Authors
Department of Biology, Faculty of Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
Abstract
Keywords
شوری از جمله عوامل مهم محدود کننده تولید محصولات کشاورزی مختلف است. تنش شوری با کاهش پتانسیل آب، نامتعادل ساختن یون‌ها و سمّیت باعث کاهش متابولیسم گیاهی و در نهایت، کاهش محصولات زراعی می‌شود (Munns, 2002). گزارشات حاکی از آن است که بیش از 6 درصد سطح کل خاک‌های کره زمین شور است که 20 درصد آن را خاک‌های کشاورزی تشکیل می‌دهد (Flexs, 2008). میزان تحمل به شوری در گیاهان به خانواده، جنس، گونه و رقم بستگی دارد. یکی از راه‌های مقابله با شوری استفاده از گونه‌ها و ارقام مقاوم است. از این رو، لزوم به کارگیری معیارهای مناسب برای گزینش ژنوتیپ‌های مقاوم به شوری ضروری است (Jones, 1983). کمبود آب و شوری خاک فرآیندهای سازشی زیادی را در گیاهان القا می‌کنند که بسیاری از آنها با تغییر در بیان ژن‌ها همراه است. گروه‌های مختلفی از ژن‌ها در پاسخ به شوری دخالت دارند که محصول آنها به طور مستقیم یا غیر مستقیم عمل می‌کند. از این گروه ژن‌ها می‌توان ژن‌های درگیر در مسیرهای آنزیمی سنتز اسمولیت‌ها، کانال‌های یونی، گیرنده‌های مسیر انتقال پیام کلسیم و سایر پیامبران تنظیمی را نام برد که در تنظیم متابولیسم، انتقال پیام و پاسخ به تنش نقش دارند (Mahajan et al., 2008). از جمله اسمولیت‌هایی که در تنش شوری گیاهان را حفظ می‌کند، قند ترهالوز-6-فسفات (T6P) است. این قند یک دی‌ساکارید است که در سیتوزول از ترکیب دو مولکول گلوکز و
UDP-گلوکز و با فعالیت آنزیم ترهالوز 6- فسفات سنتاز (TPS) در گیاه آرابیدوپسیس سنتز می‌شود (Kolbe et al., 2005). میزان این قند در موجودات زنده بسیار اندک است (Muller et al., 1995).
T6P نقش‌های متعدد مهمی را در زندگی گیاهان ایفا می‌کند که از آن جمله می‌توان تأثیر آن بر گل‌دهی، رشد گیاه، مصرف کربن، مقاومت به تنش و فتوسنتز را نام برد Schluepmann et al., 2003)؛ Pellny et al., 2004؛ Schluepmann et al., 2004؛ Van Dijken et al., 2004). همچنین، نشان داده شده که تنش شوری و خشکی سبب افزایش غلظت این قند در گیاهان می‌شود. در واقع این قند با نگهداری و ثبات پروتئین‌ها و غشاها، گیاهان را از تنش حفظ می‌کند (Goddijn and Van Dun, 1999). نتایج حاصل از انتقال ژن TPS1 از باکتری اشیرشیاکلی به گیاه برنج نشان داده که گیاهان تراریخته نسبت به تنش شوری و خشکی مقاومت نشان می‌دهند (Garg et al.,2002).
پنبه از خانواده پنیرکان و جنسGossypium است که تاکنون قریب 50 گونه از آن شناسایی شده است. در بین گونه‌های شناسایی شده، تنها 4 گونه به صورت زراعی در سطح جهان به زیر کشت می‌رود که گونه‌های Gossypium hirsutum و G. barbadense از گونه‌های زراعی تتراپلویید (2n=52) و گونه‌های
G. herbaceum وG. arboreum از گونه‌های زراعی دیپلویید (2n=26) هستند که به ترتیب تحت عنوان پنبه‌های دنیای جدید و قدیم معروف هستند (Abdalla et al., 2001). G. hirsutum یک گونه تتراپلویید است که به پنبه آمریکایی یا پنبه آپلند یا پنبه الیاف متوسط معروف است (Chaudhry, 2001; Abdalla et al., 2001). G. herbaceum گونه‌ای دیپلویید پنبه است که به پنبه خاوری مشهور بوده، طول الیاف آن کوتاه است.
