Authors
Department of Biology, Faculty of Sciences, Shahid Bahonar University, Kerman, Iran
Abstract
Keywords
تنش سرما یک عامل محیطی اصلی است که تولید محصولات زراعی را محدود میکند و اثر شدیدی بر بقا و توزیع جغرافیایی گیاهان دارد. گیاهان از نظر تحمل دماهای سرد (صفر تا 15 درجه سانتیگراد) و انجماد (کمتر از صفر درجه سانتیگراد) بسیار متفاوتند. بیشتر گیاهان متحمل به سرما هستند؛ گرچه بسیاری از آنها متحمل به انجماد نیستند، با وجود این، میتوانند از طریق فرآیند عادت به سرما (cold acclimation) که در نتیجه قرارگیری در معرض طول روزهای کوتاه و دماهای سرد بالای صفر درجه حاصل می‌شود، تحمل به سرما و انجماد را در خود افزایش دهند. فرآیند عادت به سرما مستلزم تغییرات بزرگ زیست-شیمیایی و عملکردی است (Jan et al., 2009). در زمستان، فعالیت گیاهان چندساله که توانایی عادت به سرما را دارند، در مرحله رویشی متوقف می‌شود. در واقع، گیاهان وارد مرحله خفتگی می‌شوند و تحمل به انجماد در آنها افزایش مییابد. به طور معمول، پاسخ گیاه به تنش سرما به سه مرحله مشخص تقسیم می‌شود. نخستین مرحله عادت به سرما (cold acclimation) (پیش از سخت شدن= prehardiness) است که در دماهای سرد بالای دمای انجماد آب رخ میدهد. مرحله دوم (سخت شدن=hardiness) به یک دوره قرارگیری در معرض دماهای زیر صفر نیاز دارد و پس از آن میزان کامل تحمل به دست میآید. مرحله سوم و پایانی، عادتزدایی (deacclimation) و بازگشت گیاه به حالت عادی پس از زمستان است. برخی از گیاهان (به ویژه درختان) به ترکیبی از طول روز کوتاه و سرما نیاز دارند تا تحمل به سرما به طور کامل در آنها ایجاد شود و پس از گرم شدن هوا و طولانی شدن طول روز، تحمل به انجماد در آنها از دست میرود (Janska et al., 2010). فرآیند عادت به سرما (مرحله نخست پاسخ گیاه به تنش سرما) شامل دو مرحله مشخص است. در ابتدا کاهش طول روز باعث توقف رشد و ایجاد خفتگی می‌شود و افزایش حدواسطی در تحمل به انجماد دیده می‌شود. سپس، در مرحله دوم با قرارگیری گیاه در معرض دماهای سرد و سپس دماهای انجماد، بیشینه تحمل به انجماد در گیاهان به دست میآید و بخشهای ماندگار در زمستان قادر به بقا در دماهای انجماد می‌شوند (Puhakainen et al., 2004). پسته خوراکی (Pistacia Vera) از گونه‌های مهم جنس Pistacia L. است. این جنس متعلق به تیره Anacardiaceae و راسته Sapindales است. P. vera تنها گونه مهم از نظر اقتصادی در جنس Pistacia L. است و در مناطق گرمسیری دنیا به خاطر دانه خوراکیاش کشت می‌شود. پسته گونه‌ای درختی، شاخص مناطق کم آب است که در معرض خشکی و دماهای گرم و سرد شدید قرار میگیرد (Tilkat and Onay, 2008). پروتئینهای دهیدرین یعنی گروه
(D-11) از پروتئینهای LEA (Late embryogenesis ebundant) در اعضای مختلفی از قلمرو گیاهان مانند گیاهان غیر‌آوندی، گیاهان آوندی بدون دانه و به طور عمومیتر در همه گیاهان دانهداری که بررسی شده‌اند، شناسایی شده است. مطالعات نشان داده است که این پروتئینها به شکل بسیار آبدار، بدون ساختار و بینظم در محلول آبی قرار دارند و در زمان تنشهایی که باعث آب‌گیری سلول می‌شوند (مانند سرما، خشکی، شوری و ...) از غشاها و ماکرومولکولهای سلول حفاظت میکنند (Battaglia et al., 2008). توالی ناحیه کد کننده ژن دهیدرین پسته (PV-dhn) توسط Yakubov و همکاران (2005) شناسایی شد. ژن دهیدرین پسته cDNA ای با bp 874 جفت باز و یک ORF (Open reading frame) با bp 690 دارد که پروتئینی با 230 اسید آمینه