Authors
Department of Biology, Faculty of Sciences, Urmia University, Urmia, Iran
Abstract
Keywords
آلودگی خاک با فلزات سنگین مشکل محیطی مهمی در سرتاسر جهان است. از آغاز انقلاب صنعتی، آلودگی محیط با فلزات سمّی سرعت یافت .(Nriagu, 1996). این نوع آلودگی همچنین، یکی از تنش‌های محیطی برای گیاهان است. زمین‌های کشاورزی، در نتیجه صنعتی شدن، شهری شدن و فعالیت‌های کشاورزی با فلزات سنگین آلوده شده‌اند (Kabata-Pendias and Pendias, 1986). تجمع فلزات سنگین در خاک موجب کاهش فعالیت میکروبی خاک، تنوع زیستی و حاصلخیزی خاک شده، حتی می‌تواند به سلامتی جانوران و انسان در زنجیره غذایی آسیب رساند (Mathys, 1977). در بسیاری از خاک‌های اسیدی سراسر دنیا و حدود نیمی از زمین‌های زراعی که پتانسیل تولید غذا و مواد غذایی را دارند، فلزات سنگین عامل اصلی محدودیت رشد گیاهان هستند (کافی و مهدوی دامغانی، 1379). روی، عنصر کم مصرف ضروری برای رشد و نمو طبیعی گیاهان محسوب می‌شود و در بسیاری از فرآیندهای متابولیسمی آنها شرکت می‌کند، با وجود این، مقادیر خیلی کم یا زیاد آن باعث اختلال در فرآیندهای مهم متابولیسمی و در نتیجه توقف یا کاهش رشد آنها می‌شود (Broadley et al., 2007). روی در فعالیت آنزیم‌ها، بیوسنتز کلروفیل، اکسین، پروتئین و کربوهیدرات و همچنین، متابولیسم لیپید، اسید نوکلئیک و استحکام غشا شرکت دارد (MadhavaRao and Srestry, 2000).
برخی از محققان معتقدند که فلز روی از طریق محافظت پروتئین‌ها و لیپیدهای غشایی در برابر رادیکال‌های آزاد و سایر محصولات حاصل از واکنش‌های احیایی درون سلولی، باعث حفاظت تمامیت غشای سلول‌ها می‌شود، همچنین، این فلز به همراه مس بخش اصلی آنزیم سوپراکسید دیسموتاز را به عنوان جاروب‌کننده رادیکال‌های آزاد تشکیل می‌دهد (Alloway, 2008). مانند سایر فلزات سنگین هنگامی که فلز روی در خاک و در نهایت، در بافت‌های گیاهی تجمع می‌یابد، بسته به گونه گیاه باعث تغییر در برخی فرآیندهای متابولیکی گیاه شده، از این طریق در رشد و نمو گیاهان اختلال ایجاد می‌کند (Stoyanova and Doncheva, 2002). علایم سمیّت روی در گیاهان شامل: کاهش تولید محصول، توقف رشد، زردی برگ‌ها در اثر کمبود آهن، کاهش سنتز کلروفیل، تجزیه کلروپلاست و اختلال در جذب فسفر، منیزیم و منگنز است (Chaney, 1993). اطلاعات جمع‌آوری شده نشان می‌دهد که روی زیاد باعث تنش اکسیداتیو توسط افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و پراکسیداسیون لیپیدی می‌شود (Marschner, 1995). توانایی گیاه برای رشد و بقا در محیط آلوده شده به فلز سنگین که معمولاً مقاومت نامیده می‌شود، می‌تواند از طریق مکانیسم‌های مختلف کسب شود که عبارتند از اجتناب و یا تحمل (Millaleo et al., 2010).
