Authors
1 Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Iran
2 Department of Biology, Payame Noor University, 19395-4697 Tehran, I. R. of Iran
Abstract
Keywords
یونجه (Medicago sativa) یک گیاه علوفهای با ارزش بوده، در تثبیت نیتروژن از اهمیت خاصی برخوردار است. این گیاه چند ساله، دگرگردهافشان، هتروزیگوت و پلیپلویید است (McCoy and Walker, 1984). در یونجه، درصد کالوسزایی به شرایط کشت بافت، به ویژه نوع محیطکشت پایه (Tadashi et al., 1990)، غلظت و نوع هورمونهای محیطکشت (Walker et al., 1978)، ریزنمونه (Okumora et al., 1992) و ژنوتیپ بستگی دارد (Reisch and Bingham, 1980). باززایی یونجه از طریق جنینزایی سوماتیکی وابسته به نوع و غلظت منبع 2,4-D (Walker et al., 1978)، اکسین(Saunders and Bingham, 1975)، و نیتروژن احیا شده در محیطکشت باززایی (Skokut et al., 1985) است. اکسین به عنوان یک هورمون گیاهی نقش درخور توجهی در تقسیم و چرخه سلولی و بیان ژن cdc2 برای تنظیم فعالیت پروتئین کینازها دارد. همچنین، مطالعات صورت گرفته نشان میدهد که ارتباطی قوی میان جنینزایی سوماتیکی با تغییرات شیب pH که به وسیله تنش یا 2,4-D ایجاد شده، وجود دارد. تحت شرایط جنینزایی، pH سیتوپلاسم و واکوئل افزایش مییابد. فرض بر این است که 2,4-D در غلظت بالا به عنوان یک ماده تنشزا عمل میکند (Feher et al., 2002).
سیستم کشت لایه نازک سلول اجازه مطالعه در زمینههای سلولشناسی، فیزیولوژی، بیوشیمی و تغییرات مولکولی را که در یک برنامه ریختزایی ویژه اتفاق میافتد، میدهد. این روش به مطالعه نحوه ریختزایی جنین سوماتیکی، شاخهزایی، ریشهزایی کمک کرده، احتمالاً در آینده از آن به عنوان واحدهای تکثیر انبوه استفاده خواهد شد. همچنین، بهرهگیری از سیستم کشت لایه نازک سلولی، تولید گل در شرایط درون شیشهای را امکانپذیر ساخته است (Jaime and Teixeire, 2003). ریختزایی در کشت لایه نازک سلولی میتواند با کنترل نور، غلظت قند یا الیگوساکاریدها، ترکیب یونی محیطکشت، pH و عوامل دیگر انجام شود (Cousson and Tran, 1992).
از جمله مزیتهای کشت لایه نازک سلولی میتوان به تعیین دقیق غلظت مؤثر هورمون (های) خارجی برای بررسی فرآیندهای ریختزایی (Tran, 1980)، تشکیل مستقیم شاخساره در ارکیده (Le et al., 1999)، تولید، تکثیر و بهبود گیاهان زینتی، دستکاریهای ژنتیکی (که امکان تولید بیشتر متابولیتهای ثانویه و مواد دارویی را میدهد) اشاره کرد (Teixeira and Fukai, 2002). همچنین، باززایی و تکثیر از طریق جنینزایی سوماتیکی در لیمو و پرتقال از طریق لایه نازک سلولی خامه و کلاله صورت گرفته است (Fiore et al., 2002). جنینزایی سوماتیکی نیز از طریق کشت لایه نازک سلولی در گیاهان آلو (Steinmacher et al., 2007)، کلزا (Shu and Loh, 1991) و گل داوودی (Jaime et al., 2003) صورت گرفته است. با توجه به اینکه در یونجه الگوی ریختزایی از لایه نازک سلولی انجام نشده است، لذا هدف از این تحقیق مطالعه نحوه تولید کالوس، مراحل تولید جنین سوماتیکی و تولید گیاهچه از لایه نازک سلولی هیپوکوتیل یونجه (نهال رشد یافته 6 - 7 روزه) و نیز تأثیر غلظتهای مختلف 2,4-D بر جنینزایی سوماتیکی است.
