Authors
Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Bahonar University, Kerman
Abstract
Keywords
به طور کلی، طیف فرابنفش به سه ناحیه تقسیم میشود: ناحیه UV-C (طول موج 220 تا 280 نانومتر)، ناحیه UV-B (طول موج 280 تا 320 نانومتر) و ناحیه UV-A ( طول موج 320 تا 400 نانومتر). تابش UV-B پر انرژیترین جزء نور خورشید است که به سطح زمین میرسد. سیستمهای زیستی نسبت به طول موجهایی که در ناحیه 280 تا 320 نانومتر قرار میگیرند، حساس هستند. آسیبهای ناشی از تابش UV-B بر گیاهان به علت نیاز آنها به نور خورشید برای بقا و عدم توانایی گیاهان در حرکت باید بیشتر مورد توجه قرار گیرد (Mpoloka, 2008). بنابراین در گیاهان ساز و کارهای دفاعی، شامل ساز و کارهای آنزیمی و غیر آنزیمی تکامل یافته است که آنها را در مقابل این پرتو حفاظت میکند (Hollosy, 2002). مکانیسمهای آنزیمی شامل فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز، گلوتاتیون، ردوکتاز و غیره است (Mittler, 2002). در حفاظت غیرآنزیمی تولید آنتیاکسیدانهای غیر آنزیمی، چون آسکوربیک اسید، کاروتنوئیدها، فلاونوئیدها، آنتوسیانینها و آلکالوئیدها افزایش مییابد. مؤثرترین مکانیسم حفاظتی غیر آنزیمی تحریک شده تحت یک رژیم نوری، بیوسنتز فلاونوئیدها و ترکیبهای فنلی جذبکننده UV-B است (Landry et al., 1995). مطالعههای بسیاری اثبات کرده است که تجمع فلاونوئیدها و آنتوسیانینها توسط گیاه، مکانیسمی حفاظتی را در برابر تابش UV-B ایجاد میکند. فلاونوئیدها در جنبههای بسیاری از رشد و نمو گیاهان، از جمله مقاومت در برابر پاتوژنها، تولید رنگدانه، حفاظت در برابر پرتو فرابنفش، رشد گرده و نمو پوشش دانه دخالت میکنند (Winkel-Shirley, 2001). این ترکیبها به ویژه گروهی که متعلق به رده فلاونولها هستند (مانند کامفرول و کوئرستین) به علت ظرفیت بالای آنتیاکسیدانی و توانایی حفاظت از سیستم آنزیمی به صورت in vitro، در رژیم غذایی انسان برای حفظ سلامتی اهمیت ویژهای دارند. افزایش در جذب روزانه فلاونوئیدهای معین میتواند به کاهش 30 تا 40 درصدی در بیماریهای تصلب شرایین و سرطان بیانجامد (Bovy et al., 2002). با توجه به این یافتهها، علاقه روزافزونی در جهت پرورش و رشد محصولات غذایی غنی از فلاونوئیدها به وجود آمده است. گوجهفرنگی گیاهی متعلق به تیره سیبزمینی (Solanaceae) و یکی از محصولات غذایی پر مصرف در سراسر جهان است که در این زمینه مورد توجه قرار گرفته است. نتایج حاصل از مطالعات همهگیرشناسی نشان داده است که گوجهفرنگی و محصولات آن نقش حفاظتی مهمی را در برابر اشکال مختلف سرطان، به ویژه سرطان پروستات و بیماریهای قلبی-عروقی ایفا میکنند. میوه گوجهفرنگی منبع مهمی از آنتیاکسیدانها ست که انواع مهم آن شامل رنگدانههای کاروتنوئیدی (به ویژه لیکوپن)، آسکوربیک اسید و ترکیبهای فنلی هستند (Jagadeesh et al., 2009). لیکوپن کاروتنوئید اصلی در گوجهفرنگی است که بیش از 80 درصد کاروتنوئیدهای موجود در میوه به طور کامل رسیده گوجهفرنگی را تشکیل میدهد(Dorais et al., 2008). با توجه به خواص دارویی و آنتیاکسیدانی ترکیبهای فنلی و لیکوپن در سلامتی انسان و همچنین، با توجه به نقش دفاعی که این ترکیبها در برابر پرتو فرابنفش برای گیاهان ایفا مینمایند، میتوان به طور مؤثر از پرتو UV برای افزایش این ترکیبهای مفید در گیاهان بهره برد. بر این اساس، در این پژوهش اثر سه تیمار مختلف UV-B بر افزایش لیکوپن و برخی ترکیبهای ثانویه دارویی، شامل فلاونوئیدها و آنتوسیانینها و نیز فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز و پروتئین کل در میوه رسیده گوجهفرنگی مطالعه گردید.
