های روزنه‌ای را سبب می‌شود که این پدیده، کاهش محتوای رطوبت نسبی آب برگ را سبب می‌شود.

نتایج بررسی حاضر نشان دادند با افزایش محلول‌پاشی، محتوای نسبی آب برگ افزایش 15/38 درصدی یافت که با نتایج پژوهش Mahdavi و Rahimi (2013) مبنی بر افـزایش محتـوای نسـبی آب بـرگ گیــاه زنیــان بر اثر محلول‌پاشی کیتــوزان هم‌خوانی دارد.

 

 

شکل 3- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر محتوای نسبی آب برگ پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

افزایش محتوای نسبی آب برگ در پنیرک معمولی بـا نتـایج به‌دست‌آمده در خیار (Gu et al., 2010)، نخود (Mahdavi and Safari, 2016) و گلرنگ (Modrres Sanavi et al., 2014) مطابقت دارد و بیان کردند محلول‌پاشی با کیتوزان در گیاهان قرارگرفته در معرض تنش خشکی، محتـوای آب نسـبی برگ را افزایش داد.کیتوزان با بهبود سیستم ریشـه‌ای کارآمد، افـزایش جـذب آب و ذخـایر آبـی گیـاه را باعث شـد و همچنین با کاهش تعرق در گیاه، حفظ محتوای نسبی آب برگ را در شرایط تنش باعث می‌شود (Asgharipor et al., 2015)؛ بنـابراین بـا توجـه بـه نتـایج به‌دست‌آمده از آزمـایش حاضر و گزارش‌های سایر پژوهشگران استنباط می‌شود کیتـوزان احتمالاً با کاهش تعرق و همچنین حفظ محتوای نسبی آب، تحمل به خشکی ایجـاد می‌کند (Mahdavi and Rahimi, 2013). نتایج پژوهش Modrres Sanavi و همکاران (2014) نشان دادند کیتوزان با حفظ تعادل آبی سلول از کاهش شدید محتوای نسبی آب برگ جلوگیری کرد که سبب پایداری ساختار سلول را دربرابر تنش کم‌آبی باعث شد و ازسویی مصرف کیتوزان کـاهش آثار سوء تنش را باعث شد.

 

ترکیبات آنتی‌اکسیدانی

فنل: نتایج به‌دست‌آمده از تجزیة واریانس داده‌های جدول 2 نشان دادند تأثیر دور آبیاری، محلول‌پاشی کیتوزان و اثر متقابل آنها بر میزان فنل کل در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار شد. نتایج آثار متقابل (شکل 4) نشان دادند محلول‌پاشی با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان در دور آبیاری 15 روز، افزایش 79 درصدی میزان فنل کل را نسبت به شاهد سبب شد.


 

شکل 4- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15) بر میزان فنل پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 


آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی: نتایج به‌دست‌آمده از جدول تجزیة واریانس (جدول 2) نشان دادند تیمار دور آبیاری و محلول‌پاشی کیتوزان و اثر متقابل دور آبیاری در کیتوزان بر فعالیت برخی از ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز تأثیر گذاشتند و تفاوت آماری در سطح یک درصد معنی‌دار شد. مقایسة میانگین آثار متقابل نشان داد در تنش خشکی و کیتوزان، میزان فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز را افزایش داد؛ به ‌‌طوری ‌که محلول‌پاشی با غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان در دور آبیاری 15 روز، به‌ترتیب افزایش 51، 72، 70، 54 و 80 درصدی فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز را نسبت به شاهد سبب شد (شکل‌های 5 تا 9).

یکـی از سازوکارهای دفـاع غیـرآنزیمی برای مقابله با تنش اکسـیداتیو القـاء‌شـده با خشـکی در گیاهان، تجمع ترکیبات فنلی است. ترکیبات فنلی به‌صورت گیرنـدة رادیکـال‌هـای آزاد عمـل می‌کنند و مقاومـت گیاهـان را دربرابـر تنش‌های اکسیداتیو سـبب می‌شوند (Sharafati chaleshtori et al., 2008). نتایج بررسی حاضر نشان دادند بین میزان فنل و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان همبستگی وجود دارد که در تطابق با نتایج پژوهش Ghasemzadeh و همکاران (2010) است که بیان کردند رابطة مثبتی بین محتوای فنل کل و فعالیت آنتی‌اکسیدانی آنها وجود دارد.

 

 

 

شکل 5- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم کاتالاز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

 

شکل 6- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم گایاگول پراکسیداز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

شکل 7- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم پراکسیداز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

 

شکل 8- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم آسکوربات پراکسیداز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 

شکل 9- اثر متقایل کیتوزان (با غلظت‌های صفر، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) و دور آبیاری (7، 11 و 15 روز) بر آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز پنیرک معمولی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف‌معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 01/0>P براساس آزمون دانکن هستند.

