بررسی اثر سیلیکون بر برخی شاخص‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی و بیان ژن‌های بتائین‌آلدهید‌دهیدروژناز و پرولین‌5-کربوکسیلات‌سنتتاز در گیاه دارویی گاوزبان ایرانی در معرض تنش خشکی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، صندوق پستی 3697-19395، تهران-ایران

2 هیئت علمی/گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، صندوق پستی 3697-19395، تهران-ایران

10.22108/ijpb.2020.122181.1206

چکیده

خشکی از مهم‌ترین عوامل محدود‌کنندۀ رشد گیاهان است. وسعت زیاد زمین‌های در معرض خشکی و کمبود منابع آبی، توجه زیادی را به مباحث مربوط به خشکی معطوف کرده است. در پژوهش حاضر، آزمایشی به‌شکل فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و در 3 تکرار برای بررسی اثر تیمار سیلیکون بر برخی ویژگی‌های مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و مولکولی گیاه گاوزبان ایرانی در شرایط تنش خشکی طراحی و انجام شد؛ به این منظور، گیاهچه‌های چهارده‌روزۀ گاوزبان ایرانی در شرایط کشت هیدروپونیک در معرض تیمارهای سیلیکون (با سه غلظت صفر، 5/0 و 5/1 میلی‌مولار) و تنش خشکی (با نمک پلی‌اتیلن‌گلایکول در سه غلظت‌ صفر، 9 و 12 درصد) قرار گرفتند. پنج هفته پس‌از اِعمال تیمار، شاخص‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی گیاهچه‌ها بررسی شدند. نتایج نشان دادند خشکی شاخص‌های رشد، میزان رنگیزه‌های کلروفیلی و کاروتنوئیدها را به‌طور معنا‌داری نسبت به شاهد کاهش می‌دهد و تیمار گیاه با سیلیکون سبب کاهش آثار منفی تنش خشکی و افزایش شاخص‌های رشد و محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی می‌شود. در اثر تنش خشکی، افزایش معنا‌دار میزان آنتوسیانین، کربوهیدرات‌ها (محلول و احیا)، گلایسین‌بتائین، پرولین و افزایش بیان ژن‌های بتائین‌آلدهید‌دهیدروژناز (BADH) و پرولین‌5-کربوکسیلات‌سنتتاز (P5CS) مشاهده شد. در پژوهش حاضر، تیمار توأم خشکی و سیلیکون سبب کاهش معنادار بیان ژن‌های BADH و P5CS و میزان محصول این دو ژن یعنی پرولین و گلایسین‌بتائین نسبت به نمونه‌های در معرض تنش خشکی شد که مؤید نقش سیلیکون در کاهش تنش اسمزی است.
 
 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effect of silicon on some of morphological. physiological parameters and the expression of betaine aldehyde dehydrogenase and proline 5-carboxylate synthase genes in Iranian Borago medicinal plant under drought stress

نویسندگان [English]

  • Nahid Bagheri 1
  • shekoofeh Enteshari 2
  • Roya Razavi zadeh 1
1 Department of Biology, Payame Noor University, PO Box 3697-19395, Tehran-Iran
2 Department of Biology, Payame Noor University, PO Box 3697-19395, Tehran-Iran
چکیده [English]

Drought is one of the most important growth limiting factors in plants. The great extent of drought-prone land and the scarcity of water resources have drawn much attention to drought related issues. In this study, in order to investigate the effect of silicone on some morphological, physiological and molecular characteristics of Iranian Borago under drought stress conditions, a factorial experiment was conducted in a completely randomized design with 3 replications. For this purpose, 14-day-old Borago seedlings were treated with silicone (0, 0.5 and 1.5 mM) and drought (with polyethylene glycol at three concentrations of 0, 9 and 12%) under hydroponic conditions. Morphological and physiological parameters were evaluated 5 weeks after treatment. The results showed that drought significantly reduced the growth parameters, chlorophyll a, total chlorophyll and carotenoids contents compared to the control. Silicon treatment reduced the negative effects of drought stress and increased growth parameters and photosynthetic pigments. Also, drought stress caused significant increase in anthocyanin, carbohydrates (soluble and reducing sugar), glycine betaine, proline contents, and increased expression of BADH and P5CS genes. Combined drought and silicon treatments significantly reduced the expression of BADH and P5CS genes and the products of these two genes, proline and glycine betaine, in comparison to drought stress samples, which confirms the role of silicon in reducing osmotic stress in the present study.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Betaine aldehyde dehydrogenase
  • proline
  • proline-5-carboxylate synthase
  • Silicon
  • glycine bayain

.اصطلاح خشکی به وجودنداشتن رطوبت کافی برای رشد طبیعی و کامل‌شدن چرخۀ زندگی گیاه اطلاق می‌شود (Manivannan et al., 2008). تنش خشکی از طریق اختلال در فرایندهای فیزیولوژیکی سبب محدودیت تولیدات کشاورزی می‌شود (Nasibi, 2011) و نخستین اثر آن، ازدست‌رفتن آماس است که کاهش سرعت رشد، کاهش طویل‌شدن ساقه، کاهش گسترش برگ و کاهش گشودگی روزنه را در پی دارد؛ فرایند تنظیم اسمزی، سازوکار شناخته‌شده‌ای برای مقاومت در برابر تنش خشکی است (Yarmohammadi et al., 2011). خشکی سبب تجزیۀ کلروفیل می‌شود و در اثر این تنش، گلوتامات که پیش‌مادۀ سنتز کلروفیل و پرولین است، به پرولین تبدیل و از محتوای کلروفیل کاسته می‌شود (Li et al., 2007)؛ علاوه‌براین، تنش خشکی سبب ایجاد تـنش اکسیداتیو می‌شود که نقش ویژه‌ای در تخریب سامانۀ فتوسنتزی، تخریب غشای سلولی و کلروپلاستی، کاهش مقدار رنگدانه‌های کلروفیل a و b و متعاقب آن، کاهش توانایی فتوسنتز دارد (Ort, 2001). سهم قندها در تنظیم اسمزی گیاهان درخور توجه است و در برخی گیاهان، کربوهیدرات‌ها (مانند فروکتان و ساکارز) و پُلی‌اُل‌ها (قندهای الکلی یا اشکال احیاشدۀ قندهای آلدوز و کتوز) در پاسخ به تنش خشکی در برگ تجمع می‌یابند (Noiraud et al.,2000).

نتایج بسیاری از پژوهش‌ها نشان می‌دهند تجمع گلایسین‌بتائین، عمده‌ترین تطابق بیوشیمیایی است که گیاهان در شرایط خشکی در پیش می‌گیرند. بیوسنتز گلایسین‌بتائین شامل اکسیداسیون دومرحله‌ای کولین است که طی آن، ابتدا کولین به بتائین‌آلدهید و سپس به گلایسین‌بتائین تبدیل می‌شود (Zangishei and Salari, 2016)؛ آنزیم بتائین‌آلدهید‌دهیدروژناز (BADH) این واکنش دومرحله‌ای را کاتالیز می‌کند. رایج‌ترین جنبۀ مدنظر در مطالعه‌های انجام‌شده در زمینۀ BADH‌های گیاهی به نقش آنها در بهبود تحمل تنش‌های غیر‌زیستی مربوط است (Fitzgerald et al., 2009). در شرایط تنش، آنزیم‌های کولین‌مونواکسیژناز (CMO) و بتائین‌آلدهیددهیدروژناز (BADH) کولین را در کلروپلاست‌ها اکسید و به گلایسین‌بتائین تبدیل می‌کنند (Chen and Murata, 2002)؛ تجمع گلایسین‌بتائین به دنبال قرارگرفتن گیاه در معرض تنش‌های غیر‌زیستی می‌تواند فعالیت اکسیژن فعال را به‌شکل‌های مختلف خنثی ‌کند. الکترون‌های اضافی تولیدشده طی فتوسنتز در پاسخ به تنش غیرزیستی در بیوسنتز گلایسین‌بتائین استفاده می‌شوند و درنتیجه، اکسیژن فعال کمتری تولید می‌شود (Kurepin et al., 2017). در گیاهان، افزایش میزان بیان ژن BADH با توانایی زیاد انباشته‌سازی گلایسین‌بتائین همراه است و مقاومت درخور توجه این گیاهان در برابر انواع تنش‌های غیرزیستی گزارش شده است. Yang و همکاران (2005) با مطالعه روی گیاه تنباکو گزارش کردند بیان ژن BADH سبب افزایش گلایسین‌بتائین می‌شود و این امر، مقاومت گیاه در برابر تنش را در پی دارد؛ همچنین با مطالعه‌هایی که روی گیاه جو انجام شده‌اند، مشاهده شده است تنش خشکی سبب افزایش بیان ژن BADH می‌شود؛ فعالیت فزایندۀ BADH و انباشته‌سازی گلایسین‌بتائین در شرایط تنش‌ به حفاظت گیاه در برابر خسارت اکسیداتیو از طریق حفظ قابلیت انعطاف‌پذیری غشا، افزایش فعالیت فتوسنتزی و کاهش تولید گونه‌های فعال اکسیژن با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان منجر می‌شود (Chen and Murata, 2008).