را کد میکند و احتمالاً ژنی تک نسخهای در ژنوم پسته است. پروتئین دهیدرین پسته وزنی حدود 9/25 کیلودالتون دارد. دهیدرین پسته از نوع K5 است (Yakubov et al., 2005). با توجه به اثر درخور توجه تنش سرما بر گیاهان و همچنین، آثار مخرب این تنش بر گیاه پسته که از صادرات مهم غیر نفتی ایران است، بررسی سازوکارهای درگیر در فرآیند عادت به سرما و پاسخ به این تنش میتواند مهم باشد. هدف این پژوهش، این است که تأثیر تیمارهای سرما و طول روز کوتاه بر بیان ژن دهیدرین، در برگ دانهرُستهای پسته بررسی شود و مشخص شود که آیا ژن دهیدرین پسته در اثر سرما، طول روز یا هر دوی آنها در زمستان بیان می‌شود، همچنین، مشخص شود که آیا این ژن علاوه بر اندامهای ماندگار در زمستان، در اندام غیر ماندگار مانند برگ نیز عملکردی هست یا خیر. از آن جا که گیاهان باززایی شده ممکن است پاسخهای متفاوتی به تنشها ارایه دهند، مقایسهای بین گیاهان رشد کرده در شرایط در زیوه (in vivo) و در شیشه (in vitro)، از نظر میزان بیان این ژن در اثر تیمارهای یکسان انجام شود.
مواد و روش‌ها
کشت گیاهان در گلخانه
بذرهای پسته رقم بادامی از مؤسسه تحقیقات پسته کشور در رفسنجان تهیه شدند. بذرها به مدت 1 دقیقه در محلول (WV-1) 1000/1 قارچکش بنومیل ضدعفونی شدند، سپس به مدت 24 ساعت در آب خیسانده، در گلدانهای حاوی مخلوط 1:1 از خاک و ماسه کاشته شدند. گلدانها در شرایط گلخانه با حرارت روز و شب 23-25 درجه سانتیگراد و تحت نور 2000 لوکس با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفته، یک روز در میان آبیاری شدند.
کشت گیاهان در شیشه
محیط‌کشت مورد استفاده، محیط‌کشت پایه MS (Murashige and Skoog, 1962) همراه با 30 گرم در لیتر سوکروز، 8 گرم در لیتر آگار، مقدار
mgl-1 2,4-D 25/0mgl-1 BAP+ 3 و ویتامینها بود. اسیدیته محلول در حد 8/5-9/5 تنظیم و محلول حاصل به مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار 2 اتمسفر اتوکلاو شد. قطعات تکگره به اندازه حدود 1 سانتیمتر از گیاهان گلخانهای یک ماهه به دست آمدند. برای ضدعفونی کردن، جداکشتها به مدت 45 ثانیه در الکل 70 درصد غوطهور شدند و پس از شستشو با آب مقطر استریل به مدت 25 دقیقه در محلول هیپوکلرید سدیم 5 درصد همراه با4 قطره تویین 20 قرار گرفتند. جداکشتها 3 تا 4 بار با آب مقطر استریل شسته و روی محیط‌کشت قرار گرفتند. نمونهها در اتاق رشد در دمای 23-25 درجه سانتیگراد و تحت نور 2000 لوکس و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند و هر 2 هفته یک‌بار واکشت شدند.
تیمارها
به منظور انجام تیمار سرما، دانهرُستها و شاخسارهای باززایی شدة یک ماهه به مدتهای 1، 3، 7 و 14 روز در دمای 4 درجه سانتیگراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند. به منظور انجام تیمار طول روز کوتاه، دانهرُستها و شاخسارهای باززایی شدة یک ماهه به مدتهای 1، 3، 7 و 14 روز در دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
طراحی آغازگر
توالی ناحیه کد کننده ژنهای دهیدرین پسته به عنوان ژن پاسخگو (accession no: Y07600) و ژن NADH dehydrogenase،(accession no: HM991263) پسته به عنوان ژن مرجع (reference gene) از سایت NCBI گرفته شد و طراحی آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار Primer3 انجام شد و سپس مناسب بودن آنها توسط نرمافزارهای BLAST و GeneRunner بررسی شد. توالی آغازگرهای طراحی شده به صورت زیر است، پس از آن، سنتز آغازگرهای طراحی شده توسط شرکت سیناژن انجام شد.