 

 

این ترکیبات با سازوکار‌های متعددی مانند پاک‌روبی رادیکال‌های آزاد، دادن هیدروژن، کلات‌کردن یون‌های فلزی یا در همکاری با پراکسیدازها در جمع‌آوری یا حذف هیدروژن پراکسید، نقش آنتی‌اکسیدانی خود را ایفا می‌کنند (Kovacik et al., 2009) و درنتیجه، ثبات غشاهای سلولی و ممانعت از پراکسیداسیون لیپیدها را سبب می‌شوند (Chang et al., 2002). Malekpoor و همکاران (2015) گزارش کردند در تنش‌ خشکی ترکیبات فنلی در گیاهان تجمع می‌یابند. در پژوهش حاضر، با افزایش تنش خشکی میزان فنل افزایش یافت که با نتایج Habibi و همکاران (2004) مطابقت دارد. آنها بیان کردند در بادام‌زمینی (Arachis hypogaea) با افزایش شدت تنش، میزان مواد فنلی و آنزیم‌هـای دفـاعی افزایش می‌یابد. وقتی فنل‌ها در این واکنش‌ها به‌صورت آنتی‌اکسیدان شرکت می‌کنند، به رادیکال فنوکسیل اکسید تبدیل می‌شوند و سپس با واکنش با آسکوربات به حالت اولیه برمی‌گردند (Makkar et al., 1988). Tian و Li (2006) در بررسی اثر تنش خشکی در گیـاه گنـدم دریافتند علت افزایش ترکیبات فنلـی، از افـزایش فعالیـت و میزان آنزیم‌های بیوسنتزی ترکیبات فنلی مانند فنیل آلانین آمونیالیاز ناشی می‌شود.

به فعالیت آنتی‌اکسیدانی کیتوزان بسیار توجه شده است (Park et al., 2004). کیتین و کیتوزان افزایش میزان ترکیبات فنلی را باعث می‌شوند که در سازوکارهای دفاعی گیاه نقش دارند (Pu et al., 2009). نتایج Emami Bastegani و همکاران (2016) نشان دادند با افزایش غلظت کیتوزان، محتوای فنل افزایش می‌یابد که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. Taheri (2015) و Coqueiro و همکاران (2011) در نتایج خود بیان کردند کیتوزان با افزایش تولید ترکیبات فنلی به‌صورت سد دفاعی دربرابر تنش‌های محیطی عمل می‌کند. Malekpoor و همکاران (2015) بیان کردند محرک‌هایی مانند کیتوزان ممکن است با فعال‌کردن ژن‌ها و مسیرهای بیوسنتزی مختلف وآنزیم‌ها تشکیل متابولیت‌های ثانویه‌ای مانند ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی را موجب شود که با نتایج بررسی حاضر مبنی بر افزایش ترکیبات فنلی هم‌خوانی دارد.

افزایش دفاع آنتی‌اکسیدانی نقـش بسـیار مهمی در غیرفعال‌کردن رادیکـال‌هـای آزاد اکسـیژن در سـلول گیـاه دارد و میزان فعالیت سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی  به گونة گیاهی و شدت تنش در گیـاه بستگی دارد (Apel and Hirt, 2004). مهم‌ترین نقش رادیکـال‌هـای آزاد اکسـیژن، اکسید‌کردن اسیدهای چرب غیراشباع است که به پراکسیداسیون لیپید و تخریب غشا منجر می‌شوند (Sharma and Dubey, 2005). گزارش شده است آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در افزایش تحمل گیاهان دربرابر تنش‌های محیطی شرکت دارند. افزایش این آنزیم‌ها در شرایط تنش در بسیاری از گونه‌ها گزارش شده است (Yahubyan et al., 2009). زمانی‌که گیاهان در معرض تنش کم‌آبی قرار می‌گیرند برای مقابله با صدمه‌های اکسیژن فعال، همة سازوکارهای دفاعی باید فعال شوند. در بسیاری از گیاهان مشخص شده است تنش خشکی بر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز اثر می‌گذارد (Blokhina et al., 2003).

افزایش 51، 72، 70، 54 و 80 درصدی فعالیت آنزیم پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز، نشان‌دهندة بـروز تنش اکسیدانی در شرایط تنش خشکی در گیاه پنیرک معمولی اسـت؛ از این ‌رو به نظر می‌رسد آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در افزایش تحمل گیاهان به تنش خشکی نقش مهمی دارند (Mittler, 2002). مقایسة فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، نشان می‌دهد بیشترین فعالیت مربوط به آنزیم سوپراکسید دیسموتاز است. آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز نخستین خط دفاعی را دربرابر رادیکال‌های فعال اکسیژن در سلول تشکیل می‌دهند (Yong et al., 2009). سوپراکسید دیسموتاز، رادیکـال سوپراکـسید را به هیدروژن پراکسید تبـدیل مـی‌کنـد. کاهش فعالیــت این آنــزیم، تجمع رادیکال سوپراکسید را موجب می‌شود. ایـن رادیکـال با هیدروژن پراکسید ترکیب می‌شود و با انجام واکـنش هابر ـ ویز رادیکال بسیار خطرنـاک هیدروکـسیل را به وجود می‌آورد (Mittler et al, 2004).

