Authors
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Urmia, Urmia, Iran
2 Artemia and Aquatic Animals Research Institute, University of Urmia, Urmia, Iran
3 Department of Plant Science, College of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran
Abstract
Keywords
جلبکها گروه بزرگی از موجودات هستند که از جنبههای اقتصادی و بومشناختی اهمیّت زیادی دارند. از نظر بومشناختی، جلبکها در پایه هرم انرژی بومنظامهای عظیم آبی بوده، به عنوان تولید کنندگان اصلی زنجیره غذایی، تثبیت کنندگان ازت و ایجاد بومنظام ویژه و تأمین غذای آبزیان اهمیّت دارند (Volkman et al., 1989). از لحاظ اقتصادی این جلبکها در تهیه علوفه، کود و تولید بسیاری از پلیساکاریدهای با ارزش مانند آگار، کاراژینان (carrageenans) و آلژیناتها (alginates) حایز اهمیّت بوده، مصرف مستقیم این گیاهان و فیکوکلوئیدهای قابل استخراج از آنها در حال گسترش است (Chapman and Chapman, 1980).
جلبکهای تکسلولی منبع تولید بسیاری از مواد غذایی مختلف هستند (Goldberg, 1996). هم اکنون انواع مختلفی از گونهها و جنسهای مختلف از جلبکهای تکسلولی در دنیا به شکل انبوه در مخازن پلی اتیلنی، استخرهای بتونی و خاکی به شکل کاملاً خالص و تجاری کشت داده میشوند (Lavens and Sorgeloos, 1996). بررسی تنوع گونهای جلبکهای بومی منطقه و بررسی ارزش غذایی و اهمیّت آنها از مهمترین پژوهشهای بنیادی در ابتدای راه تجاریسازی و صنعتی کردن پرورش جلبکها است. بر اساس مطالعات انجام شده منابع آبهای داخلی منبع بسیار مهم و سرشاری از انواع جلبکهای تکسلولی هستند Shariati and Hadi, 2000)؛ Hadi et al,. 2008؛ (Asal Pishe et al., 2012 شناسایی گونه و جنسهای این جلبکها نخستین گام در کاربردی نمودن استفاده از جلبکها و کشت آنهاست و با شناسایی و بررسی فیزیولوژیک آنها میتوان سیستمهای کشت، محیطهای کشت و ارزش غذایی آنها را بررسی و گونهها و جنسهای بومی مفید برای آبزی پروری را به شکل خالص جداسازی کرد.
Dunaliella از جلبکهای تک سلولی مهم متعلق به رده Chlorophyceae و دارای 29 گونه است. گونههای این جنس به دلیل توانایی تولید گلیسیرول قادر به زندگی در شوریهای بسیار بالا بوده، مقادیر بالای انواع کارتنوئید به ویژه بتاکاروتن را نیز در خود جمع میکند Borowitzka and Siva, 2007)؛ Hadi et al., 2008؛ (Abusara et al., 2011 (جدول 1).
D. salina یکی از گونههای مهم تولید کننده بتاکاروتن شناخته شده است Nikookar et al., 2004)؛ Fazeli et al., 2006؛ Borowitzka and Siva, 2007؛ Hadi et al., 2008). بتاکاروتن رنگیزهای زردرنگ در فرآوردههای غذایی و غذاهای رژیمی است و به دلیل دارا بودن خواص ضدسرطانی و آنتیاکسیدانی در صنایع دارویی کاربرد فراوانی یافته و در سالهای اخیر کشت این جلبک برای تولید کارتنوئیدها افزایش یافته است Hosseini and Shariati, 2006)؛ Raja et al., 2007a؛ (Jayappriyan et al., 2010.
