Study on pollen grain and ovule developmental properties in Centaurea iberica Trevir. ex Spreng

تیره آفتابگردان (Asteraceae) بزرگترین تیره گیاهی است (Bremer, 1994). بر اساس گزارش­های باغ گیاه‌شناسی سلطنتی کیو، این تیره بیش از 1600 سرده و 23000 گونه دارد. در این تیره تقسیم‌بندی سرده‌ها و تشخیص مرز بین آنها اغلب مشکل‌زا بوده و برخی از آنها باید پی در پی به زیر گروه­های کوچک­تر تقسیم ‌شوند (Hind et al., 1995). یکی از مشکلات اساسی آرایه‌شناختی در این تیره ارتباطات بین سرده‌ها، طایفه‌ها و همچنین وجود گونه‌های چند شکل (پُلی‌مورف) است (Torrell et al., 1999)، که مطالعات تکوینی و رویان‌شناختی می­تواند به حل مشکلات آرایه‌شناختی در این تیره نیز کمک نماید.

سرده‌ها و گونه‌های فراوان این تیره، پراکنش جهانی، و این حقیقت که شامل تعداد زیادی گیاه مفید و دارویی است این تیره را موضوع مطالعات متعددی نموده است (Watanabe, 2002). بسیاری از گیاهان این تیره از جمله Centaurea از نظر دارویی و داشتن اسانس، ارزش ویژه‌ای دارند (Valles et al., 2005). مطالعات متعدد کاریولوژیک و فیتوشیمی در این آرایه صورت گرفته است (Valles et al., 2005). اما با وجود این، به نظر می­رسد که مطالعات تکوینی و رویان‌شناختی محدودی در این تیره انجام شده است، بنابراین هنوز انجام مطالعات جدید تکوینی برای افزایش دانش و آگاهی درباره گیاهان این تیره ضروری است (Shamrov, 1998). همچنین پیش‌بینی می­شود مطالعات تکوینی و رویان‌شناختی بتواند در کنار سایر مطالعات در حل مشکلات آرایه‌شناختی این گروه نیز همانند سایر تیره­های گیاهی استفاده شود (Johri et al., 1992). بر اساس مطالعات رویان‌شناختی محدود که در این تیره انجام شده است، ویژگی­های استثنایی و نادر متعددی در این گیاهان این تیره گزارش شده است. برخی از موارد استثنایی و نادر مشاهده شده در گیاهان این تیره عبارت است از: وجود پدیده Nemec یعنی تشکیل ساختارهایی شبیه به کیسه رویانی در دانه گرده (Davis, 1964; Batygina, 1987)، افزایش یاخته­های قرینه (سینرژید­ها) در کیسه رویانی (Cichanand Palser, 1982; Pandey, 2001)، افزایش یاخته­های آنتی‌پود(Richards, 1997; Harling, 1951)، تکوین کیسه­ رویانی 4 یاخته­ای
(Davis, 1968) و وجودآپومیکسی (Chaudhury, et al., 2001).

در مقایسه با اطلاعات گردآوری شده درباره نمو دانه گرده، شناخت کمتری از نمو گامتوفیت ماده و ارتباط کیسه رویانی با تخمک قبل و بعد از لقاح، در دسترس است. مقداری اطلاعات درباره اولین مراحل نمو تخمک نیز صرفاً در گزارش‌های  Roth(1957) و Schulz و Jensen (1981) یافت می­شود. بر پایه شباهت‌های زیاد در ساختار کیسه رویانی (تکوین نوع نرمال یا تیپ علف هفت‌بند) که در بخش عمده­ای از نهاندانگان وجود دارد و عمومیت مطلق لقاح مضاعف در بین آنها، به نظر می‌رسد این ویژگی‌ها یکباره در تاریخ تکاملی نهاندانگان، به وجود آمده‌اند (Romanov, 1944; Maheshwari, 1950). اطلاعات جدید تهیه شده توسط شاخه‌های مختلف علوم زیستی از قبیل ریخت‌شناسی، زیست‌شناسی تولید مثلی و زیست‌شناسی تکوینی، بایستی مطالعات رویان‌شناسی با دیدگاه تکاملی را تکمیل نمایند که در این زمینه پژوهش‌های متعددی به ویژه در ارتباط با جنبه‌های مختلف رویان‌زایی توصیفی و مقایسه‌ای صورت گرفته است (Johri et al., 1992).