عمده مکانیسم تحمل فلز سنگین، جداسازی آنها توسط ترکیبات آلی، در سلول‌ها و یا اندامک‌هایی است که فعالیت متابولیکی اندکی دارند. واکوئل بزرگترین و مهم‌ترین اندامک در این زمینه است، زیرا واکوئل می‌تواند بسیاری از ترکیبات سمّی را انبار کند (Pittman, 2005). این ترکیبات می‌توانند آسیب به سلول را از طریق شلاته کردن فلز سنگین، انتقال آن به داخل واکوئل و محافظت پروتوپلاسم از یون فلز کاهش دهند (Davis et al., 2001). جداسازی در واکوئل‌ها برای مقاومت به فلز روی در ساقه گیاه تجمع‌دهنده Thlaspi caerulescens گزارش شده است (Lasat et al., 1998). چندین مکانیسم برای توضیح غیر فعال شدن فلز روی در واکوئل بیان شده است که شامل رسوب به عنوان فیتات روی (Qiu et al,. 2008) و اتصال به اسیدهای آلی با وزن مولکولی پایین است (Dou et al., 2008).
برای کاهش سمیّت فلز در گیاهان، سیستم‌های آنتی‌اکسیدان به عنوان مکانیسم تحمل بررسی می‌شوند (Millaleo et al., 2010). سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی شامل آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مانند سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، فنل پراکسیداز (POX)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، گایاکول پراکسیداز (GPX) و مولکول‌های آنتی‌اکسیدان غیر آنزیمی مانند آسکوربات، آلفا توکوفرول، کاروتنوئیدها، فلاونوئیدها و گلوتاتیون هستند (Apel and Hirt, 2004).
گونه‌های مختلف گیاهی واکنش‌های متفاوتی را در واکنش به آلودگی خاک نشان می‌دهند. از آنجا که گیاه ذرت، محصول مهم کشاورزی بوده، در سطح وسیعی کشت می‌شود، هدف از این مطالعه، بررسی اثر سمیّت روی به همراه برخی اسیدهای آلی در گیاه ذرت از طریق بررسی برخی پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمایی به ویژه شاخص‌های رشد و پاسخ‌های آنتی‌اکسیدانی بوده است.
مواد و روش‌ها
این آزمایش در گروه زیست‌شناسی دانشگاه ارومیه در سال 1390 انجام شد. ابتدا بذرهای ذرت به مدت 15 دقیقه در محلول هیپوکلریت 10 درصد سدیم استریل شد. سپس، چندین بار با آب مقطر شستشو داده شد و برای آبگیری، بذرها به مدت 24 ساعت در آب مقطر خیسانده شدند. بذرها برای جوانه‌زنی به پتری‌دیش‌هایی به قطر 15 سانتی‌متر که حاوی دو لایه کاغذ صافی مرطوب بودند، منتقل شدند. پتری‌دیش‌های حاوی بذر به آون با دمای 27 درجه سانتیگراد منتقل شد. پس از 5 روز، دانه‌رُست‌های همسان ذرت درون گلدان‌های پلاستیکی حاوی ماسه قرار داده شد و با محلول هوگلند حاوی غلظت‌های صفر، 400 و 600 میکرومول سولفات روی و همچنین، سیتریک اسید و مالیک اسید 32/0 میکرومولار (Inaba and Takenaka, 2005) به همراه غلظت‌های روی (تیمارها شامل غلظت‌های صفر، 400، 600 میکرومولار روی، 400 میکرومولار روی + سیتریک اسید، 400 میکرومولار روی + مالیک اسید، 600 میکرومولار روی + سیتریک اسید و 600 میکرومولار روی + مالیک اسید) و از هر کدام 6 تکرار تیمار شد. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. دوره تیمار (10 روز) در اتاقک‌های کشت با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و درجه حرارت 27/22 درجه سانتیگراد (روز/شب) انجام شد. سپس، گیاهان برای ارزیابی شاخص‌های مورد نظر برداشت شدند. پس از اندازه‌گیری طول ریشه با یک خط‌کش، 3 تکرار از هر تیمار برای خشک کردن نمونه‌ها برای تعیین وزن خشک ریشه‌ها و اندام هوایی پس از شستشو با آب مقطر در پاکت‌های مجزا قرار داده شد و در آون 80 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت قرار گرفت. وزن خشک با ترازویی با حساسیت 001/0 گرم اندازه گرفته شد. 3 تکرار دیگر از هر تیمار پس از برداشت و جدا کردن اندام هوایی از ریشه‌ها برای انجام آزمایشاتی که نیاز به بافت تازه داشتند در فریزر 80- درجه سانتیگراد قرار داده شد.
