Authors
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Golestan, Gorgan, Iran
2 Department of Statistic, Faculty of Sciences, University of Golestan, Gorgan, Iran
Abstract
Keywords
توانایی افزایش تولید مولکولهای فعال شیمیایی از جمله گونههای فعال اکسیژن ویژگی کلی عوامل تنشزایی است که موجودات زنده هر روز در معرض آنها هستند. گونههای فعال اکسیژن در ایجاد و بدخیمی بیماریهایی نظیر سرطان، دیابت، نقرس، پیری و بیماریهای قلبی-عروقی مؤثرند (kris-Ethertonmet et al., 2002). سیستمهای آنتیاکسیدان بافتهای گیاهی شامل آنزیمهای پالاینده ROS مانند کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز، پراکسیدازها و آنزیمهای سمّزدای فرآوردههای حاصل از پراکسیداسیون لیپید مانند گلوتاتیون-S-ترانسفراز، فسفولیپید-هیدروپراکسیدگلوتاتیون پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و شبکهای از آنتیاکسیدانهای با جرم مولکولی کم مانند آسکوربات، گلوتاتیون، ترکیبات فنلی، توکوفرولها، کاروتنوئیدها و ... هستند. به علاوه، مجموعه کاملی از آنزیمها شامل مونو دهیدرو آسکوربات ردوکتاز، دهیدرو آسکوربات ردوکتاز و گلوتاتیون ردوکتاز برای تولید مجدد شکلهای فعال آنتیاکسیدانها نیاز هستند (Blokhina et al., 2003). گیاه عروسک پشت پرده با نام علمی Physalis alkekengi متعلق به خانواده سیبزمینی، دارای 80 گونه در دنیا و 2 گونه در ایران است. گیاهی علفی، یک ساله یا چند ساله به ارتفاع 30 تا 60 سانتیمتر، به صورت خودرو در استانهای مازندران، گیلان و گلستان میروید. از این گیاه برای درمان بیمارهایی نظیر سنگ کلیه و مجاری ادراری، نقرس و هپاتیت استفاده میشود (Amini, 2004). از آنجا که ترکیبات آنتیاکسیدانی گوناگون از طریق سازوکارهای مختلفی عمل میکنند، واضح است که تنها یک روش نمیتواند پیشبینی جامعی از تأثیر تمام شاخصهای درگیر در ویژگیهای آنتیاکسیدانی ارایه دهد (Pellegrini et al., 2000). از روشهای معروف اندازهگیری ویژگی آنتیاکسیدانی میتوان به روش به داماندازی رادیکال 1و1- دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل (DPPH، بر مبنای توانایی هیدروژندهی عصاره) (Miliauskas et al., 2004)، مطالعه مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید (BCB) و سنجش فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها بر اساس توانایی احیاکنندگی آهن دو ظرفیتی (FRAP) (Benzie and Strain, 1999) نام برد. این سه روش سنجش، در ویژگیهایی مانند نوع سوبسترا، شرایط واکنش، روشهای کمّی کردن دادهها و ... از یکدیگر متفاوتند (Conforti et al., 2007). بسته به روش سنجش به کار برده شده، عصارههای گیاهی در دورههای مختلف توانایی آنتیاکسیدانتی متفاوتی را نشان میدهند (Gardner et al., 2000). روش FRAP فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها را بر اساس توانایی احیاکنندگی آهن میسنجد و مطابق تحقیقات Deepa و همکاران (2007) در حقیقت، تخمین ویژگی آنتیاکسیدانی ترکیبات محلول در آب را نشان میدهد. Gardner و همکاران (2000) با اندازهگیری FRAP و مقدار آسکوربیک اسید در عصاره پرتغال نشان دادند که محتوای آسکوربیک اسید با ویژگیهای آنتیاکسیدانی عصاره با روش FRAP ارتباط مستقیم دارد. اندازهگیری ویژگی آنتیاکسیدانی از طریق مهار لینولئیک اسید (روش BCB)، توانایی بازدارندگی پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع مزدوج نظیر لینولئیک اسید و آراشیدونیک اسید را نشان میدهد. لیپیدهای غشایی غنی از اسیدهای چرب غیر اشباع بوده که بیشترین حساسیت را به اکسیداسیون دارند (Ordon et al., 2006). Menichini و همکاران (2008) نشان دادند که سنجش BCB در گیاه ارتباط خطی با ترکیبات کاروتنوئیدی آن دارد. فعالیت پالایشی رادیکالهای آزاد موجود در عصاره با استفاده از روش DPPH سنجش میشود که Velioglu و همکاران (1998) گزارش کردند که با ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در گیاه ارتباط خطی دارد. از آنجا که اثر آنتیاکسیدانی عصاره گیاه عروسک پشت پرده در طی مراحل مختلف رشد تاکنون گزارش نشده است، بدین منظور سه روش استاندارد برای این پژوهش انتخاب شد. بنابراین، هدف از این پژوهش تعیین فعالیت آنتیاکسیدانی و میزان برخی از ترکیبات آنتیآکسیدانهای غیر آنزیمی عصاره خام گیاه عروسک پشت پرده نظیر فنل کل، فلاونوئید کل، آنتوسیانین، کاروتنوئید کل و مقدار کوئرستین، لوتئولین در مراحل مختلف رشد است تا بتوان مرحلهای که بیشترین مقدار ترکیبات و ویژگی آنتیاکسیدانی را دارد انتخاب و برداشت کرد.
