Authors
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Shahid Bahonar University, Kerman, Iran
2 Department of Nutrition and Irrigation, Institute Pistachio Research, Iran
3 Department of Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University, Kerman, Iran
Abstract
Keywords
فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها، تانن‌ها، هیدروکسی سینامیک استرها و لیگنین‌ها از ترکیبات فنلی و جزو متابولیت‌های ثانویه حاصل از مسیر فنیل پروپانوئید هستند که در بافت‌های گیاهی به وفور یافت می‌شوند. آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) آغازگر مسیر فنیل پروپانوئید است که L-فنیل آلانین را با دآمیناسیون به ترانس سینامیک اسید تبدیل می‌کند. این، مسیر اصلی بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه در سلول است. این آنزیم کلیدی در تشکیل ترکیبات فنلی (یکی از مکانیسم‌های دفاعی غیر آنزیمی درگیاهان) نقش اساسی داشته، به عنوان یکی از شاخص‌های حساس به تغییرات محیطی و همچنین، یکی از نشانگرهای بیوشیمیایی دفاعی گیاه در برابر تنش‌های محیطی مطرح می‌شود (Boudet, 2007; Vogt, 2010). ترکیبات فنلی در شرایط مطلوب محیطی نیز در سلول‌های گیاهی سنتز می‌شوند، با وجود این، تنش‌های محیطی مختلف مقدار آنها را در سلول تغییر می‌دهند (Kliebenstein, 2004). این ترکیبات از شواهد فیزیولوژیک ارزشمند در تعیین اختلاف واریته‌های مختلف به شمار می‌روند و استفاده از روش‌های بیوشیمیایی در تشخیص تفاوت ژنتیکی رقم‌ها، نقش کلیدی این ترکیبات را در اثر متقابل گیاه و محیط نشان می‌دهد .(Tattini et al.,2006) فلاونوئیدها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی موجود در گیاهان هستند که در تنش‌های محیطی با افزایش فعالیت آنزیم PAL تولید آنها افزایش می‌یابد (Myung-Min et al., 2009). این ترکیبات با اسکلت ساختمانی اصلی C6-C3-C6 و ایجاد متیلاسیون، گلیگوزیلاسیون و آسیلاسیون گروه‌های متنوع زیادی از جمله چالکون‌ها، فلاوون‌ها، فلاونول‌ها، آنتوسیانین‌ها و ... تولید می‌کنند. تشکیل حلقه A و C در ساختمان فلاونوئیدها توسط آنزیم کلیدی چالکون‌سنتاز (CHS) و چالکون ایزومراز (CHI) انجام می‌شود. همچنین، آنزیم دی هیدرو فلاونول-ردوکتاز (DFR) واکنش تشکیل آنتوسیانین‌ها را از فلاونول‌ها ایجاد می‌کند (Vogt, 2010). مطالعات انجام شده نقش اکوفیزیولوژی این ترکیبات را در حفاظت از گیاهان در برابر تنش‌های محیطی نشان می‌دهد (Nicolva and Ivancheva, 2005). ترکیبات فنلی دارای ویژگی آنتی‌اکسیدانی هستند که با جمع‌آوری و احیای گونه‌های فعال اکسیژن از اکسیداسیون متابولیت‌های حیاتی سلول پیشگیری کرده، مانع بروز تنش اکسیداتیو در سلول‌های گیاه می‌شوند (Rice-Evans et al., 1997; Myung-Min et al., 2009).
پسته، گیاهی است که در شرایط آب و هوای گرم و خشک و نیمه کویری ایران به خوبی رشد می‌کند و در مقابل خشکی هوا و کم‌آبی مقاوم است. در ایران ارقام متفاوت پسته وجود دارد که از مهم‌ترین آنها می‌توان به اکبری، کله‌قوچی، احمد آقایی، اوحدی و شاه‌پسند اشاره نمود (شیبانی، 1373). در مناطق پسته‌کاری ایران از سه گونه پسته اهلی، بنه و خنجک به عنوان پایه استفاده می‌شود. این که آیا پایه‌های مختلف در رشد، وضعیت جذب عناصر، مقاومت به شوری و تولید میوه پیوندک را تحت تأثیر قرار می‌دهد یا نه، مسأله انتخاب پایه را به یکی از مهم‌ترین مسائل برای احداث باغ پسته تبدیل نموده است (شیبانی، 1373؛ فرگوسن، 1378). بررسی‌های انجام گرفته در گیاه پسته نشان داده است که پایه‌های مختلف در رشد، وضعیت جذب عناصر، عملکرد، مقاومت به شوری، سرما، تولید میوه پیوندک تأثیر دارند (Kaksa et al., 2002). همچنین، مطالعات پیشین نشان داده‌اند که در پوست میوه پسته ترکیبات فنلی وجود دارد (Goli et al., 2005). ویژگی‌های پایه‌های مختلف می‌تواند در بازده پایه برای ساخت بیشتر هورمون‌های تنشی، پروتئین‌ها و برخی ترکیبات خاص (ترکیبات فنلی) برای مقاومت به تنش‌های محیطی، مؤثر باشد (Satisha et al., 2007). بنابراین، با توجه به اهمیّت پایه در تولید محصول و مقاومت نسبی گیاه پسته در برابر تنش‌های محیطی و همچنین، اهمیّت فعالیت آنزیم PAL و ترکیبات فنلی در ایجاد مقاومت گیاهان به تنش‌ها، هدف این پژوهش، بررسی میزان فعالیت آنزیم PAL و تولید ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی و آنتوسیانینی به عنوان ترکیبات مهم آنتی‌اکسیدانی در سه رقم تجاری (اوحدی، کله‌قوچی و احمد آقایی) روی دو پایه (اهلی و موتیکا) و مقایسه پایه‌ها در تولید ترکیبات مورد نظر در گل، برگ و پوست میوه رقم‌ها و معرفی بهترین پایه و رقم از نظر تولید این ترکیبات در ایجاد مقاومت به تنش‌های محیطی است. به علاوه، با توجه به اهمیّت تجاری و اقتصادی مغز پسته و تأثیر پایه در کیفیت مغز و نقش ترکیبات فنلی (ترکیبات فعال زیستی) مغز پسته در تغذیه انسان، بررسی این ترکیبات در مغز ارقام و پایه‌های مختلف پسته ضروری به نظر می‌رسد.