اندازه‌گیری میزان پراکسید هیدروژن
میزان پراکسید هیدروژن با روش Jana و Choudhuri (1981) اندازه‌گیری شد. 5/0 گرم بافت برگ در 3 میلی‌لیتر بافر فسفات با اسیدیته 8/6 همگن شد. عصاره حاصل به مدت 25 دقیقه با نیروی g 6000 سانتریفیوژ شد. برای تعیین میزان پراکسید هیدروژن 3 میلی‌لیتر از عصاره حاصله برداشته، روی آن 1 میلی‌لیتر تیتانیوم کلرید 1/0 درصد در سولفوریک اسید 20 درصد (V/V) اضافه شد و محلول فوق به مدت 15 دقیقه با نیروی g 6000 سانتریفیوژ شد. جذب محلول زرد رنگ حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 410 نانومتراندازه‌گیری شد (ضریب خاموشی=mM-1cm-1 28/0).
اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدئید
برای اندازه‌گیری میزان مالون‌دی‌آلدئید به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی از روش Heath و Packer (1968) استفاده شد. یک گرم بافت تر اندام هوایی و ریشه توزین و توسط 5/2 میلی‌لیتر محلول تری‌کلرو‌استیک اسید 10 درصد ساییده شد. سپس، محلول حاصل به مدت 20 دقیقه در داخل سانتریفیوژ با نیروی g 15000 گذاشته شد. پس از عمل سانتریفیوژ، حجم مساوی از عصاره رویی و تیوباربیوتیک اسید 5/0 درصد در تری کلرو استیک اسید 20 درصد به داخل لوله آزمایش منتقل شد و به مدت 30 دقیقه در داخل انکوباتور 96 درجه سانتیگراد قرار داده شد. در پایان، لوله‌ها به مدت 5 دقیقه وارد آب یخ شد و پس از آن، به مدت 5 دقیقه با نیروی g 10000 سانتریفیوژ شد. جذب محلول حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 532 و 600 نانومتر اندازه‌گیری شد (ضریب خاموشی= mM-1 cm-1 155).
سنجش فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز و کاتالاز و گلوتاتیون ردوکتاز
برای استخراج عصاره گیاهی از روش Kang و Saltiveit (2002) با اندکی تغییر استفاده شد. 5/0 گرم از بافت تر ریشه و اندام هوایی به همراه 3 میلی‌لیتر بافر استخراج تریس- کلریدریک اسید 50 میلی‌مولار (اسیدیته 7) محتوی 3 میلی‌مولار MgCl2 و 1 میلی‌مولار EDTA در هاون سرد ساییده شد. بافر استخراج برای آنزیم آسکوربات پراکسیداز محتوی 2/0 میلی‌مولار آسکوربات نیز بود. همگنای حاصل به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 5000 دور سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و کاتالاز استفاده شد.
سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز
سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) با روش Nakano و Asada (1981) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار (اسیدیته 7) محتوی EDTA 1/0 میلی‌مولار، آسکوربات سدیم یک میلی‌مولار، 2/0 میلی‌لیتر H2O2 یک درصد و 1/0 میلی‌لیتر عصاره استخراجی بود. فعالیت APX به صورت کاهش در جذب H2O2 طی یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر محاسبه شد (ضریب خاموشی= mM-1 cm-1 8/2).
سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز
سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) با روش Upadhyaya و همکاران (1985) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار (اسیدیته 7) محتوی یک میلی‌لیتر گایاکول یک درصد، یک میلی‌لیتر H2O2 یک درصد و 1/0 میلی‌لیترعصاره استخراجی بود. فعالیت GPX به صورت افزایش در جذب گایاگول اکسید شده طی یک دقیقه در طول موج 420 نانومتر محاسبه شد (ضریب خاموشی= mM-1 cm-1 6/26).
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) با روش Aebi (1984) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار (اسیدیته 7) محتوی 2/0 میلی‌لیتر H2O2 یک درصد و 3/0 میلی‌لیتر عصاره استخراجی بود. فعالیت آنزیم کاتالاز به صورت کاهشی در جذب طی یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر محاسبه شد (ضریب خاموشی =
mM-1 cm-1 0436/0).
سنجش فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز
سنجش فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز (GR) با روش Foyer و Halliwell (1976) با اندکی تغییر انجام شد. اساس سنجش کاهش جذب نمونه‌ها طی یک دقیقه در طول موج 340 نانومتر به علت اکسیداسیون NADPH بود. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار، کلرید منیزیم 5/2 میلی‌مولار، NADPH 2/0 میلی‌مولار، GSSG 5/0 میلی‌مولار و 3/0 میلی‌لیتر عصاره استخراجی بود (ضریب خاموشی=
1-mM-1 cm 2/6).
تحلیل داده‌ها
میانگین و انحراف استاندارد نمونه‌ها با آنالیز واریانس در نرم‌افزارهای SPSS نسخه 0/16 و Excel محاسبه شد. میزان معنی‌داری تغییرات در گروه تجربی در مقایسه با شاهد بر اساس آنالیز واریانس ANOVA و آزمون‌های توکی و دانکن در سطح 05/0 است.
نتایج
مطالعه علایم ظاهری در گیاهان ذرت شاهد و تیمار شده با روی نشان داد که افزایش غلظت روی باعث نکروزه شدن حاشیه برگ‌ها شده است. نتایج حاصل از تأثیر روی بر طول ریشه، اندام هوایی و وزن خشک در جدول 1 آورده شده است. نتایج حاصل از بررسی‌ها بر طول ریشه و اندام هوایی در گیاهان تیمار دیده نشانگر آن است که با افزایش روی، طول ریشه و اندام هوایی و وزن خشک آن کاهش یافته است. این کاهش رشد و وزن خشک در اندام هوایی در هر دو غلظت 400 و 600 میکرومول و در ریشه تنها در غلظت 600 میکرومول نسبت به شاهد معنی‌دار است، اما با افزودن اسیدهای آلی روند کاهش تعدیل یافته است.
میزان مالون‌دی‌آلدئید به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی با افزایش غلظت روی افزایش پیدا کرد. این افزایش در غلظت غلظت 600 میکرومولار روی به بیشینه رسید، ولی تفاوت معنی‌داری بین غلظت 400 و 600 میکرومولار مشاهده نشد. همچنین، افزودن مالیک اسید و سیتریک اسید باعث کاهش میزان مالون‌دی‌آلدئید هم در اندام هوایی و هم در ریشه نسبت به تیمار روی به تنهایی شد و بیشینه کاهش در تیمار مالیک اسید مشاهده شد. با وجود این، تفاوت معنی‌داری بین اعمال سیتریک اسید و مالیک اسید مشاهده نشد (شکل 1).
نتایج حاصل از بررسی میزان H2O2 نشان داد که با افزایش غلظت روی تولید H2O2 هم در ریشه و هم در اندام هوایی نسبت به شاهد افزایش پیدا کرد و این افزایش فقط در غلظت 600 میکرومول معنی‌دار بود. با افزودن مالیک اسید و سیتریک اسید روند افزایش پراکسید هیدروژن کمتر شد (شکل 2). نتایج حاصل از اندازه‌گیری آنزیم آسکوربات پراکسیداز نشان داد که با افزایش غلظت روی میزان فعالیت این آنزیم هم در اندام هوایی وهم در ریشه افزایش می‌یابد. این افزایش در تمام تیمارها نسبت به شاهد معنی‌دار بود. همچنین، با افزودن مالیک اسید و سیتریک اسید اثر سمّیت روی کاهش پیدا کرد و روند افزایش فعالیت آنزیم کمتر شد (شکل 3).
میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار با روی افزایش یافت و این میزان در غلظت 600 میکرومول در اندام هوایی نسبت به شاهد درخور توجه و معنی‌دار است و در ریشه افزایش فعالیت آنزیم تحت تیمار روی نسبت به شاهد معنی‌دار نیست. همچنین، افزودن مالیک اسید و سیتریک اسید باعث کاهش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز هم در ریشه و هم در اندام هوایی نسبت به اعمال به تنهایی روی شد (شکل 4).
فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز تحت تنش روی در شکل 5 نشان داده شده است. با افزایش غلظت روی میزان فعالیت آنزیم افزایش پیدا کرد و این افزایش هم در اندام هوایی و هم در ریشه نسبت به شاهد معنی‌دار است. افزودن مالیک اسید و سیتریک اسید باعث کاهش فعالیت آنزیم در اندام هوایی و ریشه نسبت به اعمال به تنهایی روی شد. بیشینه کاهش در اعمال سیتریک اسید مشاهده شد.
میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز تحت تیمار Zn در هر دو اندام هوایی و ریشه افزایش یافت و این افزایش فقط در غلظت 600 میکرومول نسبت به شاهد معنی‌دار است. همچنین، اسیدهای آلی مالیک و سیتریک باعث کاهش آثار سمّیت فلز روی و کاهش فعالیت آنزیم GR شدند (شکل 6).
جدول 1- طول و وزن خشک ریشه و اندام هوایی گیاه ذرت تحت تأثیر غلظت‌های مختلف روی و بر همکنش روی با مالیک اسید و سیتریک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار انحراف معیار است. *: وجود اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح P<0.05 است.
|
تیمارها |
طول ریشه |
طول اندام هوایی (cm) |
وزن خشک ریشه |
وزن خشک اندام |
|
|
شاهد (molµ 0) |
38/0±6/22 |
55/1±9/48 |
002/0±102/0 |
004/0±201/0 |
|
|
روی (molµ 400) |
98/0±4/21 |
*87/0±4/39 |
007/0±0086/0 |
*001/0±102/0 |
|
|
روی (mol µ 400) + مالیک اسید |
51/0±7/22 |
27/1±44 |
001/0±095/0 |
*001/0±149/0 |
|
|
روی (molµ 400) + سیتریک اسید |
2/2±5/22 |
3/1±9/43 |
002/0±103/0 |
*002/0±182/0 |
|
|
روی (molµ 600) |
*29/0±2/18 |
*69/0±3/38 |
*004/0±075/0 |
*002/0±085/0 |
|
|
روی (molµ 600) + مالیک اسید |
83/0±3/22 |
*8/0±9/42 |
001/0±094/0 |
*002/0±153/0 |
|
|
روی (molµ 600) + سیتریک اسید |
92/0±8/22 |
*75/0±9/42 |
001/0±103/0 |
*002/0±177/0 |
|
شکل 1- اثر غلظت‌های مختلف روی و بر همکنش آن با مالیک اسید (MA) و سیتریک اسید (CA) بر میزان مالون‌دی‌آلدئید اندام هوایی (A) و ریشه (B). مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 05/0 است.
شکل 2- اثر غلظت‌های مختلف روی و بر همکنش آن با مالیک اسید (MA) و سیتریک اسید (CA) بر میزان H2O2 اندام هوایی (A) و ریشه (B). مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 05/0 است.
شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف روی و بر همکنش آن با مالیک اسید (MA) و سیتریک اسید (CA) بر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز اندام هوایی (A) و ریشه (B). مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 05/0 است.
شکل 4- اثر غلظت های مختلف روی و بر همکنش آن با مالیک اسید (MA) و سیتریک اسید (CA) بر میزان فعالیت کاتالاز اندام هوایی (A) و ریشه (B). مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 05/0 است.
