Authors
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Urmia University, Urmia, Iran
2 Department of Agronomy and Plant Breeding, University of Agriculture and Natural Resources, Sari, Iran
Abstract
Keywords
پروانش (Catharanrthu sroseus L.) گیاه علفی و همیشه سبز متعلق به تیره خرزهره (Apocynaceae) است. این گیاه ارتفاعی معادل 30 تا100 سانتی‌متر داشته، دارای ساقه‌های استوانه‌ای، مستقیم و چوبی به رنگ‌های سبز یا قرمز کم‌رنگ است. برگ‌های گیاه به صورت براق، سبز تیره و گل‌های آن معطر و در رنگ‌های سفید تا بنفش متمایل به صورتی در انتها است. واریته‌ای که دارای گل‌های قرمز- صورتی است به علت مقدار بالای آلکالوئیدهای آن مورد توجه است و در این پژوهش نیز استفاده شد. همچنین، این گیاه به صورت معمول در باغ‌ها به عنوان گیاهی زینتی کشت می‌شود (Aslam et al., 2010). این گیاه یکی از مهم‌ترین گیاهان طبی و دارویی است که دارای بیش از 400 نوع آلکالوئید از نوع ترپنوئید ایندول آلکالوئید است (Faheem et al., 2011). دو آلکالوئید دیمر وینبلاستین و وینکریستین که به صورت عمده در بخش‌های هوایی این گیاه وجود دارند به صورت وسیعی در درمان تومورهای انسانی به کار می‌روند. همچنین، آلکالوئید مونومر آجمالیسین که در ریشه این گیاه به فراوانی وجود دارد، از کاربرد وسیعی در درمان بیماری‌های گردش خون، به ویژه در بهبود تخریب جریان خون طبیعی در مغز برخوردار است. گیاهان پروانش رشد یافته در محیط زراعی هنوز هم منبع اقتصادی برای تولید این داروها هستند. کشت بافت و سلول این گیاه به عنوان منبع جایگزین برای تولید این آلکالوئیدهای ارزشمند است (Whitmer et al., 2002).
کشت بافت کاربرد زیادی در علم گیاه‌شناسی، بیوشیمی، مهندسی ژنتیک و زیست‌شناسی مولکولی دارد و ابزاری مهم در مهندسی ژنتیک برای دست‌ورزی سلول‌های پذیرنده ژن خارجی است، در حالی که انجام آن در شرایط طبیعی کاری مشکل و غیر قابل کنترل است. علاوه بر این، روش کشت بافت به صورت مؤثر امکان تکثیر تعداد زیادی از واریته‌های مهندسی شده را فراهم می‌کند. بهینه‌سازی شرایط کشت نظیر افزودن پیش‌سازهای بیوسنتزی به محیط‌کشت، ممکن است تولید آلکالوئیدها را در جایی که تولید توسط فقدان پیش‌ساز ویژه محدود می‌شود، افزایش می‌دهد. تریپتوفان یکی از آمینو اسیدهای ضروری در گیاهان است و پیش‌ساز آلکالوئیدهای ایندولی در پروانش به شمار می‌آید. این آمینو اسید توسط آنزیم تریپتوفان دکربوکسیلاز (TDC) به تریپتامین تبدیل می‌شود که فراهم کننده شاخه ایندولی در این آلکالوئیدها است (Whitmer et al., 2002). همچنین، تریپتوفان می‌تواند به صورت مستقیم یا غیر مستقیم از طریق تبدیل شدن به اکسین (IAA) بر فرآیندهای فیزیولوژیک گیاه تأثیر گذارد.
انتقال گیاهچه‌های کشت شده در محیط درون شیشه (in vitro) به ex vitro یکی از مهم‌ترین مراحل سازگاری ساختاری و فیزیولوژیک در طول آماده‌سازی گیاهچه‌ها است به طوری که فرآیند سازگاری برای بسیاری از گونه‌های گیاهی، چالش برانگیزترین مرحله کشت بافت است. این مسأله به صورت عمده ناشی از ناتوانی این قبیل گیاهان نسبت به تحمل انواع مختلف تنش‌ها، نظیر شوک انتقال گیاه، از دست رفتن آب، حمله پاتوژن‌ها، فتوسنتز ضعیف و ... است. گیاهان تولید شده در سوبسترای غنی از مواد غذایی در شرایط سترون بسیار حساس هستند. ممکن است حتی یک درصد از گیاهان باززایی شده در شرایط درون شیشه‌ای زمانی که به شرایط ناسترون منتقل می‌شوند، زنده نمانند. برگ‌های گیاهان ریزازدیادی شده نازک و دارای مزوفیل برگی با مقدار اندک کلروفیل هستند که به علت سازمان‌‌دهی ضعیف کلروپلاست‌های آن است. همچنین، برگ گیاهچه‌های رشد یافته در شرایط درون شیشه دارای روزنه‌های بدون عملکرد هستند و فعالیت آنزیم فتوسنتزی روبیسکو در چنین برگ‌هایی ضعیف است. همه این شاخص‌ها به کارآیی فتوسنتزی پایین در گیاهچه‌های منتقل شده به ex vitro منجر می‌شود. آبگیری بالا یا شیشه‌ای شدن گیاهچه‌ها که به کاهش رشد در این گیاهان منجر می‌شود، مشکل دیگری در تثبیت موفق گیاهچه‌های مشتق شده از شرایط درون شیشه‌ای است. گیاهان باززایی شده در شرایط درون شیشه به طور ضعیف در برابر بیماری‌ها مقاومت می‌کنند که ناشی از مقدار کم فیتوآلکسین‌های آنها است. گیاهان باززایی شده اغلب ارتباطات آوندی ضعیفی را نشان می‌دهند که بر جذب آب از ریشه‌ها و انتقال آن به بافت‌های اندام هوایی اثر می‌گذارد (Kapoor et al., 2008).
