Authors
1 Department of Biology, Tehran Payame Noor University, Tehran, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Sceinces, University of Guilan, Rasht, Iran
Abstract
Keywords
پلی فنل اکسیدازها (Polyphenol Oxidases: PPOs) دسته وسیع و مهمی از متالو پروتئین‌ها هستند با شماره کمیته آنزیمی (EC .1 .14 .18 .1) که واکنش تبدیل هیدروکسی فنل‌ها را به مشتقات کوئینون کاتالیز می‌کنند (Van Gelder et al., 1997). اورتو کوئینون‌ها به شدت واکنش‌گر و ناپایدار بوده، متعاقبا با خودشان، آمینو اسیدها یا پروتئین‌ها، فنل‌ها و دیگر ترکیبات سلولی اتصال عرضی برقرار می‌کنند و سبب ایجاد پلیمرهای غیر همگون قرمز، سیاه و قهوه‌ای می‌شوند. تشکیل رنگدانه‌های قهوه‌ای به وسیلة آنزیم پلی فنل اکسیداز، یکی از مهمترین واکنش‌هایی است که در انسان و برخی جانوران عالی موجب کدر و لکه‌دار شدن پوست (Del Marmol and Beermann, 1996)| و در گیاهان موجب تغییر رنگ آنها شده، عامل از دست رفتن کیفیت در بیشتر غذاهاست (Fraignier, 1995). بنابراین، بررسی انواع، ویژگی‌های مربوطه و بازدارنده‌های این آنزیم می‌تواند از نظر اقتصادی و همچنین از جنبه‌های تحقیقاتی حایز اهمیت زیادی باشد
(Espin and Witchers, 1999; Espin et al., 1999; Espin et al., 2000a). تشکیل کوئینون در محصولات کشاورزی بسیار اهمیت دارد و این امر مهمترین علت تمایل گسترده و روز افزون دانشمندان برای مطالعه ویژگی‌های پلی فنل اکسیداز است. پلی فنل اکسیدازها دارای سه نوع فعالیت شناخته شده هستند که عبارتند از: فعالیت‌های کاتکولاز، لاکاز و کرسولاز (Garcia-Borron and Solano, 2002). آنزیم تایروزیناز حداقل دو نوع واکنش را کاتالیز می‌کند که در هر دو نوع واکنش از اکسیژن مولکولی و ترکیبات فنلی به عنوان سوبسترا استفاده می‌کند. این واکنش‌ها عبارتند از هیدروکسیله کردن منوفنل‌ها به ارتو- دی فنل‌ها (فعالیت مونو فنلاز یا کاتالاز) و اکسیده کردن ارتو- دی فنل‌ها یا پارا- دی فنل‌ها به ارتو- کوئینون (فعالیت دی فنلاز یا کاتکولاز). شکل 1 این دو نوع واکنش را در حضور تایروزین به عنوان سوبسترا نشان داده است.
شکل 1- فعالیت کرسولازی و کاتکولازی آنزیم تایروزیناز (Julivet et al., 1998)
چنانکه در شکل 1 ملاحظه می‌شود، در هر دو واکنش فوق اکسیژن ملکولی نقش کمک کننده سوبسترا را دارد. در واقع، آنزیم تایروزیناز یک آنزیم دو سوبسترایی است و این که چگونه یک سیستم آنزیمی قادر است هر دو فعالیت مونو و دی فنل اکسیدازی را انجام دهد، تا مدت‌ها نامشخص و موضوع تحقیق برخی دانشمندان بوده است (Friedman and Daron, 1977).
