Authors
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Islamic Azad University, Arsanjan Branch, Arsanjan, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Science, University of Shiraz, Shiraz, Iran
Abstract
Keywords
کیسههای ترشحی به طور طبیعی در تمام گونههای تیره مرکبات (Rutaceae) تشکیل میشوند و مهمترین صفت تشریحی این تیره هستند (Fahn, 1988). در جنس Citrus کیسههای ترشحی معمولاً غده روغنی نامیده میشوند و ساقه، مزوفیل برگ، اندامهای گل (به جز پرچمها) و برون بر میوه محل سنتز و تجمع اسانس هستند (Mauseth, 1988).
در رابطه با چگونگی تکوین کیسههای ترشحی اسانس در گونههای مختلف جنس Citrus اختلاف نظر وجود دارد. کتابهای معتبر آناتومی تشکیل حفره مرکزی کیسه را ناشی از شکستن و خرد شدن سلولها (Lysigeny) میدانند (Esau, 1977; Fahn, 1990). در عین حال، تشکیل فضای حاصل از جدا شدن سلولها (Schizogeny) در هنگام تقسیم سلولی (Turner et al., 1988; Knight et al., 2001) و یا ترکیبی از هر دو پدیده (Schizolysigeny)، که ابتدا فضا به وسیله جدا شدن سلولها تشکیل و سپس بر اثر خرد شدن سلولهای حفره عریض میشود، در تمایزیابی غدههای روغنی برگ و میوه انواع مرکبات گزارش شدهاند (Buvat, 1989; Bennici and Tani, 2004; Rafiei and Rajaei, 2007; Liang et al., 2009) . مسأله لیزیژن و یا شیزولیزیژن بودن کیسه ترشحی اسانس از اهمیت خاصی برخوردار است زیرا اتولیز سلولهای غده روغنی و آزادسازی ترشحات در فضای بین سلولی میتواند مثالی از پدیده مرگ برنامهریزی شده سلولی باشد.
گیاه لیموترش در طول سال گلدهی مکرر داشته، بدین لحاظ اهمیت اقتصادی ویژهای دارد (McGregore,1976). از طرفی، اسانس لیموترش هم به لحاظ طعم و هم رایحه، کاربرد بیشتری نسبت به اسانسهای سایر مرکبات دارد (Lawless, 1995). مطالعات ساختاری کیسههای ترشحی در لیموترش محدود به پوست میوه رسیده (Bennici and Tani, 2004) و برگ آن (Turner et al., 1998) میگردد و تاکنون گزارشی مبنی بر تکوین غدههای روغنی در طی فاز زایشی، از زمان تشکیل گل تا بلوغ میوه در گونه مورد نظر ارائه نشده است. پژوهش حاضر با هدف بررسی الگوی تمایزیابی کیسههای ترشحی اسانس و مطالعه رابطه بین تکوین اندامهای زایشی و نمو غدههای روغنی در لیموترش (Citrus limon (L.) Burm.f.) انجام شده است.
مواد و روشها
برای مطالعات ساختاری کیسههای ترشحی اسانس، نمونههای گل و پوست میوه لیموترش در 6 مرحله نموی (20 نمونه به ازای هر مرحله فنولوژیک)، شامل غنچه کوچک سبز رنگ (مرحله 1)، غنچه کروی با گلبرگهای سفید (مرحله 2)، گل باز شده قبل از لقاح (مرحله 3)، میوه سبز رنگ تازه تشکیل شده (مرحله 4)، میوه در مرحله تغییر رنگ (مرحله 5) و میوه رسیده (مرحله 6) از شهرستان خفر استان فارس جمعآوری شده و در قطعات 1×1×1 میلیمتری، پس از تثبیت مضاعف به وسیله گلوتار آلدئید 5 درصد و تتراکسید اسمیوم 1درصد در بافر فسفات 1/0 مولار، در سریهای مختلف استون آبگیری شدند. نفوذپذیری و قالبگیری در رزین (Epon-Araldite) انجام شده، سپس برشهای عرضی به ضخامت 5/0-1 میکرون توسط تیغ شیشهای اولترامیکروتوم LKB تهیه گردیدند. برشهای آماده شده، با دو روش 1) آبی تولوئیدین 1 درصد و 2) آبی متیلن- آزور ب- فوشین بازی رنگآمیزی شدند (Roland, 1978; Ruzin, 1999). برای مشاهده و عکسبرداری نمونهها از میکروسکوپ نوری مدل Zeiss مجهز به سیستم عکسبرداری آنالوگ Photoautomat استفاده شد.