پرولین از گسترده‌ترین تنظیم‌کننده‌های اسمزی است و تجمع آن در فرایند سازگاری به تنش خشکی دخالت دارد (Soha et al., 2010). بیوسنتز پرولین از طریق دو مسیر گلوتامات یا اورنیتین‌ رخ می‌دهد؛ بیوسنتز پرولین در شرایط تنش از مسیر گلوتامات و با القای فعالیت آنزیم‌های دلتا-1-پرولین‌5-کربوکسیلات‌سنتتاز (P5CS) و پرولین‌۵-کربوکسیلات‌ردوکتاز (P5CR) و ممانعت از فعالیت آنزیم‌های اکسید‌کنندۀ پرولین مانند پرولین‌دهیدروژناز (ProDH) و پرولین‌۵-کربوکسیلات‌دهیدروژناز (P5CDH) در سلول انجام می‌شود؛ در مسیر یادشده، گلوتامات با دو کاهش پی‌در‌پی به پرولین تبدیل می‌شود. آنزیم P5CS، آنزیمی دوعملکردی است که ابتدا فعال‌سازی گلوتامات فسفوریلاسیون را کاتالیز می‌کند و به دنبال آن، کاهش مادۀ حدواسط γ-گلوتامیل‌فسفات به گلوتامات‌سمی‌آلدئید (GSA) را انجام می‌دهد که در تعادل با شکل P5C است. افزایش بیان ژن P5CS در گیاه به سنتز پرولین بیشتر نسبت به گیاه شاهد و تحمل بیشتر نسبت به تنش اسمزی منجر می‌شود. همبستگی شدیدی بین بیان P5CS و تجمع پرولین در برنج و آرابیدوپسیس در معرض تنش خشکی گزارش شده است (Maghsoudi et al., 2018).

پس‌از اکسیژن (49 درصد)، سیلیکون (31 درصد) دومین عنصر فراوان در خاک است. در اوایل دهۀ 1900، سیلیکون یکی از عناصر لازم برای گیاه شناخته شده بود. این عنصر محدودیت‌های زیست‌محیطی نظیر تنش فلزات سنگین، شوری، خشکی، سرما و یخ‌زدگی را کاهش می‌دهد (Zare et al., 2015) و با دو فرایند عمده به مقاومت در برابر تنش کمک می‌کند: اول، حفاظت فیزیکی و مکانیکی که با رسوبات سیلیکون ایجاد می‌شود و دوم، پاسخ‌های بیوشیمیایی که سبب تغییرات متابولیکی می‌شوند. کاربرد سیلیکون آثار تنش آبی را تعدیل می‌کند و رشد گیاه را افزایش می‌دهد (Imtiaz et al., 2016). کاربرد مثبت سیلیکون در افزایش رشد گیاهان مختلف ازجمله گوجه‌فرنگی گزارش شده است (Siddiqui et al., 2014)؛ همچنین، سیلیکون سبب کاهش هدایت روزنه‌ای و ازدست‌رفتن آماس سلول‌های محافظ از طریق رسوب سیلیکون و تشکیل دیوارۀ سلولی خاص می‌شود و بنابراین، سیلیکون در افزایش کارایی مصرف آب بسیار مؤثر است (Zhu and Gong, 2014). سیلیکون سبب سنتز آنتی‌اکسیدان‌های اندوژن می‌شود که تنش اکسیداتیو را در گیاه کاهش می‌دهند. طی مطالعۀ انجام‌شده روی گیاه جو مشاهده شد سیلیکون فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید‌‌دیسموتاز،کاتالاز و گلوتاتیون‌ردوکتاز را به میزان زیادی در ریشه‌های گیاهان در معرض تنش خشکی افزایش می‌دهد (Imtiaz et al., 2016). مطالعه‌های ژنتیکی گسترده روی گوجه‌فرنگی، برنج و گندم در خاک‌های اصلاح‌شده با سیلیکون در شرایط تنش‌های زیستی نشان می‌دهند تعداد زیادی از ژن‌ها ازجمله pad4 و sid2 در سازوکار‌های دفاعی این گیاهان در برابر تنش‌ها در مقایسه با گیاهان شاهد دخالت دارند (Vivancos et al.,2015).

باتوجه‌به مطالب یادشده، تنش خشکی یکی از مهم‌ترین عوامل محدود‌کنندۀ رشد گیاهان است که با کاهش فعالیت‌ها و متابولیسم‌های گیاه موجب کاهش رشد‌و‌نمو گیاهان زراعی و دارویی می‌شود و هرساله میلیاردها دلار خسارت به محصولات کشاورزی در سطح جهان وارد می‌کند. به‌منظور شناخت بهتر فرایندهای درون‌سلولی ایجادشده درنتیجۀ تنش، بررسی‌ بیان ژن‌های مؤثر در تولید آنزیم‌ها، آنتی‌اکسیدان‌ها و عوامل کاهش‌دهندۀ تنش ضروری است. ازآنجاکه آنزیم‌های P5CS و BADH از آنزیم‌های کلیدی در مسیر بیوسنتز پرولین و گلایسین‌بتائین هستند، بررسی عوامل مؤثر بر بیان ژن‌های P5CS و BADH و سایر ژن‌های دخیل در تحمل به خشکی می‌تواند درک درستی را از تعامل بین مسیرها و ساز‌وکارهای پیچیدۀ پاسخ گیاهان به تنش خشکی فراهم کند.

گاوزبان ایرانی (Echium amoenum Fisch. & C. A. Mey.)، گیاهی دارویی از تیرۀ Boraginaceae، راستة Polemoniales، جنس Echiumو از گیاهان دولپه‌ای و مقاوم به خشکی است. ازآنجاکه کشت این گیاه دارویی مدنظر بوده است، بررسی عوامل مختلف مؤثر بر رشد آن اهمیت دارد. این گیاه از دیرباز در طب سنتی ایران به‌شکل آرام‌بخش، مدر، معرق، شیر‌افزا، ضد‌سرفه و آسم، مرهم بافت‌های مخاطی، نرم‌کننده، خلط‌آور، کاهش‌دهندۀتپش قلب، کاهش‌دهندۀ فشار خون، تقویت‌کننده و تصفیه‌کنندۀ خون استفاده داشته است (Abed et al.,2014). با‌توجه‌به ارزش گیاه دارویی گاوزبان ایرانی در طب سنتی و افزایش مصرف آن در صنایع داروسازی و همچنین لزوم کاهش مصرف آب در کشاورزی به‌علت خشکسالی‌های پی‌در‌پی و کاهش متوسط بارندگی سالانه، کشت این گیاه در سطح وسیع و به‌شکل تجاری و کاهش آب مصرفی در آن ضروری به نظر می‌رسد. پژوهش‌هایی در زمینۀ اثر سیلیکون در افزایش مقاومت به تنش شوری گیاه گاوزبان اروپایی (Torabi et al., 2013) و گاوزبان ایرانی (Saadatmand and Enteshari, 2012) انجام شده‌اند، ولی تاکنون مطالعه‌ای در زمینۀ تأثیر سیلیکون بر بیان ژن‌های درگیر در مقاومت به تنش خشکی گیاه گاوزبان انجام نشده است؛ از‌این‌رو، پژوهش حاضر به‌منظور بررسی برخی شاخص‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی و همچنین تعیین الگوی بیان ژن‌های P5CS و BADH از ژن‌های دخیل در مقاومت به تنش در گیاه گاوزبان ایرانی در معرض تنش خشکی و تیمار سیلیکون انجام شد تا تیمارهای مؤثر در بهبود مقاومت و همچنین چگونگی پاسخ این گیاه ارزشمند دارویی به تنش خشکی در معرض تیمار سیلیکون بررسی شوند. نتایج پژوهش حاضر در مطالعه‌های مربوط به افزایش تحمل به تنش خشکی گیاهان اهمیت دارند.

 

مواد و روش‌ها.