آنزیم تایروزیناز برای استفاده تحقیقاتی در صنایع دارویی و آرایشی کاربرد فراوان داشته، در هر حال، برای اغلب کاربردهای فوق، منبع آنزیم مذکور تایروزیناز قارچ خوراکی (Nakamura et al., 1966; Strothkamp et al., 1976) | و یا سایر قارچ‌ها است ( Fan et al., 2004)، ولی در حد تحقیقاتی نیز تاکنون این آنزیم را از منابع گوناگون جانوری (Garcia Borron et al., 1985; Kwon et al., 1987) | و گیاهی مانند سیب‌زمینی (Matheis and Belitz, 1977) | و توتون (Sariri et al., 2007) و یا میوه‌ها مانند هلو (Wong et al., 1971)، گلابی (Espin et al., 2001) و سیب (Rocha and Morais, 2001) استخراج نموده و خواص آن را بررسی کرده‌اند. از طرف دیگر، مطالعات در مورد سینتیک واکنش آنزیم و اثر کننده‌های آن نیز بیشتر در مورد تایروزیناز قارچ بوده است (Hsu et al., 2007; Chen et al., 2003). این در حالی است که آنزیم تایروزیناز موجود در حبوبات کمتر مطالعه شده است. جستجو در مورد وجود و یا بررسی آنزیم تایروزیناز در میان حبوبات به یافتن تنها یک گزارش قدیمی (Miller, 1929)| برای استخراج آنزیم تایروزیناز کم محلول از برگ‌های پهن نوعی لوبیا انجامید. از طرفی، چند مقاله جدید نیز در مورد حبوباتی، از قبیل باقلا (Waliszewski et al., 2009; Paul and Gowda, 2000) | و جوانه نخود (Marcio and Fabricio, 2008) اخیرا چاپ شده است. در هر صورت، بر اساس بررسی‌های انجام شده توسط گروه ما، تاکنون در مورد پلی فنل اکسیداز بادام‌زمینی تحقیقات کمتری صورت گرفته است.
بادام‌زمینی با نام علمی Arachis Hypogaea گیاهی است از تیره نخود (Leguminosae)، کوتاه و یک ساله که، چنانچه در ناحیه‌های فاقد یخبندان باشد، ظرفیت چند ساله شدن را دارد. میوۀ بادام‌زمینی به طول تقریبی 4 سانتی‌متر بوده، در یک پوسته شکننده به رنگ خاکستری مایل به زرد قرار دارد. بر روی پوسته یک تا سه برجستگی مشاهده می‌شود که هر یک محل دانه‌ها را نشان می‌دهد. دانه بادام‌زمینی تقریبا مانند فندق به رنگ سفید مایل به زرد بوده ولی تخم‌مرغی شکل است. پوسته نازکی دانه را پوشانده که به رنگ قرمز قهوه‌ای است. بادام‌زمینی در طب قدیم ایران برای تقویت ریه و طحال، افزایش کلسترول خوب خون، کاهش درد معده و ناراحتی‌های گوارشی، بر طرف کردن سرفه خشک، ازدیاد شیر در مادران شیرده، به عنوان ملین و تقویت قوای دماغی مفید استفاده می‌شده است. به علاوه، برخی خواص دیگر این گیاه دارویی نیز مورد توجه و مطالعه قرار گرفته است که از جمله آنها بررسی خواص آنتی‌اکسیدانتی در پوسته آن (Lou et al., 2004) | را می‌توان نام برد.
هدف
از آنجایی که بادام‌زمینی از محصولات مهم کشاورزی استان گیلان بوده، با توجه به تجربه و تخصص گروه ما در دانشگاه گیلان در مورد تایروزیناز، عزم بر این شد که آنزیم این گیاه بررسی و با منابع دیگر مقایسه شود. به علاوه، بر اساس تحقیق از تولید کنندگان محلی و مشاهدات و بررسی‌های طولانی مدت توسط نویسندگان، مشخص شده است که بادام‌زمیتی دارای عمر کوتاهی بوده، بررسی ارتباط عمر بادام با میزان آنزیم تایروزیناز، در بازار پسند تمودن محصول و افزایش بهره‌وری می‌تواند موثر باشد. بنابراین، به نظر می‌رسد که تولید فرآورده‌های بادام‌زمینی، از قبیل روغن، کره و یا استخراج مواد بیوشیمیایی مهم آن، مانند تایروزینازبتواند در این منطقه از کشور سبب تحول اقتصادی گردد. با توجه به فاکتورهای ذکر شده، هدف این تحقیق استخراج آنزیم تایروزیناز از انواع بادام‌زمینی تازه و یک ساله و بررسی خصوصیات آن در مقایسه با تایروزیناز قارچ- که مصرف تجاری فراوانی دارد- بوده است.
