Authors
Department of Biology, Faculty of Sciences, Shahid Bahonar University, Kerman, Iran
Abstract
Keywords
آرسنیک، عنصری سمّی برای گیاهان و جانوران است که از طریق منابعی مانند سموم، کودها، مواد نگهدارنده چوب، سوختن زغال سنگ، معادن آرسنیک و طلا، احتراق سوختهای فسیلی و فعالیتهای صنعتی و کشاورزی در محیط انتشار مییابد (Gomez-Caminero et al., 2001). آرسنیک معدنی باعث تولید گونه فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species, ROS) در گیاهان میشود. ROS میتواند به طور مستقیم سبب تخریب آمینواسیدها، پروتئینها، نوکلئیک اسیدها و تحریک پراکسیداسیون لیپیدهای غشا گردد. تحریک آنتیاکسیدانهای آنزیمی و غیر آنزیمی، مکانیسم دفاعی گیاهان برای خاموش کردن ROS است. بر اساس گزارشهای به دست آمده، آرسنیک باعث کاهش میزان فتوسنتز، تعرق گیاه، مهار جوانهزنی، کاهش رشد، تخریب غشای کلروپلاستی و افزایش پراکسیداسیون لیپیدها میگردد (Stoeva and Bineva, 2003). سالیسیلیکاسید هورمونی است که نقش مهمی در مقاومت به تنشهای زیستی و غیر زیستی ایفا میکند و بر رشد گیاه، جوانهزنی دانه، ساختار غشا، جذب و انتقال یون، نرخ فتوسنتز، هدایت روزنهای، مقدار کلروفیل، گلدهی و رسیدن میوه نیز تأثیر میگذارد (Belkhadi et al., 2010). بررسیها نشان داده است که سالیسیلیکاسید باعث تغییر پاسخ گیاهان به سرما، دمای بالا، تنش شوری، تنش اسمزی و علفکشها میگردد و رشد گیاه را تحت این شرایط بهبود میبخشد (Belkhadi et al., 2010)، همچنین سالیسیلیکاسید تأثیرات تخریبی فلزات سنگین بر رشد را نیز تعدیل میکند (Drazic and Mihailovic, 2005). برای مثال، کاربرد سالیسیلیکاسید، تخریب غشای ایجاد شده توسط سرب در گیاه برنج (Mishra and Choudhuri, 1999)، سمّیت منگنز در گیاه خیار (Shi and Zhu, 2008)، تنش اکسیداتیو القا شده توسط جیوه در گیاه یونجه (Zhou et al., 2009)، سمّیت کادمیوم در گیاهان جو و ذرت (Metwally et al., 2003) را بهبود بخشیده است، اما آزمایشهایی در زمینه اثر سالیسیلیکاسید در بهبود سمّیت آرسنیک انجام نگرفته است.
گیاهان دارویی از اهمّیت خاصی در تأمین بهداشت و سلامت جامعه برخوردارند و در سالهای اخیر رویکردی همه جانبه برای استفاده از داروهایی با منشأ طبیعی و خصوصاً گیاهی در جوامع مختلف جهان پدید آمده است. از سوی دیگر، جهان در معرض خطر فلزات سنگین قرار دارد و ورود عناصر سنگین سمّی مانند آرسنیک به چرخه زندگی گیاهان و سایر موجودات زنده و افزایش آلودگی محیطزیست امری اجتنابناپذیر است، لذا در این پژوهش اثر سالیسیلیکاسید بر کاهش میزان سمّیت ناشی از فلز سنگین آرسنیک در گیاه بابونه مطالعه گردیده است.
مواد و روشها
در این پژوهش، بذرهای بابونه (Matricaria recutita)در گلدانهای حاوی پرلیت کاشته شدند. این آزمایش در شرایط گلخانهای و با سه تکرار انجام گرفت. در مدت رشد، گلدان ها هفتهای سه بار با 70 میلیلیتر محلول غذایی لانگ – اشتون با رقت 2:1 و اسیدیته 5/6 آبیاری شدند و پس از دو ماه، به مدت 10 روز با غلظتهای مختلف سالیسیلیکاسید (0، 1/0 و 5/0 میلیمولار) افشانهسازی شدند. سپس هفتهای سه بار و به مدت 14 روز با محلولهای سدیم آرسنیک
(0، 10، 45 و 80 میکرومولار) تیمار گردیدند (Shi and Zhu, 2008).