در پی تنش شوری تبدیل اکسیژن‌های غیر‌فعال به رادیکال‌های فعال اکسیژن سرعت می‌یابد که سبب تخریب پروتئین‌ها، لیپیدها، اسیدهای نوکلئیک و ترکیبات دیگر سلولی و متعاقباً باعث مختل شدن فرآیندهای زیستی مانند فتوسنتز، تثبیت کربن، تثبیت ازت و افزایش شدت تنفس نوری خواهد شد (Joseph and Jini, 2010). سیستم دفاعی گیاهان برای پالایش رادیکال‌های فعال اکسیژن، کمپلکس آنتی‌اکسیدانی و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان از قبیل کاتالاز (CAT)، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز است (Foyer and Halliwell, 1976). در صورتی که بین تولید رادیکال‌های فعال اکسیژن و دفاع آنتی‌اکسیدانی تعادل وجود نداشته باشد، تنش اکسیداتیو و متعاقب آن به گیاه صدمه وارد می‌شود (Mittler, 2002).
هدف از تحقیق حاضر، مقایسه دو رقم دیپلویید و تتراپلویید پنبه در تیمار شوری در سطح فیزیولوژیک و مولکولی است. در این تحقیق، ضمن بررسی انواع شاخص‌های مورفولوژیک و فیزیولوژیک مرتبط با شوری، بیان ژن TPS1 در اندام‌های مختلف پنبه در دو رقم یاد شده در پاسخ به شوری مقایسه خواهد شد.
مواد و روش‌ها
مواد گیاهی و شرایط کشت
بذرهای پنبه رقم ساحل (تتراپلویید) و قوزه‌درشت (دیپلویید) از مرکز تحقیقات پنبه گرگان تهیه و پس از ضد‌عفونی سطحی با آب ژاول 10 درصد روی کاغذ صافی قرار داده شدند. جوانه‌زنی در شرایط آزمایشگاه و در دمای 25 درجه سانتیگراد انجام گرفت. سپس گیاهچه‌های 6 روزه به محیط‌کشت هوگلند با 5 سطح شوری 0، 50، 75، 100، 150 میلی‌مولار کلرید سدیم در شرایط گلخانه انتقال داده شدند و پس از 4 هفته برداشت گیاهچه‌ها صورت گرفت. تعویض محیط‌کشت هوگلند به طور هفتگی و کنترل اسیدیته محیط‌کشت به طور روزانه انجام شد. آزمایش در قالب طرح بلوک کامل تصادفی با سه تکرار در محیط تحت کنترل انجام شد. پس از برداشت، طول گیاهچه‌ها (طول ریشه و بخش هوایی)، میزان کلروفیل، سدیم، فعالیت آنزیم‌های اکسیداتیو و بیان ژن TPS بررسی شد.
تعیین محتوای کلروفیل
اندازه‌گیری کلروفیل به روش Arnon (1949) انجام گرفت. بدین منظور، مقدار 05/0 گرم از بافت تر بخش هوایی با 5 میلی‌لیتر استون 80 درصد ساییده شد. مخلوط به دست آمده به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شد، در نهایت، محلول رویی عصاره جدا و حجم نهایی آن با استون 80 درصد به حجم 8 میلی‌لیتر رسانده شد. سپس میزان جذب آن را در دو طول موج 645 و 663 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد.
اندازه‌گیری میزان سدیم
به این منظور، مقدار 50 میلی‌گرم از نمونه‌های خشک آسیاب شده به مدت 30 دقیقه در دمای 300 درجه سانتیگراد و سپس 4 ساعت در دمای 550 درجه سانتیگراد در کوره الکتریکی قرار گرفتند. پس از سرد شدن به هر کدام از ظروف حاوی خاکستر گیاهی، 1 میلی‌لیتر کلریدریک اسید 6 نرمال اضافه شد. سپس حجم محلول با آب مقطر به 50 میلی‌لیتر رسانده شد. برای اندازه‌گیری میزان سدیم از دستگاه فلیم فلومتر استفاده شد. غلظت یون‌های سدیم در نمونه‌های گیاهی با استفاده از منحنی استاندارد و بر حسب میلی‌گرم در گرم وزن خشک بافت محاسبه شد.