مواد و روشها
میوههای گوجهفرنگی (Lycopersicon esculentum var. philippos) از گلخانهای تجاری واقع در جاده هفت باغ ماهان در استان کرمان، در مرحلهای که میوهها به طور کامل رسیده و به رنگ قرمز بودند، برداشت شدند و به مدت 14 روز در چهار گروه جداگانه تحت تیمارهای زمانی صفر (شاهد)، 1، 2 و 4 ساعت UV-B با دوزهای دریافتی صفر (شاهد)، 2/7، 4/14 و 8/28 کیلوژول بر متر مربع در روز قرار گرفتند. پرتودهی با استفاده از لامپ فرابنفش (UV-B) از شرکت UVitec (Cambridge) مدل 215-LF با طول موج 312 نانومتر در همه سطوح میوه انجام شد. در هر تیمار سه تکرار استفاده شد. پس از این مدت، نمونهها در نیتروژن مایع منجمد گردید. از این نمونهها برای اندازهگیری مؤلفههای مورد نظر استفاده شد.
سنجش میزان فلاونوئید کل: میزان فلاونوئید کل با روش رنگسنجی آلومینیوم کلراید اندازهگیری شد
(Toor and Savage, 2005). 1/0گرم از نمونههای گیاهی در 10 میلیلیتر متانول عصارهگیری شد. به 5/0 میلیلیتر از عصاره حاصل، آب مقطر اضافه شد تا حجم 5 میلیلیتر به دست آید. سپس به محلول حاصل 3/0 میلیلیتر NaNO2
5 درصد و پس از 5 دقیقه، 6/0 میلیلیتر AlCl3 10 درصد اضافه گردید. در نهایت 2 میلیلیتر NaOH 1 مولار و
2 میلیلیتر آب مقطر اضافه و شدت جذب در طول موج 510 نانومتر اندازهگیری شد. غلظت نمونهها با استفاده از منحنی استاندارد کوئرستین به دست آمد.
سنجش میزان آنتوسیانینها: برای اندازهگیری مقدار آنتوسیانینها از روش Wagner (1979) استفاده شد. 1/0 گرم از بافت تازه میوه در هاون چینی با 10 میلیلیتر متانول اسیدی (متانول خالص و کلریدریک اسید خالص به نسبت حجمی 99 به 1) به طور کامل ساییده و عصاره حاصل در لولههای آزمایش درپیچدار ریخته شد و به مدت 24 ساعت در تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس به مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید و جذب محلول بالایی در طول موج 550 نانومتر اندازهگیری شد. برای محاسبه غلظت، ضریب خاموشی (ε) 33000 سانتیمتر بر مول در نظر گرفته شد.
A=εbc
A= جذب؛
b= عرض کووت؛
c= غلظت محلول مورد نظر.
سنجش میزان ترکیبهای فنلی کل: این اندازهگیری بر اساس روش Folin-Ciocalteu به صورت زیر انجام شد (Ronald and Laima, 1999). 1/0گرم از هر نمونه در 10 میلیلیتر اتانول 96 درصد عصارهگیری و عصاره حاصل به مدت 24 ساعت در تاریکی قرار داده شد. سپس به محلول حاصل 1 میلیلیتر اتانول 95 درصد، 5/0 میلیلیتر فولین 50 درصد و 1 میلیلیتر کربنات سدیم 5 درصد اضافه شد. شدت جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر (WPA light wave مدل S2000) در طول موج 725 نانومتر پس از یک ساعت نگهداری در تاریکی خوانده شد. برای محاسبه غلظت ترکیبهای فنلی از منحنی استاندارد گالیک اسید استفاده شد.
فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز (PAL):
3/0 گرم از بافت تازه میوه را توزین کرده و در 5/6 میلیلیتر بافر Tris-HCl 50 میلیمولار (اسیدیته 8/8) که حاوی بتا مرکاپتواتانول 15 میلیمولار بود، ساییدیم و عصاره حاصل به مدت 30 دقیقه در g 5000 سانتریفیوژ گردید. محلول رویی برای شناسایی استفاده شد. مخلوطی از 1 میلیلیتر بافر استخراجی بالا، 5/0 میلیلیتر فنیلآلانین 10 میلیمولار، 4/0 میلیلیتر آب و 1/0 میلیلیتر از عصاره آنزیمی در حمام آب گرم 37 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت قرار داده شد. سپس واکنش توسط 5/0 میلیلیتر کلریدریک اسید 6 مولار متوقف گردید. در نهایت، به محلول حاصل 15 میلیلیتر اتیل استات افزوده شد. فاز روغنی تشکیل شده جدا و باقیمانده در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا تبخیر شود. سپس باقیمانده، که همان سینامیک اسید است در 3 میلیلیتر سود 05/0 مولار حل شد و غلظت سینامیک اسید با اندازهگیری میزان جذب در طول موج 290 نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی معادل M-1cm-1 9500 به دست آمد. فعالیت این آنزیم بر اساس سرعت تبدیل فنیلآلانین به ترانس سینامیک اسید تعیین میشود. یک واحد از فعالیت PAL معادل 1 میکرومول از سینامیک اسید تولید شده در یک دقیقه است (Wang et al., 2006).