جدول 1- ردهبندی و جایگاه جنس Dunaliella (Borowitzka and Siva, 2007).
|
ردهبندی Dunaliella |
|
|
دامنه |
Eukaryota |
|
سلسله |
Plantae |
|
زیرسلسله |
Viridaeplantae |
|
شاخه |
Chlorophyta |
|
رده |
Chlorophyceae |
|
راسته |
Dunaliellales |
|
خانواده |
Dunaniellaceae |
|
جنس |
Dunaliella |
دریاچه ارومیه بزرگترین پهنه آبی در شمالغربی ایران، بین دو استان آذربایجان غربی و آذربایجان شرقی در مختصات جغرافیایی 37 درجه تا 5/38 درجه عرض شمالی و 45 تا 46 درجه طول شرقی واقع شده است. سطح آن نسبت به سطح آب دریاهای آزاد 1300 متر بالاتر است. این دریاچه بیستمین دریاچه بزرگ دنیا و دومین دریاچه شور پس از بحرالمیت محسوب میشود. میانگین مساحت آن 5000 کیلومتر مربع برآورد شده است. حدود 20 رودخانه دایمی و فصلی و همچنین تعدادی از جریانهای زیرسطحی و فصلی، دریاچه ارومیه را تغذیه میکنند (Manaffar, 2012). این دریاچه به عنوان یکی از تالابهای بینالمللی در کنوانسیون رامسر و همچنین، به عنوان ذخیرهگاه زیستکره یونسکو به ثبت رسیده است (Birkett and Mason, 1995).
در سالهای اخیر به علتی بحران خشکسالی منطقهای، دریاچه ارومیه نیز دستخوش خشکسالی گستردهای شده است. بستر خشک حاصل از پسروی شدید دریاچه (بیش از 3000 کیلومتر مربع) به ویژه در نواحی جنوبی دریاچه ارومیه شاهد این ادعا است. تاکنون حدود 4 متر از میانگین سطح آب دریاچه در سالهای 1375-1378 که سالهای پُر آبی دریاچه ارومیه بوده است، کاهش یافته است. میانگین شوری آب دریاچه که در سالهای پُر آبی در حدود 150 گرم در لیتر بود، هم اکنون به بیش از 300 گرم در لیتر (حالت اشباع) رسیده است (Rad et al., 2011).
به علت افزایش دما و شوری آب، جمعیت Artemia (تنها جانور دریاچه ارومیه) به شدت کاهش یافته است (Manaffar, 2012). در حقیقت، بخشی از کاهش جمعیت Artemia به علت کاهش شدید جمعیت جلبک تکسلولی Dunaliella در دریاچه است (Rad et al., 2011). شوری بالا همچنین، باعث ایجاد تنش و تولید بتاکارتن در این جلبک میشود. حتی در برخی مواقع نیز تجمع این جلبک در داخل دریاچه باعث ایجاد رنگ قرمز در برخی نواحی دریاچه شده است (Rad et al., 2011). پژوهشهای انجام شده پیش از بحران خشکسالی در دریاچه ارومیه نشان داده است که گونههای مختلفی از جنسهای متفاوت جلبکهای تکسلولی در دریاچه ارومیه وجود داشته است. جنسهای گوناگون از رده Chlorophyceae نظیر Dunaliella، Diatoms و Cyanophyceae گزارش شده است. البته جنس Dunaliella فیتوپلانکتون چیره در دریاچه ارومیه است
Sorgeloos, 1997)؛ (Manaffar, 2013.
هدف از اجرای این پژوهش، بررسی، شناسایی و کشت خالص گونههای مختلف جلبک تکسلولی Dunaliella از دریاچه ارومیه و به ویژه بررسی تنوع این جلبک در دریاچه ارومیه پس از بحران چندین ساله خشکسالی است. بدین منظور گونههای مختلف این جنس از لحاظ ریختشناسی و مولکولی شناسایی و پس از جداسازی روی محیطکشت جامد به شکل انبوه در سیستم پرورش بسته کشت داده شدند.
مواد و روشها
نمونهبرداری
نمونهبرداری از آب دریاچه ارومیه طی دو فصل بهار و تابستان سال 1390 از پنج نقطه مختلف ساحلی دریاچه ارومیه در ساعات میانی روز که تابش نور خورشید بیشینه است، انجام شد. بدین منظور در هر ایستگاه از کل ستون آب، 10 لیتر از آب توسط ظروف پلی اتیلنی برداشت شد. میزان شوری آب توسط دستگاه شوریسنج (Refractometer model ATAGO) و اسیدیته توسط دستگاه pHمتر (model HANA) در محل نمونهبرداری تعیین شد. نمونههای آب بلافاصله به آزمایشگاه جلبکشناسی پژوهشکده آرتمیا و جانوران آبزی دانشگاه ارومیه انتقال داده شد. مختصات جغرافیایی محلهای نمونهبرداری در شکل 1 مشخص شده است.
