زیست‌پالایی رنگ نساجی Direct Blue 129 توسط جلبک سبزChlorella vulgaris Beijerinck و سیانوباکتر Spirulina (Arthrospira) platensis Gomont و ارزیابی شاخص‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی آنها تحت‌تأثیر رنگ

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کیلومتر 5 جاده تهران - خرم آباد، دانشگاه لرستان- دانشکده علوم- گروه زیست شناسی

2 کیلومتر 5 جاده تهران- خرم آباد، دانشگاه لرستان- دانشکده علوم- گروه زیست شناسی

3 گروه شیمی کاربردی، دانشکدة شیمی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

10.22108/ijpb.2020.118969.1172

چکیده

حذف آلاینده‌های نامطلوب از اکوسیستم‌های آبی که به‌علت تخلیۀ آلاینده‌های صنعتی و شهری حاصل شده‌اند، به فناوری‌های کارا، مقرون‌به‌صرفه و سازگار با محیط‌زیست نیاز دارد؛ در این فرایند زیستی، توانایی فیزیولوژیک جلبک‌ها و باکتری‌ها برای حذف و سمیت‌زدایی آلاینده‌هایی نظیر مواد رنگ‌زا استفاده می‌شود. در پژوهش حاضر، توانایی جلبک سبز Chlorella vulgaris و سیانوباکتر Spirulina platensis در رنگ‌زدایی مادۀ Direct Blue-129 (DB129) در غلظت‌های صفر (شاهد)، 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر رنگ طی یک هفته بررسی شد و شاخص‌های فیزیولوژیک در روزهای اول، سوم و هفتم رشد اندازه گیری شدند. درصد رنگ‌زدایی C. vulgaris بیشتر از S. platensis بود. تیمار رنگ سبب افزایش شاخص‌های رشد Xm  (بیشینة تودة سلولی)،Px   (تولیدات سلولی)، µm  (بیشترین سرعت رشد ویژه) و کاهش td  (زمان دوبرابرشدن سلول‌ها)در C. vulgaris در مقایسه با نمونۀ شاهد (برخلاف تأثیر آن بر S. platensis) شد، اما مقدار آستاگزانتین در S. platensis افزایش بیشتری نشان داد. مقادیر کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید کل در C. vulgaris در هر دو غلظت رنگ و صرفاً در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر در S. platensis نسبت به شاهد و فیکوبیلین‌ها در S. platensis افزایش یافتند. غلظت 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر سبب بیشترین تولید مقدار کربوهیدرات محلول در هر دو ریزموجود شد و با افزایش غلظت مادۀ رنگ‌زا، مقدار پروتئین در C. vulgaris برخلاف S. platensis افزایش یافت؛ درمجموع، به نظر می‌رسد توانایی C. vulgaris در رنگ‌زدایی و تحمل آن نسبت به تنش حاصل از مادۀ رنگ‌زای DB129 در مقایسه با S. platensis بیشتر است.
 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Bioremediation of textile dye Direct Blue 129, by green alga Chlorella vulgaris Beijerinck and cyanobacter Spirulina (Arthrospira) platensis Gomont, and influence of dye on their physiological and biochemical indices

نویسندگان [English]

  • Zahra Moradi 1
  • Maryam Madadkar Haghjou 2
  • Mahmoud Zarei 3
1 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Lorestan University, Khorramabad, Iran
2 Departement of Biology (Plant Physiology), Faculty of Science, Lorestan University, 5th K Tehran-Khoramabad road, Iran
3 Department of Applied Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Tabriz, Tabriz, Iran
چکیده [English]

Abstract
Removal of undesirable pollutants from aquatic ecosystems, which is caused by discharge of large amounts of industrial and urban pollutants into water resources, requires efficient, cost-effective and environmentally friendly technologies, such as phycoremediation. In this biological process, the physiological ability of some algal and cyanobacterial species in detoxifying pollutants such as textile dyes is used. In the present study, the ability of eukaryotic green alga Chlorella vulgaris and prokaryotic cyanobacter Spirulina platensis for decolorization of Direct Blue 129 (DB129) dye at zero (control), 20 and 60 mg. L-1 was studied during one week. Evaluations of physiological indices were performed on 1, 3 and 7 days of growth. C. vulgaris showed a higher percentage in removal efficiency than S. platensis. Dye treatment increased growth indices; Xm (maximum cell concentration), Px (cell productivity) and µm (maximum specific growth rate) and decreased td (doubling time) in C. vulgaris, compared to the control, but astaxanthin showed a higher increase in S. platensis. Chl a, Chl b and total carotenoid contents were increased in C. vulgaris alga at both concentrations of dye, and at 20 mg. L-1 in S. platensis, compared to control. Phycobilins were also increased in treated S. platensis. The highest concentration of dye (60 mg. L-1) caused the highest soluble carbohydrate production in both microorganisms. Along with an increase in dye concentration (unlike S. platensis) protein content was also increased in C. vulgaris. In general, it seems that C. vulgaris has a higher ability in decolrization and is more tolerant to DB129 dye stress than S. platensis.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioremediation
  • decolorization
  • Pollution
  • Textile effluent

مقدمه.

در میان ترکیبات آلایندۀ محیط‌زیست، مواد رنگ‌زای حاصل از صنایع رنگرزی و نساجی قابلیت پالایش‌شدن ساده را ندارند و ازاین‌رو، دشواری‌های فراوانی در زمینۀ حذف آنها از محیط وجود دارند؛ یکی از مهم‌ترین دلایل این امر آن است که مواد رنگ‌زای مصنوعی معمولاً ساختار مولکولی آروماتیک و پیچیده‌ای دارند که سبب پایداری آنها و دشوارشدن فرایند تجزیۀ این مواد می‌شود (Fu and Viraraghavan, 2001). برخی بررسی‌‌ها در زمینۀ آثار منفی مواد رنگ‌زا بر موجودات آبزی نظیر ماهی‌ها، سخت‌پوستان، گیاهان آبزی و جلبک‌ها نشان داده‌اند مواد رنگ‌زای آزو (Azo dyes) سبب اختلال در فرایندهایی مانند زنده‌‌مانی، تکثیر و مصرف اکسیژن در ماهی‌ها و مژه‌داران کوچک می‌شوند و از طریق کاهش‌دادن نفوذ نور، در فتوسنتز و رشد گیاهان آبزی و جلبک‌ها اختلال ایجاد می‌کنند (Novotný et al., 2006; Almeida and Corso, 2014;. Movafeghi et al., 2015). استفاده از زیست‌پالایی برای رنگ‌زدایی و تصفیۀ مواد رنگ‌زای مصنوعی به‌علت سازگاربودن با محیط‌زیست، مقرون‌به‌صرفه‌بودن، تولید پسماندهای کمتر، تولید فراورده‌های غیرسمی و مصرف آب کمتر در مقایسه با روش‌های فیزیکوشیمیایی مناسب‌تر است (Bafana et al., 2011). موجودات فتوسنتزکننده نظیر سیانوباکترها و جلبک‌ها پراکندگی منحصر‌به‌فرد و گسترده‌ای در بیشتر زیستگاه‌های طبیعی سراسر جهان و تحمل درخور توجهی نسبت به تنش‌‌های زیست‌محیطی دارند که این موضوع سبب معطوف‌شدن توجه زیاد به این موجودات برای تصفیۀ پساب‌های حاوی مواد رنگ‌زای نساجی شده است (Saratale et al., 2011). سلول‌های جلبکی به‌علت گسترده‌بودن سطح و وجود گروه‌های شیمیایی روی دیوارۀ سلولی دارای قابلیت جذب زیادی‌اند؛ درحقیقت، دیوارۀ سلولی جلبک‌ها نقش مهمی در فرایند جذب دارد و جایگاه‌هایی را برای جذب الکترواستاتیک فراهم می‌کند که ترکیبات متفاوتی را به خود متصل می‌کنند (Rasolzadeh et al., 2019)؛ همچنین پژوهش‌ها نشان داده‌اند این سلول‌ها به‌واسطۀ برخی آنزیم‌های خود می‌توانند ترکیبات کربنی آلی و غیرآلی را متابولیزه‌ کنند و این ویژگی آنها را قادر می‌کند آلاینده‌ها را تجزیه و مواد تجزیه‌شده را به‌شکل منبع غذایی برای تولید زیست‌تودۀ سلولی استفاده کنند (Rawat et al., .2011; Dmytryk et al., 2014; Osundeko et al., 2014). زیست‌تودۀ جلبکی منبع رنگیزه‌ها، لیپیدها، پروتئین‌ها و اسیدهای چرب است که در صنایع مختلف نظیر کشاورزی، داروسازی، رنگرزی و تولید سوخت‌های زیستی استفاده می‌شوند. این ریزموجودات ظرفیت فتوسنتزی زیادی دارند و اکسیژن محلول محیط را از طریق فتوسنتز افزایش می‌دهند و سبب کاهش دی‌اکسیدکربن و درنتیجه، کاهش گازهای گلخانه‌ای می‌شوند (Rawat et al., 2011; Renuka et al., 2015). استفاده از جلبک‌ها برای پالایش پساب‌ها و تولید هم‌زمان سوخت زیستی و ترکیبات ارزشمند غذایی و دارویی، علاوه‌بر اینکه سبب کاهش هزینۀ پالایش پساب‌ها می‌شود، کاهش هزینۀ کشت جلبک‌ها و صرفه‌جویی در مصرف آب شیرین را در پی دارد؛ زیرا پساب‌های حاوی مواد رنگ‌زا تمام مواد و عناصر ضروری لازم برای رشد جلبک‌ها مانند کربن، نیتروژن، فسفات، آمونیوم و برخی فلزات مانند آهن، کادمیوم و روی را دارند (Diniz et al., 2017; Yaseen and Scholz, 2019). پژوهش‌ها نشان می‌دهند سیانوباکترها، موجودات پروکاریوتی فتوسنتز‌کننده‌ای‌اند که توانایی بسیار خوبی در تصفیۀ پساب‌ها ازجمله رنگ‌های نساجی دارند (Dellamatrice et al., 2017).