شاید گسترده‌ترین و احتمالاً مهم‌ترین همیاری بین گیاهان و قارچ‌ها، نوعی همزیستی ریشه‌ای به نام همزیستی میکوریزی آربوسکولار با ریشه گیاهان باشد. این قارچ‌های درون همزیست که با حدود 80 درصد گیاهان خاکزی همزیست می‌شوند، مزایای متعددی را برای گیاهان میزبان خود فراهم می‌سازند که از آن جمله می‌توان افزایش جذب عناصر غذایی به ویژه فسفر، تولید هورمون‌های گیاهی، افزایش مقدار پروتئین و بالا بردن مقادیر لیپیدها و قندها، افزایش تحمل در برابر تنش‌های محیطی و بیماری‌ها را نام برد (Selvaraj and Chellappan, 2006). قارچ‌های میکوریز آربوسکولار با افزایش جذب عناصر معدنی نظیر فسفر که تحرک نسبتاً اندکی در خاک دارند، حیات گیاه میزبان را بهبود می‌بخشند. در گیاهان، به ویژه آن دسته از گیاهانی که سیستم‌های ریشه‌ای محدود و ضعیفی دارند، ارتباطات هیفی توسط این قارچ‌ها به عنوان پُلی ارتباطی میان ریشه و مکان‌های تغذیه‌ای در خاک عمل کرده، جذب عناصر غذایی غیر متحرک و کم تحرک را توسط سلول‌های میزبان تسهیل می‌کند (Kapoor et al., 2008). در این پژوهش، اثر قارچ‌های میکوریز آربوسکولار بر گیاهچه‌های ریزازدیادی شده تحت شرایط اعمال تریپتوفان در محیط‌کشت باززایی طی فرآیند سازگاری بررسی شد.
مواد و روش‌ها
در این بررسی، از ریزنمونه‌های قطعات گرهی حاصل از گیاهچه‌های سترون رشد یافته در شرایط درون شیشه‌ای و محیط MS استفاده شد. به منظور سترون‌سازی، بذرهای گیاه پروانش ابتدا به مدت 30 دقیقه در آب خیسانده شد، سپس در اتاقک کشت استریل به مدت 30 ثانیه در معرض اتانول 70 درصد قرار گرفتند. پس از آن، بذرها با آب مقطر استریل چندین بار شسته و الکل اضافی از آنها زدوده شد. سپس، به مدت 15 دقیقه توسط محلول هیپوکلریت سدیم یک درصد حاوی چند قطره تویین 20 ضدعفونی شدند. برای به دست آوردن گیاهچه‌های سترون، دانه‌ها در محیط موراشیگ و اسکوگ (MS) بدون هورمون که اسیدیته آن با استفاده از NaOH یک نرمال در حد 5/5 تنظیم شده بود، کشت شدند.
محیط‌کشت استفاده شده برای شاخه‌زایی ریزنمونه‌ها شامل محیط‌کشت MS غنی شده با 30 گرم در لیتر سوکروز و 7 گرم در لیتر آگار و هورمون‌های mg/l)1mg/l)+ NAA(5/0BAP( بود. برای تعیین اثر تریپتوفان بر رشد و میزان شاخص‌های بیوشیمیایی گیاه پروانش، این آمینو اسید در 4 غلظت (صفر، 150، 250 و 350 میلی‌گرم در لیتر) به محیط‌کشت باززایی اضافه شد. برای افزودن تریپتوفان به محیط‌کشت باززایی، پس از تهیه محیط‌کشت بهینه شاخه‌زایی و اتوکلاو نمودن آن، تحت شرایط هود لامینار و در اتاق کشت سترون شده، تریپتوفان در آب مقطر سترون حل و پس از سترون‌سازی از طریق فیلترهای 2/0 میکرومتری واتمن در غلظت‌های مشخص شده به 4 محیط‌کشت مورد نظر اضافه شد. پس از آن، محیط‌کشت آماده شده به شیشه‌ها منتقل و پس از سه روز برای کشت استفاده شد. نمونه‌ها در دمای 2±25 درجه سانتیگراد و در دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و تحت شدت نور 3000 لوکس قرار گرفتند. واکشت نمونه‌ها هر دو هفته یک‌بار صورت گرفت. پس از شاخه‌زایی نمونه‌ها، گیاهچه‌های حاصل برای تشکیل گیاهچه کامل و ریشه‌زایی به محیط‌کشت ریشه‌زایی شامل محیط‌کشت MS 2/1غنی شده با 30 گرم در لیتر سوکروز و 7 گرم در لیتر آگار و IBA mg/l) 1/0( و غلظت‌های در نظرگرفته شده تریپتوفان، منتقل شدند. این آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی و در 4 تکرار انجام شد.
