Electrophoretic changes and peroxidase activities in infected and uninfected Ahmadaghaii Pistachio Seedlings (Pistacia vera L.) with Aspergillus niger from Rafsanjan – Iran

گیاهان موجوداتی غیر متحرک هستند و به همین علت تحت تأثیر شرایط متغیر محیط، مانند خشکسالی، توفان، دمای بالا، غلظت بالای نمک، فلزات سنگین، تابش اشعه با شدت بالا و آلودگی با عوامل بیماری‌زا قرار می‌گیرند. بنابراین، باید متابولیت‌های لازم برای سازگاری با تنش‌های محیط را تولید کنند. بدین منظور، درگیاهان به طور طبیعی برنامة ژنتیکی برای تولید پروتئین‌های ویژه در برابر تحریکات تنش‌زا وجود دارد .برای مثال، بافت‌های غوطه‌ور گیاهان ضمن سنتز الکل دهیدوژناز (ADH) تشکیل اتانول را به همراه اکسیداسیون (NADH) کاتالیز می‌کنند و سبب ثابت ماندن سرعت گلیکولیز در سلول‌های بی‌هوازی می‌گردند (Ho and Sachs, 1989; Michell and Barrett, 2002).

گیاهان در برابر عوامل تنش‌زای زیستی پروتئین‌هایی با نام کلی پروتئین‌های وابسته به عامل بیماری‌زا (PRPs: Pathogen Related Proteins) تولید می‌کنند. این پروتئین‌ها به گروه‌های مختلفی تقسیم می‌شوند. تحقیقات نشان داده‌اند که اعضای یک تا پنج این پروتئین‌ها
(PRP1 - PRP5) فعالیت آنزیمی ندارند، ولی از PRP6 تا PRP11 همگی دارای خاصیت آنزیمی هستند و آنزیم پراکسیداز در خانواده PRP9 قرار دارد (Caruso et al., 1999; Chittoor et al., 1999; Van Loon and Vanstrien, 1999).

از جمله آنزیم‌هایی که بر اثر تنش‌های زیستی فعال می‌شود، پراکسیدازها هستند .دیوارة سلولی، یکی از اولین سطوح دفاع گیاه بر علیه حمله پاتوژن است و پراکسیداز‌ها نقشی کلیدی در فرآیند سنتز دیواره سلولی دارند. نخستین بار Schonbein در سال 1855 به وجود این دسته از پروتئین‏ها پی برد و Linossier در سال 1898 نام پراکسیداز را بر آن‏ها نهاد. پراکسیدازها، گلیکوپروتئین‌هایی واجد گروه هم هستند که به کمک پراکسید هیدروژن باعث انجام اکسیداسیون در بسیاری از سوبستراهای آلی و غیر آلی، مانند: سیتوکروم C، نیتریت، آسکوربیک‌اسید، ایندول آمین‌ها و یون‌های ید می‌گردند (Parida et al., 2004). این فرآیندها شامل اکسیداسیون هیدروکسی سینامیل الکل‌ها به همراه رادیکال‌های آزاد، اکسیداسیون فنل، واکنش چلیپایی پلی ساکاریدها ومونومرهای اکستنسین، چوبی و چوب پنبه‌ای شدن است. به‌طور کلی، مطالعاتی که به رسوب مواد قوی‌کنندة دیوارة سلولی و فعالیت‌های پراکسیدازی مرتبط‌اند، نشان می‌دهند که عملکرد این آنزیم‌ها در رابطه با استحکام دیوارة سلولی است. در زمان فعالیت پراکسیدازها، انواع اکسیژن فعال تولید می‌شود که بسیار سمّی است. از طرفی، این فعالیت ممکن است به عنوان یک پیام‌رسان برای ایجاد پاسخ‌های دفاعی از طرف گیاه عمل کند(Chittoor et al., 1999; Habib et al., 2003 Van Loon, 1982).