سنجش میزان لیکوپن: میزان لیکوپن با استفاده از مخلوط هگزان، استون و اتانول و با روش Fish و همکاران (2002) اندازهگیری شد.
پروتئین کل: 1/0 گرم از هر نمونه گیاهی پس از توزین، در 10 میلیلیتر بافر فسفات 50 میلیمولار با اسیدیته 2/7 ساییده و عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در g 14000 سانتریفیوژ شد. مقدار 1 میلیلیتر بافر برادفورد به 1/0 میلیلیتر عصاره پروتئینی افزوده و بیدرنگ مخلوط گردید. پس از 5 دقیقه شدت جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. از آلبومین گاوی برای رسم منحنی استاندارد و تعیین غلظت پروتئینها استفاده گردید.
آزمون آماری
این آزمایش در قالب طرح به طور کامل تصادفی انجام شد. آنالیز دادهها با استفاده از نرمافزار آماری SPSS (نسخه 5/11) و آزمون ANOVA صورت گرفت. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام و برای رسم نمودار از نرمافزار Excel استفاده شد.
نتایج
اثر پرتو فرابنفش بر میزان فلاونوئیدها: مقایسه مقدار فلاونوئیدها در نمونه شاهد و تیمارهای UV-B میوه گوجهفرنگی نشان میدهد که مقدار فلاونوئیدها در هر سه تیمار در مقایسه با شاهد افزایش معنیداری داشته است، اما این افزایش در بین سه تیمار معنیدار نیست (شکل 1). بنابراین، افزایش مدت زمان تیمار اثر قابل ملاحظهای بر میزان فلاونوئیدها نداشته است (شکل 1).
اثر پرتو UV-B بر میزان آنتوسیانینها: افزایش معنیدار مقدار آنتوسیانینها در نمونههای تحت تیمار در مقایسه با نمونه شاهد مشاهده شد (شکل 2). افزایش مدت زمان تیمار از 1 ساعت به 2 ساعت سبب افزایش معنیدار مقدار آنتوسیانینها شد، اما این افزایش در تیمار 4 ساعت معنیدار نیست (شکل 2).
اثر پرتو فرابنفش بر میزان ترکیبات فنلی کل: تیمارهای 2 و 4 ساعت پرتو فرابنفش سبب افزایش معنیدار میزان ترکیبهای فنلی در مقایسه با شاهد شد، اما تیمار 1 ساعت تفاوت آشکاری را نشان نداد؛ ضمن این که افزایش زمان نیز تفاوت معنیداری را بین تیمارها ایجاد نکرده است (شکل 3).
اثر پرتو UV-B بر میزان فعالیت آنزیم PAL: تیمارهای 1و 2 ساعت پرتو UV-B تفاوت معنیداری در میزان فعالیت آنزیم PAL نسبت به شاهد ایجاد نکرد، اما افزایش مدت زمان تیماردهی به 4 ساعت سبب افزایش معنیدار فعالیت آنزیم شد (شکل 4).
اثر پرتو UV-B بر میزان لیکوپن: مقایسه مقدار لیکوپن در نمونههای تیمار و شاهد نشان میدهد که افزایش زمان تیماردهی به 2 و 4 ساعت سبب افزیش معنیدار مقدار لیکوپن نسبت به شاهد شده است که بیشینه میزان آن تحت تیمار 4 ساعت است (شکل 5).