تاکسون مورد بررسی در این پژوهش، گونه Centaurea iberica Trevir. ex Spreng. بوده که متعلق به تیره Asteraceae و طایفه Cynareae است. هدف از انجام این بررسی، تجزیه و تحلیل مراحل تکوینی گامتوفیت نر و ماده است. علاوه بر آن، در این پژوهش سعی شد تا کلیه صفات ارزشمند در مورد اندام‌های زایشی، با استناد به مطالعات مرجع‌شناختی، در تاکسون مورد مطالعه، بررسی شوند. از آنجا که اغلب پژوهش­هایی که با دیدگاه سیستماتیک بر روی اندام‌های زایشی صورت گرفته، به دلیل سادگی نسبی کار و کثرت دانه های گرده، بر روی خصوصیات دانه گرده بوده است، به نظر می‌رسد که مطالعه اندام زایشی ماده، به ویژه مراحـل تکویـن کیسه رویانی ارائه‌دهنده ویژگی‌های ارزشمند و بسیار متنوعی است که می­تواند از دیدگاه سیستماتیک مورد توجه واقع شود.

مواد و روش‌ها

گل­ها و جوانه­های گونه مورد مطالعه در اوایل تابستان از گلدشت بروجرد جمع‌آوری شد، و نمونه هرباریومی گونه مورد نظر در هرباریوم دانشگاه بروجرد (BUH) نگهداری می­شود. گل­ها و غنچه­ها در مراحل مختلف تکوین جهت تثبیت در(formalin acetic acid ethanol) FAA_70%  قرار داده شد. سپس ذخیره‌سازی در الکل 70% صورت گرفت. پس از جاسازی، برش‌گیری نمونه­ها در قالب­های پارافین با میکروتوم در اندازه μm 10-5 صورت گرفت (Xue and Li, 2005). شفاف‌سازی نمونه­ها مطابق روش Yeung (1984) و رنگ‌آمیزی مضاعف هسته و سیتوپلاسم به وسیله هماتوکسیلین و ائوزین صورت گرفت. نمونه‌های مورد مطالعه با میکروسکوپ نوری Olympus CX21FS1 (Japan) بررسی شد و عکس‌برداری به کمک دوربین دیجیتال مدل Canon Pc. 1049 انجام گرفت.

نتایج

تشکیل پرچم

پرچم­ها ابتدا به صورت برجستگی­های کوچک مریستمی بر روی نهنج و در زیر پوشش کاسبرگ­ها ظاهر شده (شکل A1) و سپس به سرعت رشد و نمو می­یابند. ظهور و تکوین پرچم‌ها زودتر از ظهور مادگی است؛ به طوری که در زمان تشکیل پریموردیوم تخمکی، میله‌ها و بساک­ها با چهار کیسه گرده و لایه­های تشکیل‌دهنده دیواره کیسه‌های گرده قابل تشخیص هستند (شکل B1). تعداد پرچم­ها در گونه مورد بررسی پنج عدد است که به صورت جدا از هم و با آرایش چرخه‌ای بر روی یک دایره قرار گرفته­اند و کیسه­های بساک از پهلو به یکدیگر متصل می­شوند و استوانه­ای را در اطراف خامه تشکیل می­دهند (شکل F1).

تکوین بساک

بساک به صورت تتراسپورانژ یا چهار کیسه گرده‌ای است (شکل E1). هر میکروسپورانژ در ابتدای نمو از یک گروه یاخته­های زیر اپیدرمی به نام آرکسپور تشکیل یافته که با تقسیمات مماسی خود بافت هاگزا و لایه­های جداری میکروسپورانژ را تولید می­کنند (شکل B1). به دنبال تقسیمات مماسی یاخته­های لایه جداری، ساختار چهار لایه‌ای دیواره میکروسپورانژ یا کیسه گرده به وجود می­آید که این لایه­ها از سمت خارج به داخل عبارتند از لایه مکانیکی که زیر اپیدرم واقع است، لایه میانی که بین لایه مغذی (تاپی) و مکانیکی قرار دارد و لایه مغذی که بافت هاگزای بساک را احاطه می­کند. هر یک از چهار لایه مذکور صرفاً از یک ردیف یاخته تشکیل شده­اند (شکل B1).