کاشت گیاه و اِعمال تیمار:بذرهای گیاه گاوزبان ایرانی از شرکت پاکان‌بذر اصفهان تهیه شدند. بذرها به‌مدت 15 دقیقه با آب‌ژاول 10 درصد ضدعفونی و پس‌از چند بار شستشو با آب مقطر، آمادۀ کشت شدند. بذرهای سالم برای جوانه‌زنی به ظرف حاوی پرلیت و کوکوپیت منتقل شدند. از زمان جوانه‌زدن تا رسیدن به مرحلۀ دوبرگی، تغذیه بوته‌ها با محلول یک‌دوم لانگشتاین انجام شد. عناصر پر‌مصرف شامل H2PO4 2/0 ماکرومولار؛ Ca(NO3)2 5/2 ماکرومولار؛ CaCl2 5 ماکرومولار؛ MgSO47H2O 6/0 ماکرومولار؛ K2SO4 1 ماکرومولار و عناصر کم‌مصرف شامل H3BO3 1میکرومولار؛ FeEDTA 200 میکرومولار؛ MnSO44H2O 2 میکرومولار؛ ZnSO4 5/0 میکرومولار؛ CuSO4 3/0 میکرومولار و Na2Mno4 005/0 میکرومولار (Hoagland and Arnon, 1950)؛ سپس گیاهچه‌های چهارده‌روزه به محیط‌کشت هیدروپونیک منتقل شدند و اسیدیتۀ محلول غذایی با HCl و NaOH در محدودۀ 5/6 تا 7 تنظیم شد. یک هفته پس‌از استقرار گیاهچه‌ها در محیط هیدروپونیک، گیاهچه‌ها در معرض غلظت‌های صفر، 5/0 و 5/1 میلی‌مولار سیلیکون (Na2(Sio2)3)‌ قرار گرفتند. چهار هفته پس‌از پیش‌تیمار گیاهچه‌ها با سیلیکون، نمک پلی‌اتیلن‌گلایکول شش هزار ((HO(C2H4O)nH با جرم مولکولی 5400 تا 6600 گرم‌بر‌مول در سه غلظت‌ صفر، 9 و 12 درصد (به‌ترتیب شرایط بدون تنش، تنش متوسط و تنش شدید) برای اِعمال تنش خشکی به محیط‌کشت افزوده شد. یک هفته پس‌از اعمال تیمار توأم سیلیکون و خشکی با پلی‌اتیلن‌گلایکول، گیاهچه‌ها برداشت و شاخص‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی آنها بررسی شدند. گفتنی است هوادهی ظرف‌های کشت به‌طور روزانه انجام و در طول مدت کشت، هر هفته محلول غذایی تعویض شد. آزمایش به‌شکل فاکتوریل در طرح کاملاً تصادفی در محیط کنترل‌شدۀ گلخانه با دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و میانگین دمای شب و روز به‌ترتیب 2±16 و 2±24 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد.

اندازه‌گیری وزن اندام‌ هوایی و ریشه:پس‌از جدا‌کردن ریشه از اندام‌ هوایی، وزن بخش هوایی و ریشه به کمک ترازوی دیجیتال با دقت 001/0 گرم اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی:به‌منظور سنجش میزان کلروفیل و کاروتنوئید از روش Porra و همکاران (1989) استفاده شد. مقدار 1/0 گرم برگ ساییده‌شده به کمک ازت مایع با 10 میلی‌لیتر استون 80 درصد مخلوط و همگن شد. نمونه‌ها به‌مدت 5 دقیقه با سرعت 1500 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند؛ پس‌از این مرحله، فاز بالایی برداشته و شدت جذب آن با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 5/440، 6/646 و 6/663 نانومتر خوانده شد که به‌ترتیب بیشترین جذب کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید را نشان می‌دهند. غلظت رنگیزه‌های مدنظر از رابطه‌های زیر و بر حسب میکروگرم بر گرم وزن تر محاسبه شد:

Chl a (µg/ml)= 12.25 A663.6 - 2.55 A646.6

Chl b (µg/ml)= 20.31 A646.6 - 4.91 A663.6

Chl Total (µg/ml)= 17.76 A646.6 + 7.34 A663.6

Car (µg/ml)= 4.69 A440.5 - 0.267 Chl Total

سنجش میزان آنتوسیانین:مقدار 1/0 گرم برگ گیاه با مقداری متانول اسیدی به نسبت حجمی cc 1:99 (متانول خالص (99) و کلریدریک‌اسید خالص (1)) کاملاً در هاون چینی ساییده شد. عصارۀ حاصل در لوله‌های سر‌پیچ‌دار ریخته و به‌مدت 24 ساعت در تاریکی و دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد؛ سپس به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و جذب روشناور در طول موج 550 نانومتر اندازه‌گیری شد. به‌منظور محاسبۀ غلظت آنتوسیانین از رابطۀ A=εbc استفاده شد (ε: ضریب خاموشی و برابر 33000 سانتی‌متر‌بر‌مول، b: عرض کووت و برابر 1 سانتی‌متر، c: غلظت کمپلکس بر حسب میکروگرم‌بر‌گرم وزن خشک) (Wagner, 1979).

اندازه‌گیری مقدار قندهای محلول: مقدار1/0 گرم نمونۀ خشک ریشه و ساقه با 5/2 میلی‌لیتر اتانول 80 درصد در هاون ساییده و به‌مدت 60 دقیقه در دمای 90 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد. عصاره‌ها از کاغذ صافی عبور داده شدند و رسوب حاصل در 5/2 میلی‌لیتر آب مقطر حل شد. مقدار 200 میکرو‌لیتر از هر نمونه در لولۀ آزمایش ریخته و 5 میلی‌لیتر معرف آنترون به آن اضافه شد. نمونه‌ها به‌مدت 17 دقیقه در بنماری با دمای 90 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند؛ پس‌از سرد‌شدن، جذب محلول‌ها در طول موج 625 نانومتر خوانده و غلظت قندهای محلول با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن خشک محاسبه شد (Fales, 1951).

اندازه‌گیری قند احیا: میزان قند احیا بر اساس روش Somogy (1952) اندازه‌گیری شد؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا عصارۀ گیاهی با استفاده از آب مقطر تهیه و سپس 2 میلی‌لیتر سولفات‌مس به آن اضافه شد. لوله‌ها به‌مدت 20 دقیقه در بنماری با دمای 100 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند و پس‌از سردشدن لوله‌ها، 2 میلی‌لیتر محلول فسفومولیبدیک‌اسید به آنها اضافه شد. پس‌از مشاهدۀ رنگ آبی یکنواخت، جذب نوری محلول‌ها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر تعیین شد و با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز، غلظت قندهای احیاکننده بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن خشک تعیین شد (Somogy, 1952).

اندازه‌گیری مقدار گلایسین‌بتائین: مقدار 20 میلی‌لیتر آب مقطر به 5/0 گرم بافت گیاهی افزوده و به‌مدت 48 ساعت در دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد روی شیکر قرار داده شد. مقدار 1 میلی‌لیتر عصارۀ گیاهی با 1 میلی‌لیتر ‌سولفوریک‌اسید 2 نرمال مخلوط و در آب یخ قرار داده شد و 2/0 میلی‌لیتر یدیدپتاسیم و ید به مخلوط واکنش افزوده شد؛ سپس به‌مدت 15 دقیقه در دمای صفر درجۀ سانتی‌گراد با سرعت 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. مقدار جذب در طول موج 365 نانومتر خوانده و مقدار گلایسین‌بتائین بر حسب میکرومول‌بر‌گرم وزن خشک محاسبه شد (Grieve and Grattan, 1983)..

اندازه‌گیری میزان پرولین: پرولین موجود در اندام هوایی و ریشه‌ها طبق روش تغییریافتۀ Bates و همکاران (1973) و با استفاده از بافت گیاه در حضور سولفوسالسیلیک‌اسید آبدار 3 درصد استخراج شد. جذب نوری نمونه‌ها در طول موج ۵۲۰ نانومتر خوانده و غلظت پرولین باتوجه‌به منحنی استاندارد پرولین بر حسب میکرومول‌بر‌گرم وزن خشک محاسبه شد.

.بررسی الگوی بیان نسبی ژن‌های P5CS و BADH: به‌منظور استخراج RNA، مقدار 100 میلی‌گرم از بافت ریشه و اندام‌ هوایی گیاه گاوزبان در معرض تنش خشکی (صفر و 9 درصد) و تیمار سیلیکون (صفر ، 5/0 و 5/1 میلی‌مولار) با نیتروژن مایع درون هاون چینی دارای دمای کم و استریل پودر و به تیوپ‌های 2 میلی‌لیتری سرد منتقل شد. استخراج RNA به کمک کیت استخراج ترایزول مطابق دستورعمل شرکت سیناژن انجام شد. کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده با استفاده از الکتروفورز و اسپکتروفتومتر بررسی شد. واکنش رونویسی معکوس RT-PCR (Reverse Transcription PCR) به منظور سنتز cDNA انجام شد. به‌منظور جلوگیری از تکثیـر احتـمالی DNA ژنـومی که همراه با RNA استـخراج مـی‌شود، نمـونه‌های استخراج‌شده با DNaseI (Thermo Fisher) تیمار شدند. ساخت cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA شرکت Vivantis مالزی انجام شد. به منظور تجزیه و تحلیل درستی cDNA، واکنش RT-PCR با دستگاه ترموسایکلر (ABI Veriti) روی cDNA سنتزی انجام شد. آغازگر ژن‌های P5CS، BADH و EF-α از بانک اطلاعاتی NCBI دریافت و آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی مستقیم و معکوس با نرم‌افزار Oligo 3.1 طراحی شدند. در طراحی آغازگرها، طول قطعۀ تکثیری 100 تا 200 جفت باز، درصد GC بیش از 50 و طول آغازگر حدود 20 جفت در نظر گرفته شد. پس‌از طراحی آغازگرها، اختصاصیت تکثیر آنها برای ژن مدنظر به کمک Primer Blast موجود در NCBI بررسی و تأیید شد. آغازگرها ابتدا رقیق و سپس با غلظت 10 پیکو‌مول‌در‌میکرولیتر وارد واکنش Real time-PCR شدند (جدول 1).

