Authors
Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
Abstract
Keywords
یونجه با دارا بودن ساختار ژنتیکی اتوتتراپلوئیدی (32=x4=n2) و دگرگشنی، تنوع بالایی از نظر ویژگیهای ریختشناختی و زراعی دارد که این تنوع بالا، شناسایی رقمهای مختلف بر اساس ویژگیهای زراعی و ریختشناختی را مشکل میکند (Morales Corts and Crespo Martines, 2000). پیشرفتهای حاصل از برنامههای اصلاحی در یونجه به علت پیچیدگی ساختار ژنتیکی آن نسبت به گیاهان دیگر چندان چشمگیر نبوده است (Mengoni et al., 2000)، به طوری که اصلاح گونههایی نظیر ذرت در چند دهه اخیر به افزایش عملکرد در حدود 2 درصد در سال منجر شده، در حالی که افزایش عملکرد در گیاهان علوفهای به ویژه لگومها در حدود 3/0 درصد در سال بوده است (Brummer, 1999). با توجه به جایگاه یونجه در بین گیاهان زراعی، چنین بررسیهایی به ویژه در ایران که به عنوان یکی از نخستین زیستگاههای یونجه معرفی شده است و تودههای محلی متنوعی دارد، حایز اهمیّت است. از صفات ریختشناختی به طور وسیع برای تعیین میزان تنوع ژنتیک در یونجه استفاده شده است. Monirifar و همکاران (2004) 28 توده بومی و دو رقم اصلاح شده یونجه را با استفاده از 9 صفت ریختشناختی بررسی و برای بیشتر صفات تنوع معنیداری گزارش کردند. Fareghi و همکاران (2007) جمعیتهای یونجه را از نظر عناصر غذایی و ترکیبات شیمیایی مطالعه کردند. تجزیه به مؤلفههای اصلی بر اساس عناصر و ترکیبات شیمیایی نشان داد که درصد پروتئین خام و درصد کلسیم تنوع بیشتری در بین صفات دارند. Davodi و همکاران (2011) با بررسی 200 بوته یونجه از نظر عملکرد علوفه و صفات مربوط به کیفیّت علوفه، بیان کردند که گزینش بر اساس صفات مربوط به کیفیّت علوفه میتواند در افزایش عملکرد علوفه مفید باشد. یکی از مسایلی که در اصلاح نباتات به آن توجه میشود، نقش، اهمیّت و کارآیی هر یک از صفات ریختشناختی و مولکولی در تعیین سطح تنوع ژنتیکی و برآورد روابط بین افراد، ژنوتیپها و جمعیتهاست. در رابطه با این که آیا دادههای حاصل از ارزیابیهای ریختشناختی و مولکولی از نظر توارثی منبع اطلاعاتی بهتر و مناسبتری در این زمینه است، اختلاف نظر وجود دارد. برخی معتقدند که تعیین تنوع تنها بر اساس اطلاعات ریختشناختی گمراه کننده و فاقد اطلاعات کافی برای برآورد روابط بین ژنوتیپها و یا جمعیتها برای استفاده در مطالعات کاربردی است و برخی دیگر نیز بر این باورند که نشانگرهای مولکولی بیشتر تنوع افراد را از نظر بخش غیره رمز کننده ژنوم مشخص میکنند (Beyene et al., 2005). با وجود این، باید در نظر داشت که روشهای مولکولی و ریختشناختی هر کدام دارای مزایا و معایب خاص خود هستند (Mohammadi and Prasanna, 2003). از سوی دیگر، پی بردن به ارتباط بین دادههای مولکولی و ریختشناختی میتواند در کارهای اصلاحی اهمیّت داشته باشد، زیرا بیشتر صفات ریختشناختی به صورت چند ژنی کنترل میشوند، در حالی که تفاوت اساسی صفات کمّی با کیفی در تعداد ژنهای مؤثر بر گوناکونی فنوتیپ و در میزان تغییرپذیری فنوتیپ در پاسخ به عوامل محیطی نهفته است. چنان که