تهیه مایه تلقیح قارچی
از سه گونه قارچ میکوریز آربوسکولار به نام‌های Glomus intraradices، G. etunicatum و
G. versiforme استفاده شد. برای هر گونه قارچی یک گلدان در نظر گرفته شد و در هر گلدان 500 گرم از قارچ مورد نظر به علاوه خاک و ماسه به نسبت 1 به 5 افزوده شد. ذرت (Zea mays L.) واریته 703 به علت همزیستی بالایی که با این گونه از قارچ‌ها نشان می‌دهد، برای تهیه مایه تلقیح استفاده شد. بذرهای ذرت به مدت 20 دقیقه در محلول 20 درصد هیپوکلریت سدیم (NaOCl) استریل شده، با آب مقطر شستشو داده شدند. گلدان‌ها در شرایط گلخانه‌ای با دمای شبانه 32 و روزانه 20 درجه، شدت نور 10000 لوکس، دوره روشنایی 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و رطوبت نسبی 40 تا 50 درصد قرار داده شدند. نور مورد نیاز برای رشد گیاه توسط لامپ‌های فلورسنت، تنگستن و سدیمی تأمین شد. از هفته سوم از محلول غذایی Rorison برای تغذیه گیاهان استفاده شد.
در پایان هفته پنجم برای اطمینان از همزیستی، نمونه‌ای از ریشه ذرت پس از رنگ‌آمیزی زیر میکروسکوپ بررسی شد. پس از گذشت 10 هفته، بخش هوایی گیاه حذف و از بستر خاک حاوی خاک، ماسه، ریشه و هیف قارچی به عنوان مایه تلقیح استفاده شد.
آماده سازی گیاهان برای مرحله سازگاری
برای سازگار نمودن گیاهان باززایی شده با شرایط محیط خارج، ابتدا گیاهچه‌های حاصل از باززایی به آرامی از داخل ژل خارج شده با آب ولرم شسته شدند تا از حذف تمامی ذرات آگار اطمینان حاصل شود. سپس گیاهچه‌های ریشه‌دار شده به گلدان‌های حاوی پیت: ورمیکولیت: شن (1:1:1) منتقل شدند. در این تحقیق، برای بررسی نقش قارچ‌های میکوریز آربوسکولار در سازگاری گیاهان درون شیشه‌ای با محیط خارج، از 10 گرم از هر سه گونه قارچ میکوریز شامل Glomus etunicatum، G. intraradices و
G. versiforme به علاوه نمونه‌های شاهد بدون میکوریز، استفاده شد. پیش از انتقال گیاهچه‌ها به گلدان‌ها، خاک به خوبی آبیاری و زهکشی شد. پس از آن، روی گلدان‌ها با نایلون پوشیده شد تا رطوبت محیط اطراف گیاه بالا نگه داشته شود. گلدان‌ها به اتاقک کشت با شدت نور کم که توسط دستگاه رطوبت‌ساز مرطوب نگه داشته شده بود، منتقل شدند. دمای اتاقک کشت در 25 درجه سانتیگراد تنظیم شد. پس از 4 هفته گیاهان به شرایط نوری بالاتر و رطوبت پایین‌تر منتقل شدند. پس از 5 هفته درصد حیات در گیاهان سازگاری یافته ارزیابی شد. آزمایش در 4 تکرار انجام شد.
اندازه‌گیری طول اندام هوایی
برای اندازه‌گیری طول اندام هوایی، پس از برداشت نمونه‌های گیاه پروانش، بخش‌های هوایی در هر یک از بوته‌ها بریده و طول بلندترین بخش در بوته از محل مریستم انتهایی تا محل بریدگی با استفاده از خط‌کش اندازه‌گیری شد. این عمل برای هر تیمار در 4 گلدان، هر کدام حاوی یک بوته انجام شد.