مواد و روش‌ها
برای انجام پژوهش، از قطعه باغ پسته‌ای در ایستگاه شماره 2 مؤسسه تحقیقات پسته کشور واقع در رفسنجان استفاده شد. در این قطعه ارقام تجـاری شـامل احمـد آقایــی (P.vera cv. Ahmadaghai)، اوحـدی (P.vera cv. Ohadi) و کله‌قوچـی (P. vera cv. Kallehghuchi) پسته روی د پایـه مختلف شامل پایـه اهلـی (P. vera cv. Badami riz) و بنه (P. atlantica sub sp. mutica) پیوند شده است. سن درختان در زمان نمونه‌برداری حدود 15 سال بود. فاصله درختان روی ردیف 4 متر و فاصله بین ردیف درختان 7 متر بود. نمونه‌برداری از گل (در فروردین‌ماه)، برگ (در تیر ماه)، پوست میوه در سه مرحله پوست سبز (تیر ماه)، پوست سبز-قرمز (مرداد ماه)، پوست قرمز (اوایل شهریور ماه) و مغز میوه (اواخر شهریور ماه( و در زمان برداشت محصول) انجام شد. نمونه‌های گیاهی به قطعات ریز خُرد و پس از منجمد کردن در نیتروژن مایع در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند تا در مراحل بعدی استفاده شوند.
سنجش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)(EC 4. 3. 1. 5) .
سنجش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز با استفاده از سینامیک اسید تولید شده با روش Wang و همکاران (2006) و بر اساس غلظت و میزان سینامیک اسید تولید شده انجام شد. بدین منظور 300 میلی‌گرم از بافت تر نمونه‌ها با 5/6 میلی‌لیتر بافر تریس– HCl (اسیدیته 8/8، 50 میلی‌مولار) حاوی بتا مرکاپتواتانول (15 میلی‌مولار) در هاون سرد شده ساییده شد. عصاره به دست آمده با دور g50000 به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ (Eppendorf 5804R Germany) شد. محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیم استفاده شد. در این روش، از فنیل آلانین به عنوان سوبسترای آنزیمی استفاده و فعالیت آنزیم PAL بر اساس سرعت تشکیل سینامیک اسید تعیین شد. در لوله آزمایش یک میلی‌لیتری از بافر استخراج به همراه 5/0 میلی‌لیتر L-فنیل آلانین (10 میلی‌مولار)، 4/0 میلی‌لیتر آب دو بار تقطیر و یک میلی‌لیتر عصاره آنزیمی مخلوط و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. واکنش با اضافه کردن 5/0 میلی‌لیتر کلریدریک اسید (6 مولار) پایان یافت. محصول به وجودآمده با 15 میلی‌لیتر اتیل استات استخراج و سپس اتیل استات بخار شد. ماده جامد باقیمانده در 3 میلی‌لیتر هیدروکسید سدیم (05/0 مولار) حل شد و غلظت سینامیک اسید با اندازه‌گیری میزان جذب در طول موج 290 نانومتر و با استفاده از فرمول A=εbc به دست آمد و ضریب خاموشی معادل M-1cm-1 9500 در نظر گرفته شد. یک واحد از فعالیت PAL معادل یک میکرومول از سینامیک اسید تولید شده در یک دقیقه است.