اندازهگیری وزن تر اندام هوایی
برای اندازهگیری وزن تر گیاهان، ابتدا اندام هوایی هر گیاه از ریشه جدا شده و وزن تر هر یک از گیاهان با ترازوی دقیق آزمایشگاهی Sartarius مدل BP211D با دقت 001/0 اندازهگیری شد.
اندازهگیری مقدار رنگیزههای فتوسنتزی گیاه
بر اساس روش Lichtenthaler (1987)، 2/0 گرم از برگهای تازه گیاه در هاون چینی حاوی 15 میلیلیتر استون 80 درصد ساییده شد و جذب نمونهها در طول موجهای 8 /646، 2 /663 و 470 نانومتر خوانده شد. غلظت رنگیزههای فتوسنتزی از رابطههای زیر محاسبه گردید:
Chl. a = (12.25 A663.2 – 2.79 A646.8)
Chl. b = (21.21 A646.8 – 5.1 A663.2)
Chl. T = Chl. a + Chl. b
Car = ((1000 A470 – 1.8 Chl. a – 85.02 Chl. b) / 198)
سنجش میزان آنتوسیانینها
برای سنجش میزان آنتوسیانینها از روش Wagner (1979) استفاده شد. به این منظور، 1/0 گرم از بافت تازه برگی در هاون چینی با 10 میلیلیتر متانول اسیدی (متیل الکل و کلریدریکاسید خالص با نسبت حجمی 1:99) کاملاً ساییده شد و پس از سانتریفیوژ، جذب محلول بالایی در طول موج 550 نانومتر محاسبه شد. مقدار آنتوسیانین با استفاده از فرمول A=εbc به دست آمد. در این رابطه، A: شدت جذب، b: عرض کوت برابر با 1 سانتیمتر، c: غلظت آنتوسیانین (mol/g) و
ε: ضریب خاموشی برابر با mol-1 cm-1 33000 است.
اندازهگیری مقدار قندهای احیا کننده
مقدار قندهای احیا کننده به روش Somogy (1952) اندازهگیری شد. به منظور تهیه عصاره گیاهی، 5/. گرم از بافت تازه برگ در هاون چینی حاوی
10 میلیلیتر آب مقطر ساییده شد. سپس محتوای هاون به بشری منتقل گردید و روی اجاق برقی حرارت داده شد تا به نقطه جوش برسد. در این مرحله محتوای بشر با کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف گردید و در نهایت عصاره گیاهی به دست آمد. سپس 2 میلیلیتر از عصاره تهیه شده به لوله آزمایش منتقل و 2 میلیلیتر محلول سولفات مس به آن اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از سرد شدن لولهها، 2 میلیلیتر محلول فسفومولیبدیک اسید افزوده شد و در نهایت، شدت جذب محلولها در طول موج 600 نانومتر تعیین شد و نتایج بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر بیان گردید.
اندازهگیری مقدار سایر آلدئیدها (پروپانال، بوتانال، هگزانال، هپتانال و پروپانال دیمتیل استال)
سنجش مقدار این آلدئیدها بر اساس روش Meirs و همکاران (1992) انجام گرفت. مطابق این روش
2/0 گرم بافت تازه برگی در 5 میلیلیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 1/0 درصد ساییده شد. سپس به
1 میلیلیتر از محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ،
4 میلیلیتر محلول TCA 20 درصد که حاوی
5/0 درصد TBA بود اضافه شد. پس از حرارت دادن مخلوط حاصل و سانتریفیوژ در g 1000، شدت جذب این محلول در طول موج 455 نانومتر خوانده شد. جذب سایر رنگیزههای غیر اختصاصی در 600 نانومتر خوانده شد و از این مقدار کسر گردید. برای محاسبه غلظت این آلدئیدها از فرمول A=εbc استفاده شد. در این رابطه A: شدت جذب، b: عرض کوت،
c: غلظت مالون دآلدئید (mol/g) و ε: ضریب خاموشی معادل mol-1cm-1 105 × 458/0 است.
