Authors
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
2 Department of Plant Biology, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
3 Agriculture Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Rasht, Iran
Abstract
Keywords
درختان لیموترش با عدد کروموزومی 18=n2=x2، بومی شرق هیمالیا و هند بوده، عقیده بر این است که دورگ ناشی از تلاقی لایم و بالنگ هستند (فتوحی‌قزوینی و فتاحی‌مقدم، 1389) که در صنایع غذایی، داروسازی، عطرسازی و آرایشی کاربردهای فراوانی دارند. در طب سنتی نیز موارد استفاده زیادی دارند (Owhe-Ureghe et al., 2010) به عنوان مثال، برای درمان دردهای معده و سرفه کاربرد دارند (Oyagade et al.,1999). علاوه بر این، لیموترش خاصیت ضد باکتریایی (باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی) نیز دارد (Aibinu et al., 2007).
روش دو برابر کردن کروموزوم با استفاده از کلشی‌سین، به طور وسیعی در برنامه‌های اصلاحی گیاهان استفاده می‌شود (Hancock, 1997; Hartwell et al., 2004). بیشتر گیاهان حاصل از پلی‌پلوئیدی مصنوعی اغلب با افزایش اندازه سلول همراه هستند که به تولید اندام‌های رویشی و زایشی بزرگتر منجر می‌شود (Byrne et al., 1981). القای پلی‌پلوئیدی ممکن است با افزایش عملکرد و تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان پلی‌پلوئید نسبت به والدین دیپلوئید همراه باشد (Dhawan and Lavania, 1996). برای مثال، میزان اسانس در گیاهان اتوتتراپلوئید گونه‌ای از نعناع (Mentha arevensis L.)، به میزان 30 درصد
(Janaki Amal and Sobti, 1962) و در گیاه زیره (Carum carvi L.) به میزان 35 تا 85 درصد (Dijkstra and Speckmann, 1980) نسبت به گیاهان دیپلوئید شاهد افزایش نشان داده است. همچنین، در بسیاری از گیاهان افزایش سطح پلوئیدی با برخی تغییرات مورفولوژیک و فیزیولوژیک همراه بوده است (Randall et al., 1977). برای مثال، در گیاه دارویی اسطوخودوس (Lavandula angustifolia)، گیاهان اتوتتراپلوئید دارای گل‌ها و بذرهای بزرگتر، دمگل ضخیم‌تر و پرزهای سپری بزرگتر روی برگ نسبت به همتاهای دیپلوئید خود بودند (Urwin and Horsnell, 2007). القای پلی‌پلوئیدی در مرکبات سبب تولید گیاهان مرکبات تتراپلوئید و تریپلوئید می‌شود
(Lee, 1988). گیاهان تریپلوئید، بی‌دانه هستند و از آنجا که اغلب مرکبات پُردانه هستند، پُردانگی عاملی منفی در کیفیت آنها محسوب می‌شود (Geraci et al., 1975; Esen et al., 1978; Navarro et al., 2002)، علاقه روز افزون پرورش‌دهندگان مرکبات با دستکاری پلوئیدی، استراتژی‌های هدف برای تولید ارقام بی‌دانه تریپلوئید شده است (Vardi, 1996).
برای تعیین سطح پلوئیدی از روش‌های مستقیم (شمارش کروموزوم و فلوسایتومتری) و همچنین، روش‌های غیر مستقیم (مانند اندازه‌گیری طول و عرض سلول‌های روزنه، تراکم سلول‌های روزنه در واحد سطح و مشاهدات مورفولوژیک) استفاده می‌شود
(Sari et al., 1999). تعیین میزان کلروفیل نیز به عنوان ابزاری برای تشخیص سطوح پلوئیدی در گونه‌های مختلف با میزان موفقیت‌های متفاوت همراه بوده است
؛Joseph and Randall, 1981؛ (Timco et al., 1981 Mathura et al., 2006). میزان کلروفیل در گیاهان اتوتتراپلوئید نوعی آکاسیا (Acasia mearnsii)
40 درصد بیشتر از میزان کلروفیل همتای دیپلوئید آنها گزارش شده است (Mathura et al., 2006). به علت افزایش مستقیم میزان ترکیبات ثانویه در بافت و همچنین، افزایش زیتوده در گیاهان پلی‌پلوئید به ویژه گیاهان دارویی که از اندام رویشی (ساقه، برگ و گل) برای به دست آوردن متابولیت‌های ثانویه استفاده می‌شود، دو برابر کردن تعداد کروموزوم‌ها در این گیاهان موجب افزایش عملکرد متابولیت‌های ثانویه شده است (Gonzalez and Weathers, 2003).