مواد و روشها
جمعآوری گیاه و عصارهگیری
بخشهای مختلف گیاه عروسک پشت پرده از جمله برگ، غلاف گل، میوه سبز و نارنجی در طی دوران رشد از حوالی تنکابن جمعآوری شد. نمونهها در سایه و در مجاورت هوا خشک و سپس آسیاب شد. مقدار یک گرم از هر نمونه در 50 میلیلیتر متانول 80 درصد خیسانده و به مدت 48 ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. پس از طی شدن زمان مورد نظر، عصارهها صاف شد. سپس حلال در دمای کمتر از 40 درجه سانتیگراد توسط دستگاه تبخیر در خلاء تبخیر شد. باقیمانده برای انجام آزمایشها در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (Pourmorad et al., 2006).
اندازهگیری محتوای فنل، فلاونوئید، آنتوسیانین و کاروتنوئید کل عصارههای گیاه عروسک پشت پرده
برای اندازهگیری محتوای فنل کل به 100 میکرولیتر از عصاره گیاه، 2 میلیلیتر کربنات سدیم (2 درصد)، 8/2 میلیلیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر معرف فولین سیوکالچو (Folin–Ciocalteu’s) (50 درصد) اضافه شد. پس از گذشت 30 دقیقه جذب آنها در طول موج 720 نانومتر نسبت به شاهد ثبت شد. گالیک اسید به عنوان استاندارد برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد. محتوای فنل کل عصارهها بر اساس میلیگرم معادل گالیک اسید بر گرم وزن خشک گیاه گزارش شد (Meda et al., 2005).
برای سنجش میزان فلاونوئید کل به 500 میکرولیتر از هر عصاره 5/1 میلیلیتر متانول (80 درصد)، 100 میکرولیتر محلول آلومینیوم کلرید (10 درصد)، 100 میکرولیتر محلول استات پتاسیم 1 مولار و 8/2 میلیلیتر آب مقطر اضافه شد. جذب مخلوط پس از گذشت 40 دقیقه در طول موج 415 نانومتر نسبت به بلانک اندازهگیری شد. بلانک حاوی تمام ترکیبات یاد شده در بالا بود، اما به جای عصاره، همان حجم متانول 80 درصد به آن اضافه شده بود. برای رسم منحنی استاندارد از کوئرستین استفاده شد. میزان فلاونوئید کل عصارهها بر اساس میلیگرم معادل کوئرستین بر گرم وزن خشک گیاه گزارش شد (Chang et al., 2002).
برای سنجش میزان آنتوسیانین کل مقدار 02/0 گرم از بافت خشک گیاهی با 4 میلیلیتر محلول کلریدریک اسید یک درصد متانول در یک هاون چینی ساییده شد. محلول حاصل به مدت 24 ساعت در یخچال نگهداری شد. سپس، محلول به مدت 10 دقیقه و در 13000 دور سانتریفیوژ شد. فاز رویی برداشته و جذب محلول ها در طول موج 530 و 657 نانومتر نسبت به شاهد اندازهگیری شد. از محلول کلریدریک اسید یک درصد متانول به عنوان شاهد استفاده شد. میزان آنتوسیانین برای هر عصاره با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد (Mita et al,. 1997).
(657A×25/0)-530A=A
A: جذب محلول (اعداد اندیس نشانگر طول موجهایی است که جذب در آنها اندازهگیری شده است).