شکل 1- عکس هوایی دریاچه ارومیه و محلهای نمونهبرداری. 1: ابتدای جاده شهید کلانتری در سمت جنوب، 2: انتهای جاده شهید کلانتری در سمت جنوب، 3: گمیچیلر، 4: انتهای جاده شهید کلانتری در سمت شمال، 5: ابتدای جاده شهید کلانتری در سمت شمال.
کشت و جداسازی
نمونههای آبی هر ایستگاه، پس از جدا کردن ناخالصیها توسط فیلتر 100 میکرونی معمولی، در دو شوری 30 و 100 گرم در لیتر در ارلنهای 250 میلیلیتری در محیطکشت ویژه جلبکهای تکسلولی (walne)، تحت جریان ملایم هوادهی و نور فلورسنت کشت داده شد Mishra et al., 2008)؛ Jayappriyan et al., 2010). جداسازی جنس Dunaliella با روش مستقیم زیر میکروسکوپ معمولی (invert) و همچنین با کشت سریالی روی محیطکشت جامد انجام شد Mishra et al., 2008)؛ (Jayappriyan et al., 2010. بدین منظور نخست کوشش شد با استفاده از پیپت پاستور و با درشتنمایی 40 میکروسکوپ معمولی، تعدادی از سلولهای جلبک Dunaliella جدا شود. پس از آن، برای جداسازی کامل این جنس از دیگر جلبکهای تکسلولی، استوک حاصل از مرحله پیش روی محیطکشت جامد (محیطکشت walne با شوری 30 و 100 گرم در لیتر در آگاروز یک درصد) منتقل شد. پلیتهای آماده شده به انکوباتور با دمای 23 درجه سانتیگراد و در معرض نور ممتد فلورسنت با شدت µmolm₋2s₋1 50 انتقال داده شدند. کشت تککلونی روی محیط کشت آگار (کشت سریالی) حدود 5 بار تکرار شد تا ضمن خلوص بیشتر آلودگی باکتریایی نیز از محیطکشت حذف شود. کلونیهای منفرد ایجاد شده با پیپت پاستور برداشت شده، پس از اطمینان از خلوص آنها توسط میکروسکوپ نوری، به شکل مجزا در لولههای آزمایش حاوی 20 میلیلیتر محیطکشت walne کشت داده شد. سپس، نمونههای خالصسازی شده به منظور افزایش حجم به ارلنهای 250 میلیلیتری با محیطکشت walne انتقال داده شدند. در صورت وجود هر گونه ناخالصی جلبکی، مراحل یاد شده در بالا تکرار شد.
تفاوتهای ریختشناختی ابتدایی شامل رنگ کلونی، رنگ بیوماس در محیطکشت مایع، ریختشناختی جلبک و سایر عوامل فیزیولوژیک نظیر سرعت رشد در دو شوری متفاوت به عنوان شاخصهای مهم ابتدایی برای جداسازی کلونیها در نظر گرفته شد. برای شناسایی نخستین نمونههای خالص از ویژگیهای ریختشناختی و فیزیولوژیک شامل اندازه و شکل سلول و شکل کلروپلاست استفاده شد (Borowitzka and Siva, 2007). با توجه به شباهتهای ریختشناختی گونههای مختلف جنس Dunaliella و تغییر ریختشناسی و رفتار فیزیولوژیک این گونه تحت شرایط رشدی متفاوت، شناسایی دقیق گونهها با روشهای ریختشناختی معمول امکانپذیر نیست بلکه صرفاً با روشهای مولکولی امکانپذیر است Olmos et al., 2000)؛ (Tempesta et al., 2010.