فعالیـت کـم آنـزیم سوپراکـسید دیـسموتاز کارایی چرخة مهلر را در کلروپلاست کـاهش خواهـد داد. کاهش کارایی ایـن چرخـه، افـزایش شدت آسیب‌ها را به مولکول‌های زیستی حیاتی موجب می‌شود که آسـیب به غشاها یکی از مهم‌ترین آنهاست. همچنین تجمع رادیکال سوپراکسید، فعالیت آنزیم‌های کاتـالاز و پراکـسیداز را کاهش می‌دهد (Asada, 2000). این آنزیم‌ها نقـش ویـژه‌ای در جمع‌آوری هیدروژن پراکسید موجود در سلول دارنـد (Shao et al., 2005).

آنزیم کاتالاز از دستة پروتئین‌های آهـن‌دار به شمار می‌رود و هنگامی در سلول‌های گیاهی و جانوری وارد عمل می‌شود کـه مقـدار مادة هیدروژن پراکسید در محیط زیاد باشد. کاتالاز، فرایند تبدیل هیدروژن پراکسید را به آب و اکسیژن بـدون نیـاز بـه گهرمایة کمکی انجام می‌دهد و از فعالیت هیـدروژن پراکسـید در سلول ممانعت می‌کند (Habibi et al., 2004). آنــزیم پراکســیداز که گهرمایه‌های دهنـدة الکتـرون مختلف دارد و آنـزیم آسکوربات پراکسیداز با مولکـول آسـکوربات که دهندة الکترون است، هیـدروژن پراکسید را بـه آب و اکسیژن احیا می‌کند (Mittler et al, 2004). کاهش فعالیت کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز ممکن است تجمع هیدروژن پراکسید را موجب شود و به کاهش فعالیت برخی از آنزیم‌های چرخة کالوین مانند ریبولوز مونو فسفات، کیناز و بی‌فسفاتازها منجر شود (Asada, 2000). کاهش فعالیت ایـن آنزیم‌هـا در چرخـة کـالوین بـا کـاهش نـسبت NADP+/NADPH، H+ در کلروپلاســت افــزایش آســیب بــه مولکول‌های زیستی مانند لیپیـدها و تولیــد شکل‌هــای فعــال اکــسیژن را سبب می‌شود (Mittler, 2002).

آسکوربات پراکسـیداز چنـد نقـش اساسـی در فرایندهای فیزیولوژیک گیاه مانند رشـدونمـو و متابولیسـم دارد و همچنین به‌صورت احیاکنندة بسیاری از رادیکـال‌هـای آزاد و به‌ویژه هیدروژن پراکسید عمل می‌کند؛ بنابراین خسارت ناشـی از تنش اکسیداتیو را به کمترین مقدار می‌رساند (Yong et al., 2006).

بررسی‌های متعدد نشان داده‌اند ترکیبات اصلی دیوارة سلولی بسیاری از گونه‌های قارچی مانند کیتین و کیتوزان که الیسیتور زیستی هستند ممکن است توانایی از بین بردن رادیکال‌های آزاد (Yen et al., 2008; Harish Prashanth et al., 2007) و تحریک سازوکارهای دفاعی گیاه و متابولیت‌های ثانویه را داشته باشند (Pu et al., 2009).

کیتوزان در غلظت‌های کم، با از بین بردن رادیکال‌های آزاد به‌طور مستقیم یا با آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان از اکسیدشدن چربی‌ها جلوگیری می‌کند (Mahdavi and Safari, 2016). اثر تحریـک‌کننـدگی کیتوزان‌ها بر میزان فعالیت آنـزیم‌هـای آنتـی‌اکسـیدانی در تـنش خشکی در گیاه گلرنگ گزارش شده است (Abdalla, 2011; Mahdavi et al., 2011) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.

به نظر می‌رسد افـزایش فعالیـت آنـزیم‌هـای آنتی‌اکسیدانی در گیاه پنیرک معمولی به‌دلیل اثـر تحریـک‌کننـدگی کیتوزان‌ها بر ژن‌های درگیر در بیوسنتز آنزیم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی باشد که با نتایج Taheri (2015) در گیاه کمای بینالودی (Ferula flabelliloba) مطابقت دارد. این ترکیبات با تعیین مسیرهای بیوسنتزی به تشکیل و تنظیم متابولیت‌های ثانویه برای مقابله با شرایط تنش منجر می‌شوند (Waseem et al., 2010). کیتوزان، رادیکال‌های آزاد هیدروکسیل (OH-) و سوپراکسید (O2-) را خنثی می‌کند (Harish Prashanth et al., 2007). سازوکار خنثی‌کردن رادیکال‌های آزاد کیتوزان ممکن است به ساختار ویژة آن مربوط شود که از تعداد زیادی گروه آمین و هیدروکسیل در دسترس تشکیل شده است که با رادیکال‌های آزاد (ROS) واکنش می‌دهند (Sun et al., 2004).