مواد و روشها
بذر رقمهای Karysary و Rangelander از گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز تهیه شدند. برای ضد عفونی شدن، بذرها به مدت 12 ساعت در آب جاری غوطهور گردیدند و سپس در محلولهای یک درصد Tween (دترجنت) (3 دقیقه)، الکل 70 درصد (2 دقیقه)، محلول هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد (20 دقیقه) قرار گرفتند و در نهایت 3-5 بار با آب مقطر استریل شستشو شدند. بذرهای ضدعفونی شده روی محیطکشت SH بدون هورمون کشت شدند (Schenk and Hildebarendt, 1972). هیپوکوتیل از دانهرُستهای
6 - 7 روزه به دست آمد. با استفاده از اسکالپل ( زیر دستگاه لوپ) لایههای نازک سلولی به ضخامت 1/0 میلیمتری تهیه شد و از قطعات هیپوکوتیل یک سانتیمتری به عنوان نمونه شاهد استفاده گردید. سپس لایههای نازک سلولی به محیطکشت SH حاوی 5/1 میلیگرم در لیتر
2,4-D به منظور تولید کالوس انتقال داده شدند و در شرایط تاریکی با دمای ثابت 2 ± 24 درجه سانتیگراد به مدت 4 هفته نگهداری شدند. پس از 4 هفته نمونهها به همان محیطکشت منتقل شدند. هدف از این انتقال رشد بیشتر کالوس برای مراحل بعد و مستعد شدن سلولها بود. پس از این مدت، کالوسها به محیطکشت القای جنین (محیطکشت SH حاوی صفر، 5، 10 و 15 میلیگرم در لیتر 2,4-D و 1 میلیگرم در لیتر kin)، به مدت 7 روز انتقال داده شدند. نمونهها سپس به محیطکشتBOi2Y (بدون هورمون) (Bingham et al., 1975) در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی برای نمو جنین انتقال داده شدند و پس از 4 هفته درصد جنینزایی و تعداد جنین در هر کالوس اندازهگیری شد. محیطکشت BOi2Y دارای 5/12 - 20 میلیمول NH4+ از منبع NO3NH4 و گلوتامین است که برای تکامل جنین بسیار مورد نیاز است. جنینهای سوماتیکی رشد یافته به محیطکشت MS½ (Murashige and Skoog, 1962) حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر GA3 برای رشد طولی و تشکیل گیاهچه انتقال داده شدند (مطلبی آذر و جعفری مفید آبادی، 1379). گیاهچههای تولیدی به گلدانهای کوچک حاوی پرلایت منتقل و در شرایط مه افشان برای استقرار و سازگاری نگهداری شدند.
این پژوهش به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار و در هر پتریدیش 15 لایه نازک سلولی (3 پتریدیش یک تکرار) اجرا شد. عامل اول رقم و عامل دوم چهار غلظت 2,4-D بود. تجزیه واریانس صفات با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 16 و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون چند دامنه ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج
مراحل ریختزایی از کشت لایه نازک سلولی هیپوکوتیل در رقمهای Karysary و Rangelander پس از 4 - 5 روز علایم شروع کالوسزایی از ریزنمونههای لایه نازک سلولی بر روی محیطکشت SH مشاهده شد (شکل 1-A). در همه نمونهها، تشکیل کالوس در شرایط تاریکی به خوبی صورت گرفت.
کالوسهای ایجاد شده به از نظر شکل ظاهری، نرمی و سفتی بافت، متفاوت بودند. کالوسها بیشتر دارای رنگ کرمی و کمی آبدار بوده، ساختار بافتی آنها به راحتی از هم جدا و قطعه قطعه میشد. پس از واکشت، کالوسها به رشد خود ادامه دادند (شکل 1-B). بسته به غلظت 2,4-D در محیطکشت جنینزایی، جنینهای کروی شکل به طور مستقیم روی ریز نمونه (شکل 1-C) یا به طور غیر مستقیم روی کالوسها (شکل 1-D) تولید شد. شکل 1-D رنگآمیزی جنینهای سوماتیکی با استفاده از آبی متیلن را نشان میدهد. جنینهای کروی پس از انتقال به محیطکشت تکامل جنین، مراحل نموی را که شامل جنین کروی سبز (شکل 1-E)، قلبی شکل (شکل 1-F)، نیزهای شکل (شکل 1-G) و لپهای (شکل 1-H) بود، طی کردند. در نهایت، در محیطکشت MS½ حاوی GA3 گیاهچه تولید شد (شکل 1-I).