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز
عصاره‌گیری با استفاده از روش Kar و Mishra (1976) صورت گرفت. برای این منظور مقدار 05/0 گرم بافت در هاون چینی سرد و در ظرف یخ با 2 میلی‌لیتر بافر فسفات 1/0 مولار با اسیدیته 8/6، همگن و سپس برای مدت 15 دقیقه در g 17000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی عصاره (سوپرناتانت) به دست آمده برای اندازه‌گیری فعالیت سه آنزیم کاتالاز، پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز استفاده شد. اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز نیز با استفاده از روش Chance و Maehly (1955) صورت گرفت. اندازه‌گیری فعالیت کاتالاز و پراکسیداز با روش سینتیک و در طول موج 240 و 470 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (Shimidzu UV-160) انجام شد. فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز به روش Resende و همکاران (2002) اندازه‌گیری شد. 100 میلی‌مولار تریس و اسیدیته 5/8، 100 میلی‌مولار کلرید سدیم، 20 میلی‌مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA)، سارکوزین 1 درصد.
استخراج RNA
استخراج RNA از برگ و ریشه گیاهچه‌های پنبه مطابق با روش Sambrook و Russell (2001) صورت گرفت. به این منظور میزان 1/0 تا 5/0 گرم بافت تازه برگ یا ریشه در نیتروژن مایع ساییده شد، سپس به آن مقدار 750 میکرولیتر بافر استخراج اضافه شد. پس از افزودن 750 میکرولیتر مخلوط فنل-کلروفرم-ایزو آمیل الکل (به نسبت 1:24:25) به مدت 2 دقیقه مخلوط شد و روی یخ به مدت 5 دقیقه انکوبه گردید. پس از سانتریفیوژ، فاز آبی به لوله جدید منتقل و مجدداً مخلوط فنل-کلروفرم-ایزو آمیل الکل به آن اضافه گردید. پس از انجام سانتریفیوژ، فاز مایع رویی برداشته و پس از اضافه کردن یک حجم ایزو پروپانول به آن، به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. پس از سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه و حذف محلول رویی، رسوب به دست آمده در 5/0 میلی‌لیتر آب مقطر استریل حل و 5/0 میلی‌لیتر کلرید لیتیوم 4 مولار به آن اضافه شد. در مرحله بعد، نمونه به دست آمده به مدت 3 ساعت بر روی یخ انکوبه شد و پس از 20 دقیقه سانتریفیوژ، رسوب به دست آمده در آب مقطر استریل حل گردید. با افزودن استات سدیم 3 مولار و اتانول 96 درصد محلول به دست آمده به مدت یک شب در فریزر20- درجه انکوبه گردید و پس از سانتریفیوژ و شستشوی با اتانول 70 درصد، رسوب به دست آمده در آب مقطر استریل حل و در 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد. غلظت RNA استخراج شده توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر تعیین شد. به منظور حذف DNA ژنومیک، 10 نانوگرم از RNA استخراج شده با 2 واحد ازDNase (DNA- free, Ambion, Austin, USA) تیمار شد.
طراحی پرایمر
پرایمرهای ویژه ژن هدف TPS1 (Forward and Reverse) و ژن کنترل اکتین ویژه گیاه پنبه(Actin-F and R) با استفاده از نرم‌افزار Primer 3 طراحی (جدول 1) و توسط شرکت امینسان سنتز شدند.
واکنش RT-PCR
واکنش RT-PCR با استفاده ازکیت Prime Script One Step RT-PCR ساخت شرکت TAKARA BIO INC Japanese انجام شد. این واکنش در حجم نهایی 25 میکرولیتر با محتوی 2 میکروگرم RNA، 1 واحد آنزیم Prime Script، 5/12 میکرولیتر بافر آنزیم Prime Script، 5/0 میکرولیتر از هر یک از پرایمرهای R و F در دستگاه PCR با برنامه حرارتی: واسرشته شدن در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه برای چرخه اول و برای چرخه دوم به بعد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 60 درجه به مدت 30 ثانیه و بسط در دمای 72 درجه به مدت 1 دقیقه درجه انجام شد. محصول PCR با استفاده از دستگاه الکتروفورز روی ژل آگاروز 2 درصد جداسازی شد. در پایان ژل‌های به دست آمده با اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی شدند.