برای سنجش میزان کاروتنوئید کل، مقدار 05/0 گرم از بافت تازه گیاهی با 5 میلیلیتر استون در هاون چینی سرد و در حمام یخ هموژن شد. سپس به هموژنای حاصل یک گرم سولفات سدیم بدون آب افزوده و با استفاده از کاغذ صافی، صاف شد. محلول صاف شده با استون به حجم 10 میلیلیتر رسانده شد و به مدت 10 دقیقه و در 2600 دور سانتریفیوژ شد. فاز رویی برداشته و جذب محلول در طول موجهای 662، 645 و 470 نانومتر نسبت به شاهد اندازهگیری شد. از استون به عنوان شاهد استفاده شد. میزان کاروتنوئید برای هر عصاره با استفاده از فرمولهای زیر محاسبه شد (Lichtenthaler, 1987).
Ca= 24/11 A662 - 04/2 A645
Cb= 13/20 A645 - 19/4 A662
Ct= 1000 A470 - 9/1 A Ca - 14/63 Cb / 214
Ca: میزان کلروفیل a، Cb: میزان کلروفیل b، :Ct میزان کاروتنوئید کل است.
اندازهگیری محتوای کوئرستین و لوتئولین عصارههای گیاهی
محتوای کوئرستین و لوتئولین عصارهها با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تعیین شد (Chen and Xiao, 2005).
تحلیل HPLC
از دستگاه HPLC مدل Merk Hitachi با آشکارساز UV/VIS و ستون C18 فاز معکوس Lichrospher 100، ابعاد mm 4 × 250، اندازه ذرات 5 میکرومتر، برای سنجش لوتئولین و کوئرستین استفاده شد. فاز متحرک شامل متانول استونیتریل، استیک اسید، فسفریک اسید، آب (138: 1: 1: 50: 70) و سرعت جریان برابر 6/0 میلیلیتر بر دقیقه و مدت زمان کروماتوگرافی 25 دقیقه بود. طیفها در طول موج 352 نانومتر ثبت شدند. مساحت سطح زیر هر یک از پیکها محاسبه و منحنی استاندارد لوتئولین و کوئرستین نیز رسم شد (شکل 1).
فعالیت به داماندازی رادیکال DPPH
غلظتهای مختلف عصاره با 2 میلیلیتر محلول متانولی 004/0 درصد DPPH مخلوط شد. محلول شاهد شامل 2 میلیلیتر DPPH و 2 میلیلیتر متانول است. محلولها به مدت 30 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق نگهداری شدند. جذب نمونهها در 517 نانومتر در مقابل شاهد متانول خوانده شد. درصد مهار رادیکال آزاد (%I) هر عصاره به کمک فرمول محاسبه شد:
A sample) / A control ×100 - %I = (A control .
بر اساس اطلاعات حاصل، IC50 عصاره (غلظتی از سوبسترا بر حسب میلیگرم است بر میلیلیتر که برای احیای رادیکال DPPH به میزان 50 درصد اولیه نیاز است)، از منحنی درصد مهار در مقابل غلظتهای مختلف عصاره به دست آمد. با محاسبه IC50 برای آسکوربیک اسید، به عنوان استاندارد و با استفاده از فرمول زیر، دادهها بر اساس فعالیت آنتیاکسیدانی معادل آسکوربیک اسید (AEAC) بیان شدند (Miliauskas et al., 2004).
AEAC (mg AA/g dw) = IC50 ascorbate /IC50 sample×1000.
|
شکل 1- کروماتوگرامهای حاصل از تزریق به HPLC. |
بررسی قدرت احیاکنندگی آهن (FRAP)
در این روش، ویژگی الکتروندهندگی آنتیاکسیدانها در اسیدیته پایین باعث احیا کاتیون فریک به فرو Fe+3) به (Fe+2 میشود. بنابراین، آنتیاکسیدانها قادرند کمپلکس بیرنگ فریک-تری پیریدیل-تریازین را به کمپلکس آبی رنگ فرو-تری پیریدیل-تریازین تبدیل نمایند که در طول موج 593 نانومتر جذب دارد. به منظور سنجش این ویژگی، مقدار 1/0 گرم از بافت فریز شده گیاهی با 5 میلیلیتر آب مقطر در هاون چینی سرد در حمام یخ همگن شد. همگنای حاصل با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف شد. سپس به 50 میکرولیتر از عصاره به دست آمده 5/1 میلیلیتر معرف FRAP (بافر استات سدیم 300 میلیمولار با اسیدیته 6/3، فریک-تری پرییدیل-اس- تریازین و فریک کلرید) اضافه شد. مخلوط حاصل ورتکس و به مدت 4 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد انکوبه شد. جذب محلولها در 593 نانومتر نسبت به شاهد (شامل 50 میکرولیتر آب مقطر به همراه 5/1 میلیلیتر معرفFRAP)، خوانده شد. از آمونیوم فرو سولفات به عنوان شاهد برای مقایسه استفاده شد (Then et al., 2003).