نتایج
تکوین غدههای روغنی
بررسیهای میکروسکوپی پژوهش حاضر از کوچکترین اندازه غنچه آغاز شده، تا میوه کاملاً رسیده ادامه یافت. در این پژوهش، برشها به دو روش رنگآمیزی شدند که روش رنگآمیزی با آبی متیلن- آزور ب- فوشین بازی در مقایسه با آبی تولوئیدین، با تفکیک رنگ، مطالعه کیسههای ترشحی و تکوین آنها را آسانتر مینمود. طی این بررسی، کیسههای ترشحی کاسبرگ، گلبرگ و تخمدان لیموترش الگوی تکوینی مشابهی را نشان دادند.
با در نظر گرفتن ویژگیهای بافتی- سلولی، کیسههای ترشحی اسانس طی 4 مرحله مشخص تشکیل شده، به بلوغ نهایی رسیدند: ابتدا تعدادی از سلولهای اپیدرمی و زیر اپیدرمی شروع به تقسیم نمودند که این سلولها با هسته درشت تر و پروتوپلاسم متراکم تر از سلولهای پارانشیم زمینهای و یا پروتودرم قابل تشخیص بودند (مرحله 1- شکل 1). تقسیمات سلولی، همراه با افزایش ابعاد، تا زمانی ادامه یافت که یک خوشه سلولی کروی تا بیضی شکل با پایهای متصل به سلولهای اپیدرمی پدید آمد. سلولهای مرکزی کیسه نسبت به سلولهای اطراف درشتتر بوده، دیواره نازکتر، پروتوپلاسمی متراکمتر و میزان رنگپذیری بیشتری داشتند، اما سلولهای کناری کشیده تر با دیوارهای ضخیمتر بودند (مرحله 2- شکل 2). در این مرحله سلولهای خوشه فاقد فضای بین سلولی بودند. سپس روند تقسیمات در سلولهای کناری کیسه ادامه یافت و بر تعداد لایههای احاطهکننده افزوده شد. به طور همزمان، تحلیل سلولهای درونی کیسه ترشحی و تشکیل حفره مرکزی آغاز گشته (مرحله 3- شکل 3) و اندازه حفره با ادامه روند اتولیز افزایش یافت. با گسترش حفره مرکزی، سلولهای احاطهکننده آن به سمت لایههای خارجی فشرده شده و دارای شکل نامنظم شدند (شکل 4). در پایان، کیسه بالغ با حفره مرکزی گسترده که Secretory cells با دیواره سلولی نازک و پروتوپلاسم متراکم همانند غلافی حفره را احاطه می کردند، تشکیل شد (مرحله 4-شکل 5). از مرکز کیسه به طرف خارج، سلولهای کناری (Bordering cells) دیواره سلولی ضخیمتر، پروتوپلاسم رقیقتر و میزان رنگپذیری کمتری داشتند (شکل 6).
رابطه بین تکوین کیسه ترشحی و نمو اندامها
غدههای روغنی در کاسبرگ لیموترش خیلی زود تشکیل میشوند، به طوری که در کوچکترین اندازه غنچه نیز کیسههای بالغ در کاسبرگ مشاهده شدند. این کیسهها در قسمت پارانشیم زمینهای کاسبرگ واقع شده، به اپیدرم خارجی آن متصل بودند (شکل 7).