میکروجلبک Chlorella vulgaris، جلبک تک‌سلولی یوکاریوتی و فتوسنتزکننده است. بر اساس منابع، دیوارۀ سلولی ریزجلبک Chlorellaقادر به جذب سطحی برخی مواد و ترکیبات است (Dmytryk et al., 2014). رشد سریع، آسان و تحمل زیاد ریزجلبک C. vulgaris در برابر تنش‌های محیطی سبب شده است این جلبک برای استفاده در تصفیۀ پساب‌ها، صنایع غذایی، دارویی، کشاورزی و تولید سوخت زیستی مناسب باشد (Safi et al., 2014).

سیانوباکتر Spirulina platensis،ریزموجودی است که سازوکار خود را بسته به شرایط محیطی تغییر می‌دهد. این ریزموجود می‌تواند رشد فتوتروفی (Photoautotrophic)، هتروتروفی (Heterotrophic) یا میکسوتروفی (Mixotrophic) داشته باشد و این ویژگی، زیست سلول را در شرایط کمبود نور و حضور مواد آلی و آلاینده‌ها میسر می‌کند(Sánchez et al., 2003). این ریزموجودات پروکاریوتی، ریسه‌ای و پرسلولی‌اند و در محیط‌ها و آب‌های گرم و نیمه‌گرم دنیا زندگی می‌کنند و دیوارۀ سلولی آنها از شبکۀ ماکرومولکولی چندبعدی متخلخل شامل پپتیدوگلیکان‌ها، تیکورونیک‌اسید (Teichuronic acid)، تیکوئیک‌اسید (Teichoic acid)، برخی پلی‌ساکاریدها و پروتئین‌ها تشکیل شده است که گروه‌های کربوکسیلی، هیدروکسیلی و فسفات دارند (Sánchez et al., 2003). گزارش‌ها نشان می‌دهند برخی گروه‌های روی دیوارۀ Spirulina (مشابه با Chlorella) برخی مواد را روی خود متصل و آنها را از محیط اطراف جدا می‌کنند (Dmytryk et al., 2014)؛ این سیانوباکتر اهمیت غذایی بسیاری نیز دارد.

نظر به اهمیت میکروجلبک Chlorella و سیانوباکترهایی نظیر Sprirulina در تصفیۀ پساب‌های رنگی نساجی‌ها و سایر مصارف مراکز صنعتی، این ریزموجودات در کنار یکدیگر در برخی مطالعه‌ها بررسی و ازنظر توانایی و میزان تصفیۀ تعدادی از رنگ‌ها مقایسه شده‌اند (Lebron et al., 2018 ; El-Sheekh et al., 2018)؛ هرچند مطالعۀ شاخص‌های فیزیولوژیک آنها کمتر مدنظر قرار گرفته و مطالعۀ مقایسه‌ای در زمینۀ رنگ دایرکت بلو 129 (DB129) انجام نشده است. بر اساس منابع، فتواتوتروف‌هایی نظیر میکروجلبک‌ها و سیانوباکترها از موجودات بسیار مهم در تصفیۀ پساب‌های صنعتی به شمار می‌آیند؛ زیرا علاوه‌بر انجام عمل تصفیه، گاهی از رنگ به‌شکل مادۀ مغذی استفاده می‌کنند و میزان برخی ترکیبات مغذی درون سلول‌ها یا رشد خود را افزایش می‌دهند. زیست‌تودۀ تر یا خشک حاصل در تغذیه و نیز به‌شکل کود برای گیاهان استفاده می‌شود (Brar et al., 2017).

نتایج تجزیه‌وتحلیل شیمیایی ریزموجودات S. platensis و C. vulgaris نشان داده‌اند این ریزموجودات سرشار از رنگدانه‌های زیستی آستاگزانتین هستند. آستاگزانتین، کاروتنوئیدی از نوع گزانتوفیل و مکمل غذایی مفید حاوی عوامل آنتی‌اکسیدان و ضدتومور است (Sánchez et al., 2003; Safi et al., 2014). ریزموجودات یادشده حاوی پروتئین‌ها، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، آمینواسیدهای ضروری، مواد معدنی مغذی و اسیدهای چرب ضروری‌اند که ارزش غذایی و دارویی فراوانی دارند (Ambati et al., 2014; Yaakob et al., 2014). ریزموجود Sprirulina منبع رنگدانه‌های زیستی فیکو‌بیلی‌پروتئین ازجمله فیکوسیانین و آلو‌فیکو‌سیانین است که کاربردهای مختلفی در صنایع غذایی و دارویی دارند (Yaakob et al., 2014).

نتایج برخی آزمایش‌ها و پژوهش‌ها نشان داده‌اند مقدار و نوع ترکیبات ارزشمند درون جلبک‌ها و سیانوباکترها نظیر رنگیزه‌ها، پروتئین‌ها، کربوهیدرات‌ها و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی بر اثر تغییر شرایط محیطی یا به‌واسطۀ وجود برخی محرک‌ها و مواد شیمیایی موجود در محیط‌زیست ریزموجود و پساب‌ها تغییر می‌کند (Sharma et al., 2012; Battah et al., 2013; Cheng and He, 2014; Renuka et al., 2015; Akbari and Madadkar Haghjou, 2017; Pourbozorgi Rudsari et al., 2019)؛ بنابراین هدف پژوهش حاضر، بررسی و مقایسۀ قابلیت جلبک سبز C. vulgaris و سیانوباکتر S. platensis در رنگ‌زدایی مادۀ رنگ‌زای DB129 و بررسیتأثیر غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زای مطالعه‌شده (ترکیب آلاینده) بر میزان رشد و زیست‌تودۀ نمونه‌های یادشده است؛ همچنین مطالعۀ احتمال افزایش ترکیبات ارزشمندی نظیر پروتئین، کربوهیدرات و رنگدانه‌ها تحت‌تأثیر غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زا در دستورکار پژوهش حاضر قرار دارد.

 

مواد و روش‌ها

آماده‌سازی محیط‌کشت‌ها و طراحی تیمارها: جلبک C. vulgaris از مجموعۀ جلبکی دانشگاه اصفهان و سیانوباکتر S. platensis از مجموعۀ جلبکی دانشگاه لرستان و تمام مواد لازم برای تهیۀ محیط‌کشت سلول‌ها از شرکت‌های سیگما یا مرک تهیه شدند. محیط‌کشت جانسون (Johnson et al., 1968) با استفاده از KH2PO4 (2/0 میلی‌مولار)، KNO3 (5 میلی‌‌مولار)، MgSO4 (5 میلی‌مولار)، CaCl2 (2/0 میلی‌مولار)، FeCl3 (5 میکرومولار)، Na2-EDTA (5 میکرومولار)، CoCl2 (1 میکرومولار)، MnCl2 (7 میکرومولار)، ZnCl2 (1 میکرومولار)، (NH4)6MoO7.4H2O (1 میکرومولار)، CuCl2 (1 میکرومولار)، NaHCO3 (30 میلی‌مولار) و محیط‌کشت زاروک (Raoof et al., 2006) با استفاده ازK2HPO (2 میلی‌‌مولار)، NaNO3 (29 میلی‌مولار)، MgSO4.7H2O (8 میلی‌مولار)، K2SO4 (5 میلی‌مولار) CaCl2.2H2O (2/0 میلی‌مولار)، FeSO4.7H2O (03/0 میلی‌مولار)، EDTA (4/0 میلی‌مولار)، H3BO3 (46 میلی‌مولار)، MnCl2.4H2O (9 میلی‌مولار)، ZnSO4.4H2O (1 میلی‌مولار)، Na2MoO4 (07/0 میلی‌مولار)، CuSO4.5H2O (5/0 میلی‌مولار)، NaCl (17 میلی‌مولار) و NaHCO3 (4/196 میلی‌مولار) تهیه شدند. اسیدیتۀ محیط‌کشت جانسون معادل 5/7 و اسیدیتۀ محیط‌کشت زاروک با‌توجه‌به قلیادوست‌بودن سیانوباکتر S. platensis روی 5/10 تنظیم شد.

مادۀ رنگ‌زای DB129 با فرمول شیمیایی C30H19N5Na2O7S2 به گروه مواد رنگ‌زای آزو تعلق دارد و در پژوهش حاضر، به‌منظور بررسی توانایی رنگ‌زدایی ریزموجودات C. vulgarisو S. platensis و تأثیر این ماده بر مقدار و نوع برخی از ترکیبات درون‌‌سلولی آنها استفاده شد. به‌منظور اعمال تیمار مادۀ رنگ‌زا، مقدار 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زای DB129 به سوسپانسیون سلولی هریک از نمونه‌های C. vulgarisوS. platensis در هریک از محیط‌کشت‌های یادشده اضافه و یک نمونه نیز شاهد (بدون مادۀ رنگ‌زا) در نظر گرفته شد. میزان مادۀ رنگ‌زا بر اساس آزمون‌های مقدماتی به‌شکلی انتخاب شد که از آثار شدید و کشنده روی سوسپانسیون سلولی اجتناب شود، ولی تأثیر تحریک‌کنندگی محتمل آن بر رشد و تغییر مقدار ترکیبات درون‌سلولی ریزموجودات میسر شود (Walsh, 1988). سوسپانسیون‌های سلولی هریک از نمونه‌ها با کدورت نوری 3/0 (در طول موج 750 نانومتر) در شرایط استریل به محیط‌کشت‌ها اضافه شدند (روز صفر) و پس‌از‌آن، نمونه‌ها به‌مدت هفت روز در دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد، شرایط نوری 100 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه، دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و هوادهی با پمپ هوا به میزان 20 لیتر در ساعت (Mezzomo et al., 2010) قرار گرفتند. نمونه‌برداری‌ سلول‌ها برای اندازه‌گیری و ارزیابی شاخص‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی در روزهای اول، سوم و هفتم انجام شد. روش فریز‌کردن (در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد) و آب‌کردن بافت تر و روش سونیکیشن (سه مرتبه و هر بار 10 دقیقه در 80 هرتز) و ورتکس شدید در حضور گلوله‌های شیشه‌‌ای کوچک برای استخراج ترکیبات درون‌سلولی نمونه‌‌ها استفاده شدند (Moraes et al., 2011).