هدف از این پژوهش، بررسی امکان استفاده از پلی‌پلوئیدی به عنوان روشی اصلاحی برای مقایسه و همچنین، بررسی برخی ویژگی‌های رشدی و ویژگی‌های کمّی و کیفی بین گیاهان تتراپلوئید ایجاد شده از گیاهان دیپلوئید در گیاه لیموترش است.
مواد و روش‌ها
مواد گیاهی
میوه‌های لیموترش از باغ مؤسسه تحقیقات مرکبات واقع در شهرستان تنکابن تهیه شد. پوسته خارجی و پوسته داخلی بذرها جدا شد، سپس بذرهای نوسلار (بذرهایی با بیش از دو لپه و دارای شکل نامتقارن) از جنسی (بذرهایی با لپه‌های متقارن) جدا شد. بذرهای نوسلار در پتری‌دیش‌های حاوی کاغذ صافی که در اتوکلاو استریل شده بودند، قرار داده شده، و مراحل رشد اولیه را در داخل انکوباتور با دمای 25-27 درجه سانتیگراد گذراندند. پس از 2 هفته و نمایان شدن ریشه‌چه، بذرها به گلدان‌هایی به ارتفاع 10 و قطر 5/6 سانتی‌متر منتقل شدند. گلدان‌ها با نسبت برابر از کود حیوانی، خاک و ماسه (با نسبت 1:1:1) پُر شد. گیاهان پس از کشت در گلدان، در گلخانه با دمای روزانه 25 درجه سانتیگراد و دمای شبانه 18 درجه سانتیگراد نگهداری شد. به منظور ایجاد جمعیت تتراپلوئید، گیاهچه‌ها در مراحل دو برگ حقیقی اولیه برای اعمال تیمار کلشی‌سین استفاده شدند. این پژوهش طی سال‌های 1388-1390 در گلخانه مؤسسه بیوتکنولوژی شمال کشور (رشت) انجام گرفت.
القای تتراپلوئیدی در گیاه لیموترش
در این پژوهش، برای القای تتراپلوئیدی از روش تیمار مریستم انتهایی 180 گیاهچه با غلظت‌های مختلف کلشی‌سین استفاده شد. به این منظور، مریستم انتهایی رشد گیاهچه‌ها در مراحل دو برگ حقیقی اولیه در
3 روز متوالی، با استفاده از غلظت‌های مختلف محلول آبی کلشی‌سین (2/0، 6/0، 1 و 4/1 درصد) و توئین 20 (برای افزایش تماس سطحی)، با روش قطره‌چکان با استفاده از سمپلر هر روز به میزان 5 میکرولیتر تیمار شدند.