اندازه‌گیری وزن تر و خشک اندام هوایی
پس از جداسازی اندام هوایی، وزن تر اندام هوایی با استفاده از ترازوی دیجیتال اندازه‌گیری شد و پس از شستشوی آن با آب مقطر، به مدت 48 ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد آون قرار داده شد. سپس، مجدداً نمونه‌ها در آون قرار داده و توزین شدند. این عمل تا زمانی انجام شد که وزن نمونه‌ها ثابت ماند. پس از آن، وزن خشک اندام هوایی محاسبه شد.
اندازه‌گیری مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی
ابتدا 5/0 گرم از بافت تر برگ همراه با 10 میلی‌لیتر استون ساییده شد تا رنگ سبز آن کاملاً برطرف شود و محلول به دست آمده با استفاده از کاغذ صافی صاف شد. سپس، جذب نمونه‌ها در 645 و 662 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. در پایان، مقدار کلروفیلهای a و b با استفاده از فرمول‌های زیر محاسبه شد (Lichtenthaler and Wellburn, 1983):
Chl a = 11.75 A662 – 2.350A645.
Chl b = 18.61 A645 – 3.960 A662.
اندازه‌گیری مقدار قندهای محلول
برای اندازه‌گیری مقدار قندهای محلول از روش فنل سولفوریک استفاده شد که بر اساس هیدرولیز قندهای محلول و ایجاد ترکیبات فورفورال است. این ترکیبات با فنل کمپلکس رنگی ایجاد می‌کنند
(Fales, 1951). بدین منظور، بر روی 100 میلی‌گرم از ماده خشک اندام هوایی10 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد افزوده شد و به مدت یک هفته در دمای 4 درجه یخچال قرار داده شد تا قندهای محلول آن آزاد شوند. پس از این مدت، با افزودن آب مقطر، حجم 5/0 میلی‌لیتر از محلول رویی نمونه‌ها به 2 میلی‌لیتر رسانده شد. سپس روی هر کدام از لوله‌های آزمایش، یک میلی‌لیتر فنل 5 درصد و سولفوریک اسید افزوده شد. محلول زردرنگ ایجاد شده با گذشت زمان تغییر رنگ داد. پس از 30 دقیقه و بعد از سرد شدن لوله‌ها و ایجاد رنگ نهایی، شدت رنگ حاصل با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر اندازه‌گیری شد. برای تعیین غلظت قندهای محلول لازم است منحنی استاندارد با استفاده از غلظت‌های معلوم گلوکز تهیه شود. به این منظور، غلظت‌هایی از گلوکز (صفر، 10، 15، 25 و 35 میلی‌گرم در لیتر) تهیه و طیف جذبی آنها تعیین شد.
استخراج پروتئین
برای استخراج پروتئین، ابتدا 500 میلی‌گرم از بافت‌های اندام هوایی گیاه پروانش توزین شده، توسط ازت مایع به صورت پودر درآمد. سپس، 8/0 میلی‌لیتر از بافر استخراج شامل تریس 09/0 مولار، بوریک اسید 08/0 مولار و اتیلن دی آمین تترا استات (EDTA) 93/0 گرم در لیتر با اسیدیته 8/4، به علاوه 8/0 میلی‌لیتر سوکروز برای غلیظ کردن بافر به نمونه‌های پودر شده درون یک تیوب 5/1 میلی‌لیتری اضافه شد. پس از آن، تیوب‌ها در دستگاه سانتریفیوژ 13000 دور قرار داده شدند. محلول رویی حاوی پروتئین به تیوب‌های مجزا منتقل شده و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتیگراد فریزر نگهداری شد.
اندازه‌گیری غلظت پروتئین کل
برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین کل از روش برادفورد استفاده شد و سرم آلبومین گاوی در غلظت‌های مختلف برای رسم نمودار استاندارد به کار رفت (Bradford, 1979). برای تهیه معرف برادفورد، مقدار 100 میلی‌گرم از کوماسی بلو G- 250 به 50 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد اضافه شد. سپس، 100 میلی‌لیتر فسفریک اسید 85 درصد به این محلول اضافه و حجم کل محلول با استفاده از آب مقطر به یک لیتر رسانده شد. محلول از کاغذ صافی واتمن نمره یک عبور داده شد. برای اندازه‌گیری مقدار پروتئین در نمونه مجهول 50 میکرولیتر به همراه 20 میکرولیتر بافر استخراج و 900 میکرولیتر معرف برادفورد ترکیب شده و حجم آن با آب مقطر به 1000 میکرولیتر رسانده شد. محلول‌ها به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری و سپس، جذب آن در 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. در پایان، غلظت پروتئین بر اساس منحنی استاندرد بر حسب میکروگرم گرم وزن تر تعیین شد.
تحلیل داده‌ها
تحلیل آماری نتایج حاصل با نرم‌افزار SPSS نسخه 16 و آزمون توکی انجام و تفاوت میان گروه‌ها با کمک خطای استاندارد در سطح 5 درصد مقایسه شد.