بررسی مولکولی
روش استخراج DNA و شرایط PCR
استخراج DNA از سوسپانسیون سلولی کلونیهای جداسازی شده و خالص با روش CTAB (Hexa decyltrimethylammonium bromide) انجام شد Sambrook et al., 1989)؛ (Ausubel et al., 1995. برای شناسایی مولکولی گونههای Dunaliella از ژن 18srDNA استفاده شد (Olmos et al., 2000؛(Jayappriyan et al., 2010. برای تکثیر ناحیه 18srDNA، از جفت آغازگر MA1 و MA2 با توالی 5'-cgg gat ccg tag tca tat gct tgt ctc-3' و
5'-cgg aat tcc ttc tgc agg ttc acc-3' استفاده شد (Olmos et al., 2000). برنامه PCR شامل دمای تفکیک کننده ابتدایی 95 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، 33 چرخه شامل دمای واسرشت کننده 95 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، دمای اتصال 52 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، دمای گسترش 72 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه و 20 ثانیه و در نهایت، دمای گسترش نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه بود. محصول PCR روی ژل الکتروفورز 5/1 درصد بررسی شد (Olmos et al., 2000).
برش آنزیمی
محصول PCR با آنزیم اندونوکلئاز TaqI بریده شد. بدین منظور بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده اقدام شد و محصول برش آنزیمی روی ژل آگاروز 7/1 درصد بررسی شد.
نتایج
شاخصهای فیزیکوشیمیایی محل نمونهبرداری
نتایج بررسی برخی از شاخصهای فیزیکوشیمیایی نمونه آبی محل نمونهبرداری در جدول 2 مشخص شده است.
نتایج نشان داد که علاوه بر افزایش تدریجی شوری آب در تابستان، اسیدیته نیز به طور تدریجی کاهش یافته است. همچنین، رنگ آب نیز در تابستان در همه ایستگاهها قرمز بوده، کف دریاچه نیز در تمام ایستگاهها پوشیده از کریستال نمک بوده است. نتایج بررسیهای نخستین نشان داد که تنوع گونهای در فصل بهار بیش از فصل تابستان و همچنین، در ایستگاه شماره سه بیش از دیگر ایستگاهها بود. بررسی دقیق با استفاده از میکروسکوپ نوری و پرورش در محیطکشت جامد، تفاوتهای ریختشناختی و فیزیولوژیک مختلفی (سرعت رشد متفاوت و رنگ کلونی) بین کلونیهای خالصسازی شده از ایستگاههای مختلف مشاهده شد که برای بررسی دقیقتر گونههای احتمالی به شکل مجزا با روش مولکولی بررسی شد.
محصول PCR
انجام PCR اختصاصی ناحیه ژنومی 18srDNA به وسیله جفت آغازگرهای MA1 و MA2 باندهایی با وزنهای مولکولی 2170، 2570، 1170 و 2570 جفت نوکلئوتید برای نمونههای جداسازی شده (شکل 2) را تولید کرد که به ترتیب با اعداد 1 تا 4 در شکل 3 مشخص شدهاند. نتایج PCR نمونههای جلبکی نشاندهنده وجود تنوع گونهای است.
بررسی نتایج برش آنزیمی انجام شده توسط آنزیم Taq1 نشاندهنده کمینه چهار الگوی مختلف برش است. این برش آنزیمی در تأیید بررسی ریختشناختی و بررسی وزن محصول PCR نشاندهنده همان تنوع چهارگانه مشاهده شده در نمونههای جلبکی مطالعه شده است (شکل 4).