سنجش مقدار پروتئین
برای سنجش مقدار پروتئین، ابتدا پروتئین‌ها از نمونه‌های گیاهی در دمای صفر تا 4 درجه سانتیگراد استخراج شدند. به این منظور یک گرم بافت تر در یک هاون چینی محتوای 3 میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 2/7 ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال‌دار در g14000 و دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت. از محلول رویی برای سنجش پروتئین استفاده شد. سنجش مقدار پروتئین با روش Bradford (1976) انجام شد. به این منظور، به لوله‌ها‌ی آزمایش مقدار 1/0 میلی‌لیتر عصاره پروتئینی و 5 میلی‌لیتر معرف بیوره افزوده، سریعاً مخلوط شد. پس از 2 دقیقه و پیش از یک ساعت جذب آنها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵9۵ نانومتر خوانده شد و غلظت پروتئین با استفاده از منحنی استاندارد آلبومن گاوی محاسبه و بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.
سنجش ترکیبات فنلی کل
سنجش محتوای ترکیبات فنلی کل با روش Velioglu و همکاران (1998) انجام شد. 1/0 گرم از نمونه‌ها با 5 میلی‌لیتر متانول 80 درصد حاوی کلریدریک اسید یک درصد ساییده، به مدت 2 ساعت در دمای اتاق روی شیکر عصاره‌گیری کامل شد. سپس، مخلوط حاصل در g3000 سانتریفیوژ و از محلول رویی برای تعیین ترکیبات فنلی کل استفاده شد. به 100 میکرولیتر از محلول رویی750 میکرولیتر معرف فولین افزوده، مخلوط حاصل به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. سپس 750 میکرولیتر کربنات سدیم 6 درصد به آن اضافه شد. پس از 90 دقیقه، جذب هر نمونه در طول موج 725 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه غلظت ترکیبات فنلی کل با استفاده از گالیک اسید منحنی استاندارد رسم شد و غلظت ترکیبات فنلی بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر گزارش شد.
سنجش فلاونوئیدهای کل
سنجش فلاونوئیدهای کل با روش آلومینیوم کلرید کالریمتری Zhishen و همکاران (1999) انجام شد. 1/0 گرم از نمونه‌های گیاهی در10 میلی‌لیتر متانول 80 درصد به خوبی ساییده، عصاره حاصل در دور g2000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای آزمایش‌های بعدی استفاده شد. 500 میکرولیتر از عصاره با آب مقطر به حجم 5 میلی‌لیتر رسانیده شد.300 میکرولیتر سدیم نیتریت 5 درصد پس از 5 دقیقه، 600 میکرولیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد به محلول اضافه شد. پس از 6 دقیقه 2 میلی‌لیتر هیدروکسید سدیم یک مولار به همراه 2 میلی‌لیتر آب مقطر به محلول اضافه شد. شدت جذب محلول در طول موج 510 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه غلظت فلاونوئیدهای کل با استفاده از روتین منحنی استاندارد رسم شد و غلظت فلاونوئیدها بر حسب میلی‌گرم روتین (کوئرستین 3-روتینوزید) در 100 گرم وزن تر ارایه شد.
سنجش آنتوسیانین
از روش Wagner (1979)برای اندازه‌گیری مقدار آنتوسیانینی نمونه‌ها استفاده شد. 1/0 گرم از نمونه گیاهی را در هاون چینی با 10 میلی‌لیتر متانول اسیدی (متانول خالص و کلریدریک اسید خالص به نسبت حجمی 1:99) کاملاً ساییده و عصاره در لوله‌ها‌ی آزمایش سرپیچ‌دار ریخته شد و به مدت 2۴ ساعت در تاریکی و دمای 2۵ درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس، به مدت 10 دقیقه در g۴000 سانتریفیوژ و جذب محلول بالایی در طول موج ۵۵0 نانومتر اندازه‌گیری شد. محاسبه غلظت با استفاده از فرمول A=εbc و ضریب خاموشی M-1cm-1 33000 انجام و نتایج بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر ارایه شد.
تحلیل داده‌ها
بررسی پایه و رقم و اثر متقابل آنها روی صفات مورد مطالعه در قالب طرح بلوک کامل تصادفی با 3 تکرار و به صورت اسپلیت پلات (split plot) انجام شد. در این پژوهش، رقم به عنوان عامل اصلی و پایه به عنوان عامل فرعی اتنخاب شد. تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار SPSS نسخه 12 انجام شد و میانگین‌های حاصل با استفاده از آزمون دانکـن با اطمینان 95 و 99 درصد مقایسه و نمودارها با نرم‌افزار Excel رسم شد.
نتایج
مقایسه میانگین‌های اثر متقابل پایه و رقم بر فعالیت آنزیم PAL نشان داد که در سطح احتمال 1 درصد بیشترین مقدار این آنزیم در گل‌های موتیکا-احمد آقایی تولید شده است. گر چه فعالیت این آنزیم در گل‌های سه رقم مورد مطالعه در پایه اهلی تفاوت معنی‌داری نشان نداد. در حالی که فعالیت این آنزیم در برگ‌های موتیکا-احمد آقایی و اهلی-اوحدی بیشترین مقدار بود (شکل 1).