نتایج
نتایج حاصل از اندازه‌گیری طول اندام هوایی در گیاهان پروانش باززایی شده تحت تیمار تریپتوفان پس از طی دوره سازگاری نشان داد که بالاترین میزان طول اندام هوایی در گیاهان شاهد غیر میکوریزی و گیاهان همزیست با G. etunicatum و G. versiforme در mg/l 350 تریپتوفان و در نمونه‌های همزیست با میکوریز G. intraradices در mg/l 250 تریپتوفان است که با نمونه‌های شاهد با تریپتوفان صفر در هر گروه قارچی دارای تفاوت معنیداری بودند. همچنین، بین تیمارهای میکوریزی در غیاب تریپتوفان بیشترین طول اندام هوایی در گیاهان همزیست با
G. etunicatum به دست آمد که بررسی آماری نتایج حاصل، بیانگر اختلاف معنیداری در سطح 5 درصد بین تیمارهای G. etunicatum با سایر تیمارها بود و اختلاف میان شاهد غیر میکوریزی و تیمارهای
G. versiforme و G .intraradices در سطح آماری 5 درصد معنی‌دار نبود. بررسی نتایج حاصل از اعمال تریپتوفان در گیاهانی که طی سازگاری آغشتگی میکوریزی نداشته‌اند نشان داد که بیشترین طول اندام هوایی مربوط به تیمار mg/l 350 بود که با تیمارهای صفر و 250 میلی‌گرم بر لیتر تفاوت معنیداری را در سطح آماری 5 درصد نشان دادند (شکل 1).
شکل 1- طول اندام هوایی گیاهان پروانش تحت تیمار میکوریز و تریپتوفان. مقادیر، میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P≤ است.
بررسی نتایج حاصل از اندازه‌گیری وزن تر اندام هوایی نشان داد که بین تیمارهای همزیست با
G. etunicatum، G. intraradices و شاهد غیر میکوریزی بالاترین میزان وزن تر در تیمار mg/l 350 تریپتوفان و در گیاهان همزیست باG. versiforme در تیمار mg/l 150 تریپتوفان به دست آمد و بالاترین میزان وزن تر به گیاهان G. versiforme تحت تیمار mg/l 150 تریپتوفان مربوط بود که اختلاف معنیداری را تنها با گیاهان شاهد غیر میکوریزی همزیست با
G. etunicatum تحت تیمار صفر و mg/l150 تریپتوفان و گیاهان همزیست با G. versiforme فاقد تریپتوفان نشان داد. همچنین، تحلیل نتایج مربوط به وزن تر اندام هوایی در گیاهان شاهد غیر میکوریزی بیانگر عدم وجود اختلاف معنی‌دار بین نمونه‌های فاقد تریپتوفان و غلظت‌های به کار رفته آن بود. از سوی دیگر، مقایسه نتایج حاصل از اندازه‌گیری وزن تر اندام هوایی در گیاهان میکوریزی و غیر میکوریزی در شرایط عدم اعمال تریپتوفان نشان داد که بالاترین میزان وزن تر به گیاهان همزیست با G. intraradices مربوط بود که تفاوت معنیداری را با نمونه‌های شاهد غیر میکوریزی و همزیست با G. etunicatum نشان داده و با گیاهان همزیست باG. Versiforme تفاوت معنیداری را در سطح 5 درصد نداشتند (شکل 2).
شکل 2- وزن تر اندام هوایی گیاهان پروانش تحت تیمار میکوریز و تریپتوفان. مقادیر، میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P< است.
از سوی دیگر، تحلیل نتایج مربوط به وزن خشک اندام هوایی نشان داد که قارچ‌های میکوریز می‌توانند باعث افزایش این شاخص در مقایسه با نمونه‌های غیر میکوریزی شوند. بررسی آماری نتایج نشان داد که تیمار میکوریز در غیاب اعمال تریپتوفان باعث افزایش معنیداری در وزن خشک اندام هوایی در سطح آماری 5 درصد تنها در نمونه‌های همزیست با G. versiforme در مقایسه با شاهد غیر میکوریزی شده است و در بین سایر تیمارهای میکوریزی تفاوت معنیداری نسبت به شاهد مشاهده نشد. مقایسه اثر غلظت‌های مختلف تریپتوفان در غیاب میکوریز بیانگر بالاترین میزان وزن خشک اندام هوایی در غلظت mg/l 250 تریپتوفان بود. در مجموع، بالاترین میزان این شاخص در نمونه‌های همزیست با G. versiforme در غلظت صفر تریپتوفان مشاهده شد که تفاوت معنیداری را با همه غلظت‌های تریپتوفان اعمال شده نمونه‌های شاهد غیر میکوریزی و غلظت‌های صفر تریپتوفان در سایر تیمارهای میکوریزی نشان داد (شکل 3).