اثر پرتو UV-B بر میزان پروتئین: میزان پروتئین در نمونههای تحت تیمار نسبت به شاهد کاهش یافته است، که این کاهش در تیمار 4 ساعت معنیدار است (شکل 6).
|
شکل 1- اثر مقادیر مختلف پرتو UV-B بر فلاونوئیدها، دادهها شامل میانگین ± خطای استاندارد از سه تکرار هستند و با ضریب اطمینان 95 درصد مطالعه شدهاند. |
شکل 2- اثر مقادیر مختلف پرتو UV-B بر محتوای آنتوسیانین، دادهها شامل میانگین ± خطای استاندارد از سه تکرار هستند و با ضریب اطمینان 95 درصد مطالعه شدهاند. |
|
شکل 3- اثر مقادیر مختلف پرتو UV-B بر ترکیبهای فنلی کل، دادهها شامل میانگین ± خطای استاندارد از سه تکرار هستند و با ضریب اطمینان 95 درصد مطالعه شدهاند. |
شکل 4- اثر مقادیر مختلف پرتو UV-B بر فعالیت آنزیم PAL، دادهها شامل میانگین ± خطای استاندارد از سه تکرار هستند و با ضریب اطمینان 95 درصد مطالعه شدهاند. |
|
شکل 5- اثر مقادیر مختلف پرتو UV-B روی میزان لیکوپن، دادهها شامل میانگین ± خطای استاندارد از سه تکرار هستند و با ضریب اطمینان 95 درصد مطالعه شدهاند. |
شکل 6- اثر مقادیر مختلف پرتو UV-B روی میزان پروتئین کل، دادهها شامل میانگین ± خطای استاندارد از سه تکرار هستند و با ضریب اطمینان 95 درصد مطالعه شدهاند. |
بحث
افزایش مقدار فلاونوئیدها در تیمار با پرتو UV از ویژگیهای دفاعی برخی گیاهان در برابر پرتو فرابنفش است. این ترکیبها یا با جذب پرتو UV و جلوگیری از نفوذ آن به درون بافتهای حساس از ایجاد خسارت جلوگیری میکنند و یا نقش آنتیاکسیدانی در برابر رادیکالهای آزاد ناشی از تنش UV در گیاه ایفا نموده، تنش اکسیداتیو را تخفیف میدهند. افزایش در غلظت فلاونوئیدها ناشی از فعالیت زیاد آنزیم PAL و یا سرعت بالای سنتز این آنزیم تحت تنش UV است (Guo and Wang, 2008). گزارشها نشان داده که مقدار و فعالیت آنزیم چالکون سنتاز که نقش اساسی در بیوسنتز فلاونوئیدها دارد نیز تحت تأثیر پرتو UV افزایش مییابد (Sakihama et al., 2002). افزایش میزان فلاونوئیدها تحت اثر پرتو UV، در گیاهان اسفناج (Smirnoff and Wheelev, 2000) و اطلسی (Ryan et al., 2002) گزارش شده است. Brandt و همکاران در 1995 افزایش میزان این ترکیبات در پوست میوه گوجهفرنگی را پس از تیمار با پرتو UV-B نشان دادند. تحقیق حاضر نشان داد که میوه گوجهفرنگی برای مقابله با پرتو UV-B به مقدار فلاونوئیدهای خود میافزاید و از آنجایی که برخی فلاونوئیدها نقش دارویی دارند، این احتمال وجود دارد که با شناسایی گیاهان حاوی این ترکیبها و تیمار آنها با پرتو UV بتوان تولید طبیعی این قبیل مواد را افزایش داد. در این مطالعه، استفاده از زمانهای مختلف نشان داد که بین زمانهای مختلف استفاده شده تفاوت معنیداری وجود ندارد. در این راستا، به منظور کسب اطلاعات بیشتر درباره افزایش میزان فلاونوئیدها تحت UV-B، انجام مطالعات بعدی و استفاده از زمانهای طولانیتر و نیز استفاده از یک زمان با شدتهای مختلف لازم میشود. آنتوسیانینها از ترکیبهای فنلی مشتق شده از مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها هستند که خاصیت فیلتر کردن پرتو UV را دارند (Greenberg et al., 1996). خواص آنتیاکسیدانی آنتوسیانینها نیز در برخی مطالعات گزارش شده است. افزایش میزان آنتوسیانینها تحت تنش UV-B ناشی از تحریک بیان ژنهای کدکننده آنزیمهای درگیر در مسیر بیوسنتز این ترکیبات است. اثر دوزها و زمانهای مختلف پرتو UV-C بر افزایش میزان آنتوسیانینها در توتفرنگی گزارش شده است (Erkan et al., 2008). نتایج مشابهی توسط Perkinz-Veazie و همکاران در سال 2008 از اثر پرتو UV-C بر زغال اخته به دست آمد. افزایش میزان آنتوسیانینها در میوه گوجهفرنگی مورد مطالعه در این تحقیق، در پاسخ به پرتو فرابنفش نیز بیانگر نقش دفاعی گیاه