عنوان شد معمولاً صفات ریختشناختی توسط تعداد زیادی ژن تنظیم میشود و سهم هر ژن در فنوتیپ به اندازهای کم است که نمیتوان آن را با روشهای مندلی تشخیص داد (Stansfileld, 1991). علاوه بر این، اطلاعات ژنتیکی حاصل از صفات ریختشناختی اغلب محدود هستند که این موضوع استفاده از آنها را در بررسی جوامع گیاهی با محدودیتهایی همراه کرده است. پژوهشگران برای رفع این نواقص از نشانگرهای مولکولی استفاده میکنند. بیشتر نشانگرهای DNA در تمام بافتها بدون توجه به رشد، تکوین و وضعیت سلول ثابت هستند و تحت تأثیر محیط، آثار پلیوتروپیک و آثار اپیستازی نیستند (Agarwal et al., 2008). Habibi و همکاران (2012) با استفاده از نشانگرهای ISSR، 18 ژنوتیپ یونجه را مطالعه کردند و با محاسبه تفاوت ژنتیک بین ژنوتیپها سه گروه مجزا به دست آوردند. برخی پژوهشگران همزمان با استفاده از نشانگرهای مبتنی بر DNA، از نشانگرهای آنزیمی نیز در تجزیه نمونههای گیاهی خود استفاده کردهاند. Chandra (2010) تعداد 197 فرد از 50 گونه یونجه را از طریق 17 نشانگر SSR و 7 سیستم آنزیمی را مطالعه و گزارش کرد که دو گونه Medicago doliata و M. scutellata هم از نظر نشانگرهای SSR و هم از نظر آنزیمی بیشتر از سایر گونهها به هم شباهت دارند. Jenczewski و همکاران
(a, b1999) تعداد 36 فرد از هر کدام از 15 جمعیت خودرو و 6 رقم زراعی یونجه را به کمک 25 نشانگر RAPD و پنج مکان ژنی آلوزیمی مطالعه و گزارش کردند که علیرغم پایینتر بودن تنوع ژنی درون جمعیتی برآورد شده از طریق نشانگر RAPD در مقایسه با نشانگر آلوزیمی، الگوی ساختار جمعیتی برآورد شده از طریق دو نشانگر فوق با همدیگر مطابقت دارد. بنابراین، ارتباط دادن صفات کمّی با نشانگرهای مولکولی که وراثت تکژنی دارند و کمتر تحت تأثیر عوامل محیطی قرار میگیرند، میتواند تأثیر به سزایی در روند شناسایی و گزینش رقمهای با عملکرد بالا داشته باشد. هدف از پژوهش حاضر یافتن ارتباط بین ویژگیهای زراعی و نشانگرهای آنزیمی به منظور کاربرد در برنامههای اصلاحی یونجه است.
مواد و روشها
این پژوهش در سال زراعی 1389 در ایستگاه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز واقع در اراضی کرکج در 12 کیلومتری شرق تبریز با ارتفاع 1361 متر از سطح دریا به اجرا شد. در این پژوهش 12 خانواده برادر-خواهر ناتنی یونجه ارزیابی و مطالعه شد. این خانوادههای ناتنی از خزانه پلیکراس حاصل از یک برنامه ملی تحقیقاتی برای اصلاح و معرفی مناسبترین رقمهای یونجه در منطقه آذربایجان (Valizadeh و همکاران، 2002) تهیه شدند. جدول 1 اسامی و منشأ خانوادهها را نشان میدهد. برای ارزیابی ژنوتیپها از طرح پایه کاملاً تصادفی استفاده شد. برای این منظور، تعداد 35 بوته از هر جمعیت در داخل گلدانهایی به ابعاد 25×20×15 سانتیمتر به شکل انفرادی در شرایط مزرعه کاشته شد. برای یکنواخت کردن شرایط، خاک گلدانها به ترتیب با نسبتهای 1:1:2 خاک، کود دامی و ماسه پُر شد. در هر گلدان چند بذر کشت شد، اما پس از سبز شدن آنها در هر گلدان تنها یک بوته برای ارزیابیهای مزرعهای و بررسیهای مولکولی نگهداری شد.