شناسایی گیاهان تتراپلوئید با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری
با توجه به اینکه دستگاه فلوسایتومتری با اندازه‌گیری شدت نسبی فلورسانس، مقدار نسبی DNA را نشان می‌دهد، سطح پلوئیدی یک نمونه ناشناخته تنها پس از ترکیب با هسته‌های استاندارد گیاه شاخص با سطح پلوئیدی و محل پیک در مقایسه با استاندارد مشخص می‌شود. در این تحقیق، برای تخمین صحیح سطح پلوئیدی گیاهان تتراپلوئید مورد نظر توسط دستگاه فلوسایتومتری، از گیاه جعفری به عنوان گیاه استاندارد استفاده شد. برای آنالیز سطح پلوئیدی، برگ‌های دوم گیاهان 60 روز پس از اعمال تیمار جدا شده، توسط دستگاه فلوسایتومتری مدل PA ساخت شرکت Partec کشور آلمان بررسی شدند. شیوه تهیه نمونه برای آنالیز فلوسایتومتریک به این شکل است که برای تهیه سوسپانسیون هسته‌ای، به مقدار مساوی بافت برگی از برگ‌های دوم و ترجیحاً قسمت‌های بدون رگبرگ از گیاه نمونه (گیاهانی که با غلظت‌های مختلف کلشی‌سین تیمار شده بودند)، گیاهان شاهد (فاقد تیمار) و گیاه استاندارد، به اندازه تقریبی cm2 1 برداشته شد. بافت برگ در یک پتری‌دیش پلاستیکی 55 میلی‌متری حاوی 400 میکرولیتر از بافر استخراج هسته متعلق به شرکت Partec قرار داده، با استفاده از یک تیغ تیز خُرد شد. سپس به این نمونه‌ها
1600 میکرولیتر محلول فلوروکروم DAPI که نوعی رنگ مخصوص آنالیز فلوسایتومتری است، اضافه شد. سپس نمونه توسط فیلتر نایلونی فیلتر گردید. نمونه صاف شده به داخل لوله پلاستیکی متعلق به دستگاه فلوسایتومتری منتقل و آنالیز شد. پس از آن، هیستوگرام DNA به دست آمد. مقدار DNA هر نمونه با بررسی حداقل 10000 سلول بررسی شد. همچنین، برای اطمینان از نتایج حاصل، پس از تهیه لام از بافت مربوطه شمارش کروموزومی با استفاده از میکروسکوپ نیز انجام شد.
مقایسه ویژگی‌های کمّی و کیفی بین گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید
پس از شناسایی گیاهان تتراپلوئید توسط آنالیز فلوسایتومتری، گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید از نظر سطح برگ، شکل برگ، اندازه روزنه، تراکم روزنه، ارتفاع، میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و میزان کاروتنوئید با هم مقایسه شدند.
محاسبه سطح برگ گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید
برای مقایسه سطح برگ گیاه شاهد با گیاهان تحت تیمار، برگ‌های دوم از رأس ساقه گیاه هر گلدان جدا شد. از برگ‌های جدا شده، کپی کاغذی تهیه و وزن کپی مورد نظر با ترازو اندازه‌گیری شد. یک سانتی‌متر مربع از کادر کاغذ نیز جدا وزن شد، با محاسبه نسبت وزن برگ به وزن یک سانتی‌متر مربع از کاغذ (رابطه تناسبی) سطح هر برگ محاسبه و مقایسه شد (سلطانی و همکاران، 1385).
اندازه‌گیری کیسه‌های ترشحی گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید
برای سنجش تراکم کیسه ترشحی و تعداد آنها در واحد سطح، برگ‌های دوم از رأس ساقه گیاهان مورد نظر جدا شد و برای بررسی تراکم آنها در واحد سطح از میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 4 و برای سنجش طول آنها از میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 10 استفاده شد.
سنجش کلروفیل و کاروتنوئید
برای اندازه‌گیری میزان کلروفیل a، b و کاروتنوئید کل از برگ دوم، دیسک‌های برگی تهیه، در 5 میلی‌لیتر استون 80 درصد در هاون چینی همگن شد. با استفاده از سانتریفیوژ یخچال‌دار در دمای 4 درجه سانتیگراد و با 3000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه محلول جداسازی شد. سپس شدت جذب محلول در طول موج‌های 470، 8/646 و 2/663 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر UV visible از شرکت Pharmacia biotech در مقابل شاهد خوانده، با قرار دادن در روابط زیر میزان کلروفیل a و b و کاروتنوئید کل در cm2 سطح برگ محاسبه شد (Lichtenthaler, 1983).