شکل 1- مراحل آغازش کالوس و جنینزایی سوماتیکی در یونجه رقم Rangelander؛ (A مرحله آغاز کالوسزایی از رقم Karysary، 3 - 5 روز بعد از کشت؛ (B رشد کالوس در واکشت اول بر روی محیطکشت SH؛ (C تشکیل جنینزایی سوماتیکی به طور مستقیم بر روی ریز نمونهها و بدون کالوسزایی؛ (D تشکیل جنینهای کروی شکل به طور غیر مستقیم روی کالوس با استفاده از رنگ آمیزی آبی متیلن؛ (E مرحله جنین کروی شکل در محیطکشت تکامل جنین BOi2Y؛
(F مرحله قلبی شکل جنین سوماتیکی در محیطکشت تکامل جنین BOi2Y؛ (G جنین نیزهای شکل در محیطکشت تکامل جنین؛ (H جنین در مرحله لپهای در محیطکشت تکامل جنین؛ (I مرحله رشد و نمو جنین سوماتیکی و تشکیل گیاهچه.
کالوسزایی در همه ریز نمونههای کشت شده به طور کامل انجام شد (100 درصد کالوسزایی) و رشد کالوسهای تولیدی در همه واحدهای آزمایشی به طور یکسانی انجام و تفاوت اندکی بین قطر کالوسها از یک ریز نمونه به ریز نمونه دیگر و حتی از یک پتریدیش به پتریدیش دیگر مشاهده شد. همان طور که در شکل 2 ملاحظه میشود، در هر دو رقم، جنینزایی سوماتیکی از کشت لایه نازک سلولی هیپوکوتیل در محیطکشت جنینزایی فاقد 2,4-D اتفاق افتاد (ولی با فراوانی کمتر).
نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تفاوت معنیداری بین غلظتهای مختلف 2,4-D از نظر درصد جنینزایی سوماتیکی وجود دارد (01/0p<) (جدول 1). مقایسه میانگین غلظتهای مختلف 2,4-D نشان داد که درصد جنینزایی سوماتیکی از نوع رقم هم متأثر شد (01/0p<) (جدول 1). به طوری که درصد جنینزایی سوماتیکی از 20 تا 56 درصد در رقم Karysary و از 32 تا 65 درصد در رقم Rangelander متغیر بود. به عبارت دیگر، رقم Rangelander از درصد جنینزایی سوماتیکی بیشتری نسبت به رقم Karysary برخوردار بود (جدول 2). اثر متقابل 2,4-D و رقم بر درصد جنینزایی سوماتیکی معنیدار نبوده (05/0p<)، این دو عامل مستقل از هم بر درصد جنینزایی سوماتیکی مؤثر بودند (جدول 1). در تیمار شاهد (محیطکشت القای جنین فاقد 2,4-D)، درصد جنینزایی سوماتیکی در رقم Karysary، 21 درصد و در رقم Rangelander، 38 درصد بود که به طور معنیداری از درصد جنینزایی سوماتیکی در محیطهای کشت دارای غلظتهای 2,4-D، کمتر بود و این امر نشان میدهد که وجود 2,4-D برای بهبود و افزایش جنینزایی سوماتیکی در یونجه ضروری است (شکل 2).