جدول1- توالی پرایمرهای ژن‌های TPS1 و اکتین گیاه پنبه
|
اندازه محصول |
پرایمر برگشت |
پرایمر رفت |
ژن هدف |
|
323 |
TAAGCTGCGAGGGATGG |
CTGCGAGCCCAATATGCCAC |
TPS |
|
300 |
GTAGATGGGGACGGTGGAG |
ATTGTGAGCAACTGGGATGA |
اکتین |
نتایج
بررسی فیزیولوژیک
مقایسه رشد رویش
نتایج حاصل از اندازه‌گیری طول گیاهچه در تیمارهای مختلف نمک نشان داد که در غلظت‌های صفر و 50 میلی‌مولار نمک، طول گیاهچه‌های رقم ساحل و رقم قوزه‌درشت تفاوت معنی‌داری ندارند. افزایش غلظت نمک در تیمار 75 میلی‌مولار تأثیری بر طول گیاهچه‌های رقم ساحل نداشته، با این حال، طول گیاهچه‌های رقم قوزه‌درشت به طورمعنی‌داری کاهش نشان داد. افزایش بیشتر غلظت نمک در محیط‌کشت باعث کاهش شدید طول گیاهچه‌های رقم قوزه‌درشت نسبت به رقم ساحل شده است، به طوری که با تیمار 150 میلی‌مولار نمک 40 درصد از طول گیاهچه‌های قوزه‌درشت نسبت به تیمار شاهد کاسته شد، در حالی که در این سطح از نمک تنها 20 درصد از طول گیاهچه‌های رقم ساحل نسبت به تیمار شاهد کاسته شده است (شکل 1).
شکل 1- مقایسه طول گیاهچه‌های ساحل و قوزه‌درشت در پاسخ به تنش شوری. مقادیر میانگین 3 بار تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون LS Means در سطح P<0.05 است.
میزان سدیم
نتایج حاصل از اندازه‌گیری میزان سدیم در غلظت صفر میلی‌مولار نمک نشان داده که مقدار سدیم در هر دو رقم یکسان است. با افزایش غلظت نمک در محیط کشت میزان این عنصر در هر دو رقم افزایش نشان داد. غلظت سدیم در رقم قوزه‌درشت در تیمارهای 50، 75 و 100 میلی‌مولار سدیم تفاوت معنی‌داری را نشان نداد. افزایش غلظت نمک تا 150 میلی‌مولار سبب افزایش درخور توجه در میزان سدیم رقم قوزه‌درشت شد. میزان سدیم گیاهچه‌های رقم ساحل نیز با افزایش غلظت نمک افزایش پیدا کرد، اما در سطوح مختلف نمک میزان سدیم در رقم ساحل به طور معنی‌داری کمتر از رقم قوزه‌درشت است (شکل 2).
شکل 2- اندازه‌گیری میزان سدیم در برگ گیاهچه‌های پنبه رقم ساحل و قوزه‌درشت در تیمار شوری. مقادیر میانگین 3 بار تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون LS Means در سطح P<0.05 است.
اندازه‌گیری مقدار کلروفیل
در رقم ساحل میزان کلروفیل a، b و کلروفیل کل در تیمار صفر میلی‌مولار نمک به ترتیب 40، 79 و 62 درصد بیشتر از مقدار آن در رقم قوزه‌درشت است (شکل 3- الف، ب و ج)، در حالی که نسبت کلروفیل a/b در رقم قوزه‌درشت بیشتر از رقم ساحل است (شکل 3- د). با افزایش غلظت نمک در محیط‌کشت از مقدار کلروفیل در هر دو رقم کاسته شد، اما تا غلظت 100 میلی‌مولار نمک، همچنان میزان کلروفیل a، b و کلروفیل کل به طور معنی‌داری در رقم ساحل بیشتر از رقم قوزه‌درشت است. با افزایش بیشتر غلظت نمک تا 150 میلی‌مولار میزان کلروفیل در دو رقم مورد بررسی تفاوت معنی‌داری را نشان نداد. بررسی حاضر نشان داد که در رقم قوزه‌درشت نسبت کلروفیل a/b تا غلظت 100 میلی‌مولار نمک، بیشتر از این نسبت در رقم ساحل است، اما در تیمار 150 میلی‌مولار نمک این نسبت تفاوت معنی‌داری را در دو رقم مورد بررسی نشان نمی‌دهد (شکل 3- د).