مقایسه میانگین‌های اثر متقابل پایه و رقم بر ترکیبات فنلی کل، بیانگر این است که در سطح احتمال 1 درصد مقدار این ترکیبات در گل‌های موتیکا-احمد آقایی و اهلی-اوحدی به بیشترین میزان خود رسید، در حالی که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی کل برگ در موتیکا-احمد آقایی و در اهلی-کله‌قوچی تولید شده است. به بیان دیگر، بالاترین مقدار این ترکیبات در برگ‌ها و گل‌های پایه موتیکا و رقم احمد آقایی نسبت به سایر پایه‌ها و رقم‌ها مشاهده شد (شکل 1).
مقایسه میانگین‌های اثر متقابل پایه و رقم بر ترکیبات فلاونوئیدی نشان داد که در سطح احتمال 1 درصد بیشترین مقدار فلاونوئید کل درگل‌های اهلی-اوحدی و در برگ‌های موتیکا-احمد آقایی وجود دارد. همچنین، مقایسه میانگین‌های اثر متقابل پایه و رقم در محتوای آنتوسیانین در برگ‌ها و گل‌ها حکایت از وجود بیشترین مقدار آن در پایه اهلی و رقم اوحدی داشت (شکل 2).
بررسی ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه نشان داد که در گُل، همبستگی مثبت بین فعالیت آنزیم PAL و ترکیبات فنلی کل با ضریب (**96/0=r) و فعالیت آنزیم PAL و فلاونوئیدها با ضریب (**98/0=r) وجود دارد. همچنین، در برگ همبستگی مثبت بین فعالیت آنزیم PAL و ترکیبات فنلی کل با ضریب (**97/0=r) و فعالیت آنزیم PAL و فلاونوئیدها با ضرایب (**94/0=r) دیده شد. اگر چه همبستگی بین محتوای آنتوسیانین و فعالیت PAL در پایه موتیکا منفی (**98/0=r) و در پایه اهلی مثبت (**95/0=r) بود.
شکل 1-فعالیت آنزیم PAL و ترکیبات فنلی کل در گل و برگ دو پایه و سه رقم اوحدی، کله‌قوچی و احمد آقایی. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 0.01≥P است.
مقایسه میانگین‌های اثر متقابل پایه و رقم بر فعالیت آنزیم PAL و ترکیبات فنلی کل در پوست میوه (سه مرحله: پوست سبز، پوست سبز-قرمز، پوست قرمز) و مغز دانه نشان داد که در سطح احتمال 1 درصد در هر مرحله بیشترین میزان فعالیت آنزیم و ترکیبات فوق به موتیکا-احمد آقایی و اهلی-اوحدی تعلق داشت و حکایت از سیر نزولی مقادیر فعالیت آنزیم PAL و ترکیبات فنلی کل به ترتیب از مرحله پوست سبز (جدول 1)، پوست سبز-قرمز(جدول 2) و پوست قرمز (جدول 3) در طول دوره رسیدگی میوه داشت.
بررسی فلاونوئیدها در پوست نشان داد علی‌رغم سیر نزولی این صفت در هر سه مرحله، مقادیر متفاوتی از آن در دو پایه مورد مطالعه وجود داشت. به علاوه، بررسی محتوای آنتوسیانین سیر صعودی مقادیر این صفت را به ترتیب از مرحله سبز تا قرمز نشان داد که بیشترین مقدار آن متعلق به اهلی-اوحدی بود (جدول‌های 1، 2 و 3).
مقایسه میانگین‌های اثر متقابل پایه و رقم بر فعالیت آنزیم PAL، ترکیبات فنلی کل، فلاونوئیدهای کل و آنتوسیانین نشان داد که در سطح احتمال 1 درصد بیشترین مقدار در فعالیت آنزیم PAL، ترکیبات فنلی کل در مغز دانه موتیکا-احمد آقایی وجود داشت که حکایت از وجود بیشترین مقدار این ترکیبات در موتیکا-احمد آقایی داشت و پایه اهلی و رقم اوحدی در رتبه پس از آن قرار گرفت (جدول 4). همچنین، بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی در مغز دانه متعلق به موتیکا-احمد آقایی و اهلی-کله‌قوچی بود و بیشترین مقدار محتوای آنتوسیانینی در اهلی-اوحدی به دست آمد (جدول 4).