Chla=12.25 A663.2 - 2.79 A646.8
Chlb=21.50 A646.8 - 5.1 A663.2
ChlT=Chla + Chlb
Car=(1000 A470 - 1.82 Chla - 85.02 Chlb) / 198
ارزیابی ویژگی‌های روزنه در گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید
بدین منظور، پس از تعیین سطح پلوئیدی گیاهان مورد آزمایش با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری، برگ دوم هر گیاه جدا و سپس اپیدرم زیرین برگ با استفاده از لاک ناخن جدا شد. به این منظور بخشی از برگ (mm 5×mm 10) که ترجیحاً فاقد رگبرگ اصلی بود، با استفاده از لاک ناخن پوشانده، پس از 10 تا 15 دقیقه خشک شد. سپس با استفاده از یک تیغ تیز حاشیه‌های نمونه را به شکل چهار گوش در آورده، نوار چسبی شفاف روی آن چسبانده و با انگشت شست فشار داده تا اپیدرم کاملاً به چسب ملحق شد. سپس چسب که اپیدرم به صورت لایه شفاف بسیار نازکی به آن چسبیده است، جدا و روی لام چسبانده شد. ویژگی‌های روزنه همۀ نمونه‌ها با استفاده از یک میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40 بررسی شد (Smith et al., 1989).
مطالعات آماری
مراحل مختلف آزمایش با 3 تکرار انجام شد و سپس آنالیزهای آماری با استفاده از آزمون آماری t در نرم‌افزار SPSS و آزمون توکی در نرم‌افزار SAS صورت گرفت. نمودارهای مربوط به تغییرات در نرم‌افزار Excelرسم شد. طرح مورد استفاده در آزمایشات طرح کاملاً تصادفی بود.
نتایج
القا تتراپلوئیدی در گیاه لیموترش
نتایج حاصل از بررسی سطح پلوئیدی گیاهان تیمار شده با سطوح مختلف کلشی‌سین (2/0، 6/0، 0/1 و 4/1 درصد) با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری نشان داد که غلظت 4/1 درصد در گیاه لیموترش بیشترین درصد گیاهان تتراپلوئید (6/48 درصد) و غلظت 2/0 درصد کمترین گیاهان تتراپلوئید (0 درصد) را تولید کرد. این نتایج از طریق شمارش کروموزومی نیز تأیید شد (شکل 1).
شکل 1- اثر تیمارهای مختلف کلشی‌سین بر تولید گیاهان تتراپلوئید لیموترش با استفاده از آزمون توکی. مقادیر،میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.01 است.
مقایسه شکل و سطح برگ
بررسی شکل برگ (شکل 2) در گیاه لیموترش نشان داد که برگ‌های گیاهان تتراپلوئید از نظر اندازه (جدول 1) دارای طول و عرض کمتری نسبت به گیاهان دیپلوئید بودند. علاوه بر این، برگ‌های گیاهان تتراپلوئید چین‌خورده و ناصاف بودند. مقایسه سطح برگ (جدول 1) نشان داد که گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری سطح برگ کمتری نسبت به گیاهان دیپلوئید دارند.
شکل 2- شکل برگ (1: گیاه شاهد، 2: گیاه تیمار شده)
مقایسه طول، عرض و تراکم روزنه
نتایج حاصل از اندازه‌گیری طول و عرض روزنه در گیاهان تتراپلوئید لیموترش افزایش معنی‌داری (P<0.05) را نسبت به گیاهان دیپلوئید نشان داد (جدول 1). بررسی تراکم روزنه نیز نشان داد که با افزایش سطوح پلوئیدی تراکم روزنه به طور معنی‌داری (P<0.05) نسبت به گیاه دیپلوئید کاهش می‌یابد (جدول 1).
مقایسه تراکم و مساحت کیسه ترشحی
اندازه‌گیری تراکم کیسه ترشحی در نمونه‌های گیاهی تتراپلوئید و دیپلوئید نشان داد که تراکم آنها در گیاهان دیپلوئید نسبت به گونه تتراپلوئید به طور معنی‌داری (P<0.05) بیشتر بود (جدول 1 و شکل 3) در حالی که مساحت کیسه ترشحی در گیاهان تتراپلوئید افزایش معنی‌داری(P<0.05) نسبت به گیاهان دیپلوئید داشت (جدول 1).