 

آزمون‌‌های رنگ‌زدایی

درصد حذف مادۀ رنگ‌زا:ارلن‌های حاوی هریک از سوسپانسیون‌های سلولی در محیط‌کشت همراه با مادۀ رنگ‌زا در دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد آزمایشگاه قرار داده شدند. درصد حذف مادۀ رنگ‌زا از رابطۀ 1 تعیین شد.

رابطۀ 1

Dye removal (%)=[C0-Cn/C0]×100

C0 و Cn به‌ترتیب غلظت‌های ابتدایی و انتهایی مادۀ رنگ‌زای DB129 (بر حسب میلی‌گرم‌بر‌لیتر) در محیط‌کشت را پس‌از زمان‌های مدنظر نشان می‌دهند (Movafeghi et al., 2015). غلظت نهایی رنگ با استفاده از منحنی کالیبراسیون و باتوجه‌به مقادیر متفاوت جذب در برابر غلظت با اسپکتروفتومتر (مدل T80 UV-Visible، شرکت PG Instruments، انگلستان) در طول موج بیشینۀ مادۀ رنگ‌زا (598 نانومتر) سنجش شد. محلول رویی (پس‌از سانتریفیوژ) سوسپانسیون سلولی بدون تیمار رنگ برای بلانک و نمونۀ محلول رنگ با غلظت مشخص اولیه و بدون سلول برای شاهد مثبت استفاده شد.

.بررسی تأثیر مادۀ رنگ‌زا بر شاخص‌های رشد C. vulgarisو S. platensis

اندازه‌گیری وزن خشک نمونه‌ها: به‌منظور اندازه‌گیری وزن خشک جلبک، مقادیر همگنی از سوسپانسیون سلولی به‌مدت 15 دقیقه در 13500 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند و به‌منظور حذف محیط‌کشت، سطح زیست‌تودۀ تر دو تا سه بار با آب دوبارتقطیر شستشو شد. پس‌از خارج‌شدن کامل محلول رویی، زیست‌تودۀ تر به‌دست‌آمده به‌مدت 8 ساعت در دمای 55 درجة سانتی‌گراد درون آون خشک و سپس وزن شد. وزن خشک بر اساس گرم‌در‌لیتر گزارش شد.

ارزیابی سایر شاخص‌های رشد: رابطه‌های 2، 3 و 4 برای محاسبة برخی از شاخص‌های رشد شامل Xm (بیشینۀ تودة سلولی)، Px (تولیدات سلولی)، µm (بیشترین سرعت رشد ویژه) و td (زمان دوبرابرشدن سلول‌ها) استفاده شدند.

رابطۀ 2

Px (mg/L/day)=(Xm-Xi)/tm

در رابطۀ 2، Px: Cell productivity، Xm: مقدار بیشینة تودة سلولی بر حسب میلی‌گرم وزن خشک در لیتر، Xi: مقدار اولیۀ تودۀ سلولی بر حسب میلی‌گرم وزن خشک در لیتر و tm: سن کشت (روز) است (Madkour et al., 2012).

رابطۀ 3

μm(division/day)=ln (x2-x1)/(t2-t1)

در رابطۀ 3، μm: بیشترین سرعت رشد ویژه (Maximum specific growth rate)، x1: وزن خشک تودة سلولی در زمان t1 و x2: وزن خشک تودۀ سلولی در زمان t2 را نشان می‌دهد. زمان‌های t1 و t2 به‌ترتیب زمان‌های ابتدا و انتهای دوره در فواصل زمانی روز صفر تا اول، روز اول تا سوم و روز سوم تا هفتم را بیان می‌کنند (Madkour et al., 2012).

رابطۀ 4

td (day-1)=(ln 2/µ)=0.693/µ

در رابطۀ 4، td: زمان دوبرابرشدن تودۀ سلولی و µ: بیشترین سرعت رشد ویژۀ به‌دست‌آمده از رابطۀ 2 را نشان می‌دهد (Madkour et al., 2012).

.سنجش میزان کلروفیل‌هایb, aو کاروتنوئید کل در C. vulgarisو S. platensis:به‌منظور استخراج کلروفیل‌های a و b و کاروتنوئیدها در جلبک C. vulgarisاز حلال استون 80 درصد (Lichtenthaler and Buschmann, 2001) و به‌منظور استخراج کلروفیل a و کاروتنوئید کل در S. platensisاز حلال متانول (Zavřel et al., 2015) استفاده شد. رسوب سلولی از طریق سانتریفیوژکردن (مدل Sigma، شرکت 16-4KS، آلمان) سلول‌ها به‌مدت 15 دقیقه در 13500 دوردردقیقه حاصل شد. پس‌از استخراج رنگیزه‌های یادشده به کمک حلال‌های مربوطه (استون 80 درصد و متانول خالص)، لوله‌های حاوی عصاره‌ها به‌مدت 7 دقیقه در 7000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. مقادیر کلروفیل‌های a، b و کاروتنوئید کل جلبک C. vulgaris بر اساس جذب نوری عصارۀ استونی با دستگاه اسپکتروفتومتر )مدل T80 UV-Visible، شرکت PG Instruments، انگلستان( در طول موج‌های 470، 645 و 662 نانومتر و از روابط 5، 6 و 7 محاسبه و محتوای کلروفیل aو کاروتنوئید کل S. platensis بر اساس جذب نوری عصارۀ متانولی با دستگاه اسپکتروفتومتر یادشده در طول موج‌های 470، 665 و 720 نانومتر و از روابط 8 و 9 محاسبه و بر حسب میلی‌گرم رنگدانه در گرم وزن تر گزارش شدند.

 

رابطۀ 5

Chl a=11.24 A 661.6-2.04 A644.8

رابطۀ 6

Chl b=20.13 A 644.8-4.19 A 661.6

رابطۀ 7

Cx+c=(1000 A 470-1.90 Ca-63.14 Cb)/214

رابطۀ 8

Chl a=12.9447(A 665-A 720)

رابطۀ 9

Carotenoids=[1000(A 470-A 720)-2.86 Chla]/221


.سنجش میزان رنگیزه‌های فیکوبیلین در S. platensis: به‌منظور بررسی میزان فیکوبیلین‌های موجود در S. platensis، استخراج رنگیزه‌‌ها بر اساس روش Ajayan و همکاران (2012) انجام شد و پس‌از خواندن جذب عصاره در طول موج‌های 615، 652 و 562 نانومتر با دستگاه اسپکترومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان)، مقدار فیکوبیلین‌ها طبق روابط 10 تا 13 محاسبه و مقادیر بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن خشک ارائه شدند.

 

رابطۀ 10

Phycocyanin(C-PC)={A615-(0.474×A652)}/5.34

رابطۀ 11

Allophycocyanin(APC)={A652-(0.208×A615)}/5.09

رابطۀ 12

Phycoerythrin(PE)={A562-(2.41×PC)-(0.849×APC)}/9.62

رابطۀ 13

Total phycobiliprotein=PC+APC+PE


سنجش آستاگزانتین:به‌منظور اندازه‌گیری آستاگزانتین، ابتدا محلول دی‌متیل‌سولفوکساید (DMSO) به رسوب خشک نمونه‌ها افزوده شد و سپس نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم (95 درجۀ سانتی‌گراد) قرار گرفتند و پس‌از‌آن، سانتریفیوژ شدند. پس‌از برداشت مایع رویی و افزودن استون، دوباره عصارۀ جلبک‌ها سانتریفیوژ شد. میزان جذب محلول‌ها در طول موج 489 نانومتر بادستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) خوانده شد. مقدار آستاگزانتین بر حسب میلی‌گرم رنگدانه بر گرم وزن خشک جلبک‌ها با استفاده از ضریب خاموشی 105×25/1 لیتر بر مول بر سانتی‌متر محاسبه شد و نتایج گزارش شدند (Régnier et al., 2015).

.سنجش میزان کربوهیدرات محلول کل:سوسپانسیون سلولی برداشت‌شده به‌مدت 15 دقیقه در 13500 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی تخلیه شد؛ سپس به‌منظور حذف تداخل رنگدانه‌ها، ابتدا استون 100 درصد افزوده و دوباره سانتریفیوژ در 13500 دوردردقیقه به‌مدت 15 دقیقه انجام شد (Marshall, 1986). رسوب برداشت‌شده در اتانول 80 درصد با حداقل سه بار فریز- ذوب- سونیک و ورتکس هموژن و دوباره سانتریفیوژ شد. پس‌از جداسازی مایع رویی، رسوب باقیمانده دوباره با اتانول هموژن شد و پس‌از ورتکس شدید و سانتریفیوژ، مایع رویی جدا و با محلول به‌دست‌آمده از مرحلۀ پیش مخلوط شد و سپس به روش آنترون بر اثر واکنش با سولفوریک‌اسید (72 درصد) در گرما ( 100 درجۀ سانتی‌گراد) سنجیده شد (Irigoyen et al., 1992). میزان جذب در طول موج 625 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) خوانده و گلوکز خالص برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد.

سنجش مقدار پروتئین محلول:به‌منظور تهیۀ عصاره، سوسپانسیون سلولی برداشت‌شده پس‌از سانتریفیوژ به‌مدت 15 دقیقه در 13500 دوردردقیقه و دورریختن محلول رویی، بافر استخراج روی آن ریخته شد و سه بار مراحل فریز- ذوب و سونیک را گذراند. بافر استخراج با اسیدیتۀ 8/7 شامل 100 میلی‌مولار Tricine–KOH، PVP-40 5 درصد، 5 میلی‌مولار مرکاپتواتانول و گلیسرول 20 درصد (Smirnoff and Colombe, 1988) بود که به رسوب حاصل از سانتریفیوژ در مرحله پیش اضافه شد.پس‌از اتمام مراحل فریز- ذوب و سونیک، دوباره سانتریفیوژ انجام و از محلول رویی حاصل برای سنجش مقدار پروتیئن محلول و از پروتئین آلبومین گاوی برای استاندارد (مطابق با روش Bradford, 1979) استفاده شد. جذب نمونه‌ها در طول موج 595 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch، شرکت BioTek، انگلستان) خوانده شد و نتایج بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر گزارش شدند.