شکل 2- ترکیبات فلاونوئیدی کل، محتوای آنتوسیانین در دو پایه و سه رقم اوحدی، کله‌قوچی و احمد آقایی. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 0.01≥P است
بحث
مطالعات نشان می‌دهد در گیاهان پایه و پیوند آسیب اکسیداتیو کمتر و سطح پایین ROS ناشی از وجود ترکیبات و آنزیم‌هایی با خاصیت خورندگی ROS است (Martínez-Ballesta et al., 2010). Sobhana و همکاران (2000) مشاهده کرده‌اند که پایه‌هایی با خاستگاه ژنتیکی متفاوت روی الگوهای آیزوزیمی آنزیم‌های موجود در تنش اکسیداتیو در پیوند‌های گیاه هوآ (Hevea sp.) نقش دارند. گزارش‌ها گویای آن است که پایه‌های متفاوت عناصر ویژه‌ای را ترجیح می‌دهند که می‌توانند در ساخت ترکیبات ویژه در انواع تنش‌ها مؤثر باشد به طوری که عناصر غذایی کم مصرف به صورت کوفاکتور در ساختن ترکیبات بیوشیمیایی مانند آنزیم‌های گوناگون، هورمون‌های گیاهی، پروتئین‌ها و به ویژه ترکیبات فنلی در گیاهان شرکت می‌کنند (Sobhana et al., 2000; Satisha et al., 2007). He و همکاران (2009) نشان دادند اختلاف در ژنوتیپ پایه و نوع آن در مقاومت گیاه به تنش محیطی مؤثر است. به علاوه، گزارش‌ها همبستگی بین فعالیت آنزیم PAL و تجمع ترکیبات فنلی در برگ‌های هیبرید گیاه ذرت در تنش خشکی و فعالیت دفاعی این ژنوتیپ را در مقاومت به خشکی نشان می‌دهد (Hura et al., 2008). در این تحقیق فعالیت بالای آنزیم PAL و ترکیبات فنلی و همچنین، همبستگی مثبت بین فعالیت این آنزیم و فنل کل در برگ‌ها و گل‌های پایه موتیکا-احمد آقایی نسبت به پایه اهلی و دیگر رقم‌ها می‌تواند اثر متقابل این پایه و رقم در مقاومت بیشتر در برابر تنش‌های محیطی نسبت به پایه اهلی و رقم‌های دیگر را آشکار سازد. Orazem و همکاران (2011) بیان کردند ژنوتیپ پایه در تولید مقدار و نوع ترکیبات فنلی مؤثر است. همچنین، گزارش‌ها نشان می‌دهد که ترکیبات فنلی در مهار و کاهش اتواکسیداسیون لیییدها و خاموش کردن اکسیژن یکتایی، به عنوان آنتی‌اکسیدان ضروری برای دفاع در برابر گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) عمل می‌نمایند (Ksouri et al., 2007). بر اساس نتایج موجود به نظر می‌رسد مقاومت بیشتر پایه موتیکا-احمد آقایی با افزایش فعالیت سطح PAL و ترکیبات فنلی کل که به عنوان آنتی‌اکسیدان ضروری برای حفاظت در برابر ROS است، می‌تواند با تفاوت ژنتیکی دو پایه مشخص شود.
Cheng و همکاران (2005) نشان داده‌اند که آنزیم PAL در تشکیل فلاونوئیدها اثر مستقیم دارد و طول موج‌های بلند نور فعالیت PAL و CHS (نخستین آنزیم در مسیر بیوسنتزی فلاونوئیدها) و تجمع فلاونوئیدها را افزایش می‌دهد. همچنین، گیاهان جهش‌یافته‌ای که فاقد ژن‌های آنزیم CHS هستند قادر به تجمع فلاونوئیدها نبوده، نسبت به تنش اکسیداتیو حساس هستند (Shao et al., 2007). در این مطالعه، وجود بیشترین میزان فعالیت PAL و فلاونوئید کل و همچنین همبستگی مثبت بین فعالیت این آنزیم و فلاونوئید کل در برگ‌های پایه موتیکا-احمد آقایی نسبت به پایه اهلی و رقم‌های مورد مطالعه نشان داد، بر اساس وجود فرضیه عمل حفاظتی فلاونوئیدها در برابر تنش‌ها و نقش آنتی‌اکسیدانی این ترکیبات در افزایش مقاومت گیاهان به تنش‌ها (Shao et al., 2007)، به نظر می‌رسد تجمع فلاونوئیدها در برگ‌های پایه موتیکا-احمد آقایی نسبت به گیاهان دیگر می‌تواند به مقاومت بیشتر این گیاه در برابر تنش‌ها کمک کند. Rodríguez و همکاران (2011) گزارش کرده‌اند در گوجه گیلاسی افزایش ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و ظرفیت القا مقاومت پایه نسبت به تنش‌ها، به ژنوتیپ اندام‌های هوایی بستگی دارد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد پایه اهلی-اوحدی از نظر مقدار ترکیبات فنلی و فعالیت PAL در گل و برگ پس از پایه موتیکا-احمد آقایی در رتبه دوم قرار دارد و فقط در مقدار فلاونوئیدهای گل در پایه اهلی-اوحدی بیشترین مقدار را نشان داد که به نظر می‌رسد در این گیاه افزایش مقدار فلاونوئیدها می‌تواند به ژنوتیپ رقم مرتبط باشد.