قارچ آسپرژیلوس، که یکی از گونه‌های آن، Aspergillus niger است، سبب بیماری کپک سیاه در میوه، دانه و سبزیجات می‌شود و یک آلوده‌کنندة معمول مواد غذایی است. بیماری زایی این قارچ در دانه‌های پسته به اثبات رسیده است. در کالیفرنیا گزارش شده است که این قارچ در دانه پسته، بیماری کپک دانه و پوست را ایجاد می‌نماید (Samson et al., 2001).

در آمریکا آفت ریشه و جوانه و انواع مختلف تخریب دانه و پوست پسته را به این قارچ نسبت داده‌اند. این قارچ‌ها در میوه‌های طبیعی که به وسیله حشرات و یا فشارهای مکانیکی زخمی شده‌اند، ایجاد بیماری می‌نمایند. میزان شیوع بیماری در میوه‌هایی که به طور طبیعی باز می‌شوند، بیش از میوه‌هایی است که زخمی شده‌اند (Themis, 2004). کلونی‌های این قارچ در محیط دکستروز آگار اسیدی (Acidified potato dextrose Agar) ابتدا سفید یا زرد رنگ‌اند. سپس به صورت یک لایة متراکم قهوه‌ای یا مشکی گسترش می‌یابند. دمای مناسب برای رشد 25 - 33 درجه سانتی‌گراد است. این قارچ دارای کاربردهای صنعتی متفاوت نیز است (Themis, 2004).

گیاه پسته از گیاهان مهم و اقتصادی جنوب ایران است که محصول آن علاوه بر ارزش غذایی بالا، اهمیت صادرات دارد. با توجه به اثبات بیماری‌زایی قارچ آسپرژیلوس در قسمت‌های مختلف گیاهان، در صورت آلوده شدن قسمت‌های خوراکی گیاه، خطر آلودگی در مغز پسته وجود خواهد شد. این قارچ می‌تواند موجب استرس در گیاه پسته شده، واکنش‌های پاسخی متناسب با آن مانند تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز را موجب شود. بنابراین، هدف از تحقیق حاضر، بررسی فعالیت آنزیمی در گیاهچه‌های در حال رشد پسته سالم و آلوده به قارچ آسپرژیلوس نیجر است.

مواد و روش‌ها

برای انجام کارهای عملی در این تحقیق، از دانه‏های پستة سالم و آلوده به قارچ در دوره‏های مختلف رشد، عصارة پروتئینی تهیه شد و سپس فعالیت ویژه آنزیمی بر حسب u/ml، به‌دست آمد. در انجام روش‌های عملی حداکثر دقت در استریل کردن دانه‏ها و استخراج پروتئین به عمل آمد تا نتایج واقعی به دست آمده و خطاهای احتمالی به حداقل برسند. برای اندازه‏گیری میزان فعالیت ویژه آنزیم پراکسیداز، ابتدا سوبسترای ترکیبی H₂O₂ و4- آمینو آنتی پیرین آماده شد و سپس میزان تغییرات جذب نوری در زمان‌های صفر و یک دقیقه پس از تلقیح آنزیم در طول موج 510 نانو متر محاسبه گردید.