روش کار
عصاره‌گیری از دانه بادام‌زمینی
دانه‌های سالم و بدون پوست بادام‌زمینی، ابتدا درون یک هاون چینی تمیز کمی خرد و سپس با استفاده از نیتروژن مایع به صورت پودر درآورده شدند. در مرحله بعدی، 5/0 گرم از پودر حاصل در 1000 میکرولیتر بافر استخراج (بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 8/6 pH=همراه با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید 1 میلی‌مولار) به مخلوط تبدیل و مدت 15 دقیقه در rpm 14000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ گردید. محلول رویی جدا شده، دوباره به مدت 5 دقیقه در rpm14000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ گردید. سپس محلول رویی حاوی آنزیم پلی فنل اکسیداز به آرامی با سمپلر برداشته و در میکروتیوب‌های جدید ریخته شد.
رسوب‌گیری با سولفات آمونیم
برای رسوب دادن پروتئین‌ها از سولفات آمونیوم 85 درصد استفاده شد. نمونه‌های استخراجی درون استوانه مدرج ریخته شد و روی همزن مغناطیسی قرار گرفت و با قرار دادن در یخچال، سولفات آمونیوم طی شش مرحله 10 دقیقه‌ای به محلول پروتئینی افزوده شد. بعد از انحلال کامل سولفات آمونیوم، محلول در دمای °C 4 و با دور rpm 5000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس محلول رویی دور ریخته شد و رسوب پروتئینی در حداقل بافر فسفات حل گردید.
دیالیز
دیالیز با استفاده از کیسه دیالیز با اتدازه منافذ 12 کیلو دالتون جهت حذف نمک آمونیوم سولفات از رسوب پروتئینی و همچنین جدا کردن پروتئین‌هایی با اوزان مولکولی بیشتر از 12 کیلو دالتون انجام شد. پس از آماده‌سازی کیسه‌ها، دیالیز در بافر فسفات (50 میلی‌مولار با 8/6 pH=) بر روی استیرر در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با سه بار تعویض بافر انجام شد (Scotter et al., 2006).
تخلیص تیروزیناز
برای تخلیص آنزیم تیروزیناز از کروماتوگرافی تبادل آنیونی استفاده شد. برای انجام این کار از دستگاه FPLC مدلBIORAD و ستون(UNO-Q1) که فاز ثابت (رزین) آن Q- سفاروز بود، استفاده شد. برای انجام این کروماتوگرافی، از دو نوع بافر A و B استفاده شد و سرعت جریان (Flow Rate) بافر یک میلی‌لیتر در دقیقه تنظیم گردید. بافر A شامل تریس با غلظت 20 میلی‌مولار
2/7 pH= و بافر B متشکل از تریس با غلظت 20 میلی‌مولار و NaCl یک مولار 2/7 pH= است. پس از انجام کروماتوگرافی، فعالیت آنزیم تیروزیناز در فراکشن‌های هر پیک سنجیده شده، فراکشن‌هایی که حاوی آنزیم پلی فنل اکسیداز بودند برای انجام مراحل بعدی در دمای °C 20- منتقل شدند.
تغلیظ به روش اولترافیلتراسیون
با توجه به اینکه نمونه پروتئین خارج شده از FPLC رقیق شده، جهت تشخیص میزان خلوص، بر روی ژل SDS-PAGE قابل رؤیت نخواهد بود، بنابراین، بعد از انجام کروماتوگرافی تبادل یونی فراکشن‌های حاوی آنزیم تایروزیناز که با سنجش فعالیت آنزیمی مشخص شده بودند، به‌وسیله روش اولترافیلتراسیون با میکروتیوب سنتریکون تغلیظ گردید. برای تغلیظ در این روش از سانتریفیوژ با سرعت چرخش rpm 12000 در دمای °C 4 به مدت 10 دقیقه استفاده شد.
سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز SDS -PAGE
به منظور مشاهده ایزوفرم‌های آنزیم پلی فنل اکسیداز (PPO) و میزان خلوص آنزیم از عمل الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید 12% استفاده شد. الکتروفورز
SDS-PAGE از نمونه‌های تغلیظ شده پس از انجام کروماتوگرافی تبادل آنیونی انجام گردید. پس از انجام الکتروفورز، ژل حاصل با روش کوماسی بریلیانت بلو
G-250 رنگ‌آمیزی گردید.
سنجش فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز
برای سنجش فعالیت آنزیم از سوبسترای دوپامین هیدروکلراید با غلظت 55 میلی‌مولار، 3- متیل- 2- بنزوتیازولینون هیدرازون(Merek) (MBTH) با غلظت 5 میلی‌مولار، دی متیل فرم آمید (DMF) 2 درصد حجمی و اسید فسفریک 08/0 درصد حجمی و بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 8/6pH= استفاده شد (Sanchez-Ferrer, 1988). محلول سوبسترا به شدت، نسبت به نور حساس است، بنابراین، باید از تابش نور به آن جلوگیری نموده، در درون ظرف تیره نگهداری شود. با توجه به ناپایدار بودن این سوبسترا می‌باید برای هر نوبت سنجش فعالیت آنزیمی، محلول سوبسترای تازه تهیه نمود. محیط سنجش یک میلی‌لیتری حاوی Lμ990 سوبسترا و Lμ10 آنزیم (نمونه استخراجی) است. تغییرات جذب بر روی زمان در طول موج 505 نانومتر در مقابل بلانک حاوی Lμ 990 سوبسترا و Lμ10 بافر استخراج، بررسی شد.
محاسبه Km وVmax
برای این آزمایش غلظت‌های 5/12، 25، 50، و75 میلی‌مولار از سوبسترای تایروزیناز تهیه شد. سوبسترای اصلی تایروزیناز دوپامین هیدروکلراید بود و نمونه آنزیمی بعد از FPLC جهت محاسبه Km و Vmax با سه بار تکرار استفاده شد.
محاسبه دمای بهینه
ابتدا رقت مناسب نمونه آنزیمی تهیه شد و سپس در 7 میکروتیوب 40 میکرولیتر از آنزیم با رقت مناسب ریخته شد. ابتدا یکی از میکروتیوب‌ها در دمای 10 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه قرار داده شده و سپس سنجش آنزیمی سه بار انجام گردید. میکروتیوب دوم در دمای 20 درجه به مدت20 دقیقه در بن ماری قرارداده شد و مانند روش قبل سه بار سنجش آنزیمی روی آن انجام گرفت و به همین ترتیب، برروی مابقی میکروتیوب‌ها دمای 30، 40، 50، 60 و 70 درجه با مدت زمان 20 دقیقه اعمال نموده، مورد سنجش قرارگرفتند. سپس با مقادیر جذب‌های به‌دست آمده، از طریق رسم نمودار در برنامه Excel میزان دمای بهینه فعالیت آنزیم محاسبه گردید.
اندازه‌گیری pHبهینه
برای تعیین pH بهینه آنزیم ابتدا با استفاده از منوهیدروژن دی سدیم فسفات، سیتریک اسید و آب دیونیزه، بافرهایی با pHهای مشخص تهیه شدند ( جدول 1) و سپس فعالیت آنزیمی نمونه‌ها با استفاده از سوبسترای دوپامین هیدروکلرید طبق روش فوق حداقل 3 بار در هر یک از این بافر‌ها اندازه‌گیری شد.
تعیین غلظت پروتئین و محاسبه فعالیت ویژه
برای تعیین غلظت پروتئین از روش برادفورد استفاده شد. بعد از هر مرحله جدا سازی،تغلیظ وتخلیص، غلظت پروتئین محاسبه شد وهمچنین در هر مرحله از جداسازی، تغلیظ وتخلیص، فعالیت پلی فنل اکسیداز در یک مخلوط سنجش یک میلی‌لیتری با روش اسپکتروفتومتری از طریق اندازه‌گیری افزایش جذب در طول موج 505 نانومتر در یک دوره زمانی 2 دقیقه‌ای بررسی گردیده، فعالیت ویژه پروتئین در هر مرحله به‌دست آمد (Mayer and Staples, 2002).