جدول 1- مقادیر میانگین صفات مورد مطالعه با 3 تکرار ± SE در پوست سبز پسته (تیر ماه). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 0.01≥P است.
|
آنتوسیانین |
فلاونوئید کل |
ترکیبات فنلی |
PAL |
پایه-رقم |
|
13/0 ±05/7 b |
1/0± 90/38 a |
32/0± 68/28 c |
02/0 ± 86/1 b |
موتیکا-اوحدی |
|
1/0± 27/7 a |
16/0 ± 87/32 c |
6/0 ± 4/29 c |
a 02/0 ± 15/2 |
موتیکا-کله‌قوچی |
|
07/0 ±51/6 c |
14/0 ±33/30 d |
28/0± 12/39 a |
05/0 ± 31/2 a |
موتیکا-احمد آقایی |
|
02/0 ±66/7 a |
19/0 ± 20/36 b |
28/0 ± 13/36 b |
05/0 ± 82/1 b |
اهلی-اوحدی |
|
05/0 ± 35/7 ab |
25/0 ± 67/32 c |
21/0 ± 82/29 c |
01/0 ± 56/1 c |
اهلی-کله‌قوچی |
|
07/0 ± 10/6 d |
16/0 ±68/35 b |
32/0 ± 86/28 c |
03/0 ± 38/1 d |
اهلی-احمد آقایی |
جدول 2- مقادیر، میانگین صفات مورد مطالعه با 3 تکرار ± SE در پوست سبز-قرمز پسته (مرداد ماه). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 0.01≥P است.
|
آنتوسیانین |
فلاونوئید کل |
ترکیبات فنلی |
PAL |
پایه-رقم |
|
13/0 ± 05/17 d |
14/0 ± 90/30 c |
32/0 ± 86/26 b |
a 02/0 ± 74/1 |
موتیکا-اوحدی |
|
1/0 ± 75/17 c |
b 16/0 ± 97/34 |
31/0 ± 2/24 c |
b03/0 ± 43/1 |
موتیکا-کله‌قوچی |
|
16/0 ± 65/16 e |
14/0 ± 30/28 e |
38/0 ± 32/29 a |
05/0 ± 79/1 a |
موتیکا-احمد آقایی |
|
14/0 ± 24/20 a |
32/0 ± 12/28 e |
22/0 ± 48/24 C |
03/0 ± 58/1 C |
اهلی-اوحدی |
|
15/0 ± 82/18 b |
21/0 ± 02/31 d |
23/0 ± 21/24 C |
03/0 ± 45/1 b |
اهلی-کله‌قوچی |
|
1/0 ± 73/17 c |
24/0 ± 41/39 a |
18/0 ± 71/18 d |
01/0 ± 28/1 d |
اهلی-احمد آقایی |
جدول 3-مقادیر، میانگین صفات مورد مطالعه با 3 تکرار ± SE در پوست قرمز پسته (اوایل شهریور ماه). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 0.01≥P است.
|
آنتوسیانین |
فلاونوئید کل |
ترکیبات فنلی |
PAL |
پایه-رقم |
|
38/0 ± 87/35 a |
12/0 ± 89/19 f |
17/0 ± 78/24 a |
03/0 ± 52/1 b |
موتیکا-اوحدی |
|
14/0 ± 23/22 d |
d 15/0 ± 50/22 |
3/0 ± 17/23 b |
05/0 ± 42/1 c |
موتیکا-کله‌قوچی |
|
12/0 ± 37/21 e |
51/0 ± 40/52 a |
34/0 ± 64/24 a |
02/0 ± 67/1 a |
موتیکا-احمد آقایی |
|
b 20/0 ± 56/29 |
31/0 ± 30/21 e |
24/0 ± 75/22 c |
02/0 ± 46/1 c |
اهلی-اوحدی |
|
c 14/0 ± 85/24 |
27/0 ± 57/30 c |
11/0 ± 71/20 d |
03/0 ± 34/1 d |
اهلی-کله‌قوچی |
|
19/0 ± 66/19 f |
15/0 ± 28/38 b |
15/0 ± 07/15 e |
01/0 ± 12/1 e |
اهلی-احمد آقایی |
جدول 4- مقادیر، میانگین صفات مورد مطالعه با 3 تکرار ± SE در دانه (اواخر شهریور ماه). حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 0.01≥P است.