دانه ‏های پستـه(Pistacia vera) از مرکز تحقیقات پسته رفسنجان تهیه شد. در این تحقیق، از ورمی کولیت خاک مانند (شرکت Shawa Mine) استفاده شد. به منظور جلوگیری از آلوده شـدن دانه‏های پسته، بستر ورمـی‏کولیت به مدت 20 دقیقه در دمـای ^C°120 اتـوکلاو شد. در درون ظروف مقاوم به حرارت با ارتفاع 14 سانتی‌متر، ورمی‌کولیت تا ارتفاع 2 تا 3 سانتی‌متر ریخته شد. به منظور آماده‌سازی دانه‌های پسته، ابتدا از پوسته سخت جدا و به ظرفی دیگر انتقال یافتند و سپس به آن آب اضافه شد. پس از گذشت 6 ساعت که دانه‏ها به اندازة کافی آب جذب کرده و متورم شدند، برای کشت آماده شده بودند. ظرف‏های کشت‌داده شده داخل دستگاه ژرمیناتـور (مدل GL60 شرکـت طراحی مهندسـی گروک) قـرار داده شد، تنظیـم دستگاه بـه تـرتیب زیـر انجام گرفت: در سیکل 1 (سیکل روز)، دما ^°C30 و رطوبت 25% و در سیکل 2 (سیکل شب)، دما ^°C27 و رطوبت 20% تنظیم شدند. تأمین نـور در دستگاه ژرمیناتور به کمک شش عدد لامپ مهتابـی30 وات صورت گرفت که در شرایط اول، از ماکزیمم نور به معنی روشن بودن همة لامپ‌ها و فقدان نور یا تاریکی برای شرایط دوم استفاده شد. به منظور آلوده‏سازی دانه‌های پسته ، محیط کـربوکسی متیل سلولز 2% (محلول در آب) تهیه و استریل شـد. سپس توسط لوپ فلزی زیر هود لامینار در شرایط کاملاً استریل، اسپور قارچ A. niger(تهیه شده از آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده علوم دانشگاه گیلان) به محیط افزوده شد. آنگاه دانه‏های پسته خیسانده و به محیط اضافه شد و به مدت نیم ساعت روی شیکر قرار گرفت. پس از طی مراحل فوق، پسته به طریق گفته شده، در روی ورمی کولیت و داخل ظروف ویژه کشت داده شد. از دانه‏های پسته در بازه‏های زمانی2، 4، 6، 8، 10 و 12 روز پس از کشت، هر بار به میزان پنج گرم از اندام هوایی و ریشه هر گیاهچه نمونه‌برداری شد. برای جداسازی آنزیم پراکسیداز، پنج گرم پسته وزن و 10 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 1/0 مولار، ۲/۷pH= به آن اضافه شد. مخلوط حاصل درون هموژنایزر کاملاً همگن شد. محلول به‌دست آمده در دمای ^°C 4 به مدت 20 دقیقه در 6500 دور (rpm) سانتریفیوژ شد. برای جلوگیری از افزایش دما هنگام عمل از سانتریفیوژ یخچال‌دار با دمای تنظیم شده روی ^°C 4 استفاده شد. سپس محلول رویی به ظرف جدید منتقل و رسوب دور ریخته شد (Mitchel and Barrett, 2002). در مورد دانه‌های آلوده به قارچ، پس از نمونه‌برداری ، باید دانه‌ها چندین مرتبه توسط آب مقطر استریل شستشو شود تا احتمال وجود قارچ و ترشحات خارج سلولی از بین برود. برای افزایش غلظت پروتئین در عصاره استخراجی، رسوب‌دهی پروتئین توسط آمونیوم سولفات 85% صورت گرفت. به هر ml 10 عصاره استخراج شده، 59/5 گرم نمک آمونیوم سولفات افزوده شد. به منظور جلوگیری از کاهش فعالیت آنزیمی، این مراحل باید در دمای ^°C 4 و با سرعت انجام شود (Habib et al., 2003). پس از آنکه نمک اضافه و حل شد، محلول به لوله منتقل و به مدت 20 دقیقه در در دمای^°C 4 و سرعت 5000 دور در دقیقه (rpm) سانتریفیوژ شد. سرانجام رسوب حاصل، پس از دور ریختن محلول رویی، دیالیز شد.

نحوة انجام دیالیز

الف- کیسه دیالیز (خریداری شده از شرکت پژوهش گستر خراسان) به قطر 4 و طول 20 سانتی‌متر برش داده شد و سپس در محلول حاوی NaHCO₃ 100 میلی‌مولار و EDTA 10 میلی‌مولار، که به نسبت مساوی (v/v) در ساخت محلول از آنها استفاده شده است، به مدت پنج دقیقه جوشانده شد.