نتایج همبستگی: نتایج ارزیابی همبستگی بین صفات بررسی‌شده در پژوهش حاضر با ضریب پیرسون در جدول 3 نشان داده شده‌اند. تحلیل همبستگی، نشان‌دهندة ارتباط مثبت و منفی (معنی‌داری یا معنی‌دارنبودن) صفات با یکدیگر است. نتایج نشان دادند آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی، بیشترین میزان همبستگی را با هم دارند. ازسویی بین میزان پرولین با محتوای نسبی آب برگ رابطة مستقیم اما بین پرولین و کلرفیل رابطة عکس وجود دارد.

 

 

ns، * و ** به‌ترتیب عدم تفاوت معنی‌دار و تفاوت معنی‌دار را درسطح 5 و ۱ درصد نشان می‌دهند.

فنل

کلروفیل a

محتوای نسبی آب برگ

پرولین

کاتالاز

سوپراکسید دیسموتاز

پراکسیذاز

آسکوربات پراکسیداز

گایاکول پراکسیداز

 

جدول 3- ضرایب همبستگی بین صفات فیزیولوژیک و آنزیمی پنیرک معمولی در دورهای آبیاری و محلول‌پاشی کیتوزان

**99/0

**97/0-

ns42/0

**96/0

**98/0

**91/0

**94/0

**95/0

1

گایاکول پراکسیداز

**95/0

**89/0-

ns54/0

**93/0

**94/0

**94/0

**99/0

1

 

آسکوربات پراکسیداز

**94/0

**87/0-

ns 55/0

**92/0

**93/0

**94/0

1

 

 

پراکسیداز

**94/0

**92/0-

ns51/0

**97/0

**95/0

1

 

 

 

سوپراکسید دیسموتاز

**99/0

**98/0-

ns45/0

**98/0

1

 

 

 

 

کاتالاز

**98/0

**98/0-

**42/0

1

 

 

 

 

 

پرولین

ns43/0

**36/0

1

 

 

 

 

 

 

محتوای نسبی آب برگ

**97/0-

1

 

 

 

 

 

 

 

کلروفیل a

1

 

 

 

 

 

 

 

 

فنل

 


جمع‌بندی

براساس نتایج پژوهش حاضر، با افزایش دور آبیاری، محتوای نسبی آب برگ و کلروفیل a برگ کاهش یافتند؛ به ‌طوری ‌که بیشترین مقدار کلروفیل a و محتوای نسبی آب برگ در محلول‌پاشی یک میلی‌گرم در لیتر کیتوزان و آبیاری کامل به دست آمد. ازسویی با افزایش دور آبیاری؛ میزان پرولین، فنل کل و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی افزایش یافتند؛ به ‌طوری ‌که بیشترین مقدار فنل کل، پرولین و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌‌اکسیدانی پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در محلول‌پاشی یک میلی‌گرم در لیتر کیتوزان و آبیاری 15 روز به دست آمد. براساس نتایج همبستگی نتیجه‌گیری می‌شود کیتوزان با افــزایش فعالیــت سیســتم دفــاع آنتــی‌اکســیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی گیاه پنیرک معمولی، کــاهش پراکسیداسیون لیپیدها را موجب می‌شود و با افزایش محتوای تنظیم‌کننده‌های اسمزی (پرولین) حفظ تعادل آبی سلول را سبب می‌شود و از کاهش شدید محتوای نسبی آب برگ جلوگیری می‌کند؛ بنابراین به پایداری ساختار سلول دربرابر تنش کم‌آبی منجر می‌شود و میزان کلروفیل را افزایش می‌دهد؛ از این ‌رو نتیجه‌گیری می‌شود مصرف کیتوزان آثار سوء تنش را کاهش دهد.

 

سپاسگزاری

از کارمندان مزرعة آموزشی شمارة 1 دانشگاه زابل واقع در سد سیستان و آزمایشگاه بیوسنتر دانشگاه زابل بابت همکاری در اندازه‌گیری‌ها و اجرای آزمایش حاضر سپاسگزاری می‌شود. همچنین هزینه اجرای این آزمایش از محل اعتبار پژوهانه شماره UOZ-GR-9517-21 معاونت پژوهشی دانشگاه زابل تامین شده است.

Abdalla, M. M. (2011) Beneficial effects of diatomite on the growth, the biochemical contents and polymorphic DNA in Lupinus albus plants grown under water stress. Agriculture and Biology Journal of North America 2: 207-220.