جدول 2- شاخصهای فیزیکوشیمیایی آب ناحیه بررسی شده
|
عمق آب cm |
کف دریاچه |
رنگ آب |
اسیدیته |
شوری g/l |
ایستگاه |
فصل نمونهبرداری |
|
40 |
رسوبات |
روشن |
2/7 |
324 |
1 |
بهار خردادماه 90 |
|
65 |
رسوبات |
روشن |
3/7 |
340 |
2 |
|
|
30 |
کریستال نمک |
روشن |
28/7 |
322 |
3 |
|
|
50 |
رسوبات |
روشن |
26/7 |
324 |
4 |
|
|
30 |
رسوبات |
قرمز |
2/7 |
328 |
5 |
|
|
22 |
کریستال نمک |
قرمز |
95/6 |
380 |
1 |
تابستان شهریورماه 90 |
|
20 |
کریستال نمک |
قرمز |
87/6 |
320 |
2 |
|
|
10 |
کریستال نمک |
قرمز |
76/6 |
360 |
3 |
|
|
30 |
کریستال نمک |
قرمز |
89/6 |
300 |
4 |
|
|
35 |
کریستال نمک |
قرمز |
86/6 |
380 |
5 |
|
شکل 2- تصویر میکروسکوپ نوری از جنس Dunaliella خالص شده از پنج ایستگاه مطالعه شده دریاچه ارومیه. بررسی دقیق توسط میکروسکوپ نوری بر تفاوتهای ریختشناختی و احتمال متفاوت بودن این چهار گونه تأیید دارد. (1 D. salina، (2 D. bardawil، |
|
|
شکل 3- محصول PCR حاصل از نمونههای جلبک خالص شده از دریاچه ارومیه. تنها الگوهای جدید نشان داده شده است. اعداد 1 تا 4 با نمونههای ارایه شده در شکل 2 مطابقت دارد. |
شکل 4- برش آنزیمی محصول PCR جلبکهای خالص شده از دریاچه ارومیه. اعداد اشاره شده با نمونههای شکلهای 2 و 3 مطابقت دارند. |
بحث
بررسی و شناسایی فلور جلبکی آبهای هر منطقه از اهداف مهم پژوهشی در اغلب کشورهای جهان است. در سالهای اخیر پژوهشهای محدودی در کشور ایران روی فلور تالابها و جلبکهای آبهای شیرین و لب شور انجام شده است. از جمله پژوهشهای اخیر انجام شده، بررسی و شناسایی تراکم و پراکنش فیتوپلانکتونهای دریاچه سد لار است که در آن، طی شش مرحله نمونهبرداری 14 جنس از شاخه جلبکهای Diatoms، 1 جنس از شاخه Euglenophyceae، 7 جنس از شاخه جلبکهای سبز، 3 جنس از شاخه جلبکهای Pyrrophyta، 1 جنس از شاخه جلبکهای Chlorophyceae و 2 جنس از شاخه جلبکهای سبز آبی را شناسایی کند (Salavatian et al., 2010). طی نمونهبرداریهایی که از باتلاق شور گاوخونی انجام شد، سه گونه مختلف از جنس Dunaliella بر اساس تفاوتهای ریختشناسی و فیزیولوژیک خالصسازی شد و با روشهای مولکولی گونههای D. parva،
D. pseudosalina و D. salina شناسایی شدند (Shariati and Hadi, 2000). همچنین، Orlova و همکارانش 357 گونه از ریز جلبکهای دریایی را طی سالهای 1991 تا 2006 در دریای Amursky Bay واقع در کشور روسیه شناسایی کردند (Orlova et al., 2009).
پژوهشهای انجام شده روی گونههای مختلف جنس Dunaliella نشان داده است که تعدادی از گونههای این جنس میتوانند در شوریهای بالا به خوبی رشد کنند و حتی توانایی تولید مقادیر بالایی از بتاکارتن را دارند (Rad et al., 2011). این بررسیها همچنین نشان داده است که حتی برخی گونهها از جمله D. salina در تولید بتاکاروتن نسبت به دیگر گونهها توانایی بیشتری دارند Garcia et al., 2007)؛Hadi et al., 2008).
دریاچه ارومیه به عنوان دریاچه الیگوتروف (Manaffar, 2012) با میزان تولید اولیه پایین (بیوماس جلبکی) دارای تنوع و مقدار کمتری از جلبکهای تکسلولی نسبت به آبهای اقیانوسها و آبهای شیرین است. تنوع جنسها بسته به میزان شوری آب متفاوت است. در بررسیهایی که در سال 1373 روی دریاچه ارومیه انجام شد، حدود 12 جنس فیتوپلانکتون شناسایی شد که شامل 6 جنس از Cyanophyceae، 4 جنس از Chlorophyceae و 2 جنس از Bacillariophyceae بود (Manaffar, 2013). در بررسی دقیقتر در سال 1375، در 18 ایستگاه از دریاچه ارومیه، 6 جنس از سه رده Chlorophyceae، Bacillariophyceae و Cyanophyceae شناسایی شد که از نظر تنوع، جنسهای مختلف رده Bacillariophyceae با 4 جنس بیشترین و ردههای Chlorophyceae و Cyanophyceae هر کدام با یک جنس کمترین تنوع را نشان دادند. البته در بین فیتوپلانکتونها، جنس Dunaliella به طور غالب (80 درصد) در 18 ایستگاه مشاهد شد (Manaffar, 2013). در تحقیقات پژوهشگران بلژیکی در سال 1997 روی 18 ایستگاه از دریاچه ارومیه، مشخص شد که جنس Dunaliella، جلبک سبز تکسلولی غالب در این محلها بوده، به طوری که غلظت آن 10 برابر گونههای دیگر بود (Sorgeloos, 1997).