Dehydrin Forward 2:
5’ ATGGATATGGCGTAGAGAAG 3’ TM: 52
Dehydrin Reverse 2:
5’ TACTTGGGATCTCATTCACC 3’ TM: 52
Product size: 156 bp
NADH dehydrogenase Forward:
5’ GGAGACTCAAATGGTGGATA 3’ TM: 55
NADH dehydrogenase Reverse:
5’ ACCTGCTAGTGGAGGAAGAC 3’ TM: 55
Product size: 216 bp
مطالعات بیان ژن
RNA کل از برگ گیاهان شاهد و تیمار با استفاده از کیت استخراج RNA،(Qiagene, RNeasy Plant Mini Kit, Germany) طبق روش مندرج در کیت استخراج شد. برای بررسی حضور، ارزیابی خلوص و تعیین غلظت RNA از روشهای اسپکتروفتومتری با استفاده از زیست‌سنج نوری مدل 6131 (Eppendorf AG Biophotometer, Germany) و الکتروفورز افقی روی ژل آگاروز 1 درصد استفاده شد. برای انجام
RT-PCR، از RNA استخراج شده از همه گیاهان شاهد و تیمار به مقدار مساوی (600 نانوگرم) برداشته شد و برای هر نمونه (شاهد و تیمارها) دو لوله در نظر گرفته شد که در یکی از آنها آغازگرهای ژن دهیدرین و در لوله دیگر، به عنوان شاهد داخلی (internal control)، آغازگرهای ژن NADH dehydrogenase ریخته شد. برای انجام RT-PCR از کیت RT-PCR یک مرحلهای، (BIONEER, AccuPowerR RT/PCR PreMix, Korea) طبق روش مندرج در کیت و ترموسایکلر مدل PTC،(MJ Mini Personal Termal Cycler BioRad, USA 1148)، استفاده شد. لولههای لیوفیلیزه موجود در کیت دارای تمامی مواد لازم برای سنتز cDNA و انجام PCR هستند. برنامه استفاده شده برای انجام واکنش PCR در جدول 1 آورده شده است:
جدول 1- برنامه اجرا شده در PCR به وسیله آغازگرهای سنتزکننده قطعه 156 جفت بازی از ژن دهیدرین و قطعه 216 جفت بازی از ژن مرجع. دمای اتصال آغازگرها برای ژن دهیدرین 52 و برای ژن مرجع 55 است.
|
زمان |
حرارت |
مرحله |
تعداد سیکل |
|
5 |
94 |
واسرشت‌سازی اولیه |
1 |
|
1 |
94 |
واسرشت‌سازی |
30 |
|
1 |
52 و 55 |
اتصال آغازگرها |
|
|
1 |
72 |
طویل شدن زنجیره DNA |
|
|
7 |
72 |
طویل شدن نهایی |
1 |
تحلیل دادهها
شدت باند تکثیر شده در واکنش PCR با استفاده از نرم‌افزار Totallab به دست آمد. سپس دادههای مربوط به شدت باندها برای مقایسه میزان بیان ژن بین نمونههای شاهد و تیمار، با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن توسط نرم‌افزار SPSS نسخه 5/11 و با ضریب اطمینان 95 درصد مقایسه و نمودارها با استفاده از نرم‌افزار Excel نسخه 2007 ترسیم شدند. در آزمایش‌ها،
RT-PCR سه تکرار در نظر گرفته شد.
نتایج
RNA کل
نتایج حاصل از خواندن جذب RNA استخراج شده نشان داد که جذب RNAها در طول موج 260 نانومتر به طور متوسط 06/0-07/0 بود. حضور سه باند پُر رنگ که به RNAهای ریبوزومی که نشان‌دهنده کیفیت مطلوب RNA استخراج شده برای انجام RT-PCR مربوط است، روی ژل آگاروز مشاهده شد (شکل 1).
شکل 1- نیمرخ الکتروفورزی یکی از نمونههای (7 روز تیمار سرما) RNA کل استخراج شده از برگ پسته روی ژل آگاروز 1 درصد. M: نشانگر مولکولی (1kb DNA ladder, Fermentase).