ب- کیسه‏ها در اتانول20% در فریزر با سرمای ^°C 4- نگهداری و قبل از مصرف، با آب دوبار تقطیر، خوب شستشو داده شد. ته کیسه دیالیزها مسدود شد و رسوب حاصل از سانتریفیوژ به کیسه‌ها منتقل گردید. در انتها سر کیسه‌ها نیز بسته شد. برای خارج کردن نمک موجود در محلول، کیسه‌های دیالیز حاوی نمونه، به مدت 6 ساعت در بشر حاوی محلول بافر فسفات قرارگرفت. در این مدت، سه بار بافر فسفات خالی و بشر با بافر تازه پر شد. شایان ذکر است که دیالیز به منظور حفظ فعالیت آنزیمی در دمای^°C 4 انجام شد. پس از اتمام کار، عصاره‌ها برای استفاده در مراحل بعدی، از کیسه‌های دیالیز به درون لوله منتقل شد (Mitchel and Barrett, 2002). میزان پروتئین کل نمونه توسط روش برادفورد اندازه‌گیری شد. مراحل فوق طی سه تکرار و هر بار حداقل در مورد 30 گیاهچة پسته انجام شد.

سنجش فعالیت پراکسیداز

برای تعیین فعالیت ویژه آنزیم پراکسیداز گیاهی می‏توان از رابطه زیر استفاده نمود که در آن فعالیت ویژه بر حسب unit/mg محاسبه می‌شود. فعالیت ویژه یک واحد آنزیمی معادل تجزیه یک میکرومول پراکسیدهیدروژن در مدت زمان یک دقیقه و در در دمای^°C 25 است.

Unit/mg = ∆A₅₁₀/(6.58×C)

rA₅₁₀: تفاوت جذب در دقیقه در طول موج 510 نانومتر و C: میلی‏گرم پروتئین در میلی‌لیتر مخلوط واکنش است. برای اندازه‌گیری جذب آنزیمی از اسپکتروفتومتر (مدل Pharmacia biotech) استفاده شد (Sariri et al., 2006).

سنجش فعالیت روی ژل الکتروفورز

(PAGE: Poly Acrylamid Gel Electrophoresis)

لازم است آنزیم مورد نظر؛ یعنی پراکسیداز در ضمن حفظ فعالیت خود، تا حد امکان از بقیه پروتئین‌ها جدا گردد. در این حال، از الکتروفورز توسط ژل پلی آکریل‏آمید (PAGE) ناپیوسته استفاده شد که پروتئین را واسرشت نمی‌کند. ژل تحتانی 10% و ژل فوقانی 5 % است. پس از مخلوط نمودن یک حجم بافر نمونه با چهار حجم از عصاره‌های حاصل از دیالیز، 60 میکرولیتر نمونه به داخل هر یک از چاهک‌های ژل تزریق شد. به منظور جلوگیری از گرم شدن ژل و کاهش فعالیت آنزیمی در مورد ژل فوقانی ولتاژ 70 میلی‌آمپر و برای ژل تحتانی 40 میلی‌آمپر به کار برده شد. محلول رنگ‏آمیزی عبارت بود از: ml 50 محلول 50 میلی‌مولار استات سدیم، ml330 محلول 30% H₂O₂ و ml330 گایاکول. این محلول باید سریعاً ساخته و استفاده شود. رنگ‏آمیزی ژل در محیط کاملاً تاریک انجام شد. ژل تا زمان مشاهده باندهای قهوه‏ای تیره در محلول رنگ‏آمیزی نگهداری شد (Mitchel and Barrett, 2002). از نمونه قارچ آسپرژیلوس نیجر دو هفته پس از کشت، برای آلوده نمودن نمونه‌های پسته، استفاده شد.

نتایج

اندازه‌گیری فعالیت ویژه آنزیم نشان می‌دهند که میزان فعالیت در نمونه‌های آلوده بیش از نمونه‌های سالم است. شکل 2 مقایسه فعالیت آنزیمی را در دو حالت سالم و آلوده نشان می‌دهد. در شکل‌های 3 و 4 ژل‌های PAGE مربوط به دو حالت سالم و آلوده آورده شده‌اند. به طوری که از شکل 3 نتیجه می‌شود، در نمونه سالم پراکسیداز دارای یک باند است و با افزایش زمان برداشت، غلظت آن افزایش می‌یابد و در نمونه آلوده دو باند مشاهده می‌شود (شکل 4) و در این حالت نیز غلظت نسبت مستقیم با زمان برداشت نمونه دارد.