تحلیل آماری: تمام آزمایش‌ها در 3 تکرار انجام شدند و آنالیز واریانس ANOVA روی داده‌ها انجام شد. مقایسه میانگین داده‌ها از طریق آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0P< انجام و نرم‌افزار SPSS، نسخۀ 16 برای بررسی آماری نتایج استفاده شد.

 

نتایج

تحلیل آماری واریانس داده‌ها (جدول‌های 1 و 2) نشان می‌دهد آثار اصلی و متقابل نوع ریزموجود، غلظت رنگ و زمان نمونه‌برداری روی تمام شاخص‌های ارزیابی‌شده در سطح 1 درصد معنادار است.

 

 

جدول 1- میانگین مربعات جدول تجزیه واریانس شاخص‌های ارزیابی‌شده شامل وزن خشک، کلروفیل a، کلروفیل b، کاروتنوئید، آستاگزانتین در C. vulgaris و S. platensis بر اثر نوع ریزموجود، غلظت رنگ (صفر، 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) و روز نمونه‌برداری (روزهای اول، سوم و هفتم)؛ * و ** به‌ترتیب معناداری در سطح احتمال 5 و 1 درصد را نشان می‌دهند.

آستاگزانتین

کاروتنوئید

bکلروفیل

aکلروفیل

وزن خشک

درجۀ آزادی

منبع تغییرات

**02/0

0/05**

0/15**

0/004**

1/7×7-10**

1

نوع ریزموجود

0/06**

0/001**

0/002**

0/006**

1/7-10×5**

2

غلظت رنگ

**08/0

0/004**

0/001**

0/015**

1/3×7-10**

2

روز

**04/0

0/002**

0/001**

0/003**

9/8×7-10**

2

نوع ریزموجود×غلظت رنگ

**1/0

0/004**

0/002**

0/005**

2/8×7-10**

2

نوع ریزموجود×روز

**08/0

0/008**

0/004**

0/048**

1/2×7-10**

4

غلظت رنگ×روز

**1/0

0/002**

0/004**

0/02**

1/5×7-10**

4

نوع ریزموجود×غلظت رنگ×روز

000/0

2/2×6-10

2/5 × 10-6

1/1×5-10

7/7 × 10-10

36

خطا

 

 

 

 

 

54

جمع کل

 

جدول 2- میانگین مربعات جدول تجزیه واریانس شاخص‌های ارزیابی‌شده شامل PC (فیکوسیانین)، APC (آلوفیکوسیاتین)، PE (فیکواریترین)، PBP (فیکوبیلی‌پروتئین)، کربوهیدرات محلول و پروتئین در C. vulgaris و S. platensis بر اثر نوع ریزموجود، غلظت رنگ (صفر، 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) و روز نمونه‌برداری (روزهای اول، سوم و هفتم) ؛ * و ** به‌ترتیب معناداری در سطح احتمال 5 و 1 درصد را نشان می‌دهند.

پروتئین

کربوهیدرات محلول

PBP

PE

APC

PC

درجۀ آزادی

منبع تغییرات

0/5 **

462/7**

267/7**

3/6**

85/3**

27/4**

1

نوع ریزموجود

0/014**

3466/4**

10/4**

0/115**

1/4**

2/9**

2

غلظت رنگ

0/084**

2668/5**

3/4**

0/022**

1/8**

0/3**

2

روز

0/017**

1063/06**

10/4**

0/115**

1/4**

2/9**

2

نوع ریزموجود×غلظت رنگ

0/057**

2666/9**

3/4**

0/022**

1/8**

0/3**

2

نوع ریزموجود×روز

0/018**

410/3**

1/4**

0/001*

0/5**

0/2**

4

غلظت رنگ×روز

0/016**

2157/1**

1/4**

0/001**

0/5**

0/2**

4

نوع ریزموجود×غلظت رنگ×روز

6/2×5-10

549/0

005/0

0/00

002/0

001/0

36

خطا

 

 

 

 

 

 

41

جمع کل

 


.تأثیر غلظت اولیۀ مادۀ رنگ‌زا در میزان حذف آن. توسط ریزموجودات C. vulgarisوS. platensis:کارایی C. vulgarisو S. platensis در حذف غلظت‌های مختلف (20 و 60 میلی‌‌گرم‌بر‌لیتر) مادۀ رنگ‌زای DB129 طی دورۀ هفت‌روزۀ آزمایش و میزان حذف مادۀ رنگ‌زا تعیین شد (شکل 1). نتایج نشان دادند افزایش غلظت مادۀ رنگ‌زای DB129 از 20 به 60 میلی‌گرم‌در‌لیتر به کاهش کارایی حذف مادۀ رنگ‌زا منجر می‌شود. بیشترین مقدار حذف در دو ریزموجود C. vulgaris (A) و S. platensis (B) در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر به‌ترتیب معادل 85/42 و 5/27 درصد بود؛ همچنین میزان حذف رنگ در نمونه‌های یادشده با افزایش غلظت مادۀ رنگ‌زا به 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر به‌ترتیب به 15/35 و 78/12 درصد کاهش یافت.

 

 

B

A

   

شکل 1- تأثیر غلظت اولیۀ مادۀ رنگ‌زای DB129 بر درصد حذف آن به‌وسیلۀ‌ C. vulgaris (A) و S. platensis (B) در روزهای اول، سوم و هفتم. مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند.


.تأثیر مادۀ رنگ‌زا روی شاخص‌های فیزیولوژیک رشد  C. vulgarisو S. platensis: نتایج تیمار سوسپانسیون‌های سلولی با غلظت‌های متفاوت رنگ در دو سطح 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر نشان داد تیمار ریزموجودات با هر دو غلظت رنگ سبب افزایش شاخص‌های رشد نظیر Xm، Cell productivity Px، µm و کاهش td در جلبک C. vulgaris در مقایسه با نمونۀ شاهد می‌شود (جدول 3، الف)؛ برعکس، تیمار یادشده در S. platensis به کاهش مقادیر شاخص‌های رشد Xm، Px و µm و افزایش td در این ریزموجود نسبت به نمونۀ شاهد منجر شد (جدول 3، ب).

 

 

جدول 3- شاخص‌های رشد بیشترین مقدار وزن خشک (Xm)، Cell productivity (Px)، بیشترین سرعت رشد ویژه (µm)، زمان دوبرابرشدن تودۀ سلولی (td) در C. vulgaris (الف) و S. platensis (ب) در روزهای اول (A)، سوم (B) و هفتم (C) در محیط‌کشت‌های نمونۀ شاهد (غلظت صفر مادۀ رنگ‌زا) و تیمار‌شده با غلظت‌های 20 و 60 میلی‌گرم‌برلیتر مادۀ رنگ‌زای .DB129داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های متفاوت، اختلاف در سطح احتمال 05/0p< بر اساس آزمون دانکن را بیان می‌کنند.

(الف)

td (day-1)

µm (div. day-1)

Px (mg. l-1. d-1)

Xm (g. l-1)

تیمار

(غلظت رنگ-روز)

0006/0 ± 15/0  f

02/0 ± 7/4 d

08/2± 3/108  e

004/0 ± 6/0 g

0-A

005/0 ± 4/0 d

02/0 ± 8/1 f

g8/5±3/73

02/0 ± 7/0e

0-B

006/0 ± 8/0  a

007/0 ± 9/0 h

3± 9/60 h      

02/0 ± 9/0c

0-C

0008/0 ± 14/0 g

03/0 ± 2/5 b 

8/5± 7/176  c     

02/0± 6/0f

20-A

001/0 ± 14/0 f

05/0 ± 8/4 c

8/5 ±120 d

01/0± 8/0d

20-B

003/0 ± 8/0 b

003/0 ± 9/0 g

2/2± 3/83 f

03/0 ± 02/1b

20-C

0003/0 ± 12/0 h

01/0 ± 9/5  a

8/5± 3/383 a

02/0 ±  8/0d

60-A

001/0 ± 3/0 e

01/0 ± 2/2    e

b9/6±4/234

03/0± 1/1a

60-B

0079/0 ± 73/0 c

01/0 ± 94/0 g

3/7± 2/105 e

06/0± 2/1a

60-C

           

(ب)

td (day-1)

µm (div. day-1)

Px (mg. l-1. d-1)

Xm (g. l-1)

تیمار

(غلظت رنگ -روز)

0005/0 ± 1/0  g

006/0 ± 8/6 a

8/5 ± 3/893  a

0001/0 ± 2/1b

0-A

004/0 ± 31/0 e

006/0 ± 2/2 d

d9/1± 4/264

0001/0 ± 1/1b

0-B

01/0 ± 68/0  c

02/0 ± 02/1 f

8/0± 8/184 f

0002/0 ± 5/1 a

0-C

0014/0 ± 1/0 f

09/0 ± 4/6 b

8/5± 3/603 c

0001/0± 9/0c

20-A

002/0 ± 13/0 f

09/0 ± 3/5 c

9/1 ± 1/201 e

0001/0± 9/0c

20-B

013/0 ± 8/0 b

02/0 ± 9/0 f

2/2± 6/97 g

0001/0 ± 9/0c

20-C

0012/0 ± 1/0 g

12/0 ± 6/6  a

5/3± 788 b

0001/0 ±  2/1b

60-A

026/0 ± 38/0 d

13/0 ± 8/1  e

h8/1 ± 7/66

0001/0± 6/0d

60-B

027/0 ± 1/1 a

06/0 ± 6/0 g

4/1± 9/12 i

00001/0± 4/0e

60-C

 


.تأثیر غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زا بر مقدار .رنگیزه‌های فتوسنتزی درC. vulgaris و S. platensis:شکل 2، مقدار رنگیزه‌های C. vulgaris و S. platensisرا تحت‌تأثیر تیمار مادۀ رنگ‌زا نشان می‌دهد (A-E). روند تغییرات رنگدانه‌ها از روز اول تا هفتم در نمونه‌های تیمارشده با غلظت‌های متفاوت رنگ نسبت به یکدیگر یکسان نبود و در زمینۀ نمونۀ شاهد، بیشترین مقدار در روز سوم و سپس کاهش در روز هفتم در هر دو نمونه مشاهده شد. نمونه‌های تیمارشده در غلظت‌های 20 و 60 میلی‌گرم مادۀ رنگ‌زا، گاهی در روز سوم و گاهی در روز هفتم، بیشترین محتوای رنگدانه‌ای را نشان دادند. همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود، محتوای کلروفیل a(شکل 2، A)، کلروفیل b (شکل 2، E) و کاروتنوئید کل (شکل 2، C) جلبک C. vulgaris در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا به‌ترتیب به میزان 63/196، 89/247 و 81/173 درصد و در غلظت 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا به‌ترتیب به میزان 38/48، 55/126 و 545/26 درصد نسبت به نمونۀ شاهد در روز هفتم افزایش یافت؛ درحالی‌که، مقدار کلروفیل a(شکل 2، B) و کاروتنوئید کل (شکل 2، D) در S. platensis تیمارشده با مادۀ رنگ‌زا در روز هفتم صرفاً در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر به‌ترتیب به میزان 91/34 و 96/37 درصد نسبت به نمونۀ شاهد افزایش نشان داد و در غلظت 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر افزایش نیافت. بیشترین میزان کلروفیل a و کاروتنوئید در S. platensis در روز سوم رشد و در نمونۀ شاهد مشاهده شد (شکل 2، B و D).