بیان ژن دهیدرین در دانهرُستهای پسته
نتایج حاصل از RT-PCR، تکثیر قطعه 156 جفت بازی را برای ژن دهیدرین و قطعه 216 جفت بازی را برای ژن مرجع نشان داد (شکلهای 2 و 3). دادههای مربوط به شدت باندها که از نرم‌افزار Totallab (نسخه Phoretix 1D) به دست آمده بودند، نشان دادند که میزان بیان ژن مرجع در همه گیاهان شاهد و تیمار یکسان بود. همچنین، نشان داده شد که میزان بیان ژن دهیدرین تحت همه تیمارهای سرمایی (1، 3، 7 و 14 روز) نسبت به گیاه شاهد افرایش معنیداری داشت، با این حال، تفاوتی در میزان بیان ژن تحت تیمارهای مختلف سرمایی دیده نشد. هیچ یک از تیمارهای طول روز کوتاه استفاده شده در این تحقیق (1، 3، 7 و 14 روز) اثری بر بیان ژن دهیدرین نداشتند (شکلهای 2، 3 و 4).
شکل 2- نیمرخ الکتروفورزی باندهای حاصل از واکنش RT-PCR قطعه 216 جفت بازی، با استفاده از آغازگرهای ژن مرجع. M: نشانگر مولکولی (Vivantice DNA ladder)؛ C: شاهد؛ SD1: 1 روز طول روز کوتاه؛ LT1: 1 روز سرما؛ SD3: 3 روز طول روز کوتاه؛ LT3: 3 روز سرما؛ SD7: 7 روز طول روز کوتاه؛ LT7: 7 روز سرما؛ SD14: 14 روز طول روز کوتاه؛ LT14: 14 روز سرما؛ (SD: short day, LT: low temperature).
شکل 3- نیمرخ الکتروفورزی باندهای حاصل از واکنش RT-PCR قطعه 156 جفت بازی، با استفاده از آغازگرهای ژن دهیدرین. M: نشانگر مولکولی (Vivantice DNA ladder)؛ C: شاهد؛ SD1: 1 روز طول روز کوتاه؛ LT1: 1 روز سرما؛ SD3: 3 روز طول روز کوتاه؛ LT3: 3 روز سرما؛ SD7: 7 روز طول روز کوتاه؛ LT7: 7 روز سرما؛ SD14: 14 روز طول روز کوتاه؛ LT14: 14 روز سرما؛ (SD: short day, LT: low temperature).
شکل 4:- میزان بیان ژن دهیدرین در دانهرُستهای شاهد و تیمارهای 1، 3، 7 و 14 روز سرما. میزان بیان ژن در اثر تیمارهای سرمایی افزایش معنیداری نسبت به شاهد دارد و در اثر تیمارهای طول روز کوتاه نسبت به شاهد تفاوتی نشان نمیدهد. C: شاهد؛ SD1: 1 روز طول روز کوتاه؛ LT1: 1 روز سرما؛ SD3: 3 روز طول روز کوتاه؛ LT3: 3 روز سرما؛ SD7: 7 روز طول روز کوتاه؛ LT7: 7 روز سرما؛ SD14: 14 روز طول روز کوتاه؛ LT14: 14 روز سرما؛ (SD: short day, LT: low temperature). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار بین میانگینها بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در سطح P<0.05 است.
بیان ژن دهیدرین در شاخسارهای باززایی شده پسته
به منظور بررسی بیان ژن دهیدرین در شاخسارهای باززایی شده، از برگ شاخسارهای باززایی شده شاهد و تیمارهای 7 روز سرما و 7 روز طول روز کوتاه، RNA کل استخراج و RT-PCR انجام شد. نتایج نشان داد که میزان بیان ژن مرجع در همه گیاهان شاهد و تیمار یکسان بود و میزان بیان ژن دهیدرین تحت تیمار سرمایی نسبت به گیاه شاهد افزایش معنیداری داشت و در اینجا نیز طول روز کوتاه اثری بر بیان ژن دهیدرین نداشت (شکلهای 5، 6 و 7).