بررسی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان
بررسی فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز در گیاهچه‌های پنبه نشان داد که در غلظت صفر میلی‌مولار نمک فعالیت این آنزیم در رقم قوزه‌درشت به طور معنی‌داری کمتر از میزان فعالیت این آنزیم در رقم ساحل است. افزایش غلظت نمک باعث کاهش فعالیت این آنزیم را در رقم قوزه‌درشت شده است. همچنین، نتایج حاضر نشان داد که افزایش غلظت نمک تا 75 میلی‌مولار تغییر معنی‌داری را در فعالیت این آنزیم در رقم ساحل پدید نیاورده است، اما با افزایش بیشتر غلظت نمک از فعالیت این آنزیم کاسته شده است. در مجموع، در تمامی سطوح شوری بررسی شده، فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز در رقم ساحل به طور معنی‌داری بیشتر از رقم قوزه‌درشت است. فعالیت این آنزیم در رقم ساحل در تیمار 150 میلی‌مولار نمک 54 درصد بیشتر از فعالیت آن در رقم قوزه‌درشت است (شکل 4- الف). بررسی فعالیت آنزیم پراکسیداز نیز نشان داد که تا غلظت 75 میلی‌مولار نمک تفاوت معنی‌داری در فعالیت این آنزیم در دو رقم مورد بررسی وجود ندارد. افزایش غلظت نمک تا 100 و 150 میلی‌مولار باعث افزایش معنی‌دار فعالیت این آنزیم در رقم ساحل نسبت به رقم قوزه‌درشت شده است؛ در حالی که در غلظت 150 میلی‌مولار نمک فعالیت این آنزیم در رقم ساحل 73 درصد افزایش را نسبت به تیمار شاهد نشان می‌دهد. فعالیت این آنزیم در رقم قوزه‌درشت به طور معنی‌داری نسبت به تیمار شاهد کاهش معنی‌داری را نشان می‌دهد (شکل4- ب). بررسی فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهچه‌های مورد بررسی نشان داد که میزان فعالیت این آنزیم در رقم ساحل در غلظت‌های صفر و 50 میلی‌مولار نمک به طور معنی‌داری بیشتر از فعالیت این آنزیم در رقم قوزه‌درشت است؛ در حالی که در غلظت‌های 75 و 100 میلی‌مولار نمک فعالیت این آنزیم تفاوت معنی‌داری را در دو رقم مورد بررسی نشان نمی‌دهد. تیمار 150 میلی‌مولار نمک باعث کاهش شدید فعالیت این آنزیم در رقم قوزه‌درشت شده است (شکل4- ج).
|
(الف) |
(ب) |
|
(ج) |
(د) |
|
شکل 3- نمودار مقایسه میزان کلروفیل a، b و کلروفیل کل و نسبت کلروفیل a/bدر گیاهچه‌های پنبه رقم ساحل و قوزه‌درشت در تنش شوری. مقادیر میانگین 3 بار تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون LS Means در سطح P<0.05 است. |
|
تحلیل بیان ژن
مقایسه الگوی بیان ژن TPS1 در دو رقم ساحل و قوزه‌درشت نشان داد که در غلظت صفر میلی‌مولار کلرید سدیم میزان بیان این ژن در ریشه هر دو رقم بسیار پایین است، اما میزان بیان این ژن در برگ رقم ساحل تا حدودی بیشتر از میزان بیان آن نسبت به برگ رقم قوزه‌درشت است. بررسی بیان این ژن در غلظت 150 میلی‌مولار کلرید سدیم نشان داد که شوری باعث افزایش میزان بیان این ژن می‌شود. مقایسه بیان ژن TPS1 در دو اندام ریشه و برگ در تیمار 150 میلی‌مولار نمک نشان می‌دهد که میزان بیان این ژن در برگ بیشتر از ریشه است. همچنین، مقایسه الگوی بیان ژن TPS1 در دو رقم ساحل و قوزه‌درشت نشان داد که شوری بیان این ژن را در اندام برگ رقم ساحل به طور قابل توجهی تحریک می‌کند (شکل 5).