|
آنتوسیانین |
فلاونوئید کل |
ترکیبات فنلی |
PAL |
پایه-رقم |
|
08/0 ± 34/7 a |
04/0 ± 34/12 d |
01/0 ± 40/3 a |
04/0 ± 91/0 a |
موتیکا-اوحدی |
|
07/0 ± 44/5 d |
c 01/0 ± 98/12 |
05/0 ± 88/1 d |
03/0 ± 81/0 b |
موتیکا-کله‌قوچی |
|
05/0 ± 22/6 bc |
05/0 ± 24/15 a |
02/0 ± 44/3 a |
04/0 ± 93/0 a |
موتیکا-احمد آقایی |
|
a 01/0± 66/7 |
05/0 ± 72/13 b |
03/0 ± 96/2 b |
02/0 ± 92/0 a |
اهلی-اوحدی |
|
b 10/0 ± 50/6 |
04/0 ± 24/12 d |
08/0 ± 91/2 b |
01/0 ± 84/0 b |
اهلی-کله‌قوچی |
|
c 11/0 ± 94/5 |
01/0 ± 23/10 e |
08/0 ± 37/2 c |
01/0 ± 46/0 c |
اهلی-احمد آقایی |
گزارش‌های متعدد نشان می‌دهد که گر چه فعالیت PAL برای ساختن آنتوسیانین‌ها الزامی است، اما در مسیر بیوسنتز سینامیک اسید ممکن است به ترکیبات فنلی دیگر نظیر فلاونوئیدها، تانن‌ها و ... تبدیل شود (Lister et al., 1996). همچنین، در گیاه سیب آنتوسیانین‌ها به طور غیر وابسته به فعالیت PAL می‌توانند تجمع یابند و محتوای آنتوسیانین و ترکیبات فنلی به ژنوتیپ گیاه وابسته است (Hamouz et al., 2007; Feng et al., 2008). نتایج این بررسی همبستگی منفی بین فعالیت PAL و محتوای آنتوسیانین در برگ‌ها و گل‌های پایه موتیکا-احمد آقایی را نشان داد که به نظر می‌رسد آنزیم PAL در تشکیل ترکیبات فنلی در پایه موتیکا-احمد آقایی تأثیر بیشتری تا تشکیل آنتوسیانین‌ها دارد و این آنزیم به تنهایی قادر به تشکیل ترکیبات آنتوسیانینی نخواهد بود. همچنین، شایان ذکر است همبستگی مثبت بین آنتوسیانین و فعالیت آنزیم PAL در پایه اهلی-اوحدی، نشان‌دهنده نقش آنتی‌اکسیدانی آنتوسیانین‌ها در تنش‌های محیطی و در این پایه و پیوند است.
گزارش شده است آنزیم PAL در بیوسنتز ترکیبات فنلی میوه‌ها نقش کلیدی داشته، در مراحل نخستین رشد باعث تجمع این ترکیبات در این اندام می‌شود. فعالیت این آنزیم و ایجاد ترکیبات فنلی در پوست میوه بیش از سایر قسمت‌های داخلی میوه گزارش شده است (Montero et al., 1996). طی مراحل رسیدگی میوه فعالیت آنزیم PAL و محتوای ترکیبات فنلی کل به تدریج کاهش می‌یابد که این کاهش بستگی به تغییرات آنزیمی و شیمیایی موجود در مراحل رشد و نمو در اندام مورد نظر دارد (Ding et al., 2001; Remorini et al., 2008). بررسی‌های دیگر نشان داده است که نوع پایه نقش مهمی در محتوای پلی فنلی در میوه هلو (Kubota et al., 2001) و گیلاس (Jakobek et al., 2009) دارد. در نتایج حاصل از این پژوهش مشاهده شد که بیشترین فعالیت آنزیم PAL و ترکیبات فنلی در پوست میوه پایه موتیکا-احمد آقایی وجود دارد. بررسی میوه پسته در رقم‌ها و دو پایه مورد مطالعه نشان داد که مراحل رسیدگی میوه در فعالیت آنزیم PAL، محتوای کل فنلی، فلاونوئیدی و آنتوسیانینی مؤثر است. فعالیت این آنزیم و محتوای کل فنلی با رسیدگی میوه در هر سه رقم و دو پایه کاهش یافت. Arcas و همکاران (2000) گزارش کرده‌اند وجود غلظت بالای ترکیبات فنلی در پوست میوه سد مناسبی برای دفع حمله آفت‌هاست. مقادیر پایین آفلاتوکسین در مغز پسته دانه‌های دارای پوست در مقایسه با دانه‌های پوست کنده شده، احتمالاً نتیجه اثر بازدارندگی پوست در حمله آفلاتوکسین است (Doster and Michailides, 1995). همچنین، گزارش‌ها گویای آن است که فلاونوئیدها در لایه اپیدرمی می‌توانند همانند یک لایه ممانعت‌کننده در برابر تشعشعات مضر خورشید عمل کنند (Reyes-Carmona et al., 2005). گزارش‌های متعدد وجود ترکیبات فنلی را در پوست پسته و مقدار بالای این ترکیب در پوست نسبت به دانه را نشان می‌دهد (Tomaino et al., 2010). نتایج حاصل از تحقیق، وجود سطح بالای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی را در پوست میوه پسته نشان می‌دهد که به نظر می‌رسد در این پایه و رقم نسبت به دیگر گیاهان مورد مطالعه، پوست میوه پسته با داشتن ترکیبات فنلی به عنوان لایه حفاظتی در برابر اشعه UV و حمله آفات گیاهی پتانسیل حفاظتی بیشتری را دارد.