جدول 1- اسامی و منشأ خانوادههای ناتنی یونجه مطالعه شده
|
منشأ و ماخذ |
خانوادههای ناتنی |
منشأ و ماخذ |
خانوادههای ناتنی |
|
اراک |
شازند |
مراغه |
قره یونجه |
|
ارومیه |
سلوانا |
مرند |
گلهبانی |
|
تبریز |
زغال اغاج |
اراک |
لیلان حمید |
|
چهارمحال و بختیاری |
چالشته |
همدان |
مامان فامنین |
|
اصلاح شده خارجی |
رنجر |
تبریز |
عمو زینالدین |
|
اصلاح شده خارجی |
مائوپا |
نقده |
تازه کند |
تجزیههای آنزیمی روی برگهای جوان با موقعیت مشخص انجام شد. برای استخراج آنزیمها از محلول تریس (120 میلیمولار)، سوکروز (5 درصد)، آسکوربیک اسید (50 میلیمولار)، سدیم متابیسولفیت (20 میلیمولار) و PEG 6000
(2 درصد) با اسیدیته 5/7 استفاده شد. پیش از استخراج، به محلول فوق 2-مرکاپتواتانول به مقدار 1/0 درصد اضافه شد. به این منظور، یک واحد از برگها با دو واحد از بافر استخراج به خوبی همگن شدند. سپس، به مدت 10 دقیقه در g 10000 و دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند (Valizadeh et al., 2011). ژلهای اکریلامید افقی به ضخامت 6 میلیمتر و غلظت 7 درصد با استفاده از محلول ژل پولیک با عرض 10 و طول 20 سانتیمتر تهیه شدند. پس از بارگذاری در مخزن، الکتروفورز با بافر تریس 32 میلیمولار، بوریک اسید 6/0 میلیمولار، EDTA 1/0 میلیمولار با اسیدیته 8/8 انجام شد و ولتاژ منبع الکتریسیته روی 196 ولت تنظیم شد. برای رنگآمیزی آنزیم پراکسیداز از روش Olson و Varner (1993) و آنزیم استراز از دستورالعمل موجود در پژوهش Soltis و Soltis (1990) با اندکی تغییرات استفاده شد. برای تمایز خانوادههای ناتنی یونجه و تعیین ارتباط صفات ریختشناسی با نوارهای ایزوزیمی، هر نوار در صورت وجود امتیاز یک (1) و در صورت عدم وجود امتیاز صفر (0) دریافت کرد. افراد در داخل خانوادهها از نظر هر یک از نوارها به دو گروه واجد نوار و فاقد نوار تقسیم شدند. سپس، میانگین این دو گروه با هم مقایسه شد و برای بررسی ارتباط صفات زراعی و ریختشناسی با نوارهای آلوزیمی نیز، همانند مکان EST-A که دو الل بود، سایر مکانها EST-B)، POX-B و (POX-C نیز به صورت دو اللی در آورده شدند و همبستگی بین یک صفت با یک الل بیانگر همبستگی با علامت جبری متفاوت با گروه اللی دیگر نیز خواهد بود. با وجود این، به منظور تثبیت خطای نوع اول، ابتدا از آزمون T2 هتلینگ در سطح احتمال 5 درصد استفاده شد. پیش از انجام آزمون T2 هتلینگ نیز نرمال بودن توزیع هر یک از متغیرها توسط آزمون کولموکروف-اسمیرنوف در سطح احتمال 1 درصد بررسی شد.
نتایج و بحث
برای تعیین ارتباط صفات زراعی و ریختشناختی با نوارهای ایزوزیمی (شکل 1)، نوارهای آنزیمی به شکل دو گروه بود و نبود (0 و 1) بررسی شدند. از 12 ایزوزیم مشاهده شده (5 ایزوزیم مربوط به آنزیم استراز و 7 ایزوزیم مربوط به آنزیم پراکسیداز)، تنها پنج نوار ایزوزیمی با صفات ارتباط معنیداری داشتند. رابطه صفات کمّی با نوارهای آنزیمی در جدول 2 آمده است.
شکل 1- نمونهای از تفسیر ایزوزیمی در آنزیم استراز (سمت راست) و آنزیم پراکسیداز (سمت چپ) در خانواده قره یونجه
جدول 2- ارتباط بین صفات زراعی و نوارهای ایزوزیمی در کل خانوادههای ناتنی یونجه مطالعه شده. - بیانگر عدم وجود اختلاف معنیدار است.