زایموگرام تایروزیناز
به منظور انجام زیموگرام از روش Native gel electrophoresis استفاده شده است. بافرهای مورد نیاز در این نوع الکتروفورز، همانند بافرهای مربوط در روش SDS-PAGE بوده؛ با این تفاوت که در اینجا SDS به کار برده نشد. نمونه‌ها بدون اعمال حرارت در ته چاهک بارگذاری شدند و شرایط دمای 4 درجه سانتی‌گراد برای نمونه‌ها در تمامی مراحل آزمایش فراهم گردید تا فعالیت آنزیم حفظ گردد. ولتاژ دستگاه نیز روی 100 تنظیم شد. بعد از اتمام الکتروفورز ژل در محلول سوبسترای آنزیم غوطه‌ور و جهت رنگ‌آمیزی در شرایط دمایی °C 4 قرار داده شد. در ابتدا، دوپامین به سوبسترا اضافه نشد و 15 دقیقه ژل در سوبسترای بدون دوپامین قرار گرفت و سپس در چند مرحله دوپامین به آن اضافه گردید. با این کار، از شدت رنگ گرفتن ژل (با رنگ‌آمیزی به روش روش کوماسی بریلیانت بلو G-250) جلوگیری شد. ژل در محلول سوبسترا به مدت 12-10 ساعت قرار گرفت. بر اثر واکنش بین آنزیم با سوبسترا باندهای پروتئین تایروزیناز گرفته، پس از ظهور اولیه باند به منظور کاهش رنگ‌پذیری ژل بافرفسفات بیشتری به سوبسترا اضافه گردید.
جدول 1- روش تهیه بافر با pHهای مختلف استفاده شده برای تعیین pH بهینه آنزیم
|
آب دیونیزه (میلی‌لیتر) |
منوهیدروژن دی سدیم فسفات (میلی‌لیتر) |
سیتریک اسید (میلی‌لیتر) |
pH |
|
10 |
40 |
0 |
2/9 |
|
13 |
50 |
1 |
1/8 |
|
22 |
68 |
20 |
1/7 |
|
15 |
40 |
20 |
1/6 |
|
10 |
20 |
20 |
2/5 |
|
5/7 |
10 |
20 |
9/3 |
|
10 |
0 |
40 |
5/2 |
نتایج
در پایان هر مرحله هموژنیزاسیون، رسوب‌دهی و تخلیص پروتئین، مقدار پروتئین توتال، فعالیت آنزیمی توتال و فعالیت ویژه تایروزیناز، درجه تخلیص و میزان راندمان کار محاسبه گردید (جدول 2). با توجه به داده‌های جدول 2 ملاحظه می‌شود که با افزایش میزان تخلیص به حدود 7 برابر مقدار شروع عمل، فعالیت ویژه آنزیم تایروزیناز نیز به همین مقدار افزایش یافته است و این امر نشان‌دهنده راندمان بسیار خوب عمل خالص‌سازی است. از طرفی، با توجه به وجود دو باند مجزا در ژل زایموگرام الکتروفورز پلی آکریل آمید (شکل 2)، حضور دو ایزوفرم برای آنزیم پلی فنل اکسیداز بادام‌زمینی پیش‌بینی می‌شود.
به منظورتعیین میزان تخلیص، فراکشن‌های تغلیظ شده حاوی آنزیم پلی فنل اکسیداز بعد از مرحله کروماتوگرافی تبادل آنیونی با استفاده از بافرهای احیایی و غیر احیایی الکتروفورز SDS-PAGE با استفاده از ژل 12% انجام و ژل حاصل با کوماسی آبی جی-250 رنگ آمیزی شد (شکل 3).