Orazem و همکاران (2011) گزارش کردند با افزایش رشد و نمو میوه، مقدار فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها نیز افزایش می‌یابد که افزایش و تغییر در میزان محتوای آنتوسیانینی به نوع رقم، مراحل بلوغ و همچنین، منشأ ژنتیکی پایه یا به عبارتی قدرت پایه بستگی دارد. به نظر می‌رسد، افزایش محتوای آنتوسیانینی پوست در پایه موتیکا-احمد آقایی و پایه اهلی-اوحدی با رسیدگی میوه، نشانگر تغییرات بیوشیمیایی و آنزیمی در مراحل رسیدگی میوه است که با وجود بیشترین محتوای آنتوسیانینی در پایه اهلی-اوحدی، با ویژگی‌های ژنتیکی رقم می‌تواند توجیه شود.
گزارش‌های موجود بیان می‌کند که افزایش غلظت فلاونوئیدها در برخی تنش‌ها غیر القایی است و می‌تواند ناشی از هیدرولیز حالت‌های الحاقی این ترکیبات و یا تشکیل آنها از مسیرهای غیر معمول باشد (Michalak, 2006; Parry et al., 1994). در بررسی نتایج حاصل از این تحقیق به نظر می‌رسد، اگر چه در پوست پسته در مراحل مختلف و در رقم‌های متفاوت هماهنگی بین تشکیل ترکیبات فنلی و فعالیت PAL دیده شد، ولی در برخی از آنها به طور مثال در پایه اهلی-احمد آقایی (پوست سبز و قرمز)، افزایش ترکیبات فلاونوئیدی علی‌رغم کاهش در حوضچه ترکیبات فنلی می‌تواند به علت تشکیل فلاونوئیدها از مسیرهای دیگر یا تبدیل ترکیبات فنلی توسط آنزیم‌های انتهایی مسیر به فلاونوئیدها و تجزیه شکل‌های غیر فعال فلاونوئیدی به شکل‌های فعال باشد. همچنین، با بررسی نتایج به نظر می‌رسد با مقایسه دو پایه موتیکا، اهلی و رقم احمد آقایی اختلاف در فعالیت آنزیم PAL در دو پایه مورد مطالعه دور از انتظار نیست و همبستگی بین فعالیت این آنزیم و ترکیبات فنلی هم وجود دارد. ولی تغییر در مقدار ترکیبات فلاونوئیدی و آنتوسیانینی در دو پایه را با فعالیت آنزیم‌های مختلف در انتهای مسیر بیوسنتزی و تشکیل اشکال مختلف ترکیبات توجیه کرد که به تفاوت منشأ ژنتیکی پایه‌ها ارتباط دارد و پژوهش‌های دیگری را می‌طلبد.
بررسی‌های دیگر، وجود ترکیبات فنلی (فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها) در مغز پسته و ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی این ترکیبات را گزارش کرده است (Silva et al., 2007; Ballistreri et al., 2009). همچنین، بررسی‌ها نشان داده است که پایه در محتوای ترکیبات فنلی و کیفیت میوه گیلاس (Martínez-Ballesta et al., 2010) و محتوای غذایی مغز پسته (Tavallali and Rahemi, 2007) تأثیر بسزایی دارد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که مقدار PAL و ترکیبات فنلی مغز پسته در زمان برداشت نسبت به پوست میوه کمتر است که در پایه موتیکا-احمد آقایی بیشترین مقدار وجود داشت، به نظر می‌رسد، وجود غلظت نهایی ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی و آنتوسیانینی در مغز دانه به فعالیت PAL بستگی دارد و این آنزیم ممکن است در ضمن بلوغ دانه در مراحل رشد و نمو درگیر باشد. همچنین، نتایج به دست آمده وجود ترکیبات فعال زیستی را در مغز پسته نشان داد که بیشترین مقدار متعلق به پایه موتیکا-احمد آقایی است. به نظر می‌رسد نوع پایه در محتوای ترکیبات آنتی‌اکسیدانی در مغز پسته نقش بسزایی دارد.
جمع‌بندی
تأثیر پایه‌های متفاوت در تشکیل ترکیبات شیمیایی در اندام‌های گیاه پسته اهمیّت دارد. نوع و منشأ ژنتیکی پایه می‌تواند در ایجاد مقاومت به تنش‌های محیطی مؤثر باشد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد پایه موتیکا-احمد آقایی دارای مقادیر بالای فعالیت PAL، ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی در برگ و گل است و می‌تواند به عنوان پایه مقاوم در تنش‌های محیطی معرفی شود. بررسی میوه پسته و به ویژه مغز آن که از نظر تجاری اهمیّت دارد، نشان داد وجود مقادیر بالای ترکیبات فنلی در پوست در جلوگیری از حمله قارچ‌ها و عوامل بیماری‌زا به مغز پسته در این پایه نقش دارد. به علاوه، نقش پایه در تشکیل مقادیر بالای ترکیبات فنلی (ترکیبات فعال زیستی) مغز، کیفیت مغز و در نتیجه اهمیّت آن در تغذیه انسان شایان ذکر است.
سپاسگزاری
نویسندگان این پژوهش، از مسؤولان مرکز تحقیقات پسته کشور به علت همکاری در اجرای این تحقیق سپاسگزاری می‌نمایند.
)