شکل1- نمونه قارچ آسپرژیلوس نیجر در محیط‌کشت دکستروز آگار (دو هفته پس از کشت) که از اسپور آن برای آلوده‌سازی دانه پسته استفاده شد.

شکل 2 - مقایسه فعالیت آنزیم پراکسیداز در نمونه‌های سالم و آلوده به قارچ پسته احمد آقایی طی روزهای مختلف رشد دانه. الگوی فعالیت آنزیم در دو نمونه سالم و آلوده تقریباً یکسان است، اما مقدار فعالیت آن در نمونه‌های آلوده بیشتر است. همه اندازه‌گیری‌ها با 3 تکرار انجام شده و P≤0.05 بود.

شکل 3 - ژل PAGE در نمونه سالم پسته احمد آقایی، باندی که درستون سمت چپ، مشاهده می‌شود (نمونه شاهد) مربوط به آنزیم پراکسیداز
(E.C. 1.11.1.7) تهیه شده از شرکت Sigma است.

شکل 4 - ژل PAGE در نمونه آلوده به قارچ آسپرژیلوس نیجر پسته احمد آقایی. به طوری که ملاحظه می‌شود، در نمونه‌های آلوده دو باند وجود دارند.

در دانه‏های آلوده به قارچ آسپرژیلوس نیجر، تغییر آنزیم در دانه‏های خشک و کاشته شده دارای الگوی مشابه با دانه‏های سالم است؛ با این تفاوت که میزان افزایش آنزیم‏ در دانه آلوده طی روزهای مختلف رشد بسیار بیشتر از دانه سالم است. شایان ذکر است که در دانه کشت داده نشده و خیسانده آلوده به قارچ ، نسبت به این دو حالت از نمونه سالم تغییری مشاهده نمی‏شود. شکل 2 نیز نشان‌دهندة افزایش تدریجی فعالیت ویژه آنزیم است. مطالعات آماری با روش آنالیز واریانس یک طرفه(ONE WAY ANOVA) نشان می‌دهد که تفاوت‌های موجود بین میزان آنزیم پراکسیداز در دانه‌های سالم پسته احمد آقایی با میزان آن در دانه‌های آلوده معنادار (P≤0.05) است.

بحث و جمع‌بندی

Lagramini و همکاران در سال 1990 و Samson و همکاران در سال 2001 به طور جداگانه نشان داده‌اند که آلوده شدن گیاه تنباکو توسط ویروس موزائیک تنباکو، باعث القای بیان دو نوع از ایزوزیم‌های آنزیم پراکسیداز در برگ‌های آلوده و غیر آلوده گیاه می‏شود. از طرفی، آنزیم پراکسیداز ویژه سوبرینی شدن، در گیاه گوجه‌فرنگی در صورت آلودگی با Verticillie alboartum فعال می‏شود. (Lagramini et al., 1990; Samson et al., 2001). Caruso و همکاران در سال 1999 گزارش کردند که میزان آنزیم پراکسیداز گیاه گندم در روزهای مختلف رشد، متفاوت است. شدت فعالیت آنزیم در گیاهچه‏های آلوده به قارچ، با گذشت روزهای رشد افزایش می‌یابد. در سال 2002 نتایج پژوهشی نشان داد که آنزیم پراکسیداز هم در دانه خشک (قبل از کشت) و هم در دانه در حال رشد گیاهان مختلف موجود است. وجود این آنزیم در کنار آنزیم‏های دیگر، همچون: اندوکیتیناز، اگزوکیتیناز، کیتوبیاز، بتا 1 و 3 گلوکاناز، لکتین و مهار کننده‏های پروتئازی به صورت یک سیستم دفاعی مرکب عمل می‏کنند که دانه را در طی جوانه‌زنی و رشد حمایت می‏نمایند (Mitchell and Barrett, 2002). میزان آنزیم پراکسیداز در دانه خشک و خیسانده (دو نقطه اول نمودار شکل 1) کمتر از دانه‏های در حال رویش است و با افزایش روزهای جوانه‌زنی، میزان آنزیم نیز افزایش می‏یابد.