مقایسه ارتفاع گیاهان
نتایج حاصل از مقایسه ارتفاع گیاهان تتراپلوئید نسبت به دیپلوئید نشان داد که ارتفاع گیاهان تتراپلوئید به طور معنی‌داری (P<0.05) نسبت به دیپلوئید کاهش یافت (جدول 1).
مقایسه میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل و کاروتنوئید کل
نتایج حاصل از مقایسه میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل و کاروتنوئید کل بین گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید تفاوت معنی‌داری (P<0.05) را نشان نداد (جدول 1).
بحث
تولید گیاهان تتراپلوئید
در این پژوهش، به منظور تولید گیاهان تتراپلوئید از روش تیمار کلشی‌سین به صورت قطره‌چکان استفاده شد. نتایج حاصل از این تیمار نشان داد که در غلظت 4/1 درصد کلشی‌سین، 6/48 درصد از گیاهان لیموترش تتراپلوئید شدند که برتری روش فوق را نسبت به روش‌هایی که اساس آنها تیمار گیاهان با استفاده از کلشی‌سین در مراحل تولید بذر، برگ‌های لپه‌ای و یا روش‌های کشت درون شیشه‌ای است، نشان می‌دهد. برای مثال، در مطالعه‌ای که توسط Dutt و همکاران (2010) روی Citrus reticulate انجام شد، از روش تیمار بر سوسپانسیون سلولی که روش جدیدی محسوب می‌شود، استفاده شد که بیشینه راندمان تولید تتراپلوئید در این روش 35 درصد بود. در پژوهشی دیگر راندمان تولید گیاهان تتراپلوئید حاصل از تیمار بذرهای آبگیری شده گونه‌ای از بنفشه در نسل اول 73/0 درصد گزارش شد و در روش تیمار مریستم انتهایی در مرحله تولید برگ‌های لپه‌ای، راندمان 16/2 درصد گزارش گردید (Ajalin et al., 2002). همچنین، در پژوهشی که توسط Roy و همکاران (2001) گزارش شد، راندمان تولید گیاهان تتراپلوئید در گیاه رازک از طریق باززایی گیاهان تتراپلوئید از گیاهان میکسوپلوئید در شرایط کشت درون شیشه‌ای، 33 درصد گزارش شد.
سطح برگ
نتایج حاصل از این پژوهش در ارتباط با سطح برگ با القای پلی‌پلوئیدی در گیاه Spathiphyllum wallisii مشابه بود که سبب کاهش سطح برگ و نسبت طول به عرض گیاه تتراپلوئید نسبت به گیاه دیپلوئید شد
(Van Laere, et al., 2010). کاهش سطح برگ و همچنین کوتاه‌تر شدن گیاهان پلی‌پلوئید نسبت به گیاهان دپلوئید، می‌تواند سبب افزایش مقاومت این گیاهان در برابر عوامل نامساعد محیطی از جمله نور و بادهای شدید، خصوصاً در مناطق کوهستانی شود. پلی‌پلوئیدی آثار قابل توجهی بر تغییر نحوه بیان ژن‌ها دارد که ممکن است شامل خاموش یا روشن شدن برخی از ژن‌هایی شود که دو برابر شده‌اند. البته الگوی تغییر بیان ژن در سلول‌ها و اندام‌های مختلف و حتی در ژنوتیپ‌های مختلف یک گیاه می‌تواند متفاوت باشد (Adams and Wendel, 2005).