تشکیل کیسههای ترشحی گلبرگ نیز، نظیر کاسبرگ، از اولین مرحله نمو گل صورت گرفت (شکل 7). این کیسهها اغلب بدون پایه بودند که در پارانشیم زمینهای گلبرگ و در سطوح متفاوتی نسبت به اپیدرم خارجی آن متصل بودند. تمایزیابی و بلوغ کیسههای ترشحی همگام با تکوین گلبرگ انجام شد (شکل 8)، اما به طور همزمان تعدادی کیسه در حال تشکیل نیز مشاهده شد.
تشکیل کیسههای ترشحی تخمدان لیموترش، نسبت به کاسبرگ و گلبرگ، دیرتر آغاز شد. این کیسهها از دومین مرحله نمو گل (غنچه کروی با گلبرگهای سفید رنگ) در دیواره تخمدان بنیانگذاری شدند (شکل 1). غدههای روغنی تخمدان در نزدیکی اپیدرم بیرونی، و به تعداد بیشتری نسبت به کاسبرگ و گلبرگ شکل گرفتند. اغلب این غدهها بدون پایه (بدون اتصال به اپیدرم) و تعداد کمتری از آنها پایهدار بودند. در طی تکوین تخمدان بر تعداد کیسههای ترشحی بالغ (در مرحله 4 نمو) افزوده شد، اما همزمان تعدادی کیسه نیز در مراحل قبلی نموی مشاهده شدند.
پس از لقاح و تبدیل تخمدان به میوه، روند تشکیل کیسههای ترشحی اسانس تا پایان مرحله اول نمو میوه ادامه یافت. اکثر غدههای روغنی مشاهده شده در میوه سبز نارس لیموترش در مراحل پایانی تکوین خود مشاهده شدند (شکل 9). اما در مراحل بعدی نمو میوه تشکیل کیسههای ترشحی متوقف شده، تنها اندازه کیسهها افزایش یافت. تعداد لایههای احاطهکننده کیسه ترشحی با انجام تقسیمات فراوان افزایش یافته، خود سلولها نیز حجیم شدند و دیواره آنها نسبت به سلولهای پارانشیمی اطراف ضخیم تر شد، در حالی که سلولهای مرکزی دیواره نازکتر و سیتوپلاسم غلیظتری داشتند (شکل 10).
® شکلهای 1 تا 6 – مراحل تکوین کیسههای ترشحی اسانس در تخمدان لیموترش بر پایه برشهای عرضی (رنگآمیزی توسط آبی متیلن- آزور ب- فوشین بازی)؛ شکل 1- بنیانگذاری کیسه ترشحی. سلولهای تشکیلدهنده کیسه ترشحی (OG) نسبت به سلولهای اطراف هسته درشتتر، پروتوپلاسم غلیظتر و رنگپذیری بیشتری دارند. مقیاس =10 میکرومتر؛ شکل 2- مرحله دوم تکوین یک کیسه ترشحی. سلولهای مرکزی (*) نسبت به سلولهای اطراف درشتتر، دیواره نازکتر و پروتوپلاسم غلیظتر دارند، در حالی که سلولهای کناری (BC) کشیدهتر بوده، دیواره ضخیمتر دارند. نوک پیکانها تقسیمات سلولهای کناری را نشان میدهند. مقیاس = 25 میکرومتر؛ شکل 3- آغاز تحلیل سلولهای مرکزی کیسه ترشحی (*) با فرآیند اتولیز و ادامه تقسیمات در سلولهای کناری (نوک پیکانها). مقیاس = 25 میکرومتر؛ شکل 4- گسترش حفره مرکزی (OC) در فرآیند تکوین یک کیسه ترشحی. مقیاس= 25 میکرومتر؛ شکل 5- مرحله نهایی تکوین یک کیسه ترشحی. حفره مرکزی (OC) گسترده شده و سلولهای احاطهکننده ترشحی (SC) همانند غلافی حفره را در بر میگیرند (نوک پیکانها)، (سلولهای کناری=BC). مقیاس = 25 میکرومتر؛ شکل 6- در یک کیسه ترشحی بالغ، سلولهای کناری (BC) نسبت به سلولهای ترشحی احاطهکننده حفره (SC)، دیواره سلولی ضخیمتر، پروتوپلاسم رقیقتر و رنگپذیری کمتری دارند. OC = حفره مرکزی. مقیاس= 5 میکرومتر.