به دنبال تقسیمات میتوزی در توده یاخته­های هاگزایی که مرکز کیسه گرده را پُر می­کنند میکروسپوروسیت‌ها یا یاخته­های مادر گرده ایجاد می‌شوند و همان‌طور که در شکل B1 مشخص است در حال ورود به تقسیم میوز هستند و با حجم زیاد، سیتوپلاسم متراکم و هسته­های درشت و مشخص از یاخته‌های اطرافشان قابل تشخیص هستند. با شروع میوز، کالوز در اطراف میکروسپوروسیت­ها شروع به تشکیل می­کند. در طی فرآیند میکروسپورزایی، به دنبال تقسیم میوز I در میکروسپوروسیت­ها بدون تشکیل صفحه یاخته­ای، دو هسته دیادی در یک سیتوپلاسم مشترک قرار می­گیرند. بعد از تقسیم میوز II چهار هسته هاپلوئید به وجود می‌آید و به طور همزمان بین چهار هسته حاصله سیتوکینز رخ می‌دهد (شکل C1). در C. iberica آرایش تتراسپورهای ایجاد شده در داخل پوشش کالوزی، از نوع تتراگونال، تتراهدرال و خطی است (شکل C1). تمایز و تخصص‌یافتگی بیشتر یاخته­های لایه­های دیواره میکروسپورانژ همزمان با میوز رخ می‌دهد. بنابراین، یاخته‌های لایه تاپی که نقش اصلی آنها رساندن مواد مغذی به میکروسپورهای در حال نمو است، به طور معمول در مرحله تتراد به حداکثر اندازه می­رسند. در بساک
C. iberica لایه تاپی از نوع پلاسمودیومی است. یاخته­های تاپی در گونه مذکور دو هسته­ای هستند و هسته‌ها بزرگ و کاملاً مشخص­اند (شکل D1). همچنین یاخته­های تاپی به علت نقش مغذی، بیشترین رنگ‌پذیری را نسبت به سایر یاخته­های دیواره بساک دارند (شکل B1). با اتمام میوز، دیواره کالوزی اطراف این یاخته­ها به صورت همزمان شروع به تجزیه سریع می­کند و سرانجام میکروسپورهای جوان در یک تتراد از یکدیگر جدا می‌شوند. رشد محسوس میکروسپورها بلافاصله پس از رهایی آنها از پوشش کالوزی به خوبی قابل مشاهده است که همراه با آبگیری و واکوئله شدن سیتوپلاسم است. نمو میکروسپور با انجام یک تقسیم میتوز کامل می­شود؛ بدین ترتیب که تقسیم میتوز نامساوی موجب تشکیل دو یاخته متفاوت از نظر عملکردی و ریخت‌شناختی می‌شود که یاخته­های رویشی و زایشی هستند. اطراف هر میکروسپور رها شده از پوشش کالوزی را دیواره اگزین اولیه در بر گرفته است. دیواره پکتوسلولزی دیگری نیز به نام انتین، در مجاورت سیتوپلاسم تشکیل می­شود که در محل شیارها ضخیم‌تر است. باز شدن بساک تتراسپورانژ با ایجاد شکاف طولی صورت می‌گیرد و در این زمان لایه تاپی تحلیل رفته است. در این گونه، دانه‌های گرده بالغ آزاد شده از بساک، بیضی شکل بوده و همچنین سه شیار رویشی که محل‌های رویش لوله گرده هستند، بر روی سطح دیواره آنها مشاهده می‌شود (شکل F1).