مقایسه اثر سرما بر دانهرُستها و شاخسارهای باززایی شده
به منظور مقایسه اثر سرما بر بیان ژن دهیدرین در دانهرُستها و شاخسارهای باززایی شده، از برگ دانهرُستها و شاخسارهای باززایی شده شاهد و آنهایی که 7 روز تیمار سرما دیده بودند، RNA کل استخراج و RT-PCR انجام شد. نتایج نشان داد که میزان بیان ژن مرجع در همه نمونهها یکسان بود و شاخسارهای باززایی شده نسبت به دانهرُستها، هم در حالت طبیعی و هم پس از تیمار سرما، کمتر قادر به بیان ژن دهیدرین بودند (شکلهای 8، 9 و 10).
|
شکل 5- نیمرخ الکتروفورزی باندهای حاصل از واکنش RT-PCR قطعه 216 جفت بازی، با استفاده از آغازگرهای ژن مرجع. M: نشانگر مولکولی (Vivantice DNA ladder)؛ C: شاهد؛ SD7: 7 روز طول روز کوتاه؛ LT7: 7 روز سرما؛ (SD: short day, LT: low temperature). |
|
|
شکل 6- نیمرخ الکتروفورزی باندهای حاصل از واکنش RT-PCR قطعه 156 جفت بازی، با استفاده از آغازگرهای ژن دهیدرین. M: نشانگر مولکولی (Vivantice DNA ladder)؛ C: شاهد؛ SD7: 7 روز طول روز کوتاه؛ LT7: 7 روز سرما؛ (SD: short day, LT: low temperature). |
|
|
شکل 7- میزان بیان ژن دهیدرین در شاخسارهای باززایی شدهی شاهد و تیمارها 7 روز سرما و 7 روز طول روز کوتاه. میزان بیان ژن در اثر تیمار سرما افزایش معنیداری نسبت به شاهد دارد و در اثر تیمار طول روز کوتاه نسبت به شاهد تفاوتی نشان نمیدهد. C: شاهد؛ SD7: 7 روز طول روز کوتاه؛ LT7: 7 روز سرما؛ (SD: short day, LT: low temperature). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار بین میانگینها بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در سطح P<0.05 است. |
|
|
|
|
|
|
|
|
شکل 8- نیمرخ الکتروفورزی باندهای حاصل از واکنش RT-PCR قطعه 216 جفت بازی، با استفاده از آغازگرهای ژن مرجع. M: نشانگر مولکولی (Vivantice DNA ladder)؛ SLT: 7 روز تیمار سرما در دانه‌رُست؛ TLT: 7 روز تیمار سرما در شاخسارهای باززایی شده؛ SC: شاهد دانه‌رُست؛ TC: شاهد شاخسار باززایی شده؛ (SLT: seedling low temperature, TLT: tissue culture low temperature, SC: seedling control, TC: tissue culture control). |
|
|
شکل 9- نیمرخ الکتروفورزی باندهای حاصل از واکنش RT-PCR قطعه 156 جفت بازی، با استفاده از آغازگرهای ژن دهیدرین. M: نشانگر مولکولی (Vivantice DNA ladder)؛ SLT: 7 روز تیمار سرما در دانه‌رُست؛ TLT: 7 روز تیمار سرما در شاخسارهای باززایی شده؛ SC: شاهد دانه‌رُست؛ TC: شاهد شاخسار باززایی شده؛ (SLT: seedling low temperature, TLT: tissue culture low temperature, SC: seedling control, TC: tissue culture control). |
|
|
شکل 10- میزان بیان ژن دهیدرین در دانهرُستها و شاخسارهای باززایی شده شاهد و تیمار 7 روز سرما. SLT: 7 روز تیمار سرما در دانه‌رُست؛ TLT: 7 روز تیمار سرما در شاخسارهای باززایی شده؛ SC: شاهد دانه‌رُست؛ TC: شاهد شاخسار باززایی شده. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار بین میانگینها بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن در سطح P<0.05 است. (SLT: seedling low temperature, TLT: tissue culture low temperature, SC: seedling control, TC: tissue culture control). |
بحث
بیان طبیعی ژن دهیدرین در گیاهان