Aghighi Shahverdi, M., Omidi, H. and Mousavi, S. E. (2017) Effect of chitosan on seed germination and biochemical traits of milk thistle (Silybum marianum L.) Seedling under salt stress. Iranian Journal of Seed Research 3(2): 105-118 (in Persian).

Agrawal, G. K., Rakwal, R., Tamogami, S., Yonekura, M., Kubo, A. and Saji, H. (2002) Chitosan activates defense/stress response(s) in the leaves of Oryza sativa seedlings. Plant Physiology and Biochemistry. 40: 1061-1069.

Apel, K. and Hirt, H. (2004) Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress and signal transduction. Annual Review of Plant Biology 55: 373-399.

Ariafar, S. and Sirousmehr, A. R. (2015) Effect of urban waste compost on yield, essential oil percentage and some physiological characteristics of Nigella sativa under drought stress. Journal of Agricultural Crops Production 19(1): 31-42 (in Persian).

Asada, K. (2000) The water-water cycle as alternative photon and electron sinks. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences 355(1402): 1419-1431.

Asgharipor, M. R., Mousapor, H. and Basiri, M. (2015) The role of chitosan in improving salinity resistance by influencing some of the morphological and physiological characteristics of fenugreek. Journal of Science and Technology of Greenhouse Cultures 25: 165-174 (in Persian).

 

Askary, M., Behdani, M. A., Parsa, S., Mahmoodi, M. and Jamialahmadi, S. (2017) Effects of water stress and manure on stomatal conductance, relative water content, photosynthetic pigments and quantitative and qualitative yield of Thymus vulgaris L. and Thymus daenensis Celak. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 33(5): 793-811 (in Persian).

Babaei, B. (2011) Effect of cycocel on quantitative and qualitative characteristics of Ocimum bosilicus L. under drought stress. MSc thesis, University of Zabol, Zabol, Iran (in Persian).

Balaguer, L., Pugnaire, F. I., Martinz-Ferri, E., Armas, C., Valladares, F. and Manrigue, E. (2002) Ecophysiological significance of chlorophyll loss and reduced photochemical efficiency under extreme avidity in Stipa tenacissimal. Plant and Soil 240: 343-352.

Bates, L. S., Waldern, R. P. and Teave, I. D. (1973) Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant and Soil 39: 205-107.

Bautista-Baños, S., Hernández-Lauzardo, A. N. and Velázquez-del Valle, M. G. (2006) Chitosan as a potential natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural commodities. Crop Protection 25: 108-118.

Beauchamp, C. and Fridovich, I. (1971) Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Annual Journal of Biochemistry 44: 276-287.

Beers, G. R. and Sizer, I. V. (1952) A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. Journal of Biological Chemistry 195: 133-140.

Blokhina, O., Virolainen, E. and Fagerstedt, K. V. (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: A review. Annals of Botany 91: 179-194.

Bohenert, H. J. and Shen, B. (1999) Transformation and compatible solutes. Scientia Horticulturae 78: 237-260.

Boonlertinirun, S., Chaweewan, B. and Suvanasara, R. (2008) Application of chitosan in rice production. Journal of Metals Materials and Minerals 18(2): 47-52.

Boyer, J. S. (1987) Plant productivity and environment potential for increasing crop plant productivity, genotypic selection. Science 218: 443-448.

Chang, W. C., Kim, S. C., Hwang, S. S., Choi, B. K. and Kim, S. K. (2002) Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison. Plant Science 163: 1161-1168.

Coqueiro, D. S. O., Maraschin, M. and Piero, R. M. D. (2011) Chitosan reduces bacterial spot severity and acts in phenylpropanoid metabolism in tomato plants. Journal of Phytopathology 159(7): 488-494.

Demirevska, K., Zasheva, D., Dimitrov, R., Simova-Stoilova, L., Stamenova, M. and Feller, U. (2009) Drought stress effects on rubisco in wheat: changes in the rubisco large subunit. Acta Physiologiae Plantarum 31: 1113-1129.

El-Tantawy, E. M. (2009) Behavior of tomato plants as affected by spraying with chitosan and aminofort as natural stimulator substances under application of soil organic amendments. Pakistan Journal of Biological Sciences 12: 1164-1173.

Emami Bastegani, Z., Syadat, S. A., Bakhshandeh, A. M. and Ghsemi Pirbaloti, A. (2016) Effect of chemical, organic and chitosan fertilizers on physiological characteristics and phenolic compounds of Thymus vulgaris in Shahrekord. Journal of Agricultural Research 7(1): 11-27 (in Persian).

Ghasemzadeh, A., Jaafar, H. Z. and Rahmat, A. (2010) Antioxidant activities, total phenolics and flavonoids content in two varieties of Malaysia young ginger (Zingiber officinale Roscoe). Molecules Journal 15(6): 4324-4333 (in Persian).