شاید یکی از علل افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاهچه آلوده به قارچ، دخیل بودن این آنزیم در سنتز لیگنین و سوبرین دیوارة سلولی ‏باشد. با افزایش فعالیت این آنزیم، سرعت ساخت دیوارة سلولی که یکی از سدهای دفاعی اولیه گیاه در برابر انتشار عوامل پاتوژن است، افزایش می‌یابد. در واقع، با افزایش فعالیت این آنزیم، گیاه اولین گام را برای دفاع علیه عوامل پاتوژن بر می‏دارد. این افزایش می‌تواند با افزایش بیان آنزیم اولیه و یا بیان یک ایزوزیم جدید از آنزیم رخ دهد. همان‌گونه که بر روی ژل (شکل‌های 2 و 3) مشاهده شد تعداد باندها از روز هشتم نمونه‌برداری به بعد افزایش می‌یابد. می‌توان افزایش باند را بیان ایزوزیم جدیدی از آنزیم پراکسیداز دانست که فقط در شرایط آلودگی سنتز می‌شود. Macrae و Fergusson در سال 1981 طی تحقیقی دریافتند که بر اثر ایجاد تنش، ابتدا آنزیم سوپراکسید دیسموتاز فعال می‏شود که همراه با NADPH اکسیداز باعث افزایش H₂O₂ می‏گردد. این امر سبب فعال شدن آنزیم‏هایی، چون: پراکسیداز، کاتالاز و اکسیدازهای وابسته به آنها که در امر دفاع دخالت دارند، می‏گردد. پس از آن، گیاه وارد فاز دوم دفاع می‏گردد که در آن میزان آنزیم‏های فوق به جز سوپراکسید دیسموتاز و NADPH اکسیداز کاهش می‏یابد. Levin و همکاران در سال 1994و Kumar در سال 2001 به طور جداگانه بیان کردند که در این هنگام غلظت پراکسید هیدروژن با توجه به فعالیت اندک آن، افزایش چشم‏گیری را نشان می‏دهد. افزایش بیش از حد H₂O₂ به عنوان علامت برای گیاه تلقی شده، باعث فعال شدن سیستم دفاعی آن می‌گردد. معمولاً گیاه بعد از سی‏اُمین روز پس از ایجاد تنش وارد فاز دوم دفاعی می‏گردد (Chandru et al., 2003).

در این بررسی، میزان فعالیت آنزیمی دانه پسته فقط تا روز دوازدهم بررسی شده است، پس به طور کلی می‏توان نتیجه گرفت با توجه به فعالیت ویژه آنزیمی، دانه در فاز اول دفاعی بوده و هنوز وارد فاز دوم نشده است. این امر را می‏توان این‌گونه توجیه کرد که گیاه ابتدا با افزایش میزان آنزیم پراکسیداز سدهای دفاعی اولیه خود همچون دیواره سلولی را تقویت می‏نماید و پس از آن، با کاهش میزان آنزیم و افزایش تجمع سوبسترای آن؛ یعنی پراکسید هیدروژن، باعث راه‏اندازی سیگنال‌های دفاعی جدید می‏گردد. به عبارت دیگر، گیاه در مرحله اول با افزایش میزان آنزیم پراکسیداز و در مرحله بعد، با کاهش میزان آن باعث راه‌اندازی پاسخ‌های دفاعی متفاوت در برابر پاتوژن می‌گردد. نتایج فوق در مورد گیاهچه پسته مشاهده شده و ممکن است، گیاه بالغ پسته از این الگو پیروی نکند و مکانیزم دفاعی متفاوتی را در مقابله با پاتوژن انتخاب نماید. بدیهی است حصول اطمینان در این زمینه نیازمند آزمایش فرضیه فوق در گیاه کامل پسته است.

تقدیر و تشکر

از حمایت مالی دانشگاه گیلان سپاسگزاری می‌شود.