میزان پروتئین دهیدرین در سلولهای گیاهان چوبی همراه با تغییرات فصلی تغییر میکند. در گیاهان چوبی مانند غان و هلو نشان داده شده است که میزان پروتئین دهیدرین با شروع پاییز، شروع به افزایش میکند و در اواسط زمستان که گیاه عادت به سرما کرده است، به بیشینه رسیده، در اواخر بهار همراه با عادتزدایی، کاهش مییابد (Yakubov et al., 2005). Yakubov و همکاران (2005) نشان دادند که پروتئین دهیدرین پسته نیز در جوانههای گلآذین نر چنین تغییرات فصلی را نشان میدهد. Rorat و همکاران (2004) اظهار داشتند که دهیدرینها به طور تقریبی در همه بافتهای رویشی، در زمان رشد بهینه، بیان پایینی داشته و در سلولها حضور دارند. Richard و همکاران (2000) نشان دادند که در حالت طبیعی، در میزان رونوشت ژن دهیدرین بین اندامهای مختلف گیاهان تفاوتهایی وجود. همچنین، Wisniewski و همکاران (1996) نشان دادهاند که ممکن است چندین نوع دهیدرین در یک گیاه وجود داشته باشد که برخی به طور فصلی و برخی به طور دامی و ثابت بیان می‌شوند و همچنین، بعضی از دهیدرینها تنها در برخی از اندامها بیان می‌شوند. گزارشهای محدودی در مورد بیان ژن دهیدرین در برگها وجود دارد، اما Puhakainen و همکاران (2004) نشان دادند که مسیرهای انتقال پیامی که باعث تحمل به انجماد در بافتهای ماندگار در زمستان مانند ساقه و جوانههای غان نقرهای (Betula pendula cv Roth) می‌شوند، در برگهای این گیاه نیز بیان می‌شوند. این محققان اظهار داشتند که برگ میتواند مدل خوبی برای بررسی وقایع مولکولی که در طول فرآیند عادت به سرما رخ میدهند، باشد. در این تحقیق نیز برگ به عنوان اندام مورد مطالعه انتخاب شد. نتایج RT-PCR نشان داد که ژن دهیدرین پسته در شرایط طبیعی یعنی شرایط گلخانهای با طول روز بلند و دمای اتاق، میزان پایینی از بیان را در برگ دانهرُستها داشت.
بیان ژن دهیدرین در اثر تنشهای غیر زیستی مانند سرما
گیاهان در طول زندگی در معرض انواعی از تنشهای محیطی قرار میگیرند. آب‌گیری سلول، وجه مشترک تنشهای غیر زیستی مانند سرما، خشکی و شوری است و بسیاری از ژنهای پاسخگو به سرما، توسط این تنشها نیز القا می‌شوند (Puhakainen et al., 2004). در گیاهانی که در معرض آب‌گیری قرار گرفتهاند سمیّت فلزی همراه با تولید گونه‌های اکسیژن آزاد امری عمومی است و دهیدرینها میتوانند به عنوان نظافتچیهای رادیکالهای آزاد حاصل از تنش اکسیداتیو عمل کنند. اتصال به فلز که از ویژگیهای پروتئینهای دهیدرین است، ممکن است با عملکرد سمّزدایی مورد نیاز تحت شرایط تنش مرتبط باشد (Battaglia et al., 2008). همچنین، شواهدی وجود دارد که دهیدرینها از غیرفعال شدن آنزیمها که در اثر آب‌گیری اتفاق می‌افتد، جلوگیری میکنند که این عمل به برهمکنش این پروتئینها با سطوح آبگریز غشاها و پروتئینهایی که در حال واسرشت شدن هستند، وابسته است (Hara et al., 2001). به علاوه، مارپیچ‌های α و ساختار بینظم دهیدرینها در فراهم کردن یا حفظ آب در محیطهای ریز سلولی برای حفظ عملکرد و تثبیت ساختار ماکرومولکولها و ساختارهای سلولی در زمان کمبود آب نقش مهمی دارند (Battaglia et al., 2008). هورمون ABA در مسیرهای انتقال پیام بسیاری از ژنهای پاسخگو به تنش دخیل است و در نتیجه بیان این ژنها در اثر ABA خارجی نیز القا می‌شود (Puhakainen et al., 2004).
پژوهش‌های بسیاری حاکی از آن است که ژن دهیدرین گیاهان در پاسخ به شرایط محیطی که باعث آب‌گیری می‌شوند، بیان می‌شود. مطالعات زیادی روی گیاهان چوبی، افزایش بیان ژنهای مختلف دهیدرین را تحت تنش سرما، خشکی ، شوری، تیمار با ABA خارجی، پلیاتیلنگلیکول، جاسمونات و متیل جاسمونات و همچنین پس از زخم به طور قطعی بیان کردهاند (Yakubov, 2005). در این پژوهش نیز بیان ژن دهیدرین پس از تنشهای سرمایی، افزایش پیدا کرد که با گزارش‌هایی که روی سایر گیاهان انجام شده‌اند، همخوانی دارد. با افزایش طول دوره سرما از 1 تا 14 روز افزایش بیشتری در بیان ژن دیده نشد، گرچه ممکن است با افزایش طول دوره سرما بیان اندکی افزایش پیدا کرده باشد، با وجود این، ممکن است افزایش آنقدر اندک باشد که در آزمایش نشان داده نشده است و ممکن است با افزایش بیشتر طول دوره تیمار که به تدریج باعث آب‌گیری بیشتری از سلولها می‌شود، افزایش معنیداری دیده شود.