Gornik, K., Grzesik, M. and Duda, B. R. (2008) The effect of chitosan on rooting of grapevine cuttings and on subsequent plant growth under drought and temperature stress. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research 16: 333-343.

Gu, L. Q., Li, C. X., Qiao, Y. X., Gao, F. J. and Lu, H. (2010) Effects of exogenous chitosan on physiological characteristics of cucumber seedlings under drought stress. Southwest China Journal Agriculture Science 1: 70-73.

Habibi, D., Mashdi Akbar Boojar, M., Mahmoudi, A., Ardakani, M. R. and Taleghani, D. (2004) Antioxidative enzyme in sunflower subjected to drought stress. In: Proceeding of the 4th International Crop Science Congress, Brisbane, Australia.

Harinasut, P., Poonsopa, D., Roengmongkol, K. and Charoensataporn, R. (2003) Salinity effects on antioxidant enzymes in mulberry cultivar. Science Asia 29: 109-113.

Harish Prashanth, K. V., Dharmesh, K. S., Jagannatha, R. and Tharanathan, R. N. (2007) Free radical-induced chitosan depolymerized products protect calf thymus DNA from oxidative damage. Carbohydrate Research 342: 190-195.

Holy, M. C. (1972) Indole acetic acid oxidase: a dual catalytic enzyme. Journal of Plant Physiology 50: 15-18.

Iriti, M. and Faoro, F. (2009) Chitosan as a MAMP, searching for a PRR. Plant Signal and Behaviors 4(1): 66-68.

Jiang, Y. and Huang, N. (2001) Drought and heat stress injury to two cool-season turfgrasses in relation to antiaxdant metabolism and lipid peroxidation. Crop Science 41: 436-442.

Kafi, M., Borzoie, A., Salehi, A., Kamandi, A. and Nabati, J. )2010) Physiology of environmental stresses in plants. Mashhad University Press, Mashhad (in Persian).

Kerepesi, I. and Galiba, G. (2000) Osmotic and salt stress-induced alteration in soluble carbohydrate content in wheat seedlings. Crop Science 40: 482-487.

Khajeh, H. and Naderi, S. (2014) The effect of chitosan on some antioxidant enzymes activity and biochemistry characterization in melissa (Melissa officinalis). Research Journal of Crop Science in Arid Area 1: 100-116.

Khan, H. U.‚ Link, W., Hocking, T. and Stoddard, F. (2007) Evaluation of physiological biomembranes. Methods in Enzymology 148: 350-382.

Khan, W. M., Prithiviraj, B. and Smiyh, D. L. (2002) Effect of foliar application of chitin oligosaccharides on photosynthesis of maize and soybean. Photosynthetica 40: 621-624.

Kovacik, J., Backor, M., Strnad, M. and Repcak, M. (2009) Salicylic acid induced changes to growth and phenolic metabolism in Matricaria chamomilla plants. Plant Cell Report 28: 135-143.

Kuznetsov, V. I. and Shevykova, N. I. (1999) Proline under stress: Biological role, metabolism and regulation. Russian Journal of Plant Physiology 46: 274-287.

Lazcano-Ferrat, I. and Lovatt, C. J. (1999) Relationship between reative water content, nitrogen pools and growth of Phaseolus vulgaris L. and P. acutifolius A. Gray during water deficit. Crop Sciense 39: 467-475.

Levitt, J. (1980) Response of plants to environmental stresses, Vol. 2. Water, radiation, salt and other stresses. Academic Press, New York.

Limpanavech, P., Chaiyasuta, S., Vongpromek, R., Pichyangkura, R., Khunwasi, C., Chadchawan, S., Lotrakul, P., Bunjongrat, R., Chaidee, A. and Bangyeekhun, T. (2008) Chitosan effects on floral production, gene expression, and anatomical changes in the Dendrobium orchid. Scientia Horticulturae 116: 65-72.

Ma, Q., Niknam, S. R. and Turner, D. (2006) Response of osmotic adjustment and seed yield of Brassica napus and Brassica jounce to soil water deficit at different growth stages. Australian Journal of Agricultural Research 57: 221-226.

Mahdavi, B. and Rahimi, A. (2013) Seed priming with chitosan improves the germination and growth performance of ajowan (Carum copticum) under salt stress. Eurasian Journal of Biosciences 7: 69-76 (in Persian).

Mahdavi, B. and Safari, H. (2016) Effect of chitosan on growth and some physiological characteristics of chickpea under salt stress conditions. Journal of Process and Plant Function 4(12): 117-127 (in Persian).

Mahdavi, B., Modarres Sanavy, S. A. M., Aghaalikhani, M. and Sharifi, M. (2011) Effect of water stress and chitosan on germination and proline of seedling in safflower (Carthamus tinctorius L.). Journal of Crop Improvement 25: 728-741 (in Persian).