شایان ذکر است که شناسایی میکروارگانیسمها به ویژه جلبکهای تکسلولی توسط ویژگیهای ریختشناختی و فیزیولوژیکی از دقت کافی برخوردار نیست، اما توسعه ابزارهای بیوتکنولوژیک پیشرفته مانند PCR امکان شناسایی دقیق میکروارگانیسمها را فراهم کرده است (Olmos et al., 2000).
پیش از این، روشهای مولکولی برای شناسایی گونههای مختلف جلبکهای تکسلولی ثابت شده بود (Asal Pishe et al., 2012). در پژوهش حاضر، شناسایی مولکولی نمونههای خالص شده توسط توالی ناحیه 18srDNA انجام شد که پیش از این توالی با موفقیت برای شناسایی چندین گونه از جنس Dunaliella استفاده شده بود Olmos et al., 2000)؛ Raja et al., 2007b؛ Hejazi et al., 2010؛ (Jayappriyan et al., 2010. پیش از این، کاربرد پرایمرهای استفاده شده در این پژوهش برای شناسایی جلبک Dunaliella موفقیتآمیز بوده است (Olmos et al., 2000؛ Raja et al., 2007b؛ Hejazi et al., 2010؛ Jayappriyan et al., 2010). بدین ترتیب باندهایی که به D. tertiolecta، D. salina، D. parva و D. bardawil مربوط بودند به ترتیب با وزنهای 1770، 2170، 2570 و 2570 جفت باز تشخیص داده شدند. پژوهشهای Hejazi و همکاران (2010) نشان داد که برش آنزیمی با آنزیم Taq1 قادر است محصول PCR تولید شده را به حداقل چهار قطعه کوچکتر در D. salina برش دهد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که دست کم چهار گونه (یا سویه) مختلف از جلبک تکسلولی Dunaliella با وزنهای مولکولی بین 1500 تا 2500 کیلوباز که به ژن 18srDNA مربوط میشود، وجود دارد. نتایج حاصل از برش آنزیمی نیز حداقل چهار الگوی مختلف برش را نشان میدهد (شکلهای 3 و 4).
شایان ذکر است با توجه به وجود گونهها و سویههای مختلف از جنس Dunaliella و مشخص نبودن اندازه دقیق باند، تعداد زیادی از جمعیتهای این جنس، شناسایی دقیق یا احتمالی گونههای یافت شده در پژوهش حاضر با توزین باند تولید شده غیر علمی بوده، نیازمند تعیین توالی و مطالعات تکمیلی است. نتایج بررسیهای بومشناختی نشان داد که تنوع جلبکی در این ایستگاهها به شدت تابع شرایط بومشناختی منطقه است، به طوری که تنوع جلبکهای جداسازی شده در فصل بهار بیشتر از تنوع جلبکی در فصل تابستان بود. این کاهش میتواند به دلیل افزایش دما و در نتیجه افزایش شوری و تشدید خشکسالی در این فصل باشد. همچنین، نتایج بررسیهای ریختشناختی و فیزیولوژیک جلبکهای خالصسازی شده و کشت شده در دو شوری 30 و 100 گرم در لیتر نشان داد که تنوع جلبکی در ایستگاه 3 بیشتر بود و بررسیهای مولکولی نیز آن را تأیید کرد. در هر حال، پژوهش حاضر نشان داد که تنوع زیادی از گونههای Dunaliella در ایستگاههای دریاچه ارومیه وجود دارد که در ادامه این پژوهش به شکل جامع در تمامی نقاط دریاچه با استفاده از تعیین توالی در حال اجراست.
سپاسگزاری
این مطالعه با حمایت مالی و تجهیزات پژوهشکده آرتمیا و جانوران آبزی دانشگاه ارومیه انجام شد. از کارشناسان این پژوهشکده که در اجرای این پروژه نقش داشتهاند، قدردانی و سپاسگزاری میشود.
)