بیان ژن دهیدرین در اثر تغییر طول روز
فرآیند عادت به سرما شامل دو مرحله مشخص است. در ابتدا، کاهش طول روز باعث توقف رشد و ایجاد خفتگی می‌شود و افزایش حدواسطی در تحمل به انجماد به دست میآید. سپس، در مرحله دوم با قرارگیری گیاه در معرض دماهای سرد و سپس دماهای انجماد بیشینه تحمل به انجماد در گیاهان به دست میآید و بخشهای ماندگار در زمستان قادر به بقا در دماهای انجماد می‌شوند (Puhakainen et al., 2004). فیتوکرومها، حسگرهای نوری مسؤول درک طول روز در گیاهان هستند. درک تغییرات نوری توسط این گیرندهها مسیرهای انتقال پیامی را در سلولها فعال میکند که سبب تغییر در بیان برخی ژنها شده، پاسخهای عملکردی و نموی به میزان نور داده می‌شود (Welling et al., 2002). گزارش‌هایی درباره افزایش بیان ژن دهیدرین در اثر کوتاه شدن طول روز به تنهایی وجود دارد Welling et al., 2002)؛ Marian et al., 2004؛ Puhakainen et al., 2004؛ Welling et al., 2004؛ (Wisniewski et al., 2006. طول روز کوتاه نیز باعث آب‌گیری متوسطی از سلولها به ویژه سلولهای جوانهها می‌شود که این آب‌گیری ممکن است نتیجه تجمع موادی مانند پروتئینها و کربوهیدراتها باشد (Welling et al., 2002). نتایج این محققان نشان داد که طول روز کوتاه و سرما، از دو مسیر مستقل افزایش بیان دهیدرین را القا میکنند. Puhakainen و همکاران (2004) اظهار داشتند که طول روز کوتاه به تنهایی تأثیر بسیار اندکی بر بیان ژن دهیدرین در برگهای غان نقرهای داشت، اما سلولها را برای درک بعدی سرما حساستر کرد و بیان ژن دهیدرین در گیاهانی که پیش از تیمار سرما، مدتی در شرایط طول روز کوتاه قرار گرفته بودند نسبت به گیاهانی که تنها تیمار سرما دیده بودند، بسیار بالاتر بود. این اثر همیارانه (synergistic effect) طول روز کوتاه و سرما، گیاه را به سختی بیشینه در زمستان میرساند.
در این پژوهش، اثر تیمار طول روز کوتاه روی برگ پسته بررسی شد، اما حتی 14 روز پس از تیمار نیز افزایشی در میزان بیان ژن دهیدرین دیده نشد. ممکن است طول دوره تیمار (بیشینه 14 روز) به اندازه کافی زیاد نبوده تا تغییری در میزان بیان ایجاد شود. همان‌طور که Welling و همکاران (2002) نشان دادند که بیان دهیدرین در صنوبر دورگه (Populus tremula × Populus tremuloides Michx) پس از 21 روز از تیمار روز کوتاه اندکی افزایش پیدا کرد، گرچه در تحقیق Puhakainen و همکاران (2004) حتی یک روز تیمار روز کوتاه، بیان ژن دهیدرین غان را اندکی افزایش داد. همچنین، ممکن است که افزایش بیان به حدی پایین بوده که در آزمایش نشان داده نشده است و ممکن است با افزایش طول دوره تیمار که به تدریج باعث آب‌گیری بیشتری از سلولها می‌شود، افزایش معنیداری دیده شود. همچنین، ممکن است که این ژن دهیدرین (PV-dhn) که تنها ژن دهیدرین شناخته شده در پسته است، تنها از طریق پاسخ به سرما موجب عادت به سرما می‌شود و پاسخگو به طول روز نیست. همان‌طور که Wisniewski و همکاران (2006) نشان دادند که یکی از ژنهای دهیدرین هلو (Pronus persica)، به نام Ppdhn1 در اثر سرما و خشکی، و ژن دهیدرین دیگر آن Ppdhn2 تنها با خشکی بیان می‌شوند و طول روز کوتاه روی بیان هیچ یک از آنها تأثیری ندارد. همچنین، Marian و همکاران (2004) نشان دادند که از سه ژن دهیدرین Rhododendron، تنها یکی از آنها پاسخگو به هر دو عامل سرما و طول روز است و دو ژن دیگر تنها توسط پاسخ به سرما باعث عادت به سرما می‌شوند و طول روز روی بیان آنها اثری ندارد.