همان طور که ملاحظه میشود درباره ایزوزیمهای استراز تنها EST-2 در کل خانوادههای ناتنی با ارتفاع بوته ارتباط معنیدار در سطح احتمال 5 درصد داشت و وجود نوار آنزیمی باعث افزایش ارتفاع گیاه شد. سایر ایزوزیمهای استراز ارتباط معنیداری با صفات مطالعه شده پیدا نکردند. درباره آنزیم پراکسیداز، با توجه به تک شکل بودن ایزوزیم POX-7 از تجزیهها کنار گذاشته شد، همچنین، ایزوزیمهای POX-1 و POX-2 هیچ نوع ارتباط معنیداری با صفات مطالعه شده نشان ندادند. در حالی که POX-3 با ارتفاع برگ لپهای از خاک (طول هیپوکوتیل) رابطه معنیداری نشان داد. بر خلاف سایر ایزوزیمهای معنیدار با صفات که عموماً با حضور نوار، اثرگذاری مثبت روی صفات نشان دادند، ایزوزیم POX-3 در حالت عدم حضور نوار باعث افزایش طول هیپوکوتیل شد. درباره صفت طول برگ لپهای، این صفت با ایزوزیمهای POX-4 و POX-5 ارتباط معنیدار و مثبت نشان دادند، به بیان دیگر، در هر دو ایزوزیم وجود نوار باعث افزایش طول برگ لپهای شد. همچنین، POX-4 با صفت وزن خشک برگ ارتباط معنیداری نشان داد، که در صورت تداوم این ارتباط در پژوهشهای دیگر میتواند به عنوان نشانگر مؤثری که ارتباط مستقیمی با صفت مهم گیاهان علوفهای یعنی عملکرد دارد، به کار رود. POX-6 نیز با صفت عرض برگ لپهای ارتباط معنیداری در سطح احتمال 5 درصد نشان داد. Van و Jin (2011) در بررسی ارتباط بین صفات زراعی و آنزیم استراز در نسل 2F حاصل از تلاقی دو رقم برنج، تعدادی آنزیم مرتبط با صفات عملکرد و اجزای عملکرد در برنج گزارش کردند. ایزوزیم EST-2 با تعداد سنبلچه در خوشه و تعداد شاخههای ثانویه خوشه و ایزوزیمهای PGI-2 و AMP-3 با صفات تعداد سنبلچه در خوشه و تعداد شاخههای ثانویه در ارتباط هستند. Singh و همکاران (2009) گزارش کردند که حرکت نسبی نوارهای پراکسیداز و استراز با ارتفاع بوته در ارتباط است. به طوری که ایزوزیمهای پراکسیداز با حرکت نسبی 84/0 تا 90/0 در گیاهان با ارتفاع بوته بلند و ایزوزیمهایی با حرکت نسبی پایینتر از 60/0 در گیاهانی با ارتفاع بوته کوتاه دیده شدند، به عبارت دیگر، گیاهانی که ارتفاع بوته بلندتری داشتند فاقد نوارهایی با حرکت نسبی 60/0 و پایینتر از آن بودند. درباره آنزیم استراز نیز گزارش کردند که نوارهای ایزوزیمی باحرکت نسبی بالاتر در گیاهانی که ارتفاع بوته اندکی دارند دیده نشد، به این معنی که وجود این نوارهای ایزوزیمی با افزایش ارتفاع بوته همراه بوده است (Singh et al., 2009).