شکل 3- وزن خشک اندام هوایی گیاهان پروانش تحت تیمار میکوریزا و تریپتوفان. مقادیر، میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P≤ است.
تحلیل نتایج حاصل از اندازه‌گیری میزان پروتئین کل در گیاهان پروانش میکوریزی و غیر میکوریزی تحت تیمار غلظت‌های مختلف تریپتوفان پس از طی دوره سازگاری بیانگر آن بود که بالاترین میزان این شاخص در نمونه‌های همزیست با G.versiforme قرار گرفته تحت تیمار mg/l 350 تریپتوفان مشاهده شد که تفاوت اندکی را با گیاهان همزیست با G.intraradices تحت غلظت‌های mg/l 250 و
mg/l 350 تریپتوفان نشان دادند و تفاوت معنیداری بین این تیمارها مشاهده نشد، در حالی که با سایر تیمارها تفاوت در سطح احتمال 5 درصد معنی‌دار بود. مقایسه نتایج حاصل از اندازه‌گیری پروتئین‌های محلول در تیمارهای تریپتوفان در عدم حضور میکوریز نشان دهنده بالاترین میزان آن در غلظت mg/l 350 بود که تفاوت معنیداری را با سه غلظت دیگر نشان ندادند. همچنین، بررسی نتایج حاصل از اثر قارچ‌های میکوریز در غلظت صفر تریپتوفان بر مقدار پروتئین محلول نیز تفاوت معنیداری را بین سه تیمار قارچی نشان نداد، در حالی که تفاوت با شاهد غیر میکوریزی در سطح احتمال 5 درصد معنی‌دار بود. (شکل 4).
شکل 4- محتوای پروتئین کل اندام هوایی گیاهان پروانش تحت تیمار میکوریزا و تریپتوفان. مقادیر، میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P≤ است.
بررسی مقدار قند محلول در گیاهان پروانش میکوریزی و غیر میکوریزی تحت تیمار تریپتوفان نشان داد که بیشترین میزان این شاخص در گیاهان همزیست با G. versiforme تحت تیمار mg/l 350 تریپتوفان به دست آمده است که به استثنای نمونه‌های همزیست با G .intraradices تحت تیمار mg/l 350 تریپتوفان، با سایر تیمارها، تفاوت معنیداری را در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند. در بررسی اثر تریپتوفان بر مقدار قندهای محلول در نمونه‌های شاهد غیر میکوریزی، نتایج نشان دادند که تفاوت معنیداری بین تیمارهای مختلف وجود نداشته است. همچنین، مقایسه نتایج حاصل از بررسی اثر قارچ‌های میکوریز بر مقدار قندهای محلول اندام هوایی در غیاب اعمال تریپتوفان نشان داد که بالاترین میزان آن در نمونه‌های همزیست با G. versiforme به دست آمده که تفاوت معنیداری را با گیاهان شاهد غیر میکوریزی نشان داد (شکل 5).
شکل 5- مقدار قند محلول اندام هوایی گیاهان پروانش تحت تیمار میکوریز و تریپتوفان. مقادیر، میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P≤ است.
بررسی نتایج حاصل از اندازه‌گیری محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی شامل کلروفیلهای a و b نشان داد که میزان این دو رنگیزه نیز در تیمارهای میکوریزی بالاتر از نمونه‌های شاهد غیر میکوریزی بود. بالاترین میزان کلروفیل a در نمونه‌های همزیست با
G. versiforme تحت تیمار mg/l 250 تریپتوفان مشاهده شد، با وجود این، تفاوت معنیداری را در سطح احتمال 5 درصد با نمونه‌های همزیست با
G. intraradices در تمامی غلظت‌های تریپتوفان و همچنین، G. etunicatum تحت تیمارهای mg/l 150 و mg/l 250 تریپتوفان نشان ندادند. همچنین، بررسی اثر آمینو اسید تریپتوفان بر محتوای کلروفیل a نشان داد که بالاترین میزان این رنگیزه بین نمونه‌های غیر میکوریزی که تنها تحت تیمار تریپتوفان قرار داشتند به تیمار
mg/l 350 تریپتوفان مربوط بود که تفاوت معنیداری را تنها با تیمار فاقد تریپتوفان نشان دادند. تحلیل مقایسه‌ای تیمارهای میکوریزی در غیاب اعمال تریپتوفان نیز بیانگر بالاترین میزان در مقدار کلروفیل a در نمونه‌های همزیست با G .intraradices بود که تنها با نمونه‌های شاهد غیر میکوریزی تفاوت معنیداری را نشان دادند (شکل 6).
شکل 6- محتوای کلروفیل a اندام هوایی گیاهان پروانش تحت تیمار میکوریز و تریپتوفان. مقادیر، میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P≤ است.