سنجش ویژگی مهار پراکسیداسیون لیپید (BCB)
فعالیت آنتیاکسیدانی عصارههای عروسک پشت پرده برای جلوگیری از اکسیداسیون لینولئیک اسید با روش بتاکاروتن-لینولئیک اسید بررسی شد (Kumazawa et al., 2002). به مقدار 100 میکرولیتر از عصاره گیاهی رقیق شده با متانول، 3 میلیلیتر معرف بتاکاروتن-لینولئیک اسید اضافه و جذب نخستین این محلول در زمان صفر در طول موج 470 نانومتر اندازهگیری شد. محلول به مدت 60 دقیقه در بن ماری 50 درجه سانتیگراد انکوبه شد. پس از گذشت زمان مورد نظر، جذب نمونهها در همان طول موج پیشین ثبت شد. نمونه بلانک به جای عصاره گیاهی حاوی متانول بود. سرعت تجزیه بتاکاروتن (DR) و درصد فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها (%AOX) با استفاده از فرمولهای زیر محاسبه شد:
DR = Ln (Ainitial / At) / 60 ..
.% AOX = [ ( DR Control – DR Sample) / DR Control ] × 100 .
در روابط بالا Ainitial وAt به ترتیب، جذب نمونهها در زمان شروع و پس از گذشت زمان 60 دقیقه است.
تحلیل آماری
همه اندازهگیریها در 3 تکرار و همه اطلاعات به شکل میانگین ± انحراف استاندارد گزارش شد. از آنالیز واریانس یک سویه (ANOVA) برای مقایسه میانگینها استفاده شد و در صورت معنیداری آزمون دانکن برای مقایسات زوجی استفاده شد. همچنین، از نرمافزار SPSS نسخه 0/14 برای محاسبه ضریب همبستگی بین مشخصهها استفاده شد. نتایج با احتمال 05/0P< معنیدار در نظر گرفته شد. مقادیر IC50 از برازش رگرسیون خطی بین درصد مهار و غلظتهای مربوطه به دست آمد.
نتایج
تحلیل مقایسهای مراحل مختلف نمونهبرداری بر محتوای فنل کل گیاه عروسک پشت پرده نشان داد که تأثیر دورههای مختلف رشد بر میزان فنل کل در بخشهای مختلف گیاه معنیدار بود (شکل 2-الف و جدول 1). مقایسه میانگین دادههای فنل کل عصاره گیاه در مراحل مختلف رشد نشان داد که میزان فنل کل در برگ بیشتر از میوه و غلاف گل بود. به طوری که بیشترین میزان فنل کل در برگ مرحله بلوغ میوه 48/2±78/31 اکیوالان میلیگرم گالیگ اسید در گرم پودر گیاه به دست آمد که نسبت به میوه نارنجی 257 درصد و نسبت به غلاف نارنجی 71 درصد افزایش نشان داد. نتایج حاصل از سنجش محتوای فلاونوئید عصارههای گیاه عروسک پشت پرده در مراحل مختلف نمونهبرداری بر اساس روش کلریمتری آلومینیوم کلرید (شکل 2-ب و جدول 1) نشان داد که در برگ مرحله رویشی گیاه میزان فلاونوئید تقریباً اندک بود و همزمان با رشد گیاه، در برگ مرحله گلدهی میزان ترکیبات فلاونوئیدی تا حدود بیش از دو برابر برگ مرحله رویشی و به بیشترین مقدار خود افزایش یافت. مقدار فلاونوئید کل در اندامهای زایشی، میوه و غلاف گل، کمترین مقدار را به خود اختصاص داد. همچنین، نتایج نشان داد که میزان لوتئولین به عنوان یک ترکیب فلاونوئیدی در برگ مرحله رویشی اندک بوده، همگام با رشد گیاه بیشترین مقدار آن در برگ مرحله میوه سبز مشاهده شد (شکل 2-پ). در حالی که کوئرستین به عنوان نوع دیگری از ترکیبات فلانوئیدی فقط در برگ مراحل رویشی و گلدهی مشاهده شد و مقدار آن به