تعداد جنین در هر کالوس به طور معنیداری از نوع رقم و غلظتهای مختلف 2,4-D متأثر شد (01/0p<). با این حال، اثر متقابل این دو عامل از نظر تعداد جنین در هر کالوس معنیدار نبود (جدول 1). به عبارت دیگر، غلظتهای مختلف 2,4-D اثر یکسانی در هر دو رقم از نظر تعداد جنین در هر کالوس داشتند. بر این اساس، در هر دو رقم حداقل تعداد جنین در هر کالوس در غلظت صفر
2,4-D (تیمار شاهد) به دست آمد. با افزایش 2,4-D تا غلظت 10 میلیگرم در لیتر، افزایش معنیداری در تعداد جنین ملاحظه گردید. در غلظت بالاتر از 10 میلیگرم در لیتر کاهش معنیداری از نظر این صفت رخ داد و میتوان غلظت 10 میلیگرم در لیتر را به عنوان غلظت مناسب برای افزایش تعداد جنین در هر کالوس در نظر گرفت (شکل 11). تعداد جنین تولیدی در هر کالوس از نوع رقم متأثر شده، رقم Rangelander نسبت به Karysary از تعداد جنین در هر کالوس بیشتری برخوردار بود که نشاندهنده استعداد ژنتیکی رقم Rangelander است (جدول 2).
جدول 1- تجزیه واریانس صفات اندازهگیری شده در دو رقم و چهار غلظت 2,4-D
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
تعداد جنین در هر کالوس |
جنینزایی سوماتیکی |
تعداد گیاه باززایی شده |
|
2,4-D |
3 |
**040/1 |
**129/0 |
**375/177 |
|
رقم |
3 |
**36/1 |
**122/ |
ns167/4 |
|
2,4-D × رقم |
3 |
ns110/0 |
ns849/0 |
*819/67 |
|
خطای آزمایشی |
16 |
16069/0 |
31/2 |
56/20 |
* و **به ترتیب معنیدار در سطح احتمال 5 و 1 درصد ns غیر معنیدار
جدول 2- متوسط صفات اندازهگیری شده در دو رقم یونجه
|
رقم |
تعداد جنین در هر کالوس |
جنینزایی سوماتیکی (%) |
تعداد گیاه باززایی شده |
|
Karysary |
b338/0± 934/0 |
b3/17 ± 5/44 |
a22/8 ± 58/17 |
|
Rangelander |
a547/0 ± 411/1 |
a4/20 ± 8/58 |
a24/5± 667/17 |
حروف غیر مشابه در هر ستون نشاندهنده اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 درصد است.
غلظتهای مختلف 2,4-D و اثر متقابل رقم×2,4-D
تأثیر معنیداری روی باززایی گیاه داشتند (05/0p<) (جدول 1). باززایی گیاه از جنینهای سوماتیکی در محیطکشت فاقد (تیمار شاهد) و دارای 2,4-D مشاهده شد. تعداد گیاه باززایی شده در محیطکشت فاقد 2,4-D (تیمار شاهد) و 15 میلیگرم در لیتر حداقل بوده، با دو غلظت 5 و 10 که از حداکثر باززایی گیاه بر خوردار بودند، تفاوت معنیداری نشان دادند (شکل 4). بین دو رقم از نظر تعداد گیاه باززایی شده در غلظت صفر و 5 میلیگرم در لیتر
2,4-D تفاوت معنیداری وجود داشت و در دو غلظت دیگر 2,4-D، تعداد گیاه باززایی شده در هر دو رقم یکسان بود و بنابراین، غلظتهای مختلف 2,4-D بیشترین نقش را در جنینزایی سوماتیکی از لایه نازک سلولی هیپوکوتیل ایفا کردند (شکل 4).