بررسی نتایج مربوط به کلروفیل b نشان دهنده بالاترین میزان این رنگیزه در نمونه‌های همزیست با
G. intraradices تحت تیمار mg/l 250 تریپتوفان بود، با این وجود، این تفاوت در سطح آماری 5 درصد تنها با نمونه‌های شاهد غیر میکوریزی در همه غلظت‌های تریپتوفان، G. etunicatum و در غلظت صفر و
mg/l 250 تریپتوفان و G. versiforme در غلظت صفر و mg/l 150 تریپتوفان معنی‌دار بود. همچنین، مقایسه نتایج حاصل از بررسی اثر تریپتوفان به تنهایی در نمونه‌های غیر میکوریزی نشان داد که بالاترین میزان کلروفیل b در غلظت mg/l 350 تریپتوفان مشاهده شد که تنها با شاهد فاقد تریپتوفان تفاوت معنیداری را در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند. از سوی دیگر، نتایج حاصل از آغشتگی گیاهان با میکوریز در تیمارهای فاقد تریپتوفان بیانگر بالاترین میزان کلروفیل b در
G. intraradices بود که تنها با شاهد غیر میکوریزی تفاوت معنیداری در سطح 5 درصد دارا بود (شکل 7).
شکل 7- محتوای کلروفیل b اندام هوایی گیاهان پروانش تحت تیمار میکوریز و تریپتوفان. مقادیر، میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 05/0P≤ است.
بحث
بررسی نتایج حاصل از برهم‌کنش قارچ‌های میکوریز در گیاهچه‌های پروانش رشد یافته در شرایط درون شیشه که تحت تأثیر غلظت‌های مختلف تریپتوفان قرار گرفته بودند، طی فرآیند سازگاری نشان داد که این قارچ‌ها اثر مثبتی بر رشد و عوامل بیوشیمیایی این گیاهچه‌ها داشته‌اند. نتایج نشان دادند که قارچ‌های میکوریز سبب افزایش رشد و طول اندام هوایی و وزن تر و خشک در گیاهچه‌های تحت تیمار تریپتوفان شده‌اند.
قارچ‌های میکوریز با افزایش جذب عناصر معدنی نظیر فسفر که تحرک نسبتاً کمی در خاک دارند باعث افزایش رشد در گیاهان می‌شوند. این قارچ‌ها به شدت ریشه‌های جانبی را در خاک افزایش می‌دهند و با تشکیل ریسه شعاعی به گیاه برای جذب آب و مواد معدنی یاری می‌رسانند. همچنین، آغشتگی با قارچ‌های میکوریز می‌تواند بسته به نوع میزبان مقدار سایر عناصر غذایی نظیر کلسیم، مس، منیزیم و روی را در گیاه افزایش دهد و این خود به رشد گیاه کمک می‌کند. از سوی دیگر، یکی از مهم‌ترین آثار دوره سازگاری بر گیاهان انتقال یافته به محیط ex vitro قرار گرفتن گیاهان تحت تنش رطوبت و آب است. نشان داده شده که تلقیح گیاهچه‌های ریزازدیادی شده با قارچ‌های میکوریز نقش مهمی را در اقتصاد آب گیاه ایفا می‌کند (Kapoor et al., 2008). قارچ‌های میکوریز با افزایش محتوای آب نسبی (RWC) می‌توانند باعث بهبود جذب فسفر از خاک شده، در نهایت، نقش مؤثری در افزایش رشد گیاه داشته باشند (Krishna et al., 2005). از دیگر عوامل مؤثر بر میزان رشد توسط قارچ‌های میکوریز، تأثیر این قارچ‌ها بر هورمون‌های گیاهی به ویژه IAA است. افزایش مقدار IAA، جیبرلین و سیتوکینین در گیاه Prosopis juliflora همزیست با G. fasciculatum توسط Selvaraj و Chellappan (2006) گزارش شده است. Karthikeyan و همکارانش (2008) نشان داده‌اند که همزیستی گیاهان پروانش با قارچ‌های میکوریز
G. mosseae می‌تواند باعث افزایش ارتفاع گیاه شود. همچنین، اثر این قارچ‌ها بر شاخص‌هایی نظیر وزن تر و خشک اندام هوایی گزارش شده است (Morone-Fortunato and Avato, 2008).
از سوی دیگر، Talaat و همکارانش (2005) نشان داده‌اند که با افزایش غلظت تریپتوفان به کار رفته در گیاه پروانش، میزان وزن تر و خشک و ارتفاع گیاه افزایش می‌یابد. همچنین، Nahed و همکاران (2009) با به کار بردن دو غلظت از تریپتوفان در غلظت‌های 50 و 100 پی‌پی‌ام (ppm) افزایش رشد را در گیاهان Antirrhinum majus نشان داده‌اند. اثر مثبت تریپتوفان می‌تواند به علت نقش این آمینو اسید به عنوان مسیری جایگزین در سنتز IAA باشد. به علاوه، زمانی که گیاه دچار کمبود کربوهیدرات می‌شود، تریپتوفان می‌تواند به عنوان منبع کربن و انرژی عمل کند و به این طریق در رشد گیاه مؤثر باشد.