ترتیب 05/0 ± 2/9 و 53/0± 9 میکروگرم بر گرم بافت خشک گیاه به دست آمد. نتایج حاصل از سنجش محتوای آنتوسیانین کل گیاه عروسک پشت پرده در مراحل مختلف نمونهبرداری نشان میدهد که تأثیر زمانهای مختلف نمونهبرداری بر میزان این ترکیبات معنیدار است (جدول 1 و شکل 2-ت). بیشترین مقدار آنتوسیانین به برگ مرحله رویشی (mg/gDW 39/0 ± 81/33) مربوط است. این میزان در برگ در طی مراحل زایشی کاهش اندکی یافته، در میوه سبز و غلاف سبز به کمینه مقدار خود، به ترتیب 21/0 ± 3/1 و 47/0 ±36/6 میلیگرم بر گرم وزن خشک بافت، رسید. نتایج آنالیز واریانس (جدول 1)، نشان میدهد که بخشهای مختلف نمونهبرداری شده طی مراحل فنولوژیک تأثیر معنیداری بر میزان کاروتنوئید کل داشت. مقایسه میانگینها (شکل 2-ث) نشان داد که میزان کاروتنوئید در برگ مراحل رویشی و زایشی اندک بوده، در حالی که در میوههای سبز و نارنجی به صورت معنیداری بیشتر بود و بیشترین میزان کاروتنوئید در میوه نارنجی مشاهده شد.
|
|
|||||
|
|
||||
|
شکل 2- مقایسه تأثیر مراحل مختلف نمونهبرداری بر میزان برخی ترکیبات آنتیاکسیدانی گیاه عروسک پشت پرده. الف) محتوای فنل کل؛ ب) محتوای فلاونوئید کل؛ پ) محتوای لوتئولین؛ ت) محتوای آنتوسیانین کل؛ ث) محتوای کاروتنوئید کل. مقادیر میانگین دادهها±انحراف استاندارد است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است. |
|
جدول 1- تجزیه واریانس محتوای برخی آنتیاکسیدانهای غیر آنزیمی گیاه عروسک پشت پرده در مراحل مختلف نمونهبرداری. ** در سطح کمتر از 1 درصد معنیدار است. اعداد جدول مربوط به هر آنتیاکسیدان بیانگر میانگین مربعات است. DW: وزن خشک گیاه؛ FW: وزن تر گیاه
|
منبع تغییر |
درجه آزادی |
محتوای mg/gDW |
محتوای mg/gDW |
محتوای mg/gDW |
محتوای μg/gDW |
محتوای mg/gDW |
محتوای mg/gFW |
|
مراحل نمونهبرداری |
7 |
** 10/133 |
** 51/29 |
** 0062/0 |
**00037/0 |
** 94/441 |
**52/24 |
|
خطا |
16 |
13/3 |
757/0 |
000021 /0 |
0000001/0 |
52/3 |
662/0 |
فعالیت به داماندازی رادیکال DPPH
با توجه به روش سنجش، عصارههای گیاهی در دورههای مختلف رشد توانایی آنتیاکسیدانی متفاوتی را نشان دادند. مطابق جدول تجزیه آنالیز واریانس (جدول 2)، تأثیر مراحل مختلف نمونهبرداری بر میزان فعالیت آنتیاکسیدانی به روش DPPH معنیدار بود. در این روش، فعالیت آنتیاکسیدانی در برگ مراحل رویشی، زایشی و غلاف گل کم بود، در حالی که در میوه سبز افزایش نشان داد. با این حال، در میوه بالغ (میوه نارنجی) به طور معنیداری به بیشینه مقدار خود رسید (شکل 3-الف).
سنجش قدرت احیا کنندگی آهن
نتایج حاصل از سنجش FRAP نشان داد که میزان فعالیت آنتیاکسیدانی در برگها در طی رشد گیاه از مرحله رویشی به مرحله زایشی افزایش معنیداری داشت. همچنین، در میوه و جام گل نیز با بلوغ این بافتها افزایش معنیداری مشاهده شد. با این روش، بیشترین فعالیت آنتیاکسیدانی در برگ مرحله میوهدهی 034/0±225/0 میلیمول یون فرو بر گرم بافت خشک به دست آمد (شکل 3-ب و جدول 2).