 

 

جدول 1- توالی آغازگرهای استفاده‌شده در واکنش Real Time PCR

Tm(˚C)

توالی آغازگر (5´-3´)

Primers

64.40

5´-CGATGCAGTAAGTACCAGGAAAGCTC-3´

P5CS –F

64.04

5´-ATGAGACCATTCTGCCCAACAGC-3´

P5CS –R

63.70

5´-GGAGTTGGCATCTGTGACTTGTCTAG-3´

BADH -F

64.36

5´-CCATTCAGCAGCTACGTCAAGGTC-3´

BADH -R

61.13

5ʹ-TCACTCTTGGAGTGAAGCAGAT-3ʹ

EF-α -F

60.31

5ʹ-GACCTCCTTGACAATTTCTTCATAA-3ʹ

EF-α- R

 

 

هر واکنش Real Time-PCR با استفاده از فناوری SYBR Green I شرکت ABI انجام شد. شرایط بهینۀ این واکنش با 5 میکرولیتر Master Mix، 5/0 میکرولیتر آغازگرهای رفت و برگشت، 1 میکرولیتر نمونۀ cDNA و 5/3 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز فراهم شد. به‌منظور انجام واکنش از چرخۀ حرارتی 10 دقیقه در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد، 40 چرخه شامل 15 ثانیه در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد و 45 ثانیه در دمای 60 درجۀ سانتی‌گراد استفاده شد. به‌منظور بررسی نمودار منحنی ذوب، میزان جذب فلورسنس از طریق آمپلیکن‌ها در دامنۀ دمایی 60 تا 95 درجۀ سانتی‌گراد بررسی شد. میانگین چرخه‌های آستانه (Ct) برای هر ژن محاسبه شد. بر اساس چرخه‌های آستانه و قراردادن آنها در رابطۀ 1، 2 و 3 نسبت بیان ژن‌های هدف و مرجع با یکدیگر مقایسه شد. در ادامه، نسبت تغییرات بیانی بین دو نمونۀ آزمون و شاهد با استفاده از رابطۀ 4 تعیین شد.

 

رابطۀ 1

[(شاهد) ژن مرجع mCt – (شاهد) ژن مد نظر mCt ] = ΔCt شاهد

رابطۀ 2

[(آزمون) ژن مرجع mCt – (آزمون) ژن مد نظر mCt ] = ΔCt آزمون

رابطۀ 3

(آزمون) ΔCt – (شاهد) ΔCt = ΔΔCt

رابطۀ 4

-ΔΔCt 2 = Ratio (نسبت بیانی)

 


تجزیه‌وتحلیل داده‌های آماری: آزمایش به‌شکل فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و در سه تکرار انجام شد. تجزیه‌و‌تحلیل داده‌ها با نرم‌افزارهای آماری SPSS و MSTAT-C، مقایسۀ میانگین‌ داده‌ها با آزمون دانکن در سطح احتمال خطای 5 درصد و رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel انجام شد.

 

نتایج

.اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر شاخص‌های رشدی: بررسی داده‌ها نشان داد وزن تر اندام‌ هوایی و ریشه در شرایط تنش خشکی به‌طور معناداری کاهش می‌یابد. همان‌طور که شکل 1 نشان می‌دهد، افزودن سیلیکون در شرایط بدون تنش خشکی سبب افزایش معنا‌دار وزن تر در غلظت 5/1 میلی‌مولار سیلیکون می‌شود. افزودن غلظت 5/1 میلی‌مولار سیلیکون در غلظت 9 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول سبب بیشترین میزان وزن شد و افزودن غلظت 5/0 میلی‌مولار سیلیکون در غلظت 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول، بیشترین وزن تر را در پی داشت (شکل 1، A و B)..

 

 

   

شکل 1- مقایسۀ اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر میزان وزن‌ ترگیاه گاوزبان ایرانی؛ A. وزن‌ تر اندام ‌هوایی، B. وزن‌ تر ریشه (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن هستند)

 


.اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر محتوای رنگیزه‌ها: تنش خشکی سبب کاهش معنا‌دار کلروفیل a، bو کلروفیل ‌کل نسبت به گیاه شاهد شد (شکل 2). در شرایط بدون تنش خشکی، تیمار سیلیکون در غلظت‌های 5/0 و 5/1 میلی‌مولار سبب افزایش معنا‌دار کلروفیل b شد. در شرایط تنش متوسط و شدید، تیمار سیلیکون در غلظت‌های 5/0 و 5/1 میلی‌مولار سبب افزایش معنا‌دار کلروفیل کل شد (شکل2، C). نتایج اندازه‌گیری‌ کاروتنوئید نشان دادند خشکی سبب کاهش کاروتنوئید می‌شود (شکل 2، D) و در شرایط تنش، سیلیکون تأثیری بر محتوای کاروتنوئید ندارد.

 

   
   

شکل 2- تأثیر سیلیکون بر محتوای رنگیزه‌ها در شرایط تنش خشکی در گیاه گاوزبان ایرانی؛ A. محتوای کلروفیل a، B. محتوای کلروفیل b، C. محتوای کلروفیل کل، D. محتوای کاروتنوئید (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)

 

 

.اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر محتوای آنتوسیانین: تنش خشکی سبب افزایش میزان آنتوسیانین شد. در شرایط بدون تنش خشکی، تیمار سیلیکون در غلظت‌های 5/0 و 5/1 میلی‌مولار سبب افزایش محتوای آنتوسیانین شد؛ همچنین تیمار سیلیکون در شرایط تنش خشکی سبب افزایش محتوای آنتوسیانین نسبت به شاهد شد؛ درحالی‌که نسبت به تنش خشکی کاهش نشان داد (شکل 3)..

 

 

 

شکل 3- مقایسۀ اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر محتوای آنتوسیانین گیاه گاوزبان ایرانی (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)

 

.اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر مقدار قند محلول: شکل 4 نشان می‌دهد تنش خشکی سبب افزایش معنا‌دار قند محلول اندام‌ هوایی و ریشه می‌شود. در شرایط بدون تنش، تیمار سیلیکون در غلظت 5/1 میلی‌مولار سبب افزایش معنا‌دار قند محلول اندام‌ هوایی و ریشه نسبت به شاهد شد. در شرایط تیمار توأم سیلیکون و تنش خشکی، سیلیکون 5/0 و 5/1 میلی‌مولار باعث کاهش معنا‌دار قند محلول اندام ‌هوایی و ریشه نسبت به نمونه‌های در معرض تنش خشکی شد (شکل4، A و B)..

 

 

   

شکل 4- مقایسۀ اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر میزان قند محلول گیاه گاوزبان ایرانی؛ A. میزان قند محلول اندام ‌هوایی، B. میزان قند محلول ریشه (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)

 


.اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر مقدار قند احیا‌: بررسی نتایج اندازه‌گیری‌ محتوای قند احیای گیاه گاوزبان ایرانی (شکل 5، A و B) نشان داد تنش خشکی باعث افزایش معنا‌دار محتوای قند احیای اندام‌ هوایی و ریشه می‌شود؛ در شرایط بدون تنش، تیمار سیلیکون سبب افزایش معنا‌دار این شاخص شد. در تیمار توأم سیلیکون و تنش خشکی، کاهش معنادار قند احیای اندام هوایی و ریشه‌ها نسبت به نمونه‌های در معرض تنش خشکی مشاهده شد (شکل5، B)..

 

   

شکل 5- اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر میزان قند احیای گیاه گاوزبان ایرانی؛ A. میزان قند احیاکنندۀ اندام ‌هوایی، B. میزان قند احیاکنندۀ ریشه (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)


اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر مقدار گلایسین‌بتائین: شکل 6 نشان می‌دهد تنش خشکی سبب افزایش معنادار محتوای گلایسین‌بتائین اندام‌ هوایی و ریشه نسبت به شاهد می‌شود. در شرایط بدون تنش، تیمار سیلیکون در غلظت 5/0 میلی‌مولار سبب افزایش محتوای گلایسین‌بتائین ریشه شد. در شرایط تنش خشکی متوسط و شدید، تیمار سیلیکون سبب کاهش معنا‌دار محتوای گلایسین‌بتائین اندام‌ هوایی گیاه گاوزبان شد؛ ولی تفاوت معناداری در ریشه مشاهده نشد. در نمونه‌های در معرض تیمار توأم سیلیکون و تنش خشکی، محتوای گلایسین‌بتائین در اندام ‌هوایی و ریشه نسبت به نمونه‌های شاهد افزایش یافت (شکل6، A و B).