اندازهگیری مقدار پراکسید هیدروژن
در روش Alexieva و همکاران (2001) مقدار پراکسید هیدروژن بر اساس واکنش H2O2 با یدید پتاسیم (KI) تعیین گردیده است. در این روش
500 میلیگرم از بافت تازه برگ در 5 میلیلیتر TCA 1/0 درصد در حمام آب یخ ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در g 12000 سانتریفیوژ گردید. سپس به 5/0 میلیلیتر از محلول رویی، 5/0 میلیلیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلیمولار و اسیدیته 5/7 و
1 میلیلیتر یدید پتاسیم 1 مولار اضافه گردید. مخلوط واکنش به مدت یک ساعت در تاریکی در دمای اتاق قرار داده و سپس جذب نمونهها در 390 نانومتر اندازهگیری شد.
تعیین میزان یون آرسنیک در اندام هوایی به روش جذب اتمی
در این روش 25/0 گرم از بافت خشک اندام هوایی در 5 میلیلیتر نیتریک اسید غلیظ حل گردید و نمونهها به مدت 24 ساعت در آزمایشگاه قرار داده شدند تا بافت گیاهی به خوبی در اسید حل شود. سپس محلول حاصل به مدت 1 ساعت در دمای 150 درجه سانتیگراد گرم گردید و پس از سرد شدن، 2 میلیلیتر آب اکسیژنه 30 درصد به محلول اضافه شد و به مدت 2 ساعت در حرارت 150 درجه سانتیگراد گرم گردید. سپس حجم محلول به 50 میلیلیتر رسانده و از کاغذ صافی عبور داده شد. از محلول شفاف رویی برای اندازهگیری مقدار یون مورد نظر در دستگاه جذب اتمی (Atomic Absorbtion Spectrometer) مدل Spectra AA 220 ساخت کشور استرالیا استفاده گردید (Khan et al., 2009).
تجزیه و تحلیل آماری
این پژوهش در قالب یک آزمایش فاکتوریل با طرح کاملاً تصادفی انجام شد. آنالیز دادهها با استفاده از نرمافزار آماری SPSS نسخه 5/11 صورت گرفت. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد و رسم نمودارها با استفاده از نرمافزار Excel انجام پذیرفت.
نتیجهگیری
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر وزن تر اندام هوایی
با توجه به شکل 1، تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک مانع از کاهش وزن تر ناشی از آرسنیک نسبت به گیاهان تیمار نیافته با سالیسیلیکاسید گردید. البته، در تیمارهای همزمان فقط تیمار همزمان سالیسیلیکاسید (1/0 و 5/0 میلیمولار) و آرسنیک
45 میکرومولار معنیدار بود. مطالعات انجام شده بر گیاه ذرت نیز نشان داده است که کاربرد سالیسیلیکاسید سبب تحریک رشد در این گیاهان میشود و مهار رشد القا شده از طریق تنشهای غیرزیستی (تنش کم آبی، شوری، سرما، فلز سنگین و غیره) در گونههای مختلف ذرت را خنثی میکند (Belkhadi et al., 2010). اثر بهبودی سالیسیلیکاسید بر رشد گیاهان تحت تنش غیرزیستی میتواند به نقش آن در جذب مواد غذایی، ارتباط آبی، تنظیم روزنهای، نرخ فتوسنتز و مقدار کلروفیل مربوط باشد (Noreen and Ashraf, 2008). همچنین گزارش شده است که علت تحریک رشد توسط سالیسیلیکاسید میتواند به افزایش آنتیاکسیدانهای سلول مربوط باشد که گیاهان را در برابر تخریب اکسیداتیو ناشی از فلز سنگین حفاظت مینماید (El-Tayeb, 2005).
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر محتوای کلروفیل کل
بر اساس نتایج به دست آمده، تیمار آرسنیک به تنهایی در غلظت 80 میکرومولار محتوای کلروفیل کل را کاهش داد، ولی کاربرد آن به طور همزمان با سالیسیلیکاسید مانع از این اثر کاهشی شد (شکل 2). پیشتیمار سالیسیلیکاسید در گیاهچههای برنج تحت تنش سرب باعث افزایش مقدار کلروفیل شده است (Jing et al., 2007). در رابطه با نتایج حاصل از مطالعه سالیسیلیکاسید بر گیاهچههای جو تحت سمّیت کادمیوم نیز گزارش مشابهی وجود دارد (Metwally et al.,2003). سالیسیلیکاسید بسته به غلظت، زمان و گیاه مورد استفاده دارای آثار دو گانهای است، اما در غلظتهای مناسب با کاهش تخریب رنگیزه کلروفیل (Belkhadi et al., 2010)، افزایش توان آنتیاکسیدانی سلول، سنتز پروتئینهای جدید از دستگاه فتوسنتزی حمایت کند (Popova et al., 2003).