فعالیت مهار پراکسیداسیون لیپید (BCB)
تحلیل مقایسهای نشان داد که تأثیر مراحل مختلف نمونهبرداری بر میزان مهار اکسیداسیون لیپید معنیدار است (جدول 2). نتایج نشان داد که بیشترین میزان درصد مهار پراکسیداسیون لیپید در میوه نارنجی است که از نظر عددی از سایر مراحل فنولوژیک بیشتر است. با وجود این، این میزان تفاوت معنیداری با برگ مراحل رویشی، گلدهی و میوه سبز نداشت (شکل 3-پ).
بررسی همبستگی بین شاخصهای اندازهگیری شده در مراحل مختلف نمونهبرداری گیاه عروسک پشت پرده
بررسی همبستگی بین مقادیر سنجش فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها با دیگر عوامل اندازهگیری شده نشان میدهد که سنجش فعالیت آنتیاکسیدانی روش DPPH، با محتوای کاروتنوئید همبستگی مثبت معنیداری در سطح 1 درصد و با محتوای فنل، فلاونوئید کل، لوتئولین و آنتوسیانین کل همبستگی منفی معنیداری (در سطح 1 درصد) دارد. همچنین، سنجش فعالیت آنتیاکسیدانی به روش FRAP با میزان فنل، فلاونوئید کل، لوتئولین و آنتوسیانین همبستگی مثبت معنیداری دارد. بررسی همبستگی سنجش فعالیت آنتیاکسیدانی به روش BCB نیز حاکی از همبستگی مثبت معنیدار با محتوای کاروتنوئید است (جدول 3).
جدول 2- تجزیه واریانس میزان فعالیت آنتیاکسیدانی گیاه عروسک پشت پرده در مراحل مختلف نمونهبرداری. ** در سطح کمتر از 1 درصد معنیدار است.
|
منبع تغییر |
درجه آزادی |
فعالیت آنتیاکسیدانی |
فعالیت آنتیاکسیدانی |
فعالیت آنتیاکسیدانی |
|
مراحل نمونهبرداری |
7 |
** 98/1127285 |
** 014/0 |
** 25/725 |
|
خطا |
16 |
96/9699 |
0001/0 |
20/107 |
|
|
||||
|
شکل 3- مقایسه تأثیر مراحل مختلف نمونهبرداری بر میزان فعالیت آنتیاکسیدانی گیاه عروسک پشت پرده. الف) روش DPPH؛ |
|
بحث
سیستم دفاع آنتیاکسیدانی در تمام مراحل رشد گیاهان فعال است. عمل این آنتیاکسیدانها متفاوت است و به طور گسترده با چندین عامل مانند مراحل بلوغ، شرایط آب و هوایی، بخشهای مورد استفاده از گیاه، شرایط برداشت و ذخیرهسازی تغییر میکند (Mejia et al., 1988). در طی بلوغ گیاهان، تغییرات فیتوشیمیایی بر فعالیت آنتیاکسیدانی آنها مؤثر است و کیفیت غذایی انواع مختلف میوه و سبزیجات را در زمانهای خاص تحت تأثیر قرار میدهد (Conforti et al., 2007). در این مطالعه، گیاه عروسک پشت پرده در مراحل مختلف رشد از رویشگاه طبیعی خود جمعآوری و مطالعه شد. وجود اختلاف معنیدار در ویژگیهای آنتیاکسیدانی، میزان ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی، آنتوسیانین، محتوای کاروتنوئید کل و سایر عوامل (جدولهای 1 و 2)، در بخشهای مختلف گیاه در طی مراحل رویشی نشان داد که توانایی آنتیاکسیدانها به طور شایان توجهی در طی مراحل رویشی متغیر است. بدین ترتیب با توجه به درصد ترکیبات گوناگون و ویژگیهای آنتیاکسیدانی آنها در برابر اکسیدانهای مختلف، برداشت گیاه به منظور مقابله با اکسیدانی ویژه میتواند در مرحله نموی مناسب انجام شود.