 

 

 

شکل 6- مقایسۀ اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر محتوای گلایسین‌بتائین گیاه گاوزبان ایرانی؛ A. محتوای گلایسین‌بتائین اندام ‌هوایی، B. محتوای گلایسین‌بتائین ریشه (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)

 


اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر مقدار پرولین: نتایج بررسی محتوای پرولین در شکل 7 نشان می‌دهند تنش خشکی سبب افزایش معنا‌دار محتوای پرولین اندام ‌هوایی و ریشه می‌شود. در شرایط بدون تنش خشکی، تیمار سیلیکون سبب افزایش معنا‌دار محتوای پرولین در اندام‌ هوایی و ریشه شد. در تیمار توأم سیلیکون و تنش خشکی، تیمار سیلیکون در دو غلظت 5/0 و 5/1 میلی‌مولار در شرایط تنش خشکی متوسط و شدید سبب کاهش معنا‌‌دار محتوای پرولین اندام ‌هوایی و ریشۀ گیاه گاوزبان نسبت به نمونه‌های در معرض تنش خشکی شد (شکل7، A و B).

.بررسی اثر متقابل خشکی و سیلیکون بر بیان .ژن‌های BADH و P5CS با استفاده از روش ارزیابی نسبی

استخراج RNA:بررسی کمیت و کیفیت RNAهای استخراج‌شده به کمک دستگاه نانودراپ نشان داد OD 260/280 تمام نمونه‌های استخراج‌شده حدود 84/1 تا 99/1 است که کمیت خوب استخراج را نشان می‌دهد. الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد برای نمونه‌های مطالعه‌شده، کیفیت مناسب RNAهای استخراج شده را نشان داد (شکل 8).

 

 

 

شکل 7- مقایسۀ اثر متقابل تنش خشکی و سیلیکون بر محتوای پرولین گیاه گاوزبان ایرانی؛ A. محتوای پرولین اندام‌ هوایی، B. محتوای پرولین ریشه (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)

 

 

شکل 8- استخراج RNA ازگیاه روی ژل آگارز 1 درصد

 


تجزیه‌وتحلیل منحنی ذوب (Melting Curve Analysis):تحلیل منحنی ذوب نشان‌دهندۀ تکثیر اختصاصی هریک از ژن‌ها با نقطۀ ذوب مشخص است که با انجام Real-Time PCR و ظهور پیک مشخص در دمای معین بیش از 80 درجۀ سانتی‌گراد تعیین می‌شود. انتخاب ژن مرجع مناسب به‌منظور نرمال‌کردن بیان ژن‌های هدف در شرایط مختلف تنش انجام می‌شود. منحنی ذوب محصولات PCR مربوط به ژن‌های EF-α (ژن مرجع)، BADH و P5CS تکثیر اختصاصی ژن‌ها را نشان داد. نقطۀ ذوب ژن‌ها با‌توجه‌به نمودار به‌ترتیب در دماهای 28/81، 43/81، 65/79 درجۀ سانتی‌گراد مشاهده شد (شکل 9).

نتایج بیان ژن‌های BADH و P5CS در شرایط تنش خشکی و تیمار سیلیکون در اندام‌ هوایی گیاه گاوزبان ایرانی: نتایج میزان بیان ژن‌های BADH و P5CSدر اندام ‌هوایی گیاه گاوزبان ایرانی نشان دادند در شرایط تنش خشکی، تیمار سیلیکون و شرایط توأم تنش خشکی و سیلیکون، افزایش بیان هر دو ژن نسبت به گیاه شاهد معنا‌دار است (شکل 10، A)؛ همچنین نتایج نشان دادند بیشترین میزان بیان ژن‌ پرولین-5-کربوکسیلات‌سنتتاز در اندام‌ هوایی گیاه گاوزبان ایرانی در شرایط تنش خشکی مشاهده می‌شود. تیمار سیلیکون در شرایط تنش خشکی سبب کاهش معنادار میزان بیان ژن P5CS در اندام هوایی شد. میزان بیان ژن بتائین‌آلدئید‌دهیدروژناز در اندام‌ هوایی گیاه گاوزبان ایرانی طی تیمار سیلیکون کاهش معناداری نسبت به شرایط تنش خشکی و شرایط توأم تنش خشکی و سیلیکون داشت (شکل 10، B).

 

 

B

 

A

 

 

C

 

شکل 9- منحنی ذوب ژن‌های A. EF-α، B. BADH و C. P5CS در Real-Time PCR برای گیاه گاوزبان ایرانی در شرایط تنش خشکی و سیلیکون

 

   

شکل 10- تغییرات بیان نسبی ژن‌های BADH و P5CS در شرایط تیمار سیلیکون و تنش خشکی در اندام‌ هوایی گیاه گاوزبان ایرانی (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)

 


نتایج بیان ژن‌های BADH و P5CS در شرایط تنش خشکی و سیلیکون در ریشۀ گیاه گاوزبان ایرانی:نتایج میزان بیان ژن‌های بتائین‌آلدئید‌دهیدروژناز و پرولین-5-کربوکسیلات‌سنتتاز در ریشۀ گیاه گاوزبان ایرانی نشان دادند تنش خشکی، تیمار سیلیکون و شرایط توأم تنش خشکی و سیلیکون سبب افزایش معنا‌دار بیان هر دو ژن نسبت به گیاه شاهد می‌شود (شکل 11، A)؛ همچنین بررسی‌ها نشان دادند بیشترین میزان بیان ژن‌های BADH و P5CS در ریشۀ گیاه گاوزبان ایرانی طی شرایط تنش خشکی دیده می‌شود، ولی میزان بیان هر دو ژن در شرایط تیمار توأم تنش خشکی و سیلیکون نسبت به شرایط تنش خشکی به‌طور معنا‌دار کاهش می‌یابد (شکل 11، B).

 

 

   

شکل 11- تغییرات بیان نسبی ژن‌های BADH و P5CS در شرایط تیمار سیلیکون و تنش خشکی در ریشۀ گیاه گاوزبان ایرانی (داده‌ها میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار و حرف‌های نامشابه نشان‌دهندۀ اختلاف معنا‌دار (P≤0.05) بر اساس آزمون دانکن است)

 


بحث

در پژوهش حاضر، اثر سیلیکون بر تحمل گیاه دارویی گاوزبان نسبت به تنش خشکی بررسی شد. در مرحلۀ رشد رویشی، گیاهان با کوچک‌شدن برگ‌ها و ریزش آنها به تنش خشکی واکنش نشان می‌دهند و ازدست‌دادن سطح برگ و جلوگیری از گسترش شاخ و برگ سبب کاهش وزن می‌شود (Orcutt and Nilsen, 2000). گزارش‌های متعددی به کاهش زیست‌تودۀ گیاهان در اثر تنش خشکی اشاره کرده‌اند (Vivancos et al.,2015). مطالعه‌ها نشان داده‌اند مصرف سیلیکون سبب افزایش سطح برگ و درنتیجه، افزایش فتوسنتز و عملکرد گیاه می‌شود (Gottardi et al., 2012). نتایج مطالعۀ Li و همکاران (2007) در زمینۀ اثر سیلیکون روی میزان تحمل گیاه ذرت به خشکی نشان دادند تیمار سیلیکون سبب افزایش عملکرد گیاه می‌شود. در پژوهش حاضر، کاهش وزن تر اندام‌ هوایی و ریشۀ گیاهچه‌های گاوزبان ایرانی در اثر خشکی مشاهده و تیمار با سیلیکون سبب بهبود شرایط تنش و افزایش وزن تر اندام‌ هوایی و ریشه شد؛ همچنین نتایج پژوهش حاضر نشان دادند در تنش خشکی، میزان کلروفیل a، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها به‌طور معنا‌داری کاهش می‌یابد و افزودن سیلیکون سبب افزایش رنگدانه‌های کلروفیل می‌شود، ولی تأثیر معنا‌داری بر محتوای کاروتنوئید ندارد. نتایج پژوهشگران از مطالعۀ اثر سیلیکون بر گیاه Festuca arundinacea با یافته‌های پژوهش حاضر همخوانی دارند (Pilon et al.,2013). در پژوهش‌ Pilon و همکاران (2013) گزارش شده است سیلیکون باعث افزایش سطح برگ، غلظت رنگدانه‌های فتوسنتزی و کاروتنوئید در گیاه سیب‌زمینی می‌شود. کاروتنوئیدها رنگیزه‌های کمکی هستند و در حفاظت از غشاهای تیلاکوئیدی و جلوگیری از فتواکسیداسیون کلروفیل‌ها تأثیر دارند (Li et al., 2007)؛ بـه نظـر می‌رسد سیلیکون سبب کاهش آثار مضر تـنش خشـکی و محافظـت از ساختارهای برگ و درنتیجه، موجب کاهش کمتر کاروتنوئید در این شرایط می‌شود. در مطالعۀ انجام‌شده روی گیاه کلزا، افزایش محتوای آنتوسیانین در شرایط تنش خشکی گزارش شده است (Amubeigi and Razavizadeh, 2013) که با نتایج مطالعۀ گیاه گاوزبان ایرانی همخوانی دارد. آنتوسیانین‌ها گروهی از فلاونوئیدهای محلول در آب هستند که در نقطه‌ای پایانی طی مسیر بیوسـنتز فلاونوئیـدها سـنتز می‌شـوند. پژوهش حاضر نشان داد تیمار سیلیکون در شرایط تنش خشکی متوسط و شدید سبب کاهش معنا‌دار محتوای آنتوسیانین به‌ویژه در غلظت 5/0 میلی‌مولار سیلیکون می‌شود. آنتوسیانین نقش مهمی در دفاع آنتی‌اکسیدانی برگ‌های در معرض تنش دارد و با کاهش آثار تنش به کمک سیلیکون، میزان آن کاهش می‌یابد (Hajiboland and Cheraghvareh, 2014).