برای تعیین ارتباط صفات زراعی و ریختشناختی با نوارهای آلوزیمی (شکل 2)، دو مکان ژنی چندشکل برای آنزیم استراز (EST-a و EST-b) و همچنین، دو مکان ژنی چندشکل برای آنزیم پراکسیداز POX-b) و (POX-c و یک مکان ژنی تکشکل (POX-a) به دست آمد. مقایسه ارتباط صفات کمّیپ با نوارهای آلوزیمی در جدول 3 آمده است. تعداد میانگره با نوارهای EST-a1 و POX-b2 در سطح احتمال 5 درصد و نوار EST-b1 در سطح احتمال 1 درصد همبستگی معنیداری نشان دادند. به عبارت دیگر، وجود نوارهای فوق در مکان ژنی مربوط (در هر آلوزیم) سبب افزایش تعداد میانگره در بوته خواهند شد. نوار EST-b3 آلوزیم EST-B با صفت طول نخستین میانگره همبستگی مثبت و معنیدار در سطح احتمال 5 درصد نشان داد. صفت وزن تر و وزن خشک برگ با نوار EST-b1 همبستگی معنیداری نشان داد. علاوه بر این، صفت وزن تر با نوار POX-b2 نیز در سطح احتمال 1 درصد همبستگی بالایی را نشان داد. به عبارت دیگر میتوان گفت، وجود نوارهای POX-b2 و ETS-b1 در آلوزیمهای مربوط باعث افزایش وزن تر بوته خواهد بود. پژوهشگران متعددی ارتباط تغییرات فراوانی آلوزیمها با صفات زراعی و عوامل محیطی را بررسی کردهاند. Valizadeh (1978) در درختان انجیر (Ficus carica) نشان داد که بین یک آلوزیم فسفاتاز اسید و رسیدگی میوه همبستگی معنیداری وجود دارد. Stuber و همکاران (1980) گزارش کردند همبستگی بسیار قوی بین آلوزیم ACP-1 و عملکرد وجود دارد. Pollak و همکاران (1984) نیز بیان کردند که آلوزیمهای ADH-1، POX-1 و GOT-1 به ویژه ACP-1 با عملکرد و زودرسی گیاه ذرت و به ویژه با تعداد برگها ارتباط دارند. Mittal و همکاران (1993) با بررسی فعالیت آنزیمی اسید فسفاتاز بر روی هشت رقم ماش سبز (Vigna radiate L.) گزارش کردند که فعالیت آنزیم اسید فسفاتاز همبستگی مثبتی با وزن صد دانه گیاه دارد، در حالی که با تعداد نیام در بوته و عملکرد دانه در گیاه همبستگی منفی دارد. Lopez و Virmany (1990) ارتباط برخی از جایگاههای آلوزیمی PGI-2)، PGI-1، EST-9، EST-2، AMP-3 و (AMP-1 را با صفات کمّی در برنج مطالعه و گزارش نمودند که تنها سه جایگاه EST-2)، AMP-3 و (PGI-2 اکثراً با دو صفت کمّی (تعداد سنبلچه در خوشه و تعداد شاخههای ثانویه خوشه) در ارتباط است. Driedger و همکاران (1994) هفت آلوزیم را از قسمتهای متفاوت (ریشه، برگ، ساقه، دانه و گیاهچه) شش لاین نزدیک به هم لوبیا سیاه استخراج کردند و مقایسه چندشکلی آنزیمها نشان دهنده تنوع برای آنزیمهای فسفاتاز، پراکسیداز و استراز با نوارهای اختصاصی برای برخی از لاینها بود. Kahler (1983) بیان داشت که میتوان از آلوزیمها برای گزینش گیاه برای صفت عملکرد استفاده نمود.
شکل 2- نمونهای از تفسیر آلوزیمی در آنزیم استراز (در 11 بوته قره یونجه، سمت راست) و آنزیم پراکسیداز ( در 9 بوته قره یونجه، سمت چپ)
جدول 3- همبستگی بین صفات زراعی و نوارهای آلوزیمی در کل خانوادههای ناتنی یونجه مطالعه شده. -، * و ** به ترتیب بیانگر عدم اختلاف معنیدار، معنیدار در سطح احتمال 5 و 1 درصد است.
جمعبندی
با توجه به نتایج به دست آمده از همبستگی معنیدار بین برخی از آنزیمهای پراکسیداز و استراز با صفات بیوماس هوایی و سایر صفات ریختشناسی که جزو صفات مهم در گیاهان علوفهای محسوب میشود و در صورت تأیید این ارتباط در پژوهشهای دیگر و همچنین، با استفاده از نشانگرهای مبتنی بر DNA میتوان از نشانگرهای یاد شده و همبستگی ارتباط بین آنها در راستای برنامههای بهبود عملکرد و افزایش میزان بیوماس گیاهان علوفهای به ویژه گیاه یونجه استفاده کرد.
سپاسگزاری
نگارندگان لازم میدانند که از گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی دانشگاه تبریز و تمام دوستانی که در آزمایشگاه سیتوژنتیک دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز یاری نمودند تشکر و قدردانی نمایند.
)