تفاوت بیان ژن دهیدرین در اثر سرما بین گیاهان گلخانهای و گیاهان در شیشه
روشهای کشت در شیشه به روشهای سنتی پرورش گیاه برای تغییر و پیشرفت گیاهان کمک زیادی کردهاند. از دهه 1940 مشخص شد که کشت بافت باعث تولید رقمهایی از طریق عادتدهی و ایجاد تنوع سوماکلونال می‌شود و از اوایل دهه 1970 این روش برای تولید گیاه با ویژگیهای بهتر استفاده شد. این تنوع سوماکلونال در گیاهکهای باززایی شده دیده می‌شود و ممکن است از قبل در سلولها وجود داشته، یا از طریق کشت القا شده باشد. این تنوع ممکن است ژنتیک یا اپیژنتیک باشد. تغییرات در گیاهکهای باززایی شده توانایی زیادی برای کمک به کشاورزی و زراعت دارد، اما این توانایی هنوز در سطح وسیع استفاده نشده است. در کشت در شیشه ممکن است انواعی از سلولهای جهش یافته تولید شوند که تفاوتهای مفیدی مانند مقاومت به تنش، مقاومت به علفکش و مقاوت به آنتیبیوتیک نشان دهند. به هر حال، باززایی گیاهان با ویژگیهای مطلوب در موارد محدودی گزارش شده است (Thorpe, 2007). در این مطالعه، در دانهرُستها و شاخسارهای باززایی شده پسته، میزان بیان ژن در اثر تیمار سرما افزایش معنیداری نسبت به شاهد دارد. اما میزان بیان ژن در شاخسارهای باززایی شده هم در حالت طبیعی (شاهد) و هم پس از تیمار سرما کمتر از بیان ژن در دانهرُستها است، یعنی برگ شاخسارهای پسته باززایی شده در شیشه، در حالت طبیعی، تا حدودی کمتر از برگ گیاهان رشد کرده در زیوه، ژن دهیدرین را بیان میکردند که علت آن میتواند رطوبت بالای شرایط در شیشه و یا حتی حذف اثر شوری روی بیان این ژن باشد که این شرایط ایدهآل برای دانهرُستهای رشد کرده در خاک ممکن است فراهم نباشد. گرچه شاخسارهای در شیشه نیز مانند گیاهان گلخانهای، پس از تیمار سرما قادر به افزایش بیان ژن دهیدرین بودند اما پس از تیمار نیز میزان بیان ژن در شاخسارهای در شیشه نسبت به گیاهان گلخانهای که تیمار مشابهی دیده بودند، کمتر بود که علت آن میتواند پایین‌تر بودن بیان در حالت عادی در شاخسارهای در شیشه باشد، میتوان احتمال داد که با افزایش طول دوره یا پایین آوردن دمای تیمار سرما، میزان بیان ژن در شاخسارهای در شیشه به سطح دانهرُستها برسد.
مطالعات مروری در این تحقیق گزارشی درباره مقایسه بیان ژن دهیدرین بین گیاهان در شیشه و گیاهان رشد کرده در شرایط عادی نشان نداد. به هر حال، Palonen و همکاران (2000) نشان دادند که پس از تیمار سرما، شاخسارهای در شیشهی تمشک (Rubus idaeus L.) نسبت به گیاهان رشد کرده در زیوه، کمتر قادر به افزایش کربوهیدراتهای محلول (که در زمان عادت به سرما، در سلولها افزایش مییابد) در سلولها بودند و LT50 (دمایی که در آن مرگ گیاهان در اثر تنش، 50 درصد است) مشاهده شده در گیاهان در شیشه بالاتر از LT50 گیاهان رشد کرده در زیوه بود. همچنین، Guy و همکاران (1987) نشان دادند که گیاهان اسفناج (Spinacia oleracea L.) رشد کرده در شیشه مانند گیاهان رشد کرده در خاک، پس از قرارگیری در معرض تیمار سرما، قادر به عادت به سرما بودند و تحمل به انجماد خود را افزایش دادند، اما میزان تحمل به دست آمده در آنها تا حدودی کمتر از گیاهان رشد کرده در خاک بود.
)