بررسی فعالیت آنزیم در دماهای مختلف نشان داد که دمای بهینه فعالیت آنزیم در حدود °C40 با تغییراتی در محدوده یک درجه است (شکل 4). از طرفی، فعالیت آنزیم در pHهای اسیدی بالاتر از قلیایی بود و سنجش فعالیت آنزیم در بافرهایی با pHهای مختلف نشان داد که pH بهینه فعالیت آنزیم 2/5 است (شکل 5).
جدول 2- تغییرات فعالیت کل و فعالیت ویژه آنزیم پلی فنل اکسیداز در مراحل مختلف جداسازی
|
میزان تخلیص |
راندمان |
فعالیت ویژه µmol/min mg |
فعالیت کل µmol/min |
پروتئین کل mg/mL |
ΔA/min |
|
|
1 |
100 |
004/0 |
138/0 |
5/34 |
237/0 |
هموژنیزاسیون
|
|
025/2 |
27/24 |
0081/0 |
335/0 |
86/40 |
287/0 |
بعد از جداسازی نمکی |
|
925/6 |
52/11 |
027/0 |
0159/0 |
573/0 |
136/0 |
بعدازکروماتوگرافی تبادل آنیونی |
شکل 2- زیموگرام حاصل از تایروزیناز بادام‌زمینی. استاندارد (مارکر پلی فنل اکسیداز) دارای وزن مولکولی 58 کیلو دالتون است.
شکل 3- الکتروفورگرام حاصل از عمل الکتروفورز SDS-PAGE بعد از انجام کروماتوگرفی آنیونی.
نمونه سمت راست مربوط به مارکر وزن مولکولی است.
|
شکل 4- نمودار اثردما برآنزیم پلی فنل اکسیداز
|
شکل 5- نمودار تعیین pH بهینه آنزیم پلی فنل اکسیداز بادام‌زمینی
|
پارامترهای سینتیکی، Km و Vmax برای آنزیم پلی فنل اکسیداز بادام با استفاده از نمودار لینویور برک (شکل 6) به دست آمدند که عبارت بودند از:
Km = 257.5 mmol
Vmax = 0.00421 mmol/min
شکل6- نمودار لینویور برک فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز
نتیجه‌گیری و بحث
بر اساس بررسی‌های انجام شده، با آن که آنزیم تایروزیناز از برخی میوه‌ها و سبزی‌ها جدا سازی و تخلیص شده (Rast et al., 2003; Marques et al., 1995; Marcio and Fabricio, 2008)، ولی تاکنون در مورد پلی فنل اکسیداز بادام‌زمینی گزارشی موجود نبود. در این تحقیق، نتایج خالص‌سازی پروتئین با FPLC با استفاده از دتکتور ماورای بنفش 3 فراکشن جداسازی شد. هر کدام از این پیک‌ها مربوط به پروتئین‌هایی هستند که در حدود درصدهای خاصی از بافر B از ستون جدا شده‌اند. در فراکشن‌های جمع‌آوری شده سنجش فعالیت آنزیمی تایروزیناز به عمل آمد. در فراکشن‌های 1 و2 فعالیت پلی فنل اکسیدازی مشاهده شد. فراکشن اول در ناحیه با گرادیان صفر بافر B قرار دارد که آنزیم این ناحیه با ستون اتصال برقرار نکرده است، بنابراین، در فراکشن دوم آنزیم جداسازی شده است و از آنجایی که در این فراکشن درصد بافر نمکی کم بوده است، بنابراین، نتیجه می‌شود که بار منفی روی سطح پروتئین ناچیز بوده است، زیرا با توجه به جنس ماتریکس، هر چه پروتئین مورد نظر بار منفی بیشتری داشته باشد، محکم‌تر به ماتریکس متصل می‌شود و برای جدا شدن آن به درصد بالاتری از بافر B نیاز است. از طرفی، سنجش آنزیمی در فراکشن سوم نشان داد که این قسمت فاقد فعالیت پلی فنل اکسیدازی بود. در مرحله بعد، فراکشن دوم حاوی آنزیم پلی فنل اکسیداز توسط روش اولترافیلتراسیون با میکروتیوب سنتریکون که فقط پروتئین‌هایی با وزن ملکولی 30 کیلو دالتون را از خود عبور می‌داد، تغلیظ شد. سپس از هر دو نمونه بالا و پایین صافی سنجش فعالیت آنزیمی صورت گرفت و مشخص شد تنها محلول روی صافی فعالیت پلی فنل اکسیدازی دارد و بنابراین، از آن برای مراحل بعدی استفاده شد.