در مقابله با این پرتو بوده است و به احتمال خطرات ناشی از تابش پرتو UV-B را کاهش میدهد و از آنجایی که بسیاری از آنتوسیانینها نیز دارای خواص دارویی هستند؛ بنابراین، با استفاده از پرتو UV شاید بتوان اقدامی عملی در جهت افزایش ماده مؤثر دارویی در بسیاری از گیاهان انجام داد. ترکیبات فنلی به عنوان آنتیاکسیدان نقش مهمی را در تغذیه بشر ایفا میکنند. پرتو UV به طور قابل توجهی بر محتوای فنلی میوههای گوجهفرنگی اثر میگزارد (Luthria et al., 2006). نتایج Jagadeesh و همکاران در سال 2009 افزایش میزان ترکیبات فنلی را در میوههای گوجهفرنگی سبز بالغ، در اثر کاربرد پرتو UV-C پس از برداشت نشان داد. افزایش میزان ترکیبهای فنلی کل که در تیمار با پرتو UV-B در میوه گوجهفرنگی مشاهده شد، میتواند از افزایش بیان ژنهای درگیر در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها و به ویژه افزایش بیان ژن مسؤول سنتز آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز (PAL)، که اولین آنزیم در مسیر سنتز ترکیبهای فنلی است، ناشی شده باشد (Chang et al., 2008). فنیلآلانین آمونیالیاز، آنزیمی کلیدی در متابولیسم فنیل پروپانوئیدها ست که تبدیل
L-فنیلآلانین به ترانس-سینامیک اسید، اولین مرحله در متابولیسم فنولیکها را انجام میدهد. این مرحله یک واکنش بیوشیمیایی کلیدی در نمو و دفاع گیاهان به شمار میرود (Chang et al., 2008). نقش تحریکی UV-C بر فعالیت آنزیم PAL در هلو گزارش شده است
(EI Ghaouth et al., 2003). مطالعات نشان داده است که فعالیت PAL در بافتهای رویشی برنج، ذرت و شلغم که در معرض UV-B قرار گرفته بودند، تحریک میشود (Singh et al., 1999). نتایج این پژوهش نیز افزایش میزان فعالیت PAL را تحت تیمار 4 ساعت UV در مرحله قرمز، نشان میدهد. بنابراین، افزایش میزان ترکیبات فنلی کل، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها میتواند به افزایش میزان فعالیت آنزیم PAL مربوط باشد. کاروتنوئیدها و به ویژه لیکوپن برای تعیین ارزش تغذیهای میوه گوجهفرنگی ضروری و دارای فعالیت آنتیاکسیدانی هستند. لیکوپن اصلیترین کاروتنوئید در گوجهفرنگی، و رنگ قرمز میوه به علت وجود این ترکیب است. این ترکیب آنتیاکسیدانی قوی است که باعث از بین رفتن رادیکالهای آزاد میشود و همچنین، در بهبود بیماری دیابت، سرطان پوست، مثانه، سینه، گردن رحم و دستگاه گوارش مؤثراست.
(Hedges and Lister, 2005). نتایج Liu و همکاران در سال 2009 نشان داد که کاربرد پرتو UV-C پس از برداشت، محتوای لیکوپن میوه گوجهفرنگی را افزایش میدهد. مقادیر کم پرتو فرابنفش سبب افزایش تولید پروتئینهایی میشود که در گیاه مقاومت بیشتری در برابر تنش ایجاد میکنند، اما مقادیر بالای آن باعث تخریب پروتئینهای سلول، از جمله پروتئینهای اسکلت سلولی میشود. پرتو UV علاوه بر اینکه بسیاری از پروتئینها را تخریب میکند، در مسیر سنتز آنها نیز اختلال ایجاد کرده، سنتز آنها را کاهش میدهد (Ulm and Nagy, 2005). تیمارهای مختلف پرتو UV-B که باعث کاهش در میزان پروتئینها شده است، نشاندهندة پیشی گرفتن تخریب پروتئینها، از ساخت آنهاست.
جمعبندی
نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که پرتو UV-B سبب افزایش میزان آنتیاکسیدانهای فنلی شده است که این افزایش احتمالا از افزایش میزان فعالیت آنزیم PAL و یا سایر آنزیمهای درگیر در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها ناشی شده است که به مطالعات بعدی نیاز دارد.
تشکر و قدردانی
خالصانهترین مراتب قدردانی و تشکر خود را محضر استادان گرانقدر و بزرگوارم، سرکار خانم دکتر فرخنده رضانژاد و جناب آقای دکتر حسینعلی ساسان تقدیم میدارم؛ استادانی که دلسوزانه و با صبر و حوصله کم نظیر، همواره راهنمایم بودهاند.
)