تکوین تخمک

در نمونه مورد بررسی، تخمک‌ها از نوع واژگون، دو پوششی با خورش کم هستند (شکل A2). تخمک‌ها در ابتدا به صورت برجستگی کوچک در جدار تخمدان پدیدار می‌شوند. پریموردیوم تخمکی کمی انحنا بر می‌دارد و کم و بیش هلالی شکل می­شود. بنیان‌گذاری پوسته‌های تخمک در طرفین جسم تخمک و در قاعده خورش ابتدا به صورت برجستگی­های چند یاخته­ای صورت می­گیرد. هر چند زمان تشکیل پوسته درونی زودتر است (شکل B2)، ولی پوسته بیرونی نسبت به پوسته درونی از رشد سریع‌تری برخوردار است. انتهای آزاد پوسته‌ها در قطب سفتی تخمک ایجاد مجرای باریک میکروپیلی یا سفتی را می‌کند، که شکل میکروپیل به صورت خطی راست، با کمی انحنای داسی شکل است. وجود یا عدم لایه آندوتلیوم نیز اهمیت تاکسونومیک دارد. یاخته­های این لایه دارای هسته کاملاً واضح و سیتوپلاسمی متراکم هستند که از پایداری زیادی برخوردار است، به طوری که در زمان تشکیل رویان نیز حضور دارند (شکل F2). به دنبال رشد سریع یکی از یاخته­های خورش، یاخته­ای به نام آرکسپور یا یاخته مادر مگاسپور تمایز می­یابد. سپس یاخته مادر مگاسپور به دنبال افزایش حجم، متحمل تقسیم میوز می‌شود. اولین تقسیم میوزی مگاگامتوسیت موجب تشکیل دو یاخته دیاد می­گردد (شکل B2)، و دومین تقسیم میوزی آن موجب تشکیل چهار یاخته تتراد می‌شود. آرایش تترادها دراین گونه از نوع خطی است که در این مرحله از نمو، پوسته‌های تخمک بیشتر از سه چهارم از جسم تخمک را بر گرفته‌اند. سپس سه یاخته تحلیل رفته و تنها یاخته باقی‌مانده که مگاسپور فعال یا عملکردی نامیده می‌شود، به کیسه رویانی تحول می‌یابد.

نمو کیسه رویانی

هسته یاخته بنیادی کیسه رویانی در این گونه سه تقسیم میتوزی متوالی را انجام می­دهد. نخستین تقسیم میتوزی موجب تشکیل کیسه رویانی دو هسته‌ای می‌شود (شکل C2). به دنبال انجام دومین تقسیم میتوزی در هر کیسه رویانی، چهار هسته تشکیل می شود (شکل D2). حاصل تقسیم سوم، کیسه رویانی هشت هسته­ای است که شامل یک یاخته میانی تخم­زا و دو یاخته قرینه (سینرژید) است و در قسمت بُنی، سه یاخته آنتی­پود به وجود می­آید. یک یاخته مرکزی هم شامل دو هسته قطبی جدا شده از قطب‌های ُبنی و سفتی است که بیشترین حجم کیسه رویانی توسط آن اشغال می­گردد. بنابراین، کیسه رویانی در این گونه، دو قطبی، هفت یاخته­ای و هشت هسته­ای و از نوع پلی­گونوم است. همچنین دو هسته یاخته مرکزی به تدریج به هم نزدیک‌تر شده و همزمان به سمت دستگاه تخم مهاجرت می­کنند (شکلE 2)، تا این که در نزدیکی دستگاه تخم و مصادف با تمایز دستگاه تخم، یعنی زمانی که دستگاه تخم گلابی شکل می­شود و دیواره مشخصی پیدا می­کند، با هم تلفیق می­شوند و هسته ثانویه را ایجاد می­کنند (شکل E2). آنتی­پودها یا یاخته­های قطب شالازی نیز به طور سریع و قبل از عمل لقاح در کیسه رویانی از بین می­روند. بدین ترتیب، کیسه رویانی بالغ که در آن تمایز یافتگی اجزا نشان‌دهنده خصوصیات ویژه تاکسون است، کامل شده، و در این حالت کیسه رویانی آماده لقاح است (شکل E2). به دنبال لقاح یاخته تخم‌زا با یکی از اسپرم‌های لوله گرده و تشکیل یاخته تخم، رویان کروی شکل ایجاد می­شود (شکل F2) و شروع به تکوین می­نماید. در گونه C. iberica از ترکیب هسته ثانویه با دومین اسپرم و تقسیمات پی ‌در پی یاخته حاصله، بافت ذخیره­ای آلبومن (آندوسپرم) سنسیتیوم به وجود می­آید. هسته‌های حاصل از تقسیم تخم ضمیمه، به علت فقدان دیواره جدا کننده، توده‌ای سیتوپلاسمی با هسته‌های بی‌شمار به نام آلبومن هسته­ای (سنسیتیوم) را تشکیل می­دهند. رویان کروی در رأس یک سوسپانسور بلند قرار دارد (شکل F2).