.تأثیر غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زا روی رنگیزه‌های فیکوبیلین در S. platensis: همان‌گونه که در شکل 3 مشاهده می‌شود معمولاً مقادیر انواع فیکوبیلین‌های S. platensis در تیمارهای مادۀ رنگ‌زا در روزهای اول، سوم و هفتم نسبت به نمونه‌های شاهد (در همان روزها) افزایش نشان می‌دهند؛ به‌طوری‌که در روز اول، بیشترین میزان افزایش این رنگیزه‌ها نسبت به نمونۀ شاهد مشاهده می‌شود. مقادیر فیکوسیانین (شکل 3، A)، آلوفیکوسیانین (شکل 3، B) و فیکواریترین (شکل 3، C) در غلظت20 میلی‌‌گرم‌برلیتر مادۀ رنگ‌زا در روز اول به‌ترتیب به میزان 03/71، 7/47 و 2/33 درصد و در غلظت 60 میلی‌‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا در روز اول به‌ترتیب به میزان 6/317، 5/144 و 0/86 درصد نسبت به نمونۀ شاهد افزایش یافتند؛ باوجوداین، مقدار فیکواریترین در روز هفتم و در غلظت 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا بیشتر از سایر تیمارها بود. روند افزایشی در تمام روزهای آزمون از نمونه‌های شاهد به‌سمت غلظت 60 میلی‌گرم‌در‌لیتر مادۀ رنگ‌زا برای محتوای فیکوسیانین و فیکواریترین مشاهده شد و در زمینۀ رنگدانۀ آلوفیکوسیانین دیده نشد. درمجموع، محتوای رنگدانۀ فیکوبیلین کل سلول (شکل 3، D) در نمونۀ تیمارشده با غلظت 60 میلی‌گرم‌برلیتر مادۀ رنگ‌زا از نمونۀ شاهد و نیز نمونۀ تیمارشده با غلظت 20 میلی‌‌گرم‌برلیتر بیشتر بود و بیشترین مقدار آن در روز اول و 24 ساعت پس‌از تیمار رنگ مشاهده شد.

 

A

B

   

C

D

   

E

 

شکل 2- مقادیر کلروفیل a (A)، کلروفیلb (E) و کاروتنوئید کل (C) در جلبک C. vulgaris و مقادیر کلروفیل a (B) و کاروتنوئید کل (D) در S. platensis تیمارشده با غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زای DB129 در روزهای اول، سوم و هفتم. داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های متفاوت، اختلاف در سطح احتمال 05/0p< بر اساس آزمون دانکن را بیان می‌کنند.

 


.تأثیر غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زا بر .محتوای رنگدانۀ آستاگزانتین در  C. vulgarisو S. platensis: شکل 4 مقدار کاروتنوئید آستاگزانتین در جلبک C. vulgaris (شکل 4، A) و S. platensis (شکل 4، B) را نشان می‌دهد. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند مقدار آستاگزانتین بر گرم وزن خشک در S. platensis بیشتر از مقدار آن در C. vulgaris است و تغییرات آن در این سیانوباکتر طی روزهای مختلف نمونه‌برداری و تیمارهای مختلف بیشتر از جلبک Chlorellaاست. در جلبک C. vulgaris، مقدار آستاگزانتین در غلظت‌های 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا در روز اول به‌ترتیب به میزان 1/7 و 3/4 درصد و در روز هفتم به‌‌ترتیب به مقدار 1/16 و 0/13 درصد نسبت به نمونۀ شاهد خود افزایش یافت (شکل 4، A)؛ درحالی‌که در S. platensis، مقدار آستاگزانتین در غلظت‌های 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا در روز سوم به‌ترتیب به میزان 8/58 و 1/96 درصد نسبت به نمونۀ شاهد افزایش یافت (شکل4، B)؛ هرچند بیشترین مقدار آستاگزانتین در غلظت 20 میلی‌گرم‌برلیتر و در روز هفتم رشد در این نمونه مشاهده شد.


 

A

B

   

C

D

   

شکل 3- مقادیر رنگیزه‌های فیکوسیانین (A)، آلوفیکوسیانین (B)، فیکواریترین (C) و فیکوبیلی‌پروتئین کل (D) در S. platensis تیمارشده با غلظت‌های 20 و 60 میلی‌‌گرم‌برلیترمادۀ رنگ‌زای DB129 در روزهای اول، سوم و هفتم. داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های متفاوت، اختلاف در سطح احتمال 05/0p< بر اساس آزمون دانکن را بیان می‌کنند.

 

A

B

   

شکل 4- محتوای رنگیزۀ آستاگزانتین در ریزموجودات C. vulgaris (A) و S. platensis(B)تیمارشده با غلظت‌های 20 و 60 میلی‌‌گرم‌برلیتر مادۀ رنگ‌زای DB129 در روزهای اول، سوم و هفتم. داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های متفاوت، اختلاف در سطح احتمال 05/0p< بر اساس آزمون دانکن را بیان می‌کنند.

 


.تأثیر غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زا بر .محتوای کربوهیدرات محلول در C. vulgarisو S. platensis:همان‌طور که شکل 5 نشان می‌دهد، تغییرات افزایشی یا کاهشی منظمی در محتوای کربوهیدرات محلول سلول‌ها از روز اول تا هفتم رشد مشاهده نمی‌شود و تنها مقدار کربوهیدرات S. platensis در روز سوم، روند افزایشی منظمی را بر اثر تیمار با غلظت‌های 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر رنگ نسبت به نمونۀ شاهد نشان می‌دهد (شکل 5، A). در جلبک C. vulgaris، بیشترین محتوای کربوهیدرات محلول در روز اول بر اثر تیمار با غلظت 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر رنگ مشاهده شد؛ هرچند کمتر از محتوای کربوهیدراتی بود که در S. platensis در همین غلظت و طی روز سوم مشاهده شد (شکل 5، B). درکل، غلظت 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا سبب بیشترین تحریک تولید مقدار کربوهیدرات محلول در هر دو نمونه شد.

 

 

A

B

   

شکل 5- محتوای کربوهیدرات محلول در C. vulgaris(A) و S. platensis  (B)تیمارشده با غلظت‌های 20 و 60 میلی‌‌گرم‌برلیترمادۀ رنگ‌زای DB129 در روزهای اول، سوم و هفتم. داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های متفاوت، اختلاف در سطح احتمال 05/0p< بر اساس آزمون دانکن را بیان می‌کنند.

 


.تأثیر غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زا روی محتوای پروتئین C. vulgaris و S. platensis: شکل 6 محتوای پروتئین محلول در C. vulgaris (شکل 6، A) و S. platensis (شکل 6، B) را نشان می‌دهد. نتایج پژوهش حاضر نشان می‌‌دهند محتوای پروتئین محلول در S. platensisحدوداً بیش از دو برابر مقدار آن در C. vulgarisاست؛ اما برخلاف S. platensis، روند افزایشی در مقدار پروتئین C. vulgaris هم‌گام با تیمار نمونه‌‌ها با مادۀ رنگ‌زا و افزایش غلظت آن از 20 به 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر از روز اول تا هفتم رشد مشاهده می‌شود (شکل 6، A)؛ باوجوداین، بیشترین میزان پروتئین در S. platensisدر روز سوم و در تیمار با غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مشاهده می‌شود (شکل 6، B).

 

 

 

 

A

B

   

شکل 6- مقدار پروتئین‌ها در C. vulgaris (A) و S. platensis (B) تیمارشده با غلظت‌های 20 و 60 میلی‌‌گرم‌برلیتر مادۀ رنگ‌زای DB129 در روزهای اول، سوم و هفتم. داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار هستند و حرف‌های متفاوت، اختلاف در سطح احتمال 05/0p< بر اساس آزمون دانکن را بیان می‌کنند.

 


بحث.

تحلیل آماری داده‌های حاصل از تیمار C. vulgarisو S. platensis با غلظت‌های مختلف مادۀ رنگ‌زای DB129 نشان داد تأثیر عوامل نوع ریزموجود، غلظت رنگ و زمان نمونه‌برداری بر بیشتر شاخص‌های رشد و شاخص‌های فیزیولوژیک ارزیابی‌شده در سطح 1 درصد معنادار است. بر اساس نتایج، افزایش غلظت مادۀ رنگ‌زا از 20 به 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر به کاهش کارایی هر دو نوع سلول در حذف مادۀ رنگ‌زا منجر می‌شود. برخی گزارش‌ها نشان داده‌اند سطح جذب بیشتر و تمایل زیاد گروه‌های عاملی (مانند گروه‌های هیدروکسیل، کربوکسیل، آمینو، فسفات و ...) موجود روی سطح دیوارۀ ریزموجودات برای اتصال به عوامل خارجی، راهکاری برای جداسازی آلاینده‌ها از پساب‌ها به شمار می‌آید (Dmytryk, et al., 2014). کاهش کارایی دو نمونۀ C. vulgarisو S. platensis در حذف رنگ در غلظت‌های زیاد مادۀ رنگ‌زا به ظرفیت معین اتصال زیست‌توده به عوامل خارجی و میزان سمیت مادۀ رنگ‌زا نسبت داده می‌شود (Al-Fawwaz and Abdullah, 2016).