شکل 7- برش عرضی قسمتی از غنچه لیموترش در مرحله اول نمو گل. کیسههای ترشحی (OG) در کاسبرگ (S) و گلبرگ (P) از همان مرحله اول نمو گل شکل گرفته، در مراحل مختلف نموی مشاهده میشوند. رنگآمیزی توسط آبی متیلن- آزور ب- فوشین بازی. مقیاس = 25 میکرومتر؛
شکل 8- برش عرضی گلبرگ لیموترش در مرحله دوم نمو گل. کیسههای ترشحی در حال تمایز (*). رنگآمیزی توسط آبی متیلن- آزور ب- فوشین بازی. مقیاس = 25 میکرومتر؛ شکل 9- برش عرضی تخمدان لیموترش در مرحله اول نمو میوه. بیشتر کیسههای ترشحی اسانس در مراحل نهایی تکوین هستند (3 و 4). رنگآمیزی توسط آبی تولوئیدین. مقیاس = 50 میکرومتر؛ شکل 10- برش عرضی قسمتی از فرابر میوه رسیده لیموترش. به حجیم شدن سلولهای ترشحی (SC)، افزایش تعداد لایههای احاطهکننده کیسه ترشحی (BC) و ضخیم بودن دیواره سلولی آنها نسبت به سلولهای پارانشیمی (Pa) توجه شود. OC= حفره مرکزی. رنگآمیزی توسط آبی متیلن- آزور ب- فوشین بازی. مقیاس = 25 میکرومتر.
بحث و نتیجهگیری
گزارشهای ارائه شده از ویژگیهای بافتشناختی و کیسههای ترشحی اسانس در لیموترش تنها شامل برگ و میوه بالغ شده (Turner et al., 1998; Bennici and Tani, 2004)و نتایج پژوهش حاضر اولین گزارش در مورد تغییرات تکوینی گل و میوه و ارتباط آنها با غدههای روغنی در Citrus limon است.
در دید کلی، دو نوع کیسه ترشحی پایهدار و بدون پایه در اندامهای زایشی لیموترش مشاهده شدند، امّا با گرفتن برشهای پشت سر هم (Serial sectioning) مشخص شد که کلیه کیسههای ترشحی، صرفنظر از درجه بلوغ آنها، توسط پایهای غالباً مخروطی شکل به اپیدرم متصل هستند و بر اساس آن که برشگیری از چه منطقهای از کیسه صورت گرفته باشد، تعدادی از کیسهها پایهدار و تعدادی بدون پایه دیده میشوند. محققان دیگر نیز در دیواره تخمدان
Citrus deliciosa Ten (Bosabalidis and Tsekos, 1982a)، در میوه پرتقال ناول (Knight et al., 2001) و در میوه C. medica (Liang et al., 2006) به کیسههای ترشحی پایهدار اشاره کردهاند.
مراحل تکوینی غدههای روغنی در کاسبرگ، گلبرگ، تخمدان گل و پوست میوه لیموترش از الگوی یکسان و ثابتی پیروی میکند. در هیچ یک از گونههای مرکبات تاکنون گزارشی مقایسهای ارائه نشده است، امّا با توجه به الگوی تمایزیابی کیسههای ترشحی در برگ لیموترش (Turner et al., 1998)و میوه آن (Bennici and Tani, 2004) و مقایسه آن با نتایج پژوهش حاضر به نظر میرسد که الگوی تمایزیابی جزء ویژگیهای ذاتی بوده، در تمام اندامهای رویشی و زایشی یک تاکسون مشخص ثابت است.