شکل 1- مراحل تکوین بساک و دانه گرده در ‍Centaurea iberica: (A پرچم‌ها (an) به صورت برآمدگی‌های کوچکی بر روی نهنج پدیدار شده‌اند؛ (B میکروسپوروسیت‌ها (pmc) با سیتوپلاسم متراکم، اندازه بزرگ و هسته‌های مشخص از یاخته­های بافت احاطه‌کننده متمایز شده­اند و در اطراف آنها کالوز شروع به تشکیل می­کند. سه لایه دیواره بساک قابل تشخیص است: اپیدرم (ep)، لایه مکانیکی(en)، لایه تاپی (tap)؛‍(C  آرایش میکروسپورها در داخل پوشش کالوزی از نوع تتراهدرال، تتراگونال و خطی است؛ (D لایه تاپی پلاسمودیومی و دو هسته‌ای (↑↑)؛ (E برش عرضی از پرچم‌ها و بخشی از گل­آذین کپه نشان‌دهنده گلچه­ها، که در آن پرچم­های متصل بساک نیز قابل مشاهده هستند؛ (F شکل نمای قطبی دانه گرده بالغ بیضی شکل دو یاخته­ای و سه لوبه با سه فرو رفتگی مربوط به سه شیار مشاهده می‌شود، اگزین (ex) که در محل شیارها وجود ندارد و انتین (in) که در محل شیارها ضخیم‌تر بوده و به صورت کمی بیرون‌زده قابل تشخیص است.

شکل 2- مراحل تشکیل تخمک و کیسه رویانی در ‍Centaurea iberica: (A پریموردیوم تخمکی (op)، یک تخمک تمایز نیافته جوان، به صورت برجستگی کوچک تقریباً کروی و در جدار تخمدان پدیدار می­شود؛ (B تشکیل دو یاخته دیاد (↑↑)؛ (C تشکیل کیسه رویانی دو هسته‌ای (↑↑)؛ (D ایجاد کیسه رویانی (es) با چهار هسته، لایه آندوتلیوم (en) با رنگ‌پذیری بیشترنسبت به یاخته های اطراف قابل تشخیص است؛‍(E  کیسه رویانی بالغ (es) که آماده لقاح است: یاخته تخم‌زا (os)، سینرژیدها (syn)، هسته قطبی (pn)؛ (F هسته‌های حاصل از تقسیم تخم ضمیمه، تشکیل توده‌ای سیتوپلاسمی با هسته­های بی‌شمار به نام بافت نموی (syncytium) را می­دهند. رویان کروی شکل (em) در رأس یک سوسپانسور بلند (s) قرار دارد.

بحث

تکوین بساک و دانه گرده

در گونه­ مورد مطالعه، نمو سه لایه­ای دیواره بساک بر اساس تیپ دو لپه­ای انجام می­گیرد که با نظریه Davis (1966) و Pullaiah (1979) در مورد گیاهان تیره Asteraceae همسویی دارد. یاخته­های لایه تاپی درجه بالایی از پلوئیدی را نشان می­دهند که نمایانگر فعالیت متابولیسمی بالای آنهاست و از این نظر شبیه به یاخته‌های آنتی­پود کیسه رویانی هستند (Maheshwari, 1950). در نهان­دانگان دو تیپ اصلی نمو لایه تاپی بساک قابل تشخیص است (Pacini et al., 1985): ترشحی (جداری) و آمیبی (Periplasmodial). در گیاه مورد مطالعه، لایه تاپی از نوع پلاسمودیومی است که در آن تکثیر هسته­ها صورت گرفته و تعداد هسته­ها در هر یاخته به دو یا سه افزایش می‌یابد. لایه تاپی آمیبی برای گونه­های متعددی از تیره Asteraceae گزارش شده است(Pacini et al., 1985) . گزارش ما در مورد لایه تاپی گونه C. iberica با نظر Gotelli و همکاران (2008) در مورد Helianthus annuus مطابقت می‌کند. آرایش میکروسپورهای داخل دیواره کالوزی در C. iberica از نوع تتراهدرال و تتراگـونال مشاهده شد، در صورتـی که در مورد برخـی گونه‌های دیـگر تیره Asteraceae مانند Helianthus annus (Gotelli et al., 2008) و Eupatorium laevigatum (Coleman, 2005) آرایش میکروسپور­ها تنها از نوع تتراهدرال گزارش شده است. میکروسپورها در زمان آزاد شدن از تترادها هیچ واکوئلی نداشته و دارای یک سیتوپلاسم متراکم، شکل منظم با یک هسته حجیم قرار گرفته در بخش میانی هستند. هسته­ها با روش میتوز تقسیم شده و دو هسته نابرابر را به وجود می­آورند که هسته بزرگتر رویشی و هسته کوچکتر زایشی است. بنابراین، دانه گرده در گونه مورد مطالعه به صورت دو یاخته­ای و سه شیاره دیده شد که بر خلاف گزارش‌های Pullaiah (1979) و Johri و همکاران (1992) است که بیان داشته­اند دانه گرده در گیاهان تیره Asteraceae به صورت سه یاخته­ای است. دانه گرده سه شیاره از خصوصیات دولپه‌ای‌های پیشرفته است (باتی گینا، 1387).