|
شکل2- متوسط درصد جنینزایی سوماتیکی در دو رقم یونجه (Karysary و Rangelander) در غلظتهای مختلف 2,4-D |
|
شکل 3- متوسط تعداد جنین در هر کالوس در دو رقم یونجه (Karysary و Rangelander) در غلظتهای مختلف 2,4-D |
|
شکل 4- متوسط تعداد گیاه باززایی شده در دو رقم و در غلظتهای مختلف 2,4-D |
بحث
استفاده از لایه نازک سلولی در مقایسه با ریزنمونههای بزرگتر مانند قطعات برگ، هیپوکوتیل، لپه و ... به عنوان یک ریز نمونه که دارای سلولهای مشابه از نظر سطح داخلی هورمونهای گیاهی است، میتواند مشکلات مربوط به نحوه ریختزایی از سلولهای گیاهی را بر طرف کرده، و به بررسی دقیق عوامل دخیل در فرآیندهای ریختزایی کمک کند. در این راستا، در تحقیق حاضر، فرآیند ریختزایی از کشت لایه نازک سلولی هیپوکوتیل بررسی گردید. پس از کشت ریز نمونه لایه نازک سلولی در همه ریز نمونهها کالوسزایی انجام شد که نشاندهنده پاسخ بهتر لایه نازک سلولی به محیطکشت کالوسزایی است. از طرف دیگر، کشت لایه نازک سلولی به ما اجازه میدهد که در کمترین زمان بتوانیم فرآیند جنینزایی سوماتیکی را بدون نیاز به رنگآمیزی و تخریب بافت مطالعه کنیم. در این تحقیق، همه مراحل جنینزایی سوماتیکی از کالوس مشاهده و بررسی شد. کالوسهای حاصل به علت جذب سریعتر مواد، نسبت به کالوسهای حاصل از قطعات بزرگتر رشد بهتری داشتند، بعلاوه، تشکیل جنین از کشت لایه نازک سلولی سریعتر صورت میگیرد. در تحقیقی مشابه، مشخص شد که رشد کالوس حاصل از کشت هیپوکوتیل وابسته به نوع ترکیب هورمونی محیطکشت بود (مطلبی آذر و جعفری مفید آبادی، 1379). بنابراین، در یونجه، لایه نازک سلولی برای کالوسزایی و رشد آن یک ریز نمونه بسیار مناسب است. یکی از دلایل آن میتواند نحوه قرارگیری بهتر ریز نمونه و جذب بهتر و سریعتر مواد و ترکیبات شیمیایی محیطکشت باشد. بعلاوه برتری سیستم کشت لایه سلولی این است که لایه نازک، حاوی سلولهای مشابه است و میتواند تمام الگوهای ریختزایی را آغاز کند، اما تنها یک الگو را در هر تیمار نشان میدهد (Keim and Tran, 1981). با توجه به این که 20 لایه نازک سلولی از هر یک سانتیمتر هیپوکوتیل به دست میآید، لذا تعداد کالوسهای تولید شده از هر دانهرُست افزایش مییابد. این در حالی است که در کشتهای معمولی، یک سانتیمتر هیپوکوتیل به عنوان یک ریز نمونه به کار میرود. علاوه بر این، فراوانی بالا و زمان کوتاه دستیابی به کالوس میتواند یکی از مزیتهای این روش در مطالعات سلولی در یونجه محسوب شود. افزون برآن، زمان دستیابی به کالوس نسبت به حالتی که از قطعات بزرگتر استفاده میکنیم نیز کمتر است.
با توجه به اینکه جنینزایی سوماتیکی در محیطکشت دارا و فاقد 2,4-D انجام شد، بنابراین، این امکان وجود دارد که لایه نازک سلولی هیپوکوتیل، ترکیبات هورمونی لازم برای کالوسزایی و جنینزایی سوماتیکی را دارا باشد. مطالعات مربوط به کشت لایه نازک سلولی در گونههای جنس Citrus (Carimi et al., 1999) و کلزا (Shu and Loh, 1991) نشان داد که امکان تولید جنین سوماتیکی در محیطکشت فاقد تنظیمکنندههای رشدی وجود دارد. با این حال، در سایر گیاهان چنین پدیدهای مشاهده نشده است (McCoy and Walker, 1984).