شکل 5- غلظت‌های مختلف روی و بر همکنش آن با مالیک اسید (MA) و سیتریک اسید (CA) بر میزان فعالیت گایاکول پراکسیداز اندام هوایی (A) و ریشه (B). مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 05/0 است.
شکل 6- اثر غلظت‌های مختلف روی و بر همکنش آن با مالیک اسید (MA) و سیتریک اسید (CA) بر میزان فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز اندام هوایی (A) و ریشه (B). مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن در سطح 05/0 است.
بحث
علیرغم نقش بسیار مهم روی در ساختار و راه‌اندازی بسیاری از فرآیندهای متابولیکی گیاه، مقدار بالای این فلز در گیاه باعث بروز برخی علایم ناشی از تنش و عدم رشد طبیعی گیاهان می‌شود. در این تحقیق، مقدار بالای روی باعث کاهش رشد طولی و وزن خشک ریشه و اندام هوایی شد. برخی از پژوهشگران معتقدند که مهار رشد گیاهان در اثر غلظت‌های بالای فلز روی ممکن است به علت رقابت این فلز با فسفر در گیاه باشد (Rout and Das, 2003). تجمع بالای فلز روی در سیتوزول سلول‌های گیاهی در اثر غلظت بالای روی در گیاه نیز از طریق اختلال در عملکرد طبیعی سلول‌ها و مهار فرآیند تنفس و واکنش‌های انرژی‌خواه مرتبط با رشد سلول می‌تواند باعث کاهش رشد و نمو ایده‌آل گیاهان شود (Candan and Tarhan, 2003).
یکی ازاختلالات ناشی از القای تنش اکسیداتیو در گیاهان، اثر بر لیپیدهای غشایی و تغییر وضعیت تمامیت غشاهای سلولی است. رادیکال‌های آزاد اکسیژن با اثر بر پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیراشباع در غشا، واکنش‌های زنجیره‌ای پراکسیداسیون را تحریک و به تخریب اسیدهای چرب منجر می‌شوند (Savoure et al., 1999). مقدار مالون‌دی‌آلدئید (MAD) که در شرایط تنش در بافت‌ها به وجود می‌آید به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدها شناخته شده است. نتایج آزمایش حاضر نشان داد که با افزایش غلظت روی میزان مالون‌دی‌آلدئید در گیاه افزایش پیدا می‌کند. برخی مطالعات هم نشان داده‌اند که میزان بالای روی باعث افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدی می‌شود (Wang et al., 2009). پاسخ مشابه در گیاهان تیمار شده با دیگر فلزات سنگین نیز مشاهده شده است (Nakano and Asada, 1981).
پراکسید هیدروژن در بسیاری از تنش‌های محیطی در گیاهان تولید می‌شود. افزایش در ROSهایی مانند OH-، O2- و H2O2 که به ایجاد تنش اکسیداتیو منجر می‌شوند، تحت تنش فلزات سنگین مشاهده شده است. در این پژوهش، محتوای H2O2 در گیاهان تیمار شده با روی افزایش یافت. به طور مشابه، افزایش در محتوای H2O2 در Vigna mungo گزاش شده است (Gupta et al., 2011). همچنین، مشابه با نتایج این تحقیق، افزایش در میزان MDA و H2O2 در غلظت‌های بالای روی در نیشکر گزارش شده است (Jain et al., 2010). سمّیت روی باعث القای تنش اکسیداتیو از طریق تولید رادیکال‌های آزاد و گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) می‌شود (Weckx and Clijsters, 1997). مقدار بالای ROS در شرایط تنش شدید ایجاد می‌شود و تولید زیاد این ROSها مانند سوپر اکسید، H2O2 و OH- در گیاهان تحت تنش فلز ایجاد می‌شود (Galligo