بررسی‌های انجام‌شده در پژوهش حاضر روی گاوزبان نشان دادند تنش خشکی سبب افزایش کربوهیدرات‌ها‌ی محلول و احیا می‌شود؛ نتایج مشابهی نیز در گیاه خرفه مشاهده شده‌اند (Rahdari et al., 2012). همان‌گونه که گفته شد، افزایش اسمولیت‌ها در شرایط تنش خشکی یکی از سازوکارهای مقاومتی مهم در برابر تنش است؛ افزایش کربوهیدرات‌ها و انباشت قندها ممکن است ناشی از کاهش نیاز گیاه به مواد فتوسنتزی در اثر کاهش رشد، کاهش انتقال از برگ، سنتز این ترکیبات از مسیرهای غیرفتوسنتزی و همچنین تخریب کربوهیدرات‌های نامحلول یا هیدرولیز نشاسته باشد (Ehdaie et al., 2006; Sio-Se Mardeh et al., 2014). متابولیت‌های قندی با تبدیل پلی‌ساکاریدها و اولیگوساکاریدها به یکدیگر، تعادل اسمزی را کنترل می‌کنند و سبب کاهش خسارت‌های اکسیداتیو و حفظ ساختار پروتئین‌ها و آنزیم‌ها در طول تنش می‌شوند (Mahdavian et al., 2016).

در پژوهش حاضر مشاهده شد محتوای قند محلول و احیای ریشه و اندام ‌هوایی با افزودن سیلیکون در غلظت‌های 9 و 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول کاهش ‌می‌یابد که با یافته‌های Ashkavand و همکاران (2015) در گیاه زالزالک مطابقت دارد؛ این پژوهشگران گزارش کرده‌اند غلظت‌های زیاد سیلیکون (برخلاف غلظت‌های کم) سبب کاهش کربوهیدرات‌های گیاهان می‌شوند. بررسی اثر سیلیکون بر گیاه سورگوم نشان داده است افزودن سیلیکون در شرایط تنش سبب افزایش محتوای کربوهیدرات‌ها می‌شود (Yin et al., 2013)؛ این نتیجه با نتایج پژوهش حاضر همسو نیست. نتایج پژوهش حاضر دربارۀ میزان گلایسین‌بتائین در اندام‌ هوایی گیاه گاوزبان نشان دادند افزودن سیلیکون (در هر دو غلظت) در شرایط تنش خشکی سبب کاهش معنا‌دار محتوای گلایسین‌بتائین اندام ‌هوایی می‌شود؛ این ماده، نوعی قند الکلی سوربیتول است که نقش بسزایی در حفظ فشار اسمزی گیاه دارد (Aldesuquy et al., 2013). آزمایش‌های مختلف نشان داده‌اند گلایسین‌بتائین به‌شکل محافظ اسمزی سبب محافظت ساختمان چهارم پروتئین‌ها و ساختار غشای سلولی در برابر آثار مضر تنش خشکی می‌‌شود (Quan et al., 2004). به نظر می‌رسد آنزیم BADH علاوه‌بر نقش در بیوسنتز گلایسین‌بتائین، در کاتابولیسم پلی‌آمین‌ها و سنتز حفاظت‌کنندۀ اسمزی 3-دی‌متیل‌سولفونیو‌پروپیونات 5 نیز نقش دارد. ژن BADH ازجمله ژن‌هایی است که به‌‌طور مستقیم در تعدیل تنش نقش دارد و از طریق تبدیل بتائین‌آلدهید به گلایسین‌بتائین که آمینواسید تعدیل‌کنندۀ تنش محسوب می‌شود، مقاومت به تنش را ایجاد می‌کند (Fakhimi et al., 2020). Tale-Ahmad و Haddad (2011) مقدار گلایسین‌بتائین را در گیاه گندم در معرض تـنش خشـکی بررسی کردند و نتیجه گرفتند میزان گلایسین‌بتائین در گیاهان در معرض تنش خشکی از گیاهان شاهد بیشتر اسـت و سیلیکون تأثیر منفی تنش خشکی را که سبب انباشت گلایسین‌بتائین می‌شود، بهبود می‌بخشد و تا حدی سبب تحمل تنش خشکی می‌‌شود؛ نتایج این آزمایش با بررسی‌های حاضر مطابقـت دارند. نتایج بررسی محتوای پرولین در اندام ‌هوایی و ریشۀ گیاه گاوزبان ایرانی نشان دادند تنش خشکی حاصل از پلی‌اتیلن‌گلایکول سبب افزایش معنا‌دار میزان پرولین در هر دو اندام می‌شود. در مطالعه‌ای مشابه روی گیاه دارویی آویشن، میزان پرولین به‌طور معناداری در گیاهچه‌ها و کالوس‌های در معرض تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول افزایش یافت (Razavizadeh et al., 2019) که مؤید استفادۀ سلول‌ها از پرولین (اسمولیت سازگار برای تنظیم اسمزی و مقابله بـا تنش‌های محیطی) است. پرولین با جاروب‌کردن رادیکال‌های هیدروکسیل در شرایط تنش اکسیداتیو از فرو‌پاشی غشای سلولی جلوگیری می‌کند و اسمولیتی است که سبب حفظ ساختار پروتئین‌ها و آنزیم‌ها می‌شود (Talebi et al., 2013). افزودن سیلیکون در شرایط تنش خشکی سبب کاهش معنا‌دار محتوای پرولین در اندام ‌هوایی و ریشۀ گیاه گاوزبان ایرانی شد؛ این نتیجه با گزارش Parida و همکاران (2013) در گیاه فلفل در معرض تنش خشکی و تیمار سیلیکون مغایرت دارد، اما با نتایج Ashkavand و همکاران (2015) در گیاه زالزالک همسو است. در گیاهان در معرض تنش و در غیاب سیلیکون، خشکی سبب تولید عوامل رونویسی می‌شود که این عوامل، تولید پروتئین‌های آنزیمی دخیل در سنتز پرولین را فعال می‌کنند و موجب تجمع پرولین در شرایط تنش می‌شوند؛ احتمالاً سیلیکون از طریق تأثیرگذاری بر فعالیت همین آنزیم‌ها ازجمله آنزیم P5CS موجب کاهش غلظت پرولین در گیاه می‌شود. اضافه‌کردن سیلیکون سبب بهبود تحمل نسبت به تنش می‌شود و معمولاً با کاهش سنتز پرولین همراه است (Pei et al., 2010).

مطالعه‌ها نشان می‌دهند تنش خشکی سبب تغییر در بیان برخی از ژن‌های دخیل در تنش می‌شود که به‌تدریج مقاومت در برابر تنش را در گیاهان سبب می شوند؛ این ژن‌ها عبارتند از: ژن‌های بیان‌کنندۀ اسمولیت‌ها، آنزیم‌ها و پروتئین‌های حمل‌کننده و تنظیم‌کننده (Krasensky and Jonak, 2012). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند در شرایط تنش خشکی، میزان بیان ژن‌های BADH و P5CS به‌طور معناداری افزایش می‌یابد. در گیاه چندسالۀ سوسن نیز افزایش بیان ژن‌های BADH سبب افزایش تجمع گلایسین‌بتائین و افزایش مقاومت به تنش‌های غیرزیستی می شود (Bao et al.,2011). در مطالعه روی آرابیدوپسیس مشاهده شده است طی تنش خشکی، بیان یکی از ژن‌های همولوگ BADH (AtALDH9) در ریشه و برگ‌های درحال توسعه افزایش می‌یابد (Missihoun et al., 2011). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند افزودن سیلیکون در شرایط بدون تنش خشکی و همچنین در شرایط تنش خشکی سبب افزایش بیان ژن BADH نسبت به نمونه‌های شاهد می‌شود؛ این در حالیست که در نمونه‌های در معرض تنش خشکی، اعمال تیمار سیلیکون سبب کاهش معنا‌دار بیان ژن BADH در برگ و ریشه گیاه می‌شود که با نتایج بررسی میزان گلایسین‌بتائین در این دو اندام در شرایط تیمار توأم خشکی و سیلیکون مطابقت دارد.