مراحل تمایزیابی کیسههای ترشحی اسانس در لیموترش به 4 مرحله تفکیک شد که از تقسیم تعدادی از سلولهای اپیدرمی و زیر اپیدرمی آغاز شده، تا تشکیل کیسه بالغ با یک حفره مرکزی احاطه شده توسط سلولهای غلاف مانند ادامه مییابد. Knight و همکاران (2001) مراحل نموی این کیسهها در میوه پرتقال ناول را به 6 مرحله تقسیم نمودند که از یک خوشه 10 سلولی آغاز شده، به یک کیسه ترشحی بالغ با حفره مرکزی وسیع منتهی میگردد. اختلاف میان تعداد مراحل تمایزیابی غدههای روغنی در لیموترش و نتایج Knight و همکاران (2001) میتواند مربوط به این باشد که در تحقیق حاضر تفکیک مراحل تکوینی بر اساس اختلافات سلولی و درجه تمایز کیسهها، و نه تعداد سلولها و اندازه کیسهها، انجام شده است.
با توجه به مشاهده همزمان تقسیمات سلولی در قسمتهای بیرونی کیسه ترشحی و تحلیل رفتن سلولهای مرکزی الگوی تکوینی شیزولیزیژن برای اندامهای زایشی لیموترش پیشنهاد میشود. این گزارش با نتایج پژوهشهای قبلی ما بر روی لیمو عمانی (Citrus aurantifolia) همخوانی دارد (Rafiei and Rajaei, 2007). گزارشهای متعدد و متناقضی در مورد نحوه تشکیل غدههای روغنی در مرکبات ارائه شده است؛ Heinrich (1969) نمو این فضاها را در جنسهای مختلف تیره مرکبات متفاوت توصیف کرد. وی تشکیل حفره در Ruta graveolensis را به صورت شیزوژنی و در Citrus limon از نوع لیزیژنی دانست. Knight و همکاران (2001) تشکیل حفرههای ترشحی در میوه پرتقال ناول را از نوع شیزوژنی اعلام نمودند. قبل از آن Turner و همکاران (1998) با مقایسه تکنیکهای متفاوت آمادهسازی نمونهها، پیشنهاد کرده بودند که اصولاً مفهوم لیزیژنی در تکوین کیسههای ترشحی اسانس مرکبات میتواند مقوله نادرستی باشد که به دلیل تولید مواد غیر واقعی (artifact) در عملیات تثبیت نمونه حاصل شده است. محققان مزبور تکوین کیسههای ترشحی در برگ لیموترش را از نوع لیزیژن معرفی نمودند. در پژوهش حاضر از دو تثبیت کننده گلوتار آلدئید و تتراکسید اسمیوم استفاده شد. وجود لایههای منظم سلولی در اطراف حفره کیسه بالغ، نظم در تشکیل حفره، گسترده شدن آن و فشردگی لایهها در اطراف حفره شکل گرفته، مخالف نظر Turner و همکاران (1998) در توصیف آنها از پدیده lysis به علت تکنیک آمادهسازی است. Bennici و Tani (2004) نیز با استفاده از تکنیک مشابه با پژوهش حاضر همپوشانی دو پدیده شیزوژنی و لیزیژنی را در پوست میوههای پرتقال و لیموترش گزارش نمودند. همچنین Liang و همکاران (2006 و 2009) تکوین غدههای روغنی در میوه چند گونه از مرکبات را از نوع شیزولیزیژن دانستند.