|
(الف) |
(ب) |
|
|
شکل 4- فعالیت آنزیم‌های پلی فنل اکسیداز، پراکسیداز و کاتالاز در گیاهچه‌های پنبه رقم ساحل و قوزه‌درشت در تنش شوری. مقادیر میانگین 3 بار تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون LS Means در سطح P<0.05 است. |
||
|
|
(ج) |
|
|
شکل 5- الگوی بیان ژن TPS1 در اندام‌های ریشه و برگ رقم‌های ساحل و قوزه‌درشت در تیمار شوری. در این آزمایش از اکتین به عنوان شاهد داخلی استفاده شده است. |
||
بحث
شوری بالا با افزایش جذب یون‌های Na+ و ־Cl موجب کاهش رشد (Garcia-Lidon et al., 1998)، کاهش جذب آب (Desikan et al., 2005)، عدم توازن در جذب سایر یون‌های مغذی (Passarakli and Tucker, 1988)، افزایش اثر جذب انتخابی و آثار متقابل رقابتی یون‌ها (Griere and Walker, 1983) و نیز کاهش هدایت روزنه‌ای و جذب CO2 می‌شود (Banuls and Primo-Millo, 1992). مطالعات انجام شده روی برنج (Ashraf and Bhatti, 2000)، بادام‌زمینی (Hajar et al., 1993) و پروانش (Jaleel and Sridharan, 2008) نشان داده است که با افزایش شوری از میزان کلروفیل، فتوسنتز و در نهایت، میزان محصول کاسته می‌شود. علل متعددی در کاهش کلروفیل نقش دارند که از جمله می‌توان به از بین رفتن غشا (Ashraf and Ahmad, 2000)، ناپایداری کمپلکس پروتئینی رنگیزه‌ها و یا کاهش سنتز کلروفیل اشاره کرد (Levitt, 1980). در واقع، کاهش میزان کلروفیل برگ در طی تنش شوری می‌تواند حاصل آسیب اکسیداتیو باشد که در اثر تولید رادیکال‌های فعال اکسیژن و اختلال در متابولیسم کلروپلاست روی می‌دهد (Rout and Shaw, 2001) که متعاقب آن افزایش نسبت کلروفیل a/b و کاهش بازده فتوسنتزی برگ‌ها اتفاق می‌افتد (Koyro, 2006). نتایج حاصل از اندازه‌گیری میزان سدیم در غلظت‌های مختلف شوری در دو رقم ساحل و قوزه‌درشت نشان داد که با افزایش شوری میزان نمک در هر دو رقم مورد بررسی افزایش می‌یابد، اما افزایش میزان نمک در رقم قوزه‌درشت به طور معنی‌داری بیشتر از رقم ساحل است. سمّیت یونی ناشی از شوری، از توسعه برگ‌های جوان جلوگیری می‌کند و چنانچه این وضع ادامه یابد، باعث پیری زودرس آنها می‌شود (Munns and Tester, 2008). تجمع سدیم در سیتوپلاسم سلول باعث القای تولید رادیکال‌های فعال اکسیژن در سلول می‌شود (Mayer, 2006)، بنابراین، بافت‌های گیاهی برای کنترل میزان رادیکال‌های فعال اکسیژن و حفاظت سلول‌ها در شرایط تنش از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نظیر کاتالاز، پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز استفاده می‌کنند (Asada, 1999). افزایش میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان می‌تواند در تحمل گیاهان به شوری نقش داشته باشد (Agarwal and Pandey, 2004؛ (Mandhania et al., 2006. افزایش فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان تحت شرایط شوری در کتان (Desingh and Kanagaraj, 2007)، برنج (Fadzilla and Finch, 1997)، خیار (Lechno et al., 19970، ساقه گندم (Menogeuzzo and Navari-Izzo, 1999) و نخودفرنگی (Hegedus et al., 2001) گزارش شده است. در این خصوص سطوح تولید H2O2 داخل سلولی توسط کاتالاز و پراکسیداز تنظیم می‌شود (Joseph and Jini, 2010). گزارش‌ها گویای آن است که در ارقام مقاوم گیاهانی نظیر پنبه (Gossett et al., 1994)، یونجه (Wang et al., 2009)، فلفل (Turhan et al., 2006)، لوبیا (Hernandez et al., 1993) و نخود (Singh, 2004) میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز بیشتر از میزان فعالیت این آنزیم در ارقام حساس است. پراکسیدازها با مصرف H2O2 در دیواره سلولی، اکسیداسیون انواعی از ترکیبات آلی از جمله فنولیک‌ها را برای تشکیل لیگنین یا سوبرین کاتالیز می‌کنند (Quiroga et al., 2000). همچنین، آنزیم پراکسیداز علاوه بر مصرف H2O2 و کاهش آسیب‌های حاصل از آن، با لیگنینی ساختن دیواره، سدی فیزیکی در برابر سمّیت یون‌های کلرید سدیم ایجاد می‌کند (Hegedus et al., 2001). نتایج حاضر نشان داد که در رقم مقاوم ساحل آنزیم پلی فنل اکسیداز عملکرد بهتری نسبت به رقم حساس قوزه‌درشت دارد. آنزیم پلی فنل اکسیدار هم مانند پراکسیداز با مصرف H2O2 و سنتز لیگنین سد فیزیکی در مقابل یون‌های سمّی می‌سازد و از صدمه بیشتر به گیاهان جلوگیری می‌کند (Badar et al., 2006).