آنزیم P5CS، آنزیمی کلیدی در مسیر بیوسنتز پرولین در گیاهان است (Orcutt and Nilsen, 2000). در پژوهش حاضر، مطالعه روی گیاه گاوزبان ایرانی نشان داد تنش خشکی سبب افزایش بیان ژن P5CS در ریشه و اندام هوایی گیاه می‌شود؛ این نتیجه با یافته‌های Nanjo و Yoshiba (1999) در Arabidopsis thaliana طی شرایط تنش مطابقت دارد. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند افزودن سیلیکون در شرایط بدون تنش خشکی و تنش خشکی سبب افزایش بیان ژن P5CS نسبت به گیاهان شاهد می‌شود. در پژوهشی مشابه که Maghsoudi و همکاران (2018) روی دو رقم گندم انجام دادند، مشاهده شد تیمار سیلیکون سبب افزایش بیان ژن P5CS در هر دو رقم گندم می‌شود. مشابه با نتایج بررسی میزان پرولین در اندام‌ هوایی و ریشۀ گیاه گاوزبان، در تیمار توأم خشکی و سیلیکون نیز کاهش معنا‌دار میزان بیان ژن P5CS نسبت به تنش خشکی و کاهش میزان محصول این ژن یعنی پرولین مشاهده شد؛ این امر می‌تواند ناشی از نقش سیلیکون در کاهش تنش اسمزی حاصل از خشکی و کاهش آثار مضر آن باشد. درکل می‌توان گفت اگرچه بیان ژن‌های P5CS و BADH و میزان محصولات این ژن‌ها یعنی پرولین و گلایسین‌بتائین در اثر تنش خشکی در گیاه گاوزبان افزایش می‌یابد، با اِعمال تیمار سیلیکون و ایفای نقش آن در کاهش تنش اسمزی، میزان اسمولیت‌های پرولین و گلایسین‌بتائین و بیان ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتز آنها یعنی P5CS و BADH در گیاهان در معرض تیمار توأم خشکی و سیلیکون کاهش می‌یابد؛ این نتایج تأثیر سیلیکون در تخفیف آثار تنش و بهبود تحمل به خشکی در گیاه را تأیید می‌کنند. همان‌طور که گفته شد بسیاری از پژوهشگران نشان داده‌اند سیلیکون تحمل گیاهان در معرض محیط‌های تنش‌زا را افزایش می‌دهد (Agostinho et al., 2017)؛ باوجوداین، ارتباط بین تیمار سیلیکون و متابولیسم محلول‌های سازگار و انتقال آب هنوز به‌طور کامل مشخص نشده است و نیاز به بررسی‌های دقیق‌تر دارد. بر اساس نتایج آزمایش حاضر و مطالعه‌های سایر پژوهشگران می‌توان گفت سیلیکون با تنظیم ژن‌های مسئول در پاسخ به تنش در افزایش مقاومت گیاه به شرایط خشکی مؤثر است؛ بنابراین برای رسیدن به نتایج جامع‌تر، بررسی الگوی بیان سایر ژن‌های دخیل در مقاومت به تنش در شرایط تیمار سیلیکون پیشنهاد می‌شود.

 

جمع‌بندی

بر اساس نتایج پژوهش حاضر، سیلیکون آثار نامطلوب تنش خشکی را در گیاه دارویی گاوزبان ایرانی بهبود می‌بخشد و با افزایش شاخص‌های رشد و رنگیزه‌های فتوسنتزی، بقای بهتر گیاه گاوزبان ایرانی در شرایط تنش خشکی را سبب می‌شود. سیلیکون سبب کاهش تنش اسمزی حاصل از خشکی و کاهش معنا‌دار میزان بیان ژن‌های P5CS و BADH آنزیم‌های کلیدی مسیر سنتز اسمولیت‌های پرولین و گلایسین‌بتائین می‌شود. در سال‌های اخیر، رویکردی همه‌جانبه برای استفاده از داروهای با منشأ طبیعی و به‌ویژه گیاهی در جهان پدید آمده است؛ از سوی دیگر، کشور ایران در معرض خطر کمبود آب قرار دارد و درنتیجه، استفاده از سیلیکون می‌تواند راهکاری برای افزایش مقاومت گیاه گاوزبان ایرانی و دیگر گیاهان دارویی در برابر تنش خشکی باشد. نتایج پژوهش حاضر می‌تواند در اختیار مراکز پژوهشی گیاهان دارویی و کشاورزی قرار گیرد تا استانداردهای علمی و عملیاتی برای بهره‌گیری از آن را در پیش گیرند.

 

Abed, A., Vaseghi, G., Jafari, E., Fattahian, E., Babhadiashar, N. and Abed, M. (2014) Echium amoenum Fisch. Et Mey: A review on its pharmacological and medicinal properties. Asian Journal of Medicinal Pharmaceutical Researches 4(1): 21-23.
Agostinho, F. B., Tubana, B. S., Martins, M. S. and Datnoff, L. E. (2017) Effect of different silicon sources on yield and silicon uptake of rice grown under varying phosphorus rates. Plants 6: 35-52.
Aldesuquy, H. S., Abbas, M. A., Abo-Hamed, S. A. and Elhakem, A. H. (2013) Does glycine betaine and salicylic acid ameliorate the negative effect of drought on wheat by regulating osmotic adjustment through solutes accumulation? Journal of Stress Physiology and Biochemistry 9(3): 5-22.
Amubeigi, M. and Razavizadeh, R. (2013) The effect of drought stress and paclobutrazol on the accumulation of flavonoids and inorganic elements in rapeseed (Brassica napus L.) under in vitro culture. Iranian Journal of Plant Ecophysiology 8(3): 12-22.
Ashkavand, P., Tabari, M., Zarafshar, M., Tomaskova, I. and Struve, D. (2015) Effect of SiO2 nanoparticles on drought resistance in hawthorn seedlings. Lesne Prace Badawcze/Forest Research Papers 76: 350-359.
Bao, Y., Zhao, R., Li, F., Tang, W. and Han, L. (2011) Simultaneous expression of Spinacia oleracea chloroplast choline monooxygenase (CMO) and betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) genes contribute to dwarfism in transgenic Lolium perenne. Plant Molecular Biology Reporter 29: 379-388.
Bates, L. S., Waldren, S. P. and Teare, I. D. (1973) Rapid determination of free proline for water- stress studies. Journal of Plant and Soil 39: 205-207.
Chen, T. H. H. and Murata, N. (2002) Enhancement of tolerance to abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes. Current Opinion Plant Biology 5: 250-257.
Chen, T. H. H. and Murata, N. (2008) Glycinbetaine: An effective protectant against abiotic stress in plants. Trends in Plant Science 13: 499-505.
 