داده‌های حاصل نشان می‌دهند تأثیر رنگ بر فیزیولوژی سلول و شاخص‌های رشد بسته به غلظت رنگ، زمان نمونه‌برداری و نوع ریزموجود متفاوت است. سرعت رشد ویژه یا µm، مهم‌ترین شاخص رشد برای بیان موفقیت اکولوژیک یا توانایی سازگاری گونه نسبت به تغییر شرایط محیط طبیعی یا آزمایشگاهی است (Guevara et al., 2005)؛ ازاین‌رو، در پژوهش حاضر به‌منظور تعیین اثر مادۀ رنگ‌زای DB129 بر رشد ریزموجودات مطالعه‌شده به مقایسۀ سرعت رشد ویژه و سایر شاخص‌های رشد بین تیمارهای مختلف پرداخته شد و برخلاف S. platensis، مادۀ رنگ‌زای DB129 تأثیر مثبتی بر رشد نسبی و سایر شاخص‌های رشد جلبک C. vulgarisاِعمال کرد؛ به‌طوری‌که با افزایش غلظت مادۀ رنگ‌زا، شاخص‌های رشد جلبک بهبود و افزایش یافتند؛ بنابراین، به نظر می‌رسد جلبک C. vulgarisدر مقایسه باسیانوباکتر S. platensis تحمل و سازگاری بیشتری نسبت به شرایط تنشی آلایندگی رنگ DB129 دارد. بررسی‌های علمی نشان می‌دهند پاسخ فیزیولوژیک و میزان رشد انواع مختلف ریزموجودت در شرایط تنش‌زا متفاوت است (Charioui et al., 2017)؛ اما سازوکارهای دقیقی که سبب سازگاری برخی ریزموجودات با شرایط تنش‌زای حاصل از پساب‌ها می‌شوند، هنوز به‌خوبی شناسایی نشده‌اند (Osundeko et al., 2014). بروز آثار منفی مادۀ رنگ‌زا بر سرعت رشد ویژه و سایر شاخص‌های رشد در S. platensis (برای نمونه، افزایش زمان دوبرابرشدن زیست‌تودۀ سلولی) را می‌توان به عوامل مختلفی نسبت داد؛ ازجمله اینکه حضور مواد رنگ‌زا در آب سبب کاهش نفوذ نور می‌شود و کاهش میزان نور، عامل مهمی در کاهش رشد برخی موجودات فتوسنتزکننده به شمار می‌آید (Zhang et al., 2018). گزارش‌‌ها نشان داده‌اند شرایط تنش‌زا سبب کاهش کارایی فتوسنتز و درنتیجه، کاهش فعالیت‌های متابولیسمی می‌شود که این امر به کاهش سرعت رشد نسبی سوسپانسیون سلولی منجر می‌شود (Benavente-Valdés et al., 2016).

پژوهش‌های مختلف نشان داده‌اند تأثیر میزان نور بر فتوسنتز و تولیدات فتوسنتزی انواع موجودات فتوسنتزکننده شدت یکسانی ندارد (Singh and Singh, 2015; Petsas and Vagi, 2017) و می‌تواند عامل تفاوت C. vulgarisو S. platensis و برتری C. vulgarisدر زمینۀ متابولیسم و رشد سلولی باشد؛ باوجوداین، بررسی مقدار کربوهیدرات محلول در S. platensis طی پژوهش حاضر (شکل 5، B) نشان داد مقدار قند در شرایط تنش مادۀ رنگ‌زا کاهش نمی‌یابد، بلکه مقدار آن در نمونه‌های تیمارشده با 20 و 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر مادۀ رنگ‌زا مقداری افزایش نسبت به شاهد نشان می‌دهد؛ این مطلب و افزایش مقدار کلروفیل a و کاروتنوئیدهایی مانند آستاگزانتین (در نمونۀ 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) و نیز رنگدانه‌های فیکوبیلین (در نمونۀ 60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) به‌ویژه در روز هفتم رشد که یک هفته از اِعمال تنش گذشته است (شکل‌های 2، 3 و 4)، احتمال وجود اختلال شدید در میزان فتوسنتز S. platensis بر اثر عامل رنگ‌زا را کاهش می‌دهد؛ از سوی دیگر، بررسی و مقایسۀ مقدار پروتئین سلولی در C. vulgarisو S. platensis (شکل 6)، افزایش درخور توجه و متناسب با غلظت رنگ را در C. vulgarisطی تمام روزهای نمونه‌برداری و برعکس، افزایش‌نیافتن درخور توجه آن و در برخی نمونه‌ها، کاهش آن را در S. platensisنشان می‌دهد. پژوهش‌ها نشان داده‌اند تنش‌های محیطی (نظیر تنش خشکی، شوری، تنش آلاینده‌ها و ...) متابولیسم پروتئین را تحت‌تأثیر قرار می‌دهند و بیوسنتز بسیاری از پروتئین‌های ویژه و جدید (de novo) را سبب می‌شوند. این پروتئین‌ها ممکن است در انتقال سیگنال، دفاع آنتی‌اکسیدانی، بیوسنتز اسمولیت‌ها، باند‌کردن فلزات و ... مشارکت کنند (Boo and Jung, 1999). بیوسنتز برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان تحت‌تأثیر تنش اکسیداتیو مشاهده شده است (Sharma and Dubey, 2005; Sharma and Dubey, 2019) و بنابراین، محتمل است حداقل بخشی از افزایش مقدار پروتئین در پاسخ به شرایط تنش‌زای حاصل از سمیت مواد رنگ‌زا به‌علت فعالیت سازوکارهای مقابله با تنش ازجمله حذف گونه‌های فعال اکسیژن باشد. همان‌طور که گفته شد، توانایی افزایش بیوسنتز پروتئین در شرایط تنش دارای نقش مهمی در افزایش‌دادن پتانسیل سازگاری موجود با شرایط تنشی است و قدرت متابولیسمی سلول را افزایش می‌دهد (Lee et al., 2019)؛ پژوهش‌های مختلف در این زمینه به افزایش مقدار پروتئین‌هایی نظیر HSP، USP، Psb R و Psb Q در تنش‌های مختلف ازجمله تنش مواد رنگ‌زا (Danesi et al., 2004; Sasi et al., 2018; Lee et al., 2019) اشاره کرده‌اند.

برخی پژوهش‌ها ارتباط قوی بین محتوای قند محلول و تحمل تنش را گزارش کرده‌اند (Danesi et al., 2004; Rosa et al., 2009). افزایش مقدار کربوهیدرات‌های محلول در پاسخ به شرایط تنش‌زای حاصل از سمیت مواد رنگ‌زا به روش‌های متفاوتی در مقابله با تنش مؤثر است؛ برای نمونه، قندهای محلول در شرایط تنش‌زا به‌شکل منابع تولید انرژی یا مولکول‌های پیام‌رسان عمل می‌کنند و سبب تغییر بیان ژن‌های سنتز آنتی‌اکسیدان‌ها و نیز فعال‌شدن مسیرهای انتقال هورمون‌ها می‌شوند؛ همچنین قندهای محلول سبب تحریک بیوسنتز کاروتنوئیدها (آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی) می‌شوند(Couée et al., 2006; Saranya et al., 2014; Movafeghi et al., 2015).

این واقعیت که ریزموجودات انرژی خود را در شرایط تنش‌زا برای ساخت ساختارهای پلی‌ساکاریدی به کار می‌گیرند، نشان می‌دهد پلی‌‌ساکاریدها ارتباط مهمی با غلبه بر شرایط تنش‌زا دارند و احتمالاً سبب بقای سلول می‌شوند (Tannin-Spitz et al., 2005). برخی گزارش‌ها نشان داده‌اند پلی‌ساکاریدها با فراهم‌کردن هیدروژن سبب تبدیل رادیکال‌های آزاد به فراورده‌های پایدار می‌شوند و از واکنش‌های زنجیره‌ای رادیکالی جلوگیری می‌کنند؛ علاوه‌براین، پلی‌ساکاریدها در جداسازی و خارج‌کردن رادیکال‌های آزاد از سلول‌ها ایفای نقش می‌کنند؛ درنتیجه، این مواد سبب افزایش تحمل سلول و سازگاری آن نسبت به تنش می‌شوند (El-sheekh et al., 2012).

همان‌طور که گفته شد، مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی (به‌ویژه کلروفیل و کاروتنوئیدها) در نمونه‌های بررسی‌شده در پژوهش حاضر که در معرض تیمار مادۀ رنگ‌زای DB129 بودند، در روز هفتم آزمون افزایش یافت. به نظر می‌رسد کاهش رنگدانه‌ها در روز سوم رشد با کاهش اولیۀ رنگدانه‌ها تحت‌تأثیر تنش و نیاز به زمان برای سازگاری با محیط مرتبط باشد. پژوهش‌ها نشان داده‌اند وجود مواد رنگ‌زا در آب سبب کاهش نفوذ نور می‌شود و در پاسخ به کاهش مقدار نور، سیستم‌های گیرندۀ نور در سازوکاری با عنوان سازگاری سایه- نور (Light-Shade adaptation) همراه با رنگیزه‌های فتوسنتزی کلروفیل‌‌‌های a و bگسترش می‌یابند (Novotný et al., 2006; .Movafeghi et al., 2015; Ferreira et al., 2016). افزایش کاروتنوئیدها در پاسخ به شرایط تنش‌زای حاصل از سمیت مواد رنگ‌زا، سازوکار دفاعی به شمار می‌آید و نقش حفاظتی در حذف گونه‌های فعال اکسیژن ایفا می‌کند (Saranya et al., 2014; Movafeghi et al., 2015). گزارش‌های مشابهی در زمینۀ افزایش مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی در پاسخ به تنش‌ها ارائه شده‌اند (Danesi et al., 2004).