از آنجا که ترکیبات آنتیاکسیدانی متفاوت در شرایط در شیشه (in vitro) از طریق سازوکارهای مختلفی عمل میکنند، واضح است که تنها یک روش نمیتواند پیشبینی جامعی از تأثیر همه شاخصهای درگیر در ویژگی آنتیاکسیدانی ارایه دهد (Aruoma, 2003). بنابراین، در این تحقیق از سه روش سنجش FRAP، DPPH و BCB برای ارزیابی فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها استفاده شد. این سه روش سنجش در ویژگیهایی مانند سوبسترا، شرایط واکنش، روشهای کمّی کردن دادهها و ... با یکدیگر متفاوتند (Conforti et al., 2007). بسته به روشهای استفاده شده، عصارههای گیاهی در دورههای مختلف توانایی آنتیاکسیدانی متفاوتی را نمایش دادند (شکل 3-الف تا پ). نتایج فعالیت جمعآوری رادیکالهای آزاد در عصاره گیاه عروسک پشت پرده با استفاده از روش DPPH، وجود همبستگی مثبت معنیداری با محتوای کاروتنوئید کل و همبستگی منفی معنیداری را با محتوای ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی را نشان میدهد (جدول 3). بدین معنا که نقش ترکیبات پلی فنلی در فعالیت آنتیاکسیدانی به روش DPPH اساسی نیست، در حالی که طبق گزارشهای موجود (Velioglu et al., 1998; Sun et al., 2002) توانایی آنتیاکسیدانی با روش FRAP میتواند به این ترکیبات مرتبط شود.
|
جدول 3- همبستگی بین شاخصهای مختلف اندازهگیری شده در مراحل مختلف نمونهبرداری گیاه عروسک پشت پرده. * و ** به ترتیب در سطوح 5 و 1 درصد معنیدار است و ns معنیدار نیست. |
||||||||
|
|
محتوای |
محتوای |
محتوای |
محتوای |
محتوای |
فعالیت |
فعالیت |
فعالیت |
|
فعالیت |
ns 245/0 |
ns 245/0 |
ns 081/0- |
ns 037/0- |
** 650/0 |
** 536/0 |
ns 136/0 |
1 |
|
فعالیت |
** 749/0 |
** 728/0 |
** 845/0 |
** 695/0 |
ns 291/0- |
ns 376/0 |
1 |
|
|
فعالیت |
ns 198/0- |
ns 345/0- |
** 624/0- |
* 505/0- |
** 912/0 |
1 |
|
|
|
محتوای
|
ns 136/0- |
ns 205/0 |
** 568/0- |
ns 392/0 |
1 |
|
|
|
|
محتوای |
** 622/0 |
** 679/0 |
** 786/0 |
1 |
|
|
|
|
|
محتوای |
** 544/0 |
** 789/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
محتوای |
ns 351/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
محتوای |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
اندازهگیری ویژگی آنتیاکسیدانی از طریق مهار لینولئیک اسید (روش BCB) نشان داد که عصارههای گیاهی عروسک پشت پرده در مراحل مختلف رشد دارای توانایی بازدارندگی پراکسیداسیون لیپید هستند (شکل 3-پ)، که قدرت بازدارندگی آنها ارتباط مثبت معنیداری با محتوای کاروتنوئید کل دارد (جدول 3). تحقیقات زیادی بر نقش کاروتنوئیدها به عنوان آنتیاکسیدان لیپیدی متمرکز شده است که میتوانند در برابر فرآیندهای مخرب ایجاد شده توسط اکسیژن منفرد و رادیکال آزاد دخالت کنند (Menichini et al., 2008). بنابراین، احتمالاً سطح بالای کاروتنوئیدها در مرحله رسیدگی میوه میتواند مسؤول افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی (روش BCB) در این مرحله باشد (Bergquist et al., 2007).