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر محتوای کاروتنوئید
با توجه به شکل 3، تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک تأثیر معنیداری بر محتوای کاروتنوئیدی بابونه نداشته است. کاروتنوئیدها معمولاً دارای نقشی عملکردی در خاموش کردن اکسیژن یکتایی و جاروب کردن رادیکالهای آزاد هستند که به علت توانایی آنها در انتقال انرژی در فتوسنتز و نقش حفاظت نوری آنهاست (Jithesh et al., 2006). به نظر میرسد که افشانهسازی سالیسیلیکاسید با افزایش توان آنتیاکسیدانی بابونه از جمله کاروتنوئیدها موجب کاهش مقدار پراکسیداسیون لیپیدها و مقدار H2O2 و حفاظت بیشتر از غشاهای سلولی و فتوسنتزی و رنگیزههای فتوسنتزی شده و از کاتابولیسم کلروفیل جلوگیری کرده است (Costa et al., 2005).
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر مقدار آنتوسیانین
مطابق شکل 4، تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک 80 میکرومولار نسبت به گیاهان تیمار نیافته با سالیسیلیکاسید معنیدار بود و باعث افزایش معنیدار مقدار آنتوسیانینها گردید. ترکیبات فنولی شامل لیگنینها، فنولیک اسیدها، کومارینها، آنتوسیانینها و فلاونوئیدها از مسیر فنیل پروپانوئید سنتز میشوند. این متابولیتهای ثانویه میتوانند به عنوان آنتیاکسیدان، خاموشکننده و یا جاروبکننده رادیکالهای آزاد در گیاهان عمل کنند (Solecka, 1997). افزایش میزان آنتوسیانینها احتمالاً به دلیل افزایش فعالیت آنزیم PAL است (Chen et al., 2006) از طرف دیگر، لیگنین نیز به عنوان یکی از ترکیبات فنلی در مسیر فنیل پروپانوئید سنتز میشود تغییر در مسیر سنتز این ترکیب نیز در طی پیشتیمار سالیسیلیکاسید میتواند یکی از دلایل تغییر در مقدار ترکیبات فنلی باشد.
شکل 1- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر وزن تر اندام هوایی گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
شکل 2- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر محتوای کلروفیل کل گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
|
|
شکل 3- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر محتوای کاروتنوئید گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
شکل 4- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر مقدار آنتوسیانین گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر مقدار کربوهیدراتهای احیا کننده
با توجه به شکل 5، کاربرد همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک 45 میکرومولار نسبت به گیاهان تیمار نشده با سالیسیلیکاسید معنیدار است و باعث افزایش معنیدار مقدار قند میگردد. غلظت بالای کربوهیدراتها باعث کاهش خسارتهای اکسیداتیو و حفظ ساختار پروتئین در طی کمبود آب محسوب میشود. به نظر میرسد که سالیسیلیکاسید با افزایش مقدار رنگیزههای فتوسنتزی، کاهش تنش اکسیداتیو و حفاظت از غشاهای کلروپلاستی و سلولی و حفاظت از ماکرومولکولهایی، نظیر پروتئینها، موجب افزایش میزان قندهای موجود در گیاهان میشود و قندها علاوه بر نقشهای اصلی خود، در تنظیم اسمزی نیز به گیاهان کمک میکنند (Khodary, 2004).