Makkart, H. P. S., Singh, B. and Dawra, R. K. (1988) Effect of tannin-rich leaves of oak (Quercus incana) on various microbial enzyme activities of the bovine rumen. British Journal of Nutrition 60(2): 287-296.

Malekpoor, F., Salimi, A. and Ghasemi Pirbalouti, A. (2015) Effect of bioelicitor of chitosan on physiological and morphological properties in purpule basil (Ocimum basilicum L.) under water deficit. Scientific Journal of Plant Ecophysiology 27: 56-71.

Martin, M., Micell, F., Morgan, J. A., Scalet, M. and Zerbi, G. (1993) Synthesis of osmotically active substances in winter wheat leaves as related to drought resistance of different genotypes. Journal of Agronomy and Crop Science 171: 176-184.

Mazariae, A., Sirousmehr, A. R. and Babaei, Z. (2017) Effect of mycorrhizal fungi on some morphological and physiological charactristics of milk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn.) under drought stress. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 33(4): 620-635 (in Persian).

McDonald, S., Prenzler, P. D., Autolovich, M. and Robards, K. (2001) Phenolic content and antioxidant activity of olive extracts. Food Chemistry 73: 73-84.

Mittler, R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trend in Plant Science 7(9): 405-410.

Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M. and Vanbreusegem, F. (2004) Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science 9: 490-498.

Modrres Sanavi, S. A., Mavdavi, B., Alikhani, M. A. and Sharifi, M. (2014) Chitosan concentrations on germination of seeds and antioxidant enzymes of safflower under dehydrated conditions. Journal of Plant Research 26(3): 352-365 (in Persian).

Moran, J. F., Becana, M., Iturbe-Ormaetxe, I., Frechilla, S., Klucas, R. V. and Aparicio-Tejo, P. (1994) Drought induces oxidative stress in pea plants. Planta 194(3): 346-352.

Morello, J. R., Romero, M. P., Ramo, T. and Motilva, M. J. (2005) Evaluation of phenylalanine ammonialyase activity and phenolic profile in olive drupe (Olea europaea L.) from fruit setting period to harvesting time. Plant Science 168: 65-72.

Movahhedi Dehnavi, M., Ranjbar, M., Yadavi, A. R. and Kavusi, B. (2011) Effect of cycocel on proline, soluble sugares, protein, oil and fatty acids of flax (Linum usitatissimum M.) plants under drought stress in a pot trial. Environmental Stresses in Crop Sciences 3: 129-138 (in Persian).

Movahhedi Dehnavi, M., Niknam, N., Behzadi, Y., Mohtashami, R. and Bagher, R. (2017) Comparison of physiological responses of linseed (Linum usitatissimum L.) to drought and salt stress and salicylic acid foliar application. Iranian Journal of Plant Biology 9(3): 39-62 (in Persian).

Naderi, S., Fakheri, B. A. and Bahrami, M. (2015) Effect of chitosan on some physiological and biochemical indices of Carum copticum. Journal of Plant Process and Function 1(2): 187-210 (in Persian).

Nakano, Y. and Asada, K. (1981) Hydrogen peroxide is scavenged by ascarbate specific peroxidases in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiology 22: 867-880.

Nautical, P. C., Rachaputi, N. R. and Joshi, Y. C. (2002) Moisture-deficit-induced changes in leafwater content, leaf carbon exchange rate and biomass production in groundnut cultivars differing in specific leaf area. Field Crop Research 74: 67-79.

Omidbaigi, R. (2006) Production and processing of medicinal plants. Vol. 3. Astan Quds Razavi Press, Mashahd (in Persian).

Park, P. J., Je, J. Y. and Kim, S. K. (2004) Free radical scavenging activities of differently deacetylated chitosans using an ESR spectrometer. Carbohydrate Polymers 55: 17-22.

Paul, D. (2016) A review on biological activities of common mallow (Malva sylyestris L.). Innovare Journal of Life Sciences 4(5): 1-5.

Prochazka, S., Machaackova, I., Kreekule, J. and Sebanek, J. (1998) Plant physiology. Academia, Praha.

Pu, G. B., Dong-Ming, M., Chen, J. L., Ma, L. Q., Wang, H. and Li, G. F. (2009) Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia. Plant Cell Report 28: 1127-1135.

Rinaudo, M. (2006) Chitin and chitosan: properties and applications. Progress in Polymer Science 31(7): 603-632.

Sairam, R. K. and Saxena, D. C. (2000) Oxidative stress and antioxidants in wheat genotypes: possible mechanism of water stress tolerance. Journal of Agronomy and Crop Science 184: 55-61.

Sanchez-Blanco, J., Fernandez, T., Morales, A., Morte, A. and Alarcon, J. (2006) Variation in water stress, gas exchange, and growth in Rosmarinus officinalis plants infected with Glamus deserticola under drought conditions. Journal of Plant Physiology 161: 675-682.