آستاگزانتین یکی از انواع کاروتنوئیدهای گزانتوفیلی است که درنتیجۀ فعالیت برخی جلبک‌ها، باکتری‌ها و مخمرها تولید می‌شود (Kobayashi et al., 1993; Pelah et al., 2004; Hu et al., 2008). پژوهش‌ها نشان داده‌اند این ماده در پاسخ به افزایش رادیکال‌های آزاد اکسیژن در تنش نوری، تنش نمکی یا تنش دمایی (برای نمونه، در جلبک سبز Haematococcus pluvialis) تجمع می‌یابد (Kobayashi, 2003; Doria et al., 2018). در پژوهش حاضر، مقدار آستاگزانتین در سیانوباکتر Spirulina نسبت به مقدار آن در جلبک Chlorella افزایش بیشتری را نشان داد و غلظت 20 میلی‌گرم‌برلیتر رنگ نیز تأثیر القایی بیشتری نسبت به غلظت 60 میلی‌گرم‌برلیتر داشت. به نظر می‌رسد تولید این رنگدانۀ گزانتوفیلی در پاسخ به تنش اکسیداتیو ناشی از تیمار رنگ و به‌منظور کاهش آثار آن در سیانوباکتر Spirulina بیشتر از تولید آن در Chlorella تحریک شود.

گزارش‌هایی وجود دارند که نشان می‌دهند سیانوباکترها مقدار و ترکیب فیکوبیلی‌پروتئین‌های خود را در پاسخ به تغییر شرایط محیطی تغییر می‌دهند (Fatma, 2009). بر اساس پژوهش‌ها، سنتز فیکوبیلی‌پروتئین‌ها در سیانوباکتر‌ها تحت‌تأثیر شدت‌های کم نور تحریک می‌شود؛ زیرا انرژی کمی برای محافظت و تولید این رنگیزه‌ها لازم است. در تابش‌های اندک نور، این رنگیزه‌ها بخش‌هایی از طیف نور را استفاده می‌کنند که کلروفیل‌ها نمی‌توانند جذب کنند و به‌این‌ترتیب، سبب برقراری تعادل در توزیع انرژی نوری بین دو فتوسیستم و درنتیجه، بهینه‌سازی سرعت تبدیل انرژی (به‌ویژه در شرایط تنش) می‌شوند (Fatma 2009).

در جلبک Chlorella، وزن خشک سلول‌ها هم‌گام با افزایش سرعت رشد ناشی از تیمار رنگ افزایش یافت؛ در‌حالی‌که مقدار وزن خشک در Spirulina به‌ویژه در تیمار با غلظت زیاد (60 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) رنگ کاهش نشان داد (جدول 3). پژوهش‌ها نشان می‌دهند آلاینده‌های آلی و غیرآلی از طریق افزایش رادیکال‌های آزاد سبب تسریع فرایند پیری و مرگ سلولی می‌شوند (Movafeghi et al., 2015) و بنابراین می‌توانند به کاهش وزن خشک و رشد نسبی منجر شوند. گزارش‌های متعددی در زمینۀ تفاوت گونه‌های مختلف ریزموجودات فتوسنتزکننده ازنظر حساسیت به تنش اکسیداتیو حاصل از آلاینده‌ها وجود دارند که این امر از تفاوت در غلظت یا روش مقابله با آن ناشی می‌شود (Charioui et al., 2017).

 

نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر، ریزموجودات C. vulgaris و S. platensisقابلیت‌های متفاوتی در رنگ‌زدایی پساب‌های حاوی مادۀ رنگ‌زای DB129 و افزایش ترکیبات ارزشمند درون‌سلولی در حضور آلایندۀ رنگ نشان دادند؛ ازاین‌رو، کشت این سلول‌ها در پساب‌های حاوی مواد رنگ‌زا ازنظر اقتصادی و زیست‌محیطی ارزشمند است. روش پالایش زیستی علاوه‌بر اینکه به رنگ‌زدایی پساب‌ها و پالایش آنها منجر می‌شود، سبب افزایش ترکیبات مفید مانند پروتئین‌ها، کربوهیدرات‌ها و رنگیزه‌های موجود در ریزموجودات فتواتوتروف نظیر سیانوباکترها و جلبک‌ها می‌شود؛ بنابراین، شناسایی نمونه‌های مقاوم ریزموجودات در پساب‌های حاوی مواد رنگ‌زا از جنبۀ زیست‌محیطی و صنعتی اهمیت بسیار زیادی دارد؛ در این زمینه، میزان حذف مادۀ رنگ‌زا و نیز سرعت رشد نسبی میکروجلبک C. vulgaris نسبت به سیانوباکتر S. platensis در حضور مادۀ رنگ‌زای DB129 بیشتر بود.

 

سپاسگزاری

از معاونت پژوهشی دانشگاه لرستان برای پشتیبانی مالی از پژوهش حاضرسپاسگزاری می‌شود.

 

Ajayan, K. V., Selvaraju, M. and Thirugnanamoorthy, K. (2012) Enrichment of chlorophyll and phycobiliproteins in Spirulina platensis by the use of reflector light and nitrogen sources: An in vitro study. Biomass and Bioenergy 47: 436-441.
Akbari, F. and Madadkar Haghjou, M. (2017) Improvement of nutritional values of two Dunaliella (Green microalgae) species, by changing in medium factors. Journal of Fisheries (Iranian Journal of Natural Resources) 70(3): 243-261 (in Persian).
Al-Fawwaz, A. T. and Abdullah, M. (2016) Decolorization of Methylene blue and Malachite green by immobilized Desmodesmus sp. isolated from north Jordan. International Journal of Environmental Science and Development 7(2): 95-99.
Almeida, E. J. R. and Corso, C. R. (2014) Comparative study of toxicity of Azo dye Procion red MX-5B following biosorption and biodegradation treatments with the fungi Aspergillus niger and Aspergillus terreus. Chemosphere 112: 317-322.
Ambati, R., Phang, S. M., Ravi, S. and Aswathanarayana, R. (2014) Astaxanthin: sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applications-a review. Marine Drugs 12(1): 128-152.
Bafana, A., Devi, S. S. and Chakrabarti, T. (2011) Azo dyes: past, present and the future. Environmental Reviews 19: 350-371.
Battah, M., El-Ayoty, Y., Abomohra, A. E. F., El-Ghany, S. A. and Esmael, A. (2013) Optimization of growth and lipid production of the Chlorophyte microalga Chlorella vulgaris as a feedstock for biodiesel production. World Applied Science Journal 28(11): 1536-1543.
Benavente-Valdés, J. R., Aguilar, C., Contreras-Esquivel, J. C., Méndez-Zavala, A. and Montañez, J. (2016) Strategies to enhance the production of photosynthetic pigments and lipids in Chlorophycae species. Biotechnology Reports 10: 117-125.
Boo, Y. C. and Jung, J. (1999) Water deficit- induced oxidative stress and antioxidative defenses in rice plants. Journal of Plant Physiology 155(2): 255-261.
Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72(1): 248-254.
Brar, A., Kumar, M., Vivekanand, V. and Pareek, N. (2017) Photoautotrophic microorganisms and bioremediation of industrial effluents: current status and future prospects. Biotech 7: 18.
Charioui, I., Chikhaoui, M., El Filali, F., Abbassi, M., Banaoui, A. and Kaaya, A. (2017) Production in cell biomass and carotenoids under the effect of a saline stress in microalgae Dunaliella sp. isolated from Moroccan Saharian Saline. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 6(8): 286-94.
 