در ارقام مقاوم به شوری گیاهانی نظیر نخودفرنگی (Hernandez and Almansa, 2002)، چغندر‌قند (Bor et al., 2003) و نخود (Singh, 2004) فعالیت آنزیم کاتالاز بیشتر از ارقام حساس است. نتایج حاضر نشان داد که اگرچه با افزایش غلظت نمک فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز به طور معنی‌داری در رقم ساحل بیشتر از رقم غوزه‌درشت است، اما فعالیت این آنزیم در هر دو رقم مورد بررسی، با افزایش شوری کاهش یافته است. فعالیت آنزیم کاتالاز نیز با افزایش غلظت نمک در هر دو رقم به طور معنی‌داری کاهش یافته است (شکل 4). به نظر می‌رسد که افزایش غلظت نمک باعث تولید بیش از حد پراکسید هیدروژن شده، در نهایت، توانسته آنزیم کاتالاز را غیر فعال سازد (Mashoudi et al., 1997). نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز نشان داد که با افزایش غلظت نمک فعالیت این آنزیم در رقم ساحل به طور معنی‌داری افزایش می‌یابد. این امر نشان می‌دهد که این آنزیم نقش مهمی در مقابله با تنش اکسیداتیو حاصل از شوری در رقم ساحل ایفا می‌کند. نتایج حاصل از آنالیزهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیک گیاهچه‌های دو رقم ساحل و قوزه‌درشت پنبه در تیمار شوری نشان داد که غلظت‌های 75، 100 و 150 میلی‌مولار کلرید سدیم در رقم حساس قوزه‌درشت و غلظت‌های 100 و 150 میلی‌مولار کلرید سدیم در رقم مقاوم ساحل، تنش اکسیداتیو ایجاد می‌کند. رادیکال‌های فعال اکسیژن تولید شده در طی تنش اکسیداتیو باعث تخریب پروتئین‌ها و لیپیدهای غشایی و اسیدهای نوکلئیک خواهد شد Chance and Maehly, 1955)؛ Rout and Shaw, 2001). این امر باعث تخریب ساختار کلروپلاستی و ناپایداری کمپلکس‌های پروتئینی گیرنده نور می‌شود (Singh, 2004). در نهایت، میزان کلروفیل برگ کاهش یافته، با پایین آمدن سطح فتوسنتز و متابولیسم سلولی، بیوماس گیاهی کاهش می‌یابد، در مقابل هنگامی که گیاهان مقاوم در شرایط تنش قرار گیرند، با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان تولید رادیکال‌های فعال اکسیژن را کاهش داده، فتوسیستم‌ها را در مقابل آسیب‌های تنش اکسیداتیو حفاظت می‌کنند (Ashraf, 2009).