اثر مثبت چند گونه از قارچ‌های میکوریز بر رشد و ارتفاع گیاهچه‌های Vitis vinifera در طول سازگاری ex vitro گزارش شده است (Krishna et al., 2005). تحلیل نتایج حاصل از اندازه‌گیری مقدار پروتئین کل نیز بیانگر اثر مثبت قارچ‌های میکوریز و تیمارهای تریپتوفان بر مقادیر این شاخص بوده است. نشان داده شده است که تلقیح میکوریزی غلظت اسیدهای آمینه و مقدار پروتئین کل را در گیاهان همزیست افزایش می‌دهد. مشخص شده است که گیاهان Prosopis juliflora همزیست با G. fasciculatum نسبت به شاهد از پروتئین بیشتری در برگ‌های خود برخوردار بوده‌اند (Selvaraj and Chellappan, 2006). همچنین، نشان داده شده است که در گیاهان پروانش تیمار شده با سه غلظت تریپتوفان، مقدار پروتئین کل با افزایش غلظت تریپتوفان به صورت جزیی افزایش می‌یابد (Talaat et al., 2005).
برهم‌کنش دو تیمار میکوریز و تریپتوفان باعث افزایش غلظت قندهای محلول در گیاهچه‌های پروانش شد. برهم‌کنش همزیستی در اجتماعات میکوریزی بر اساس تبادل کربوهیدرات‌ها و سنتز پلی‌ساکاریدها استوار است. از سوی دیگر، قارچ‌های میکوریز می‌توانند با افزایش غلظت هورمون‌های گیاهی نظیر سیتوکینین که در باز شدن روزنه‌ها مؤثرند، باعث افزایش فتوسنتز و در نهایت، تشکیل کربوهیدرات‌ها در گیاه شوند. Demir (2004) نشان داد که میزان قندهای فروکتوز، آلفا گلوکز و مقدار قند کل در گیاهان فلفل همزیست با G. intraradices بالاتر از انواع غیر میکوریزی بوده است. همچنین، اثر تریپتوفان بر افزایش کربوهیدرات‌ها توسط Wahba و همکارانش (2002) روی Antholyza acthiopoica نشان داده شده است.
بررسی مقادیر کلروفیلهای a و b در گیاهچه‌های پروانش میکوریزی که تحت تیمار تریپتوفان، طی فرآیند سازگاری بیانگر مؤثر بودن این دو تیمار در افزایش این عوامل فتوسنتزی بوده است. پژوهش‌ها نشان داده‌اند که غلظت کلروفیل در گیاهان تیمار شده با قارچ‌های میکوریز آربوسکولار بالاتر از انواع غیرمیکوریزی است (Kapoor et al., 2006). بالا بودن غلظت کلروفیل در نمونه‌های میکوریزی را می‌توان به بالا بودن جذب فسفر به عنوان حامل انرژی طی فرآیند فتوسنتز نسبت داد (Selvaraj and Chellappan, 2006). از سوی دیگر، قارچ‌های میکوریز با افزایش جذب عناصر ضروری در بیوسنتز کلروفیل‌ها (شامل منیزیم و آهن) می‌توانند سبب افزایش ساخت این رنگیزه‌ها و در نهایت، افزایش میزان فتوسنتز شوند (Krishna et al., 2005). افزایش مقدار کلروفیلهای
a و b در گیاهان Prosopis juliflora همزیست با
G. fasciculatum گزارش شده است (Selvaraj and Chellappan, 2006). همچنین، Krishna و همکارانش (2005) افزایش غلظت کلروفیل کل را در گیاهان Vitis vinifera همزیست با چند گونه از قارچ‌های میکوریز و Moraes و همکارانش (2004) در گیاه Podyphillum peltatum طی فرآیند سازگاری در شرایط ex vitro گزارش کرده‌اند. از سوی دیگر، مشاهده شده که آمینو اسیدها و از جمله تریپتوفان می‌توانند سبب افزایش غلظت کلروفیلهای a و b و کاروتنوئیدها شوند که این نتایج هماهنگ با یافته‌های Abdel Aziz و Balbaa (2007) بر گیاه Phylodendron erubescens است.
جمع‌بندی
در مجموع، از بررسی حاضر این نتیجه به دست آمد که طی فرآیند سازگاری، قارچ‌های میکوریز و تریپتوفان بر رشد گیاهان پروانش مؤثر بوده، از میان تیمارهای اعمال شده، برهم‌کنش دو تیمار تأثیر بیشتری بر رشد و عوامل بیوشیمیایی این گیاه دارویی ارزشمند دارد.
)