Cheng, D. and He, Q. (2014) Assessment of environmental stresses for enhanced microalgal biofuel production–an overview. Frontiers in Energy Research 2: 1-8.
Couée, I., Sulmon, C., Gouesbet, G. and El Amrani, A. (2006) Involvement of soluble sugars in reactive oxygen species balance and responses to oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany57(3): 449-459.
Dellamatrice,P. M., Silva-Stenico, M. E., de Moraes, L. A. B., Fiore, M. F. and Monteiro, R. T. R. (2017) Degradation of textile dyes by cyanobacteria. Brazilian Journal of Microbiology 48(1): 25-31.
Danesi, E. D. G., Rangel-Yagui, C. O., Carvalho, J. C. M. and Sato, S. (2004) Effect of reducing the light intensity on the growth and production of chlorophyll by Spirulina platensis. Biomass and Bioenergy 26(4): 329-335.
Diniz, G. S., Tourinho, T. C., Silva, A. F. and Chaloub, R. M. (2017) Environmental impact of microalgal biomass production using wastewater resources. Clean Technologies and Environmental Policy 19(10): 2521-2529.
Dmytryk, A., Saeid, A. and Chojnacka, K. (2014) Biosorption of microelements by Spirulina: towards technology of mineral feed supplements. The Scientific World Journal 1(12): 1-15.
Doria, E., Temporiti, M. E. E., Damiani, M. C., Popovich, C. A., Leonardi, P. I. and Nielsen, E. (2018) Influence of light stress on the accumulation of xanthophylls and lipids in Haematococcus Pluvialis CCALA 1081 grown under autotrophic or mixotrophic conditions. Journal of Marine Biology and Aquaculture 4(1): 30-35.
El-Sheekh, M. M., Khairy, H. M. and El-Shenody, R. (2012) Algal production of extra and intra-cellular polysaccharides as an adaptive response to the toxin crude extract of Microcystis aeruginosa. Iranian Journal of Environmental Health Science and Engineering 9(1): 1-7.
El-Sheekh, M. M., Abou-El-Souod, G. W. and El Asrag, H. A. (2018) Biodegradation of some dyes by the green alga Chlorella vulgaris and the cyanobacterium Aphanocapsa elachista. Egyptian Journal of Botany 58(3): 311-320.
Fatma, T. (2009) Screening of cyanobacteria for phycobiliproteins and effect of different environmental stress on its yield. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 83(4): 509-515.
Ferreira, V. S., Pinto, R. F. and Sant'Anna, C. (2016) Low light intensity and nitrogen starvation modulate the chlorophyll content of Scenedesmus dimorphus. Journal of Applied Microbiology 120(3): 661-670.
Fu, Y. and Viraraghavan, T. (2001) Fungal decolorization of dye wastewaters: a review. Bioresource Technology 79(3): 251-262.
Guevara, M., Lodeiros, C., Gómez, O., Lemus, N., Núñez, P., Romero, L. and Rosales, N. (2005) Carotenogenesis of five strains of the algae Dunaliella sp.(Chlorophyceae) isolated from Venezuelan hypersaline lagoons. Revista de Biologia Tropical 53: 331-337.
Hu, Z., Li, Y., Sommerfeld, M., Chen, F. and Hu, Q. (2008) Enhanced protection against oxidative stress in an astaxanthin-overproduction Haematococcus mutant (Chlorophyceae). European Journal of Phycology43(4): 365-376.
Irigoyen, J. J., Einerich, D. W. and Sánchez‐Díaz, M. (1992) Water stress induced changes in concentrations of proline and total soluble sugars in nodulated Alfalfa (Medicago sativa) plants. Physiologia Plantarum 84(1): 55-60.
Johnson, M. K., Johnson, E. J., MacElroy, R. D., Speer, H. L. and Bruff, B. S. (1968) Effects of salts on the halophilic alga Dunaliella viridis. Journal of Bacteriology 95(4): 1461-1468.
Kobayashi, M., Kakizono, T. and Nagai, S. (1993) Enhanced carotenoid biosynthesis by oxidative stress in acetate-induced cyst cells of a green unicellular algae, Haematococcus pluvialis. Applied and Environmental Microbiology 59(3): 867-873.
Kobayashi, M. (2003) Astaxanthin biosynthesis enhanced by reactive oxygen species in the green alga Haematococcus pluvialis. Biotechnology and Bioprocess Engineering 8: 322-330.
Lebron, Y. A. R., Moreira, V. R., Santos, L. V. S. and Jacob, R. S. (2018) Remediation of methylene blue from aqueous solution by Chlorella pyrenoidosa and Spirulina maxima biosorption: Equilibrium, kinetics, thermodynamics and optimization studies. Journal of Environmental Chemical Engineering 6(5): 6680-6690.
Lee, S. Y., Chi, Y. H., Koo, S. S., Oh, H. T., Lee, E. S., Park, J. H. and Kim, M. G. (2019) The physiological functions of universal stress proteins and their molecular mechanism to protect plants from environmental stresses. Frontiers in Plant Science 10: 1-13.
Lichtenthaler, H. K. and Buschmann, C. (2001) Chlorophylls and carotenoids: measurement and characterization by UV‐VIS spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry 1(1): 3-4.
Madkour, F. F., Kamil, A. E. W. and Nasr, H. S. (2012) Production and nutritive value of Spirulina platensis in reduced cost media. Egyptian Journal of Aquatic Research 38: 51-57.
Marshall, J. D. (1986) Drought and shade interact to cause fine-root mortality in Douglas-fir seedlings. Plant and Soil 91: 51-60.
Mezzomo, N., Saggiorato, A. G., Siebert, R., Tatsch, P. O., Lago, M. C., Hemkemeier, M. and Colla, L. M. (2010) Cultivation of microalgae Spirulina platensis (Arthrospira platensis) from biological treatment of swine wastewater. Food Science and Technology 30(1): 173-178.
Moraes, C. C., Sala, L., Cerveira, G. P. and Kalil, S. J. (2011) C-phycocyanin extraction from Spirulina platensis wet biomass. Brazilian Journal of Chemical Engineering 28(1): 45-49.
Movafeghi, A., Khataee, A. R., Moradi, Z. and Vafaei, F. (2016) Biodegradation of direct blue 129 diazo dye by Spirodela polyrrhiza: an artificial neural networks modeling. International Journal of Phytoremediation 18(4): 337-347.
Novotný, Č., Dias, N., Kapanen, A., Malachová, K., Vándrovcová, M., Itävaara, M. and Lima, N. (2006) Comparative use of bacterial, algal and protozoan tests to study toxicity of azo-and anthraquinone dyes. Chemosphere 63(9): 1436-1442.
Osundeko, O., Dean, A. P., Davies, H. and Pittman, J. K. (2014) Acclimation of microalgae to wastewater environments involves increased oxidative stress tolerance activity. Plant and Cell Physiology 55(10): 1848-1857.
Pelah, D., Sintov, A. and Cohen, E. (2004) The effect of salt stress on the production of canthaxanthin and astaxanthin by Chlorella zofingiensis grown under limited light intensity. World Journal of Microbiology and Biotechnology 20(5): 483-486.
Petsas, A. S. and Vagi, M. C. (2017) Effects on the photosynthetic activity of algae after exposure to various organic and inorganic pollutants. Chlorophyll 37-77.
Raoof, B., Kaushik, B. D. and Prasanna, R. (2006) Formulation of a low-cost medium for mass production of Spirulina. Biomass and Bioenergy 30(6): 537-542.
Rasolzadeh, F., Hashemi, P., Madadkar Haghjou, M. and Safdarian, M. (2019) Chlorella Vulgaris Microalgae as a green packing for the microextraction by packed sorbent of Nitrofurantoin in Urine. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 6(2): 419-429.
Rawat, I., Kumar, R. R., Mutanda, T. and Bux, F. (2011) Dual role of microalgae: phycoremediation of domestic wastewater and biomass production for sustainable biofuels production. Applied Energy 88(10): 3411-3424.
Régnier, P., Bastias, J., Rodriguez-Ruiz, V., Caballero-Casero, N., Caballo, C., Sicilia, D. and Gueguen, V. (2015) Astaxanthin from Haematococcus pluvialis prevents oxidative stress on human endothelial cells without toxicity. Marine Drugs 13(5): 2857-2874.
Renuka, N., Sood, A., Prasanna, R. and Ahluwalia, A. S. (2015) Phycoremediation of wastewaters: A synergistic approach using microalgae for bioremediation and biomass generation. International Journal of Environmental Science and Technology 12(4): 1443-1460.
Rosa, M., Prado, C., Podazza, G., Interdonato, R., González, J. A., Hilal, M. and Prado, F. E. (2009) Soluble sugars: metabolism, sensing and abiotic stress: a complex network in the life of plants. Plant Signaling and Behavior 4(5): 388-393.
Rudsari, N. P., Haghjou, M. M. and Ghiasvand, A. (2019) Comparative study of growth, physiological and biochemical indices of blue-green alga Spirulina platensis in two Zarrouk and Johnson nutrient media under vanillin treatment. Iranian Journal of Plant Biology 10(4): 81-110 (in Persian).
Safi, C., Zebib, B., Merah, O., Pontalier, P. Y. and Vaca-Garcia, C. (2014) Morphology, composition, production, processing and applications of Chlorella vulgaris: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 35: 265-278.
Sánchez, M., Bernal-Castillo, J., Rozo, C. and Rodríguez, I. (2003) Spirulina (Arthrospira): An edible microorganism: a review. Universitas Scientiarum 8(1): 7-24.
Saranya, C., Hemalatha, A., Parthiban, C. and Anantharaman, P. (2014) Evaluation of antioxidant properties, total phenolic and carotenoid content of Chaetoceros calcitrans, Chlorella salina and Isochrysis galbana. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 3(8): 365-377.
Saratale, R. G., Saratale, G. D., Chang, J. S. and Govindwar, S. P. (2011) Bacterial decolorization and degradation of azo dyes: A review. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 42(1): 138-157.
Sasi, S., Venkatesh, J., Daneshi, R. and Gururani, M. (2018) Photosystem II extrinsic proteins and their putative role in abiotic stress tolerance in higher plants. Plants 7(4): 1-15.
Sharma, P. and Dubey, R. S. (2005) Drought induces oxidative stress and enhances the activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings. Plant Growth Regulation 46(3): 209-221.
Sharma, K. K., Schuhmann, H. and Schenk, P. M. (2012) High lipid induction in microalgae for biodiesel production. Energies 5(5): 1532-1553.
Sharma, P. and Dubey, R. S. (2019) Protein synthesis by plants under stressful conditions. In: Handbook of plant and crop stress (Ed. Pessarakli, M.) 469-487. CRC Press, Boca Raton.
Singh, S. P. and Singh, P. (2015) Effect of temperature and light on the growth of algae species: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 50, 431-444.
Smirnoff, N. and Colombe, S. V. (1988) Drought influences the activity of enzymes of the chloropiast hydrogen peroxide scavenging system. Journal of Experimental Botany 39: 1097-1108.
Tannin-Spitz, T., Bergman, M., van-Moppes, D., Grossman, S. and Arad, S. M. (2005) Antioxidant activity of the polysaccharide of the red microalga Porphyridium sp. Journal of Applied Phycology 17(3): 215-222.
Walsh, G. E. (1988) Principles of toxicity testing with marine unicellular algae. International Journal of Environmental Toxicology and Chemistry 7(12): 979-987.
Yaakob, Z., Ali, E., Zainal, A., Mohamad, M. and Takriff, M. S. (2014) An overview: biomolecules from microalgae for animal feed and aquaculture. Journal of Biological Research-Thessaloniki 21(6): 1-10.
Yaseen, D. A. and Scholz, M. (2019) Textile dye wastewater characteristics and constituents of synthetic effluents: A critical review. International Journal of Environmental Science and Technology 16(2): 1193-1226.
Zavřel, T., Sinetova, M. A. and Červený, J. (2015) Measurement of chlorophyll a and carotenoids concentration in cyanobacteria. Bio-protocol 5(9): 1-5.
Zhang, W. W., Zhou, X. F., Zhang, Y. L., Cheng, P. F., Ma, R., Cheng, W. L. and Chu, H. Q. (2018) Enhancing astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis by coupled light intensity and nitrogen starvation in column photobioreactors. Journal of Microbiology and Biotechnology 28(12): 2019-2028.