وجود 2,4-D در محیطکشت جنینزایی به عنوان یک عامل تنشزا مطرح بوده، میتواند باعث شروع برخی از فرآیندهای مربوط به تشکیل سلولهای پیش جنینی شود. بنابراین، درصد جنینزایی سوماتیکی در تمامی تیمارهای حاوی 2,4-D به طور معنیداری بیشتر از محیطکشت فاقد این هورمون بود که مؤید اثر مثبت 2,4-D بر جنینزایی سوماتیکی است که قبلاً نیز گزارش شده است
(McKersie and Brown, 1997). با توجه به منابع موجود، تولید ریشه و جنین سوماتیکی، از مهمترین مشخصات حضور اکسین در محیطهای کشت است (احسانپور و امینی، 1379). مطالعات نشان داده است که پاسخ به شرایط محیطکشت به نوع رقم نیز مرتبط میگردد؛ به طوری که از پنج رقم یونجه در محیطکشت SH حاوی 2,4-D بالا و kin پایین، پس از انتقال به محیطکشت BOi2Y تنها رقم Rangelander قادر به تولید جنین سوماتیکی بود .(Mariza, et al., 2003)درصد جنینزایی سوماتیکی در تیمارهای حاوی 2,4-D از 63 - 65 درصد متغیر بود و اختلاف معنیداری بین سه غلظت 5، 10 و 15 میلیگرم بر لیتر 2,4-D مشاهده نشد و بنابراین، به نظر میرسد که برای جنینزایی سوماتیکی از کشت لایه نازک سلولی غلظت
5 میلیگرم بر لیتر 2,4-D کافی باشد. این در حالی است که درصد جنینزایی سوماتیکی از کشت هیپوکوتیل در
2 میلیگرم در لیتر 2,4-D، 34 درصد، گزارش شده است (مطلبی آذر و جعفری مفید آبادی، 1379). به عبارت دیگر، درصد جنینزایی سوماتیکی در کشتهای هیپوکوتیل کمتر از لایه نازک سلولی هیپوکوتیل است. بالا بودن درصد جنینزایی سوماتیکی رقم Rangelander نسبت به رقم Karysary نشاندهنده نقش ژنوتیپ گیاه مادری روی پاسخ به کشت بافت است (مطلبی آذر و جعفری مفید آبادی، 1379؛ Hussain et al., 2003). با این حال، در این تحقیق، دو رقم مورد بررسی پاسخهای مشابهی را به غلظتهای مختلف 2,4-D نشان دادند.
در صورت فراهم بودن شرایط مناسب برای جنینزایی سوماتیکی، معمولاً بیش از یک جنین از سلولهای کالوس منشأ میگیرد و هر چقدر تعداد جنین در هر کالوس بیشتر باشد، محیطکشت از لحاظ جنینزایی بهینهتر است. در این تحقیق، در هر دو رقم 10 میلیگرم بر لیتر 2,4-D از تعداد جنین در هر کالوس بیشتر نسبت به بقیه غلظتها برخوردار بود. باززایی گیاه، آخرین و مهمترین مرحله در کشت بافت گیاهی است و برآیند همه عوامل مؤثر در جنینزایی سوماتیکی در تعداد گیاهان باززایی شده تجلی پیدا میکند و به نظر میرسد که غلظت 5 میلیگرم در لیتر 2,4-D با داشتن حداکثر تعداد گیاه کامل تولیدی، میتواند غلظت مناسبی برای جنینزایی سوماتیکی در هر دو رقم محسوب شود.
جمعبندی
نوع ریز نمونه و اثر متقابل آن با نوع ژنوتیپ و ترکیبات هورمونی محیطکشت بر کالوسزایی و جنینزایی سوماتیکی یونجه مؤثرند. تاکنون از لایه نازک سلولی به عنوان ریز نمونه در کشت بافت یونجه استفاده نشده است. این تحقیق نشان داد که با استفاده از کشت لایه نازک سلولی هیپوکوتیل، میتوان مراحل ریختزایی را در شرایط in vitroمشاهده نمود. 2,4-D مهمترین نقش را در جنینزایی سوماتیکی یونجه داشته، غلظتهای مختلف آن واکنشهای متفاوتی را باعث میگردد. در این مطالعه مشخص گردید که در هر دو رقم مورد مطالعه، 5 و 10 میلیگرم در لیتر 2,4-D میتواند به عنوان غلظتهای بهینه برای بهبود جنینزایی سوماتیکی از کشت لایه نازک سلولی، به کار رود.
)