به منظور مشاهده حضور پلی فنل اکسیداز، الکتروفورز ژل پلی آکریلامید PAGE در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انجام شد و پس از اتمام الکتروفورز، ژل در مجاورت سوبسترا قرارگرفت و در نهایت، باندهای پروتئینی آن ظاهر شد. مارکر مورد استفاده تیروزیناز قارچ Agaricus bisporus با وزن ملکولی 58 کیلو دالتون بود (شکل 3). از آنجایی که آنزیم در فرم ساختمانی کامل خود با سوبسترا واکنش می‌دهد، بنابراین وجود دو باند در ژل ممکن است نشان دهنده حضور دو ایزوفرم مختلف آنزیم پلی فنل اکسیداز در بادام‌زمینی باشد. موقعیت باندهای ظاهرشده بالاتر از باندهای مربوط به تایروزیناز قارچ است. بنابر این، وزن ملکولی تایروزیناز استخراج شده از بادام‌زمینی شمال کشور، اندکی بیشتر از 58 کیلودالتون است. برای تعیین دقیقتر وزن مولکولی آنزیم استخراج شده، در مرحله بعدی الکتروفورز -PAGE SDS از این نمونه‌ها در حضور بافر نمونه‌های احیایی وغیر احیایی انجام گرفت و با روش کوماسی بلو شد. درا ژل الکتروفورز PAGE حاصل جایگاه باندهای آنزیم پلی فنل اکسیداز مشخص است (شکل 3). چنانکه در این شکل ملاحظه می‌گردد، باندهای همردیف مارکر با وزن ملکولی 2/66 کیلو دالتون متعلق به آنزیم پلی فنل اکسیداز بادام‌زمینی هستند. وزن مولکولی تایروزیناز استخراج و تخلیص شده از انواعی قارچ به نام Portabella mushrooms حدود 70 کیلو دالتون گزارش شده است که اندکی بیشتر از آنزیم بادام‌زمینی است (Fan and Flurkey, 2004).
دمای بهینه فعالیت برای این آنزیم 40 درجه سانتی‌گراد به دست آمد (شکل4 )، این مقدار مشابه با دمای بهینه آنزیم‌های تایروزیناز گیاهی، مانند توتون (Sariri et al., 2007 | و یا هلو (Wong, et al. 1971)، گلابی (Espin et al., 2001) | و سیب (Rocha and Morais, 2001) است. شکل 4 نشان می‌دهد که دمای 30-50 درجه بهترین محدوده دمایی برای فعالیت آنزیم است و از طرفی، آنزیم تایروزیناز بادام‌زمینی در دماهای پایین تر از دمای بهینه در مقایسه با دماهای بالاتر از دمای بهینه فعالیت بیشتری نشان می‌دهد؛ به طوری که در دمای حدود 70 درجه سانتی‌گراد فعالیت آن تا حدود 50% کاهش می‌یابد.