روش FRAP که فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها را بر اساس توانایی احیاکنندگی آهن میسنجد در حقیقت تخمین خاصیت آنتیاکسیدانی ترکیبات قابل حل در آب را نشان میدهد (Deepa et al., 2007). گزارشها نشان داد که در گیاهانی مانند شاهتوت، تمشک و توتفرنگی بین محتوای فنل کل و فعالیت آنتیاکسیدانی برگ و میوههای سنجش شده به روشFRAP، ارتباطی خطی وجود دارد (Kim et al., 2004). بنابراین، با توجه به ارتباط مثبت بین سنجش FRAP و محتوای فنل، آنتوسیانین، فلاونوئیدهای مانند لوتئولین و کوئرستین در این گیاه (جدول 3)، به عنوان ترکیبات آنتیاکسیدان محلول در آب، احتمالاً سطح بالای این ترکیبات در برگ مرحله رسیدگی میوه میتواند علت اصلی برای قدرت احیایی بالا در این مرحله باشد. اکثر پلی فنلها در بین ترکیبات فیتوشیمیایی آنتیاکسیدان به علت ویژگی احیایی و عمل به دام انداختن رادیکال آزاد بسیار مهم هستند. آنها همچنین، از طریق تعامل با سیستمهای آنزیمی مختلف توانایی کلات کنندگی فلزات را دارند. علاوه بر آن، این ترکیبات که در طی رشد و نمو متغیر است به علت شرکت داشتن در بو، رنگ و مزه در گیاهان نیز اهمیّت دارند (Deepa et al., 2007) به نظر میرسد تأثیر دوره رشد و بلوغ بر محتوای فنل و فلاونوئیدها در بین میوهها و سبزیجات متفاوت باشد، چنانچه سطح ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در فلفل (Marin et al., 2004)، انگور (Castrejón et al., 2008) و کلم (Kim et al., 2004) در پاسخ به بلوغ کاهش مییابد و در توتفرنگی، شاهتوت و تمشک همراه با بلوغ سطح این ترکیبات افزایش مییابد (Kim et al., 2004). نتایج مطالعه اخیر مشخص میکند که تجمع ترکیبات فلاونوئیدی در برگ، در مرحله رشد رویشی گیاه آغاز شده و پس از گلدهی مقدار آن کاهش مییابد (شکل 2-ب). بدین ترتیب، بیشترین میزان این ترکیبات در گیاه عروسک پشت پرده به برگ دوران گلدهی و زایشی مربوط است. نقش دفاعی برخی از فلاونوئیدها در گیاهان اثبات شده است (Witzell et al., 2003). برای مثال، کوئرستین در گیاه سیاهگیله (Vaccinium myrtills) چنین نقشی دارد (Vedenskaya and Vorsa, 2004). در گیاه عطرسنگ (Varthemia Persica) برخی از ترکیبات فلاونوئیدی نظیر میرستین و آپی ژنین فقط در مرحله گلدهی وجود دارند (سیاهپوش و همکاران، 1387). اختصاصی بودن بعضی از فلاونوئیدها به بافتهای ویژه در گیاه عناب نیز گزارش شده است (Pellotto et al., 1993).
کاروتنوئیدها رنگدانههایی هستند که نقش مهمی در حفاظت گیاهان در برابر فرآیندهای اکسیداتیو دارند که میتوانند به عنوان عاملی آنتیاکسیدان با اکسیژن منفرد و رادیکال پراکسید واکنش دهند (Stahl and Sies, 2003). در این پژوهش، تغییرات محتوای کاروتنوئید کل در طی مراحل رشد گیاه معنیدار بود، به طوری که میوه بالغ دارای بیشترین میزان کاروتنوئید بود (جدول 1). افزایش محتوای کاروتنوئید کل در مرحله رسیدگی میوه (شکل 1-ث) گیاه عروسک پشتپرده ارتباط مثبت با فعالیت آنتیاکسیدانتی به روشهای BCB و FRAP دارد (جدول 3). گزارشها نشان داده است که محتوای کاروتنوئید کل در گیاهان رازیانه و شنبلیله با بلوغ میوه افزایش مییابد (Singh et al., 2010). سطح کلروفیل و کاروتنوئید در برگهای ذرت وابسته به سن است (Drazkiewicz and Barzyorski, 2005).
جمعبندی
نتایج این مطالعه نشان میدهد که عصاره متانولی بخشهای مختلف گیاه عروسک پشت پرده در طی مراحل رشد حاوی غلظتهای مختلفی از ترکیبات مختلف آنتیاکسیدان است. به طوری که بیشترین میزان فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین در برگهای آن در مراحل مختلف رشد وجود دارد، در حالی که بیشترین میزان کاروتنوئید در میوههای سبز و نارنجی وجود دارند. همچنین، ویژگی جمعکنندگی رادیکال آزاد در برگها بیشتر از سایر اندامهاست، در صورتی که ویژگی مهاری اکسیداسیون ترکیبات حاوی پیوندهای مزدوج نظیر اسیدهای چرب و الکتروندهندگی به رادیکال ترکیبات آروماتیک در میوهها بیشتر است.
سپاسگزاری
از معاونت پژوهشی دانشگاه گلستان و ریاست محترم دانشکده علوم برای فراهم آوردن اعتبار پژوهشی قدردانی میشود
)