Sankar, B. E., Jaleel, C. A., Manivannan, P., Kishorekumar, A., Somasundaram, R. and Panneerselvam, R. (2007) Drought induced biochemical modification and proline metabolism in Abelmoschus esculentus (L.) Moench. Acta Botanica Croatica 66: 43-56.

Schutz, M. and Fangmeir, E. (2001) Growth and yield responses of spring wheat (Triticum aestivum L. cv. Minaret) to elevated CO2 and water limitation. Environmental Pollution 114: 187-194.

Shao, H. B., Liang, Z. S., Shao, M. A. and Sun, Q. (2005) Dynamic changes of anti-oxidative enzymes of 10 wheat genotypes at soil water deficits. Colloids and Surfaces Biointerfaces 42: 187-195.

Sharma, P. and Dubey, R. S. (2005) Drought induces oxidative stress and enhances the activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings. Plant Growth Regulation 46(3): 209-221.

Sheikha, S. A. K. and AL-Malki, F. M. (2009) Growth and chlorophyll responses of bean plants to the chitosan applications. European Journal of Scientific Research 50: 124-134.

Sharafati chaleshtori, F., Sharafati chaleshtori, R. and Momeni, M. (2008) Comparison of the antimicrobial effects of the ethanolic and aqueous extracts of Scrophularia striata on Escherichia coli O157:H7 in vitro. Shahrekord University of Medical Sciences Journal 10(4): 32-37 (in Persian).

Sun, T., Xie, W. M. and Xu, P. X. (2004) Superoxide anion scavenging activity of graft chitosan derivatives. Carbohydrate Polymers 58: 379-382.

Taheri, Gh. (2015) The effect of chitosan foliar application on physiological characteristics of Binaloud under drought stress. Iranian Journal of Agricultural Research1 3(4): 728-737 (in Persian).

Tian, X. and Li, Y. (2006) Nitric oxide treatment alleviates drought stress in wheat seedlings. Biologia Plantarum 50(4): 775-778.

Urbanek, H., Kuzniak-Gebarowska, E. and Herka, K. (1991). Elicitation of defense responses in bean leaves by Botrytis cinerea polyglacturonase. Acta Physiologiae Plantarum 13: 43-50

Uthairatanakij, A., Teixeira, J. A. and Obsuwan, K. (2007) Chitosan for improving orchid production and quality. Science 1: 1- 5.

Vendruscolo, A. C. G., Schuster, I., Pileggi, M., Scapim, C. A., Molinari, H. B. C., Marur, C. J. and Vieira, L. G. C. (2007) Stress-induced synthesis of proline confers tolerance to water deficit in transgenic wheat. Journal of Plant Physiology 164: 1367-1376.

Waseem, S., Hamid, M., Ishrat, N., Waqas, K. K., Haroon, A., Saqib, H. and Atif, K. (2010) Pharmacognostical study of the medicinal plant Calendula officinalis L. (Family Compositae). International Journal of Cell and Molecular Biology 1(2): 108-116.

Wise, R. R. and Naylor, A. W. (1989) Chilling enhanced photo-oxidation, the peoxidative destruction of lipids during chilling injury to photosynthesis and ultrastructure. Plant Physiology 83: 278-282.

Xu, Y. C., Zhang, J. B., Jiang, Q. A., Zhou, L. Y. and Miao, H. B. (2006) Effects of water stress on the growth of Lonicera japonica and quality of honeysuckle. Zhong Yao Cai 29(5): 420-423.

Yahubyan, G., Gozmanova, M., Denev, I., Toneva, V. and Minkov, I. (2009) Prompt response of superoxide dismutase and peroxidase to dehydration and rehydration of the resurrection plant Haber learhodopensis. Plant Growth and Regulation 57: 49-56.

Yang Feng, H., Li, J., Wu, J. and Yurong, X. Q. (2009) Chitosan enhances leaf membrane stability and antioxidant enzyme activities in apple seedlings under drought stress. Plant Growth Regulation 58: 131-136.

Yang, F., Hu, J., Li, J., Wu, X. and Qian, Y. (2009) Chitosan enhances leaf membrane stability and antioxidant enzyme activities in apple seedlings under drought stress. Plant Growth Regulation 58: 131-136.

Yen, M. T., Yang, J. H. and Mau, J. L. (2008) Antioxidant properties of chitosan from crab shells. Carbohydrate Polymers 74: 840-844.

Yong, T., Zongsuo, L., Hongbo, S. and Feng, D. (2006) Effect of water deficits on the activity of anti-oxidative enzymes and osmoregulation among three different genotypes of Radix astragali at seeding stage. Colloids and Surfaces

Zhili, J., Yong, L., Juanjuan, L., Xu, X., Li, H., Lu, D. and Jingying, W. (2012) Effects of exogenous chitosan on physiological characteristics of potato seedlings under drought stress and rehydration. Potato Research 55: 293-301.