از طرفی، pH بهینه آنزیم استخراج شده از بادام‌زمینی در حدود 2/5 تعین گردید (شکل 5). این نوع رفتار در مقابل pH در مقایسه با برخی تایروزینازهای گیاهی گزارش، اندکی تفاوت دارد. برای مثال، pH بهینه آنزیم پلی فنل اکسیداز گوجه فرنگی در محدوده کمی قلیایی است (Thipyapong and Steffen, 1997). از طرفی، آنزیم پلی فنل اکسیداز در نوعی لوبیا به نام Vanilla bean دارای pH بهینه در محدوده قلیایی (حدود 8-10) است (Waliszewski, et al., 2009)، ولی چنانکه ملاحظه می‌شود، pH بهینه آنزیم استخراج شده از بادام‌زمینی در محدوده اسیدی است که دال بر فعالیت بیشتر آنزیم در محیط‌های اندکی اسیدی در مقایسه با محیط‌های قلیایی است. این رفتار را می‌توان تا حدی بر اساس تغییر ماهیت ساختمان پروتئینی آنزیم در نواحی نزدیک به جایگاه فعال توجیه نمود. با توجه به شکل 5 ملاحظه می‌شود که آنزیم تایروزیناز بادام‌زمینی در محیط‌های اندکی قلیایی تا قلیایی متوسط (pHهای 7/2 تا 10) حدود 60% فعالیت خود را از دست داده است و این در حالی است که در محیط اسیدی (pHهای 4 تا 5) بیش از 80% فعالیت آنزیمی خود را حفظ نموده است. حفظ درصد بیشتری از فعالیت بیولوژیک آنزیم در محیط‌های اسیدی در مقایسه با محیط‌های قلیایی، می‌تواند نشان‌دهندة تغییرات ساختمانی در اطراف جایگاه فعال آنزیم در محیط‌های قلیایی و مقاومت در مقابل محیط اسیدی باشد. مقادیر دما و pH بهینه یک آنزیم می‌توانند معیار مناسبی برای سنجش پایداری و یا حساسیت آن بوده، در نتیجه، تصمیم گیری در مورد کاربردهای طبیعی و صنعتی آن جنبه‌های علمی‌تری پیدا خواهند نمود.
مطالعات سینتیکی نشان داد که در غلظت‌های متفاوت سوبسترای دوپامین هیدروکلراید میزان Km و Vmax برای آنزیم پلی فنل اکسیداز به ترتیب mmol5/257 و mmol/min00421/0 محاسبه شد (شکل 6).
در یک سری تحقیقات موازی، از دانه تفت داده بادام‌زمینی نیز توسط نیتروژن مایع عمل استخراج انجام گرفت و سپس مانند حالت قبل مورد سنجش فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز قرارگرفت، ولی این بار هیچ فعالیتی مشاهده نشد که نشان‌دهندة غیر فعال شدن آنزیم پلی فنل اکسیداز در طی فرآیند به عمل‌آوری بادام‌زمینی است. بررسی‌های محلی نشان‌دهنده این واقعیت بودند که عمل فرآوری (تفت دادن) بادام‌زمینی در مرحله روی شن‌های داغ با دمای حدود 400 درجه سانتی‌گراد انجام می‌گیرد. قرار گرفتن محصول بادام‌زمینی حدود 6 ساعت در چنین شرایطی به احتمال زیاد سبب تغییر ماهیت بسیاری از پروتئین‌ها و کاهش و از بین رفتن فعالیت برخی آنزیم‌ها می‌گردد. در هر صورت، مانند بسیاری از اعمال فرآوری مواد غذایی، عمل تفت دادن این محصول با ارزش موجب مناسب‌تر شدن و بازار پسندتر شدن محصول و به بهای کاهش اندکی در کیفیت غذایی و ارزش‌های آنتی‌اکسیدانتی آن می‌گردد. چنین تغییراتی تحت شرایط موجود فرآوری مواد غذایی و در علوم تغذیه‌ای تا حدی اجتناب‌ناپذیر است و بهترین نظارت در این مورد، نمونه‌برداری و کنترل کیفیت محصول بسته‌بندی شده است.
از طرفی، مطالعات مشابه در مورد مقایسه فعالیت و سینتیک بادام‌زمینی تازه و یک یا دو سال کهنه شده نیز انجام شد که نتایج جالب توجهی در جهت اثر گذشت زمان روی فاکتورهای مختلف آنزیم روشن کرد. تحقیق مذکور راه تازه‌ای برای استفاده صنعتی و تحقیقاتی از بادام‌های تاریخ گذشته و ارزان قیمت پیشنهاد می‌کند و نتایج آن به زودی منتشر خواهد شد.
تشکر و قدردانی
همکاری مؤثر دانشگاه پیام نور تهران و دانشگاه گیلان شایان تشکر و قدردانی است.
)