شکل 3- مقایسه کیسه ترشحی گیاهان لیموترش (1: گیاه شاهد، 2: گیاه تحت تیمار) با بزرگنمایی 40
جدول 1- مقایسه میانگین برخی ویژگی‌های کمّی و کیفی در گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید لیموترش. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح P<0.05 است.
|
ویژگی‌های کمّی وکیفی بررسی شده |
گیاهان تتراپلوئید (SE± میانگین) |
گیاهان دیپلوئید (SE± میانگین) |
|
طول روزنه (µm) |
a4/1±62/48 |
b8/0±4/29 |
|
عرض روزنه (µm) |
a3/1±8/42 |
b6/0±8/22 |
|
کلروفیل a (mg/ml) |
a009/0±6/4 |
a02/0±6/4 |
|
کلروفیل b (mg/ml) |
a02/0±5/1 |
a1/0±4/1 |
|
کلروفیل کل (mg/ml) |
a01/0±1/6 |
a1/0±9/5 |
|
ارتفاع گیاه (cm) |
b09/0±7/3 |
a09/0±4/14 |
|
مساحت کیسه ترشحی (µm2) |
a8/169±1884 |
b09/64±471 |
|
تراکم کیسه ترشحی (µm2) |
b 01/0±04/0 |
a 04/0±09/0 |
|
طول برگ (cm) |
b 1/0±2/3 |
a 2/0±8/6 |
|
عرض برگ (cm) |
b 05/0±1/1 |
a 1/0±1/3 |
|
سطح برگ (cm2) |
b 15/0±9/8 |
a 2/0±7/22 |
|
تراکم روزنه (µm2) |
b 08/0±0004/0 |
a 2/0±003/0 |
|
کاروتنوئید (mg/ml) |
a 1/0±2/1 |
a 05/0±4/1 |
مقایسه طول، عرض و تراکم روزنه
نتایج حاصل از طول و عرض روزنه در این تحقیق، با نتایج پژوهش‌هایی که افزایش سطح پلوئیدی سلول‌ها با افزایش طول و عرض روزنه ارتباط داشتند، منطبق است. Heping و همکاران (2008) مشاهده کردند که میانگین طول روزنه در گیاه تتراپلوئید زنجبیل 8/50 میکرومتر و در گیاهان دیپلوئید 7/36 میکرومتر بود. Omidbaigi و همکاران (2010) مشاهده کردند که اندازه عرض روزنه در گیاهان تتراپلوئید ریحان به طور غیر‌منتظره‌ای بیشتر از گیاهان دیپلوئید است، به طوری که عرض روزنه در گیاهان تتراپلوئید بیش از 3 برابر گیاهان دیپلوئید بود. علت تغییر اندازه اندام‌های گیاهی در اثر القای پلی‌پلوئیدی، سازگاری بیشتر گیاهان با محیط است. در واقع پلی‌پلوئیدها ممکن است قدرت زنده ماندن بیشتری نسبت به اجداد دیپلوئید خود در برابر عوامل نامساعد محیطی داشته باشند، زیرا با کاهش سطح برگ و از طرف دیگر افزایش اندازه سلول روزنه، توانایی گیاه در حفظ آب و ایجاد تعادل آبی بیشتر می‌شود (Grant, 1981; Stebbins, 1971). همچنین، نتایج این پژوهش با نتایج پژوهش‌هایی که نشان دادند با افزایش سطح پلوئیدی، تراکم روزنه در واحد سطح برگ کاهش می‌یابد، منطبق است. در همین راستا، Omidbaigi و همکاران (2010) گزارش کردند که وابستگی بین تراکم روزنه و سطح پلوئیدی در ریحان منفی است و تراکم روزنه مشاهده شده در گیاهان تتراپلوئید نسبت به گیاه دیپلوئید کمتر است، به طوری که فراوانی روزنه در گیاهان دیپلوئید 63 درصد بیشتر از گیاهان تتراپلوئید بود. Joshi و Verna (2004) نیز در پژوهشی گزارش کردند که افزایش سطح پلوئیدی در نمونه‌های تتراپلوئید لوبیا به علت افزایش اندازه سلول‌ها، سبب افزایش اندازه روزنه‌ها، در نتیجه کاهش تعداد آنها در واحد سطح در مقایسه با نمونه‌های دیپلوئید می‌شود.