همچنین، نتایج حاصل از انتقال ژن TPS1 از مخمر به گیاه تنباکو نشان داد که در گیاهان تراریخت میزان کلروفیل و شدت فتوسنتز در واحد سطح برگ افزایش می‌یابد. این نتایج نشان می‌دهد که میزان T6P با شدت فتوسنتز رابطه مستقیم دارد (Pilon-Smits et al., 1998; Pellny et al., 2004). اخیراً گزارش‌های متعددی از دست‌ورزی ژنی برای تولید گیاهان با سطح T6P بالاتر و تولید گیاهان مقاوم به انواع تنش‌های خشکی، سرما و شوری در تک‌لپه ای‌ها و دولپهایها گزارش شده است (Miranda et al., 2007). انتقال ژن TPS و TPP (ترهالوز-6-فسفات فسفاتاز) باکتریایی به گیاه برنج نیز باعث افزایش غلظت T6P و مقاومت به تنش شده است (Iordachescu and Imai, 2008). به‌علاوه، TPS باکتریایی و یا مخمر در گیاهان برنج تراریخت شده در مقایسه با گیاهان کنترل در معرض تنش خشکی، کاهش تخریب فتواکسیداتیو را نشان دادند که متعاقب آن، سطح فتوسنتز در حد مطلوب نگه داشته شده است. از این نتایج می‌توان دریافت که متابولیسم ترهالوز (که در کلروپلاست سلول صورت می‌گیرد) در حفاظت گیاه از آسیب‌های ناشی از تنش غیر زنده دخالت دارد (Garg et al., 2002). تحمل خشکی از طریق افزایش بیان TPS1 در کلروپلاست به این نکته اشاره می‌کند که T6P به عنوان سیگنالی مهم در پاسخ به تنش خشکی عمل می‌کند (Schluepmann and Paul, 2009). Avonce و همکاران (2004) نشان دادند که بیان بالای ژن AtTPS1 در آرابیدوپسیس تالیانا به ایجاد فنوتیپ‌های حساس به ABA و گلوکز منجر می‌شود. این امر اثبات می‌کند که آنزیم AtTPS1 با سیگنالینگ ABA و قند در طول رشد رویشی نقش دارد، تحمل خشکی در آنها حاصل فرآیندهای سیگنالینگ این آنزیم است. از طرفی دیگر، نتایج حاصل از آزمایش‌های میکرواری (microarray) در گیاهچه‌های آرابیدوپسیس نشان داده است که ترهالوز باعث بیان ژن‌های مرتبط با رادیکال‌های فعال اکسیژن و متابولیسم ثانویه می‌گردد. این نتایج نشان داده است که ترهالوز باعث بیان ژن‌هایی می‌شود که در پاسخ به تنش‌های زیستی دخالت دارند (Aghdasi et al., 2008).
بررسی‌های انجام شده بر روی الگوی بیان ژن TPS1 در اندام‌های مختلف گیاه پنبه، رقم متحمل به خشکی (سوکرال 23)، در تیمار با 6000 PEG نقش سیگنالی T6P را در تحمل به تنش اسمزی نشان داده است (Sotirios et al., 2006). نتایج این گزارش نشان داد که بیان TPS1 در برگ‌ها بیشتر از میزان بیان آن در اندام ریشه است. نتایج حاضر نیز نشان داد که بیان ژن TPS1 در برگ و ریشه دو رقم ساحل و قوزه‌درشت با تیمار شوری افزایش یافته، میزان بیان آن در اندام برگ بیشتر از اندام ریشه است. همچنین، این نتایج نشان داد که بیان ژن TPS1 در رقم ساحل که رقمی تتراپلویید است، نسبت به رقم قوزه‌درشت که رقمی دیپلویید است، بیشتر است. از آنجایی که در ارقام دیپلویید یک کپی از ژن TPS1 در ژنوم گیاه پنبه وجود داشته و با توجه با اینکه رقم ساحل از گونه تتراپلویید بوده و در اللوپلوییدی گیاه پنبه همه ژن‌های هسته‌ای دو برابر شده است (Wendel and Cronn, 2002; Sotirios et al., 2006)، به نظر می‌رسد که این امر در مقاوم ساختن رقم ساحل در مقابل تنش شوری نقش داشته باشد. همچنین، با توجه به تحقیقات یاد شده سطح بالای بیان TPS1 در غلظت 150 میلی‌مولار نمک در رقم ساحل بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان اثر مطلوب داشته و با بالا نگه داشتن میزان کلروفیل‌های a و b، از کاهش سطح فتوسنتز در تنش شوری جلوگیری و متعاقب آن متابولیسم نرمال سلولی و بیوماس گیاهی در گیاهچه‌های رقم ساحل تا حدی بیشتر از رقم قوزه‌درشت حفظ می‌شود.
جمع‌بندی
نتایجحاضر اطلاعات اولیه‌ای در ارتباط با بیان ژن TPS1 در پاسخ به تنش شوری در ارقام دیپلویید و تتراپلویید گیاه پنبه فراهم آورده است. این اطلاعات می‌تواند در مراحل بعدی در انتقال ژن TPS1 به گیاه پنبه و تولید ارقام مقاوم به تنش با طول الیاف بلند استفاده شود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله از حوزه معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه گلستان برای حمایت مالی این تحقیق نهایت تشکر و قدردانی را دارند.
)