در غدههای روغنی بالغ گل و میوه لیموترش، لایههایی از سلولهای مسطح شده در اطراف حفره مرکزی مشاهده شد و ضخامت دیواره آنها به سمت خارج کیسه افزایش نشان داد. داخلیترین این سلولها ویژگیهایی مشابه با سلولهای ترشحی داشتند و میتوانند معادل boundary cells معرفی شده توسط Bosabalidis و Tsekos (b1982) در Citrus deliciosa باشند. خارجیترین این سلولهابا دیوارههای ضخیمتر، احتمالاً نقش حفاظت از سلولهای داخلیتر غده را به عهده دارند. گزارشهای مشابهی در برگ لیموترش (Turner et al., 1998)، میوه پرتقال و میوه لیموترش (Bennici and Tani, 2004) ارائه شده است.
مراحل سوم و چهارم تکوین کیسههای ترشحی در تمام اندامهای زایشی لیموترش با شروع اتولیز سلولها و گسترش حفره همراه بود. Liang و همکاران (2009) فعالیت آنزیم پکتیناز را در مراحل اولیه تشکیل حفره مرکزی در میوه انواع مرکبات گزارش نموده اند که معادل مرحله سوم تکوین غده روغنی در پژوهش حاضر است. آنزیم سلولاز باعث گسترش حفره (مرحله چهار پژوهش حاضر) میشود و فعالیت این آنزیم در کیسههای ترشحی بالغ به اوج میرسد (Liang et al., 2009).
اندازه کیسههای ترشحی اسانس در لیموترش ارتباطی با درجه بلوغ آنها نداشت، ممکن است یک کیسه ترشحی بالغ اندازه کوچکی داشته باشد و یا برعکس، یک کیسه نابالغ از اندازه بزرگی برخوردار باشد.در این رابطه تاکنون گزارشی در مرکبات ارائه نشده است.
غدههای روغنی در کاسبرگ و گلبرگ لیموترش از مرحله اول نمو گل به صورت بالغ و متمایز بودند، در حالی که پیدایش کیسهها در تخمدان از مرحله دوم نمو گل آغاز شد. در عین حال، رابطه مستقیمی بین درجه تمایز کیسه ترشحی و تکوین اندامهای گل مشاهده شد. در این رابطه گزارشی در مورد گونههای دیگر مرکبات موجود نیست.
بنیانگذاری و تمایزیابی کیسههای ترشحی تا مرحله اول نمو میوه لیموترش (میوه سبز نارس) ادامه یافت. Knight و همکاران (2001) و همچنین Bennici و Tani (2004) به ترتیب با در نظر گرفتن مراحل مختلف نموی میوه پرتقال و لیموترش بنیانگذاری غدههای روغنی را محدود به مرحله اول نمو میوه (مرحله تقسیم سلولی) دانستند. در عین حال، یافتههای پژوهش حاضر در تضاد با گزارشهای Schneider (1968) است که پیشنهاد نمود تشکیل کیسههای ترشحی اسانس در طی بلوغ میوه تداوم مییابد.
اندازه کیسههای ترشحی در طی نمو میوه لیموترش افزایش یافت. این موضوع قبلاً در مورد پرتقال والنسیا (Bain, 1958) و پرتقال ناول (Knight et al., 2001) نیز گزارش شده است. با شمارش کیسههای ترشحی در پوست میوه پرتقال ناول هنگام نمو، مشخص شد در طی افزایش اندازه میوه، تعداد کیسههای ترشحی نسبتاً ثابت میماند .(Knight et al., 2001)
پژوهشهای فراساختاری اختلافاتی را در چگونگی ترشح اسانس توسط اجزای سلولی در چند گونه از مرکبات نشان دادهاند (Bosabalids and Tsekos, 1982b; Bennici and Tani, 2004). بررسیهای تکمیلی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری مکانیزم سلولی ترشح ترکیبات ترپنی را آشکار خواهند ساخت. همچنین، نتایج حاصل از پژوهش حاضر، در تعیین محدوده زمانی و نحوه تشکیل کیسهها در گل و میوه، میتواند مقدمهای برای پژوهشهای بعدی در تشخیص زمان بهینه نمونهبرداری جهت استخراج وشناسایی ترکیبات اسانس در لیموترش باشد.
)