ارتفاع
بر اساس نتایج حاصل از این تحقیق، کلشی‌سین بر ارتفاع گیاهان تیمار شده تأثیر دارد. به طوری که با افزایش غلظت تیمار، ارتفاع کاهش بیشتری نشان می‌دهد که این کاهش ارتفاع، یک روش آسان در تشخیص گیاهان دیپلوئید از تتراپلوئید است. سحرخیز (1385) نیز در گیاه بابونه کبیر مشاهده کرد که با افزایش غلظت کلشی‌سین، میزان ارتفاع گیاهان بابونه کبیر کاهش می‌یابد. کاهش ارتفاع ممکن است به علت پلی‌پلوئیدی شدن باشد، زیرا گیاهان پلی‌پلوئید مناطق کوهستانی که کوتاه‌تر از گیاهان معمول هستند، سازگاری بیشتری با محیط خود دارند. بررسی اثر کلشی‌سین روی گیاه دارویی Astragalus memberanaceus نشان داد که رشد آهسته گیاهان تتراپلوئید ممکن است به علت تخریب فیزیولوژیک ایجاد شده توسط کلشی‌سین باشد که در نتیجه باعث کاهش سرعت تقسیم سلولی می‌شود (Chen and Gao, 2007).
کلروفیل
نتایج حاصل از این پژوهش که عدم تغییر محتوای کلروفیل در گیاه لیموترش را نشان داد، با مطالعات انجام شده توسط حسنی و همکاران (1389) مغایر بود. آنها گزارش کردند که با افزایش سطح‌پلوئیدی در گیاه ریحان میزان کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل نیز به طور معنی‌داری افزایش می‌یابد. البته در پژوهشی دیگر که روی گیاه Urgenia indica انجام شد، نشان داد که میزان کلروفیل در گیاه تتراپلوئید و دیپلوئید تغییر معنی‌داری نمی‌کند (Phulari, 2011). لذا، چنین استنباط می‌شود که نوع گونه و رقم مورد مطالعه نیز می‌تواند در میزان کلروفیل در سطوح متفاوت پلوئیدی تأثیر داشته باشد (Andersson, 2009).
کاروتنوئید
نتایج پژوهش حاضر که عدم تغییر کاروتنوئید در گیاه لیموترش را نشان داد، با نتایج انجام شده توسط Randolph و Hand (1940) مغایر بود که گزارش کردند گیاهان ذرت تیمار شده با کلشی‌سین میزان کاروتنوئید بیشتری نسبت به گیاهان دیپلوئید داشتند. البته دما، شدت پرتو و میزان آب در دسترس در طول فصل رشد نیز بر میزان کاروتنوئید تأثیر می‌گذارند (Andersson, 2009).
جمع‌بندی
مقایسه برگ‌های گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید نشان داد که برگ‌های گیاهان تتراپلوئید از نظر اندازه دارای طول و عرض کمتری نسبت به دیپلوئید بودند. مقایسه ارتفاع بین گیاهان تتراپلوئید و دیپلوئید نشان داد که ارتفاع گیاهان تتراپلوئید به طور معنی داری نسبت به دیپلوئید کمتر بود. بررسی تراکم و ابعاد روزنه و همچنین کیسه ترشحی نیز نشان داد که در گیاهان تتراپلوئید در مقایسه با دیپلوئید تراکم روزنه کاهش یافته، اما ابعاد روزنه افزایش می‌یابد. همچنین، بررسی میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل و کاروتنوئید کل گیاهان لیموترش تیمار شده با کلشی‌سین افزایش معنی‌داری نداشت.
تشکر و قدردانی
از زحمات ارزشمند کارکنان محترم پژوهشکده بیوتکنولوژی شمال، به ویژه آقای دکتر اسد اسدی آبکنار و آقای مهندس علی صیاد رمضانی و کارشناسان محترم دانشکده علوم دانشگاه گیلان به ویژه آقای مهندس سید ابوالقاسم ناصر علوی و خانم‌ها مهندس فاطمه جمال امیدی، مهوش هادوی و زهرا شایگان تشکر و قدردانی می‌شود.
)