et al., 1999). آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در سلول‌های گیاهی ممکن است H2O2 را به H2O تبدیل کنند و اثر سمّیت H2O2 را خنثی کنند (Rezai and Farboodnia, 2008). در گیاهان تعدادی از آنزیم‌ها مقادیر H2O2 درون سلولی را تنظیم می‌کنند، اما به نظر می‌رسد آنزیم‌های CAT، APX و GPX اهمیت بیشتری دارند (McKersie and Leshem, 1994). آنزیم آسکوربات پراکسیداز مهم‌ترین پراکسیداز در رفع سمّیت H2O2 هم در سیتوزول و هم در کلروپلاست‌هاست (Mittova et al., 2000). نتایج حاصل نشان می‌دهد که افزایش سطوح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی القا شده توسط روی ممکن است به عنوان مکانیسم دفاعی ثانویه در قبال تنش اکسیداتیو باشد. همچنین، نتایج آزمایش نشان داد که در حضور مالیک اسید و سیتریک اسید آثار سمّیت فلز روی کمتر شد و این نتایج ممکن است به علت تغییر ساختمان شیمیایی فلز و تغییر از حالت با سمّیت زیاد به شکلی که سمّیت کمتری در گیاه دارد، باشد. عمده مکانیسم تحمل فلز سنگین، جداسازی آنها توسط ترکیبات آلی در سلول‌ها و یا اندامک‌هایی با فعالیت متابولیکی کمتر است. واکوئل به عنوان بزرگترین و مهم‌ترین اندامک در این زمینه است، زیرا واکوئل می‌تواند بسیاری از ترکیبات سمّی را انبار نماید (Pittman, 2005). این ترکیبات می‌توانند آسیب به سلول را از طریق شلاته کردن فلز سنگین، انتقال آن به داخل واکوئل و محافظت پروتوپلاسم از یون فلز، کاهش دهند (Davis et al., 2001). نقش کلیدی مشابه اخیراً برای اگزالیک اسید در جداسازی منگنز داخل سلول توسط شلاته کردن منگنز مازاد در واکوئل‌های گیاهان تجمع‌دهنده منگنز نشان داده شده است (Dou et al., 2008). اسیدهای کربوکسیلیکی مانند سیتریک اسید و مالیک اسید دارای خاصیت باند شدن با فلزات سنگین هستند و می‌توانند نقش اساسی در تحمل و سمّیت‌زدایی فلزات سنگین داشته باشند (Clemens, 2001). سیتریک اسید می‌تواند در بیان پروتئین‌های مخصوص و یا آنزیم‌های مرتبط با دفاع آنتی‌اکسیدانی نقش داشته باشد (Gao et al., 2012). Mora و همکاران (2009) گزارش کرده‌اند که تراوش اگزالات و سیترات توسط ریشه می‌تواند منگنز فراهم در ریزوسفر را کاهش داده، تحمل به این فلز را در گیاه تلخه (ryegrass) افزایش دهد.
به طور کلی، می‌توان بیان نمود که افزایش غلظت روی باعث بیشتر شدن سمّیت در گیاه ذرت شده که این افزایش در ارتباط با القا تنش‌های اکسیداتیو توسط فلز روی در گیاه ذرت بود. احتمال داده می‌شود به کار بردن اسیدهای آلی مانند سیتریک اسید و مالیک اسید باعث کاهش سمّیت ناشی از فلز روی با جداسازی این فلز از پروتوپلاسم و انتقال به صورت شلاته شده به داخل واکوئل، در ذرت با افزایش رشد گیاه و کاهش پراکسیداسیون غشا همراه باشد. احتمالاً این اسیدهای آلی از طریق پیوند یافتن با فلز سنگین مانع حضور مقادیر زیاد این فلز در سیتوزول شده، از این طریق از آسیب‌رسانی این فلز در غلظت بالا به مولکول‌های زیستی این بخش جلوگیری نموده است. در نتیجه، با کاهش فلز در بخش سیتوزولی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در گیاهان تیمار دیده نیز در سطح گیاهان شاهد باقی مانده است.
)