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر مقدار سایر آلدئیدهای غشا
کاربرد همزمان سالیسیلیکاسید 5/0 میلیمولار و آرسنیک 45 و 80 میکرومولار معنیدار بود و باعث کاهش معنیدار آلدئیدها نسبت به گیاهان بدون سالیسیلیکاسید گردید (شکل 6). به نظر میرسد که فلزات سنگین باعث تولید رادیکالهای آزاد میشوند و این رادیکالها با اثر بر پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیر اشباع در غشا، واکنشهای زنجیرهای پراکسیداسیون را تحریک کرده، به تخریب اسیدهای چرب و افزایش میزان آلدئیدهای غشا منجر میگردد (Candan and Tarhan, 2003). پیشتیمار دانههای کتان با سالیسیلیکاسید نیز باعث بهبود تأثیرات تخریبی ناشی از کادمیوم بر میزان پراکسیداسیون لیپیدها گردیده است. تأثیرات سودمند سالیسیلیکاسید میتواند به افزایش فعالیت مکانیسمهای دفاعی، مانند آنزیمهای آنتیاکسیدان مربوط باشد. از طرف دیگر، سالیسیلیکاسید ترکیب جاروبکننده (Scavenger) مستقیم رادیکالهای هیدروکسیل و همبندکننده آهن است و اثر تخریبی رادیکالهای هیدروکسیل ناشی از واکنش فنتون را کاهش میدهد (Dinis et al., 1994).
شکل 5- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر مقدار کربوهیدراتهای احیا کننده گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
شکل 6- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر مقدار سایر آلدئیدهای اندام هوایی گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر مقدار پراکسید هیدروژن
با توجه به شکل 7، تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک تنها در تیمار همزمان سالیسیلیکاسید
1/0 میلیمولار و آرسنیک 80 میکرومولار معنیدار است و باعث کاهش معنیدار پراکسیدهیدروژن بافت نسبت به گیاهان بدون سالیسیلیکاسید گردیده است. مطالعات انجام شده نشان داده است که نقش سالیسیلیکاسید در کاهش تجمع H2O2 در گیاهان تحت تنش فلز سنگین، احتمالاً مربوط به تنظیم فعالیت آنزیمها یا آنتیاکسیدانهای غیر از آنزیمکاتالاز (CAT) و آسکوربات پراکسیداز (APX) است، چون پیشتیمار سالیسیلیکاسید باعث کاهش معنیدار فعالیت آنزیمهای CAT و APX در گیاهچههای در معرض سرب (Jing et al., 2007) و افزایش فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز (SOD) در گیاهان ذرت شده است .(Krantev et al., 2008)
اثر برهمکنش آرسنیک و سالیسیلیکاسید بر مقدار تجمع آرسنیک در اندام هوایی گیاه بابونه
با توجه به شکل 8، تیمار همزمان در اکثر موارد، به جز در تیمار همزمان سالیسیلیکاسید (1/0 و 5/0 میلیمولار) و آرسنیک 10 میکرومولار معنیدار است و تیمار سالیسیلیکاسید باعث کاهش تجمع آرسنیک در بخش هوایی گردیده است. یکی از مکانیسمهای حفاظتی سالیسیلیکاسید در گیاهان تحت تنش فلز سنگین، کنترل جذب و انتقال فلز سنگین از طریق ریشه است. برای مثال، علت کاهش سمّیت کادمیوم در گیاهان تیمار شده با سالیسیلیکاسید میتواند به دلیل کاهش جذب کادمیوم و ممانعت از ورود این فلز و یا تحریک خروج کادمیوم از ریشهها باشد (Hall, 2002).
شکل 7- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر مقدار پراکسید هیدروژن گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
شکل 8- اثر تیمار همزمان سالیسیلیکاسید و آرسنیک بر تجمع آرسنیک در اندام هوایی گیاه بابونه، مقادیر میانگین 3 تکرار است، حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 است. |
نتیجهگیری کلی
نتایج این تحقیق نشان داد که افشانهسازی سالیسیلیکاسید در گیاهان بابونه در معرض آرسنیک باعث افزایش وزن تر بخش هوایی، رنگیزههای فتوسنتزی، مقدار آنتوسیانینها، مقدار قندهای احیاکننده شده است، در حالی که مقدار سایر آلدئیدها، تجمع آرسنیک و مقدار پراکسید هیدروژن نسبت به گیاهان بدون سالیسیلیکاسید کاهش یافته است. بنابراین، کاربرد خارجی سالیسیلیکاسید، مقاومت گیاهانی مانند بابونه را در برابر سمّیت آرسنیک تا حدودی افزایش میدهد.