تکوین تخمک و کیسه رویانی

نتایج این مطالعه نشان داد که در هر تخمدان فقط یک تخمک واژگون کم خورش وجود دارد. در لایه زیر اپیدرمی تخمک فقط یک یاخته آرکئوسپوری وجود دارد که با پیشرفت رشد و تکوین تخمک، مستقیماً به یاخته مادر مگاسپور تمایز می­یابد. موقعیت زیر اپیدرمی یاخته مگاگامتوسیت در سایر گیاهان این تیره نیز گزارش شده است .(Johri et al., 1992)

مطالعه مگاسپوروژنز گونه مورد مطالعه، نشان می­دهد که شکل تتراد به صورت خطی است. وجود تترادهای خطی در گیاهان این تیره به وسیله پژوهشگران متعددی گزارش شده است (Kapil and Bhatnagar, 1981; Rangaswamy and Pullaiah,1986; Huang and Russell, 1992). سه مگاسپور دیگر که به صورت غیر عملکردی هستند توسط کالوز احاطه شده و نهایتاً تخریب می­شوند، که بر اساس نظریه Webb و Gunning (1990) وظیفه اصلی کالوز در طی مگاسپوروژنز، متوقف کردن عملکرد مگاسپور غیر عملگر است. زمان ترکیب هسته‌های قطبی با توجه به الگوی نموی کیسه رویانی می­تواند متفاوت باشد (Haig, 1990; Huang and Russell, 1992)، که در گونه C. iberica این ترکیب قبل از لقاح است. وجود سه یاخته آنتی‌پودال از جمله ویژگی­های تیپ پلی‌گونوم است (Maheshwari, 1950; Newcomb, 1972)، که در گونه مورد مطالعه نیز سه یاخته آنتی‌پودال مشاهده می‌شود. الگوی تیپ علف هفت‌بند یا پلی‌گونوم متداول‌ترین الگوی نموی کیسه رویانی است که در
70 درصد از گیاهان گل‌دار وجود دارد (Maheshwari, 1950; Haig, 1990; Huang and Russell, 1992).

سینرژیدها یاخته‌های ناپایداری هستند که قبل از لقاح تخریب می­شوند (Maheshwari, 1950). در این گونه، تخریب سینرژیدها قبل از لقاح است که مطابق با نظریه Newcomb (1972) و Yan و همکاران (1990) است. در گونه C. iberica در ابتدای رویان‌زایی آندوسپرم هسته‌ای تشکیل می­شود، به گونه­ای که هسته‌های حاصل از تقسیم تخم ضمیمه به علت فقدان دیواره جدا‌ کننده، توده‌ای سیتوپلاسمی با هسته­های بی‌شمار به نام بافت نموی را تشکیل می­دهد. در این مرحله جنین کروی در رأس یک سوسپانسور بلند قابل مشاهده است.

در تخمک این گونه، بر اثر تغییر شکل یاخته­های داخلی خورش که بعداً در تماس با کیسه رویانی قرار می‌گیرند، یک لایه از یاخته­های ترشحی به نام آندوتلیوم تشکیل می­شود (Arekal, 1963). در گونه بررسی شده، آندوتلیوم از پایداری زیادی برخوردار است و یاخته­های آن طرح­های منظم و یکنواختی را نشان می‌دهند.