Ehdaie, B., Alloush, G. A., Madore, M. A. and Waines, J. G. (2006) Genotypic variation for stem reserves and mobilization in wheat: I. postanthesis changes in internode dry matter. Crop Science 46: 735-746.
Fakhimi, F., Motalebi Azar, A., Zare Nahandi, F., Sokhandan Bashir, N. and Gohari, G. (2020) Effect of salicylic acid on transcription of betaine aldehyde dehydrogenase gene in symbiosis (Solanum tuberosum L.) Agria cultivar under salinity stress. Environmental Stresses in Crop Sciences 13(1): 1-8.
Fales, F. W. (1951) The assimilation and degradation of carbohydrate by yeast cells. Journal of Biological Chemistry 193: 113-124.
Fitzgerald, T. L., Waters, D. L. E. and Henry, R. J. (2009) Betaine aldehyde dehydrogenase in plants. Plant Biology 11: 119-130.
Gottardi, S., Iacuzzo, F., Tomasi, N., Cortella, G., Manzocco, L., Pinton, R., Romheld, V., Mimmo, T., Scampicchio, M., Dalla Costa, L. and Cesco, S. (2012) Beneficial effects of silicon on hydroponically grown corn salad (Valerianella locusta L.)Laterr plants. Plant Physiology and Biochemistry 56: 14-23.
Grieve, C. M. and Grattan, S. R. (1983) Rapid assay for the determination of water soluble quaternary ammonium compounds. Plant and Soil 70: 303-307.
Hajiboland, R. and Cheraghvareh, L. (2014) Influence of Si supplementation on growth and some physiological and biochemical parameters in salt-stressed tobacco (Nicotiana rustica L.) plants. Journal of Sciences 25(3): 205-217.
Hoagland, D. R. and Arnon, D. I. (1950) The water culture method for growing plants without soil, Circ. 347. California Agricultural Experiment Station, Berkeley.
Imtiaz, M., Rizwan, M. S., Mushtaq, M. A., Ashraf, M., Shahzad, S. M. and Yousaf, B. (2016) Silicon occurrence, uptake, transport and mechanisms of heavy metals, minerals and salinity enhanced tolerance in plants with future prospects: A review. Journal of Environmental Management 183: 521-529.
Krasensky, J. and Jonak, C. (2012) Drought, salt and temperature stress-induced metabolic rearrangements and regulatory networks. Journal of Experimental Botany 1093(10): 460.
Kurepin, L. V., Lavanov, A. G., Zaman, M., Pharis, R. P., Hurry, V. and Huner, N. P. A. (2017) Interaction of glycine betaine and plant hormones: protection of the photosynthetic apparatus during abiotic stress. Research Gate 10: 185-202.
Li, Q. F., Ma, C. C. and Shang, Q. L. (2007) Effects of silicon on photosynthesis and antioxidative enzymes of maize under drought stress. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao 18: 531-536.
Mahdavian, K., Ghaderian, S. M. and Torkzadeh Mahani, M. (2016) The effect of different concentrations of lead on some physiological parameters in two populations of harmal (Peganum harmala L.). Journal of Cell and Tissue 6(4): 543-555.
Maghsoudi, K., Emam, Y., Niazi, A., Pessarakli, M. and Arvin, M. J. (2018) P5CS expression level and proline accumulation in the sensitive and tolerant wheat cultivars under control and drought stress conditions in the presence/absence of silicon and salicylic acid. Journal of Plant Interactions 3(1): 461-471.
Manivannan, P., Abdul Jaleel, C., Somasundaram, R. and Panneerselvam, R. (2008) Osmoregulation and antioxidant metabolism in drought-stressed Helianthus annuus under triadimefon drenching. Comptes Rendus Biologies 331: 418-425.
Missihoun, T. D., Schmitz, J. Klug, R., Kirch, H. H. and Bartels, D. (2011) Betaine aldehyde dehydrogenase genes from Arabidopsis with different sub-cellular localization affect stress responses. Planta 223: 369-382.
Nanjo, T. and Yoshiba, Y. (1999) Biological functions of proline in morphogenesis and osmotolerance revealed in antisense transgenic Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 18(2): 185-193.
Nasibi, F. (2011) Effect of different concentrations of sodium nitroprusside (SNP) pretreatment on oxidative damages induced by drought stress in tomato plant. Iranian Journal of Plant Biology 13(9): 63-74.
Noiraud, N., Delrot, S. and Lemoine, R. (2000) The sucrose transporter of celery: Identifcation and expression during salt stress. Plant Physiology 122: 1447-1456.
Orcutt, D. M. and Nilsen, E. T. (2000) The physiology of plants under stress. Soil and biotic Factors. John Wiley & Sons, Inc., New York.
Ort, D. R. (2001) When there is too much light. Plant Physiology 125: 29-32.
Parida, A. K., Dagaonkar, V. S., Phalak, M. S. and Auramgabadkar, L. P. (2013) Alterations in photosynthetic pigments, protein and osmotic components in cotton genotypes subjected to short-term drought stress followed by recovery. Plant Biotechnology Reports 1: 37-48.
Pei, Z. F., Ming., D. F., Liu, D., Wan, G. L., Geng, X. X., Gong, H. J. and Zhou, W. J. (2010) Silicon improves the tolerance to waterdeficit stress induced by polyethylene glycol in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Journal of Plant Growth Regulation 29(1): 106-115.
Pilon, C., Soratto, R. P. and Moreno, L. A. (2013) Effects of soil and foliar application of soluble silicon on mineral nutrition, gas exchange, and growth of potato plants. Crop Science 53: 1605-1614.
Porra, R. J., Thomposon, W. A. and Kiedelman, P. E. (1989) Determination of accurate extraction simultaneously equation for assaying cholorophyll a and b extracted with different solvents: Verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta 975: 384-394.
Quan, R. D., Shang, M. and Zhang, H. (2004) Improved chilling tolerance by transformation with beta gene for the enhancement of glycinebetaine synthesis in maize. Plant Science166: 141-149.
Rahdari, P., Hoseini, S. M. and Tavakoli, S. (2012) The studying effect of drought stress on germination, proline, sugar, lipid, protein and chlorophyll content in Purslane (Portulaca oleraceae L.) leaves. Journal of Medicinal Plant Research 6(9): 1539-1547.
Razavizadeh, R., Farahzadianpoor, F., Adabavazeh, F. and Setsuko, K. (2019) Physiological and morphological analyses of Thymus vulgaris L. in vitro cultures under polyethylene glycol (PEG)-induced osmotic stress. Cellular and Developmental Biology 55: 342-357.
Siddiqui, M. H. and Al-Whaibi, M. H. (2014) Role of nano- SiO2 in the germination of tomato (Lycopersicum esculentum Mill). Saudi Journal of Biological Sciences 21(1): 13-17.
Saadatmand, M. and Enteshari, Sh. (2012) Effect of long-term silicone pioneering effect on salinity tolerance in Iranian borago (Echium amoenum Fisch & C.A. mey). Greenhouse Science and Technology 3(12): 45-56.
Sio-Se Mardeh, A., Gholami, S., Bahramnejad, B., Kanouni, H. and Sadeghi, F. (2014) Effect of drought stress on compatible osmolytes content, enzyme activity and grain yield in chickpea (Cicer arietinum L.) genotypes. Iranian Journal of Crop Sciences 16(2): 109-124 (in Persian).
Soha, E., Khalil Nahed, G., El-Aziz, A., Bedour, H. and Abou, L. (2010) Effect of water stress, ascorbic acid and spraying time on some morphological and biochemical composition of Ocimum basilicum plant. Journal of American Science 6(12): 33-44.
Somogy, M. (1952) Notes on sugar determination. Journal of Biological Chemistry 195: 19-29.
Tale-Ahmad, S. and Haddad, R. (2011) Study of silicon effects on antioxidant enzyme activities and osmotic adjustment of wheat under drought stress. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 47: 17-27.
Talebi, R., Ensafi, M. H., Baghbani, N., Karami, E. and Mohammadi, K. H. (2013) Physiological responses of chickpea (Cicer arietinum) genotypes to drought stress. Environmenatal and Experimental Biology 11: 9-15.
Torabi, F., Majd, A. and Enteshari, Sh. (2013) Investigation of the effect of silicon on some anatomical and physiological parameters of )Borago officinalis L.( in hydroponic conditions. Journal of Cell and Tissue 4(3): 275-285.
Vivancos, J., Labbe, C., Menzies, J. G. and Belanger, R. R. (2015) Silicon-mediated resistance of Arabidopsis against powdery mildew involves mechanisms other than the salicylic acid (SA)-dependent defense pathway. Molecular Plant Pathology 16: 572-582.
Wagner, G. J. (1979) Content and vacuole/extra vacuoles distribution of neutral sugars, free amino acid, and anthocyanins in protoplast. Plant Physiology 64: 88-93.
Yang, X., Liang, Z. and Lu, C. (2005) Genetic engineering of the biosynthesis of glycine betaine enhances photosynthesis against high temperature stress in transgenic tobacco plants. Plant Physiology 138: 2299-2309.
Yarmohammadi, V. A., Sajedi, N. A., Mirzakhan, M. and Sibi, M. (2011) Effect of water stress and application of zeolite and animal manure on potatos. The Proceedings of National Congress on Sterategy of Obtain to Sustainable Agriculture. Payam noor University, Khouzestan Branch, Iran (in Persian).
Yin, L., Wang, S., Li, J., Tanaka, K. and Oka, M. (2013) Application of silicon improves salt tolerance through ameliorating osmotic and ionic stresses in the seedling of Sorghum bicolor. Acta Physiology Plant 35: 3099-3107.
Zangishei, Z. and Salari, H. (2016) Monitoring the expression pattern of GeNES coding betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) enzymes in Arabidopsis under drought stress. Modern Genetics Journal 11(3): 349-365.
Zare, H. R., Ghanbarzadeh, Z., Behdad, A. and Mohsenzadeh, S. (2015) Effect of silicon and nanosilicon on reduction of damage caused by salt stress in maize (Zea mays) seedlings. Iranian Journal of Plant Biology 26(7): 59-74.
Zhu, Y. and Gong, H. (2014) Beneficial effects of silicon on salt and drought tolerance in plants. Agronomy for Sustainable Development 34: 455-472.