Authors
Department of Horticultural, Faculty of Agriculture Sciences, University of Guilan, Guilan, Iran
Abstract
Keywords
ایران یکی از کشورهای مهم تولید کننده مرکبات در دنیاست که سالانه بیش از 5/3 میلیون تن انواع مرکبات را تولید می‌کند. مرکبات جزو محصولات گرمسیر و نیمه گرمسیر بوده، حساس به تنش دمای پایین هستند. گیاهان برای رشد بهینه به محدوده دمایی مناسبی احتیاج دارند و خارج شدن از این محدوده یک تنش محسوب می‌شود. قرارگیری گیاهان حساس به سرما در معرض دماهای پایین به تغییرات فیزیولوژیکی در گیاه منجر می‌شود (Seppanen, 2000). در دمای پایین احتمال تشکیل گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن در اثر عدم تعادل بین دریافت نور و فتوسنتز افزایش می‌یابد. در گیاهان مقاوم به تنش سرما تشکیل گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن کنترل شده و تعدیل می‌گردد. همچنین کاهش دما در حضور نور خطر اکسیداسیون نوری را به علت عدم توان استفاده لازم از نور افزایش می‌دهد (Allen and Ort, 2001). دمای پایین فعالیت آنزیم‌ها از جمله فعالیت آنزیم روبیسکو را کاهش می‌دهد (Guo and Cao, 1999). همچنین، در دمای پایین کارآیی انتقال انرژی به مرکز فتوسیستم II کاهش می‌یابد و کلروفیل سه تایی تشکیل می‌گردد که می‌تواند با انتقال الکترون به اکسیژن، رادیکال فعال اکسیژن تولید کند Flexas et al., 1999)؛ Havaux and Niyogi, 1999). گزارش‌ها نشان می‌دهد که گیاهان برای پیشگیری از آثار ثانویه سرما به چندین روش عمل می‌کنند و هدف همه آنها حفاظت از مراکز واکنش است (Jin et al., 2003). همچنین گیاهان مقاوم به سرما مانند اسفناج با داشتن سیستم آنتی‌اکسیدانی قوی در شرایط سرما قادر به ادامه حیات هستند (Allen and Ort, 2001). در برخی از گیاهان که می‌توانند به سرما سازگار شوند، تولید ترکیبات آنتی‌اکسیدان باعث خنثی کردن و از بین بردن رادیکال‌های آزاد تولید شده در هنگام تنش می‌شود (Kiara and Roy, 1999). این گیاهان با استفاده از آنزیم‌هایی نظیر: سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، پراکسیداز (POD) و کاتالاز (CAT) توانایی کاهش گونه‌های واکنش‌پذیر اکسیژن را دارند (Gabor et al., 2001). در بسیاری از گیاهان مقاوم به تنش، مواد سازگار محلول مانند گلایسین بتائین (GB) تولید می‌شود که از گیاه در مقابل تنش محافظت می‌کند (Storey and Wallker, 1999؛ (Hasegawa et al., 2000. تحت شرایط تنش، GB می‌تواند از فعالیت فتوسنتزی شامل آنزیم‌های فتوسنتزی، پروتئین‌ها و غشاهای لیپیدی تیلاکوئید و جریان الکترون در مجموعه فتوسیستم II محافظت کند Makela et al., 1998)؛ (Chen and Murata, 2008. Reddy و همکاران (2004) نشان دادند که گیاهان توت‌فرنگی تیمار شده با GB در دمای 17- درجه سانتیگراد نسبت به گیاهان شاهد (دمای 8/5- درجه سانتیگراد) مقاومت بیشتری از خود نشان دادند. همچنین، مشخص شده است که GB در برابر سرما از غشا تیلاکوئیدی محافظت می‌کند (Reddy et al., 2004). محلول‌پاشی برگی گیاهان آرابیدوپسیس با GB، دمای یخ‌زدگی را از 1/3- به 5/4- کاهش داد (WeiBing and Rajashekar, 2001). در پژوهشی دیگر، Anjum و همکاران (2012) نشان دادند که تیمار گیاهان ذرت تحت تنش خشکی با GB فعالیت آنزیم‌های SOD، POD و CAT را افزایش داد و از این راه سبب افزایش مقاومت به خشکی شده است. همچنین Makela و همکاران (1996) نشان دادند که تیمار GB با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مقاومت دو رقم سیب‌زمینی در برابر تنش سرما را افزایش داد. لیموآب شیراز از حساس‌ترین گونه‌های مرکبات در برابر سرما محسوب می‌شود (Baghbanha et al., 2007). با توجه به ویژگی‌های ترکیب سازگار GB، تأثیر غلظت‌های مختلف این ماده بر روی برخی ویژگی‌های بیوشیمیایی نهال‌های دو ساله لیموآب شیراز طی تنش دمای پایین بررسی شد.
نهال‌های دو ساله از استان فارس تهیه و به دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان منتقل شدند. گیاهان پس از انتقال به گلدان‌ها در بستر مخلوطی با نسبت حجمی1:1:3 از خاک سطحی، خاکبرگ و ماسه قرار گرفتند. نهال‌ها به مدت 8 هفته در گلخانه و در دمای23 درجه سانتیگراد در شب و 28 درجه سانتیگراد در روز تحت شرایط نور طبیعی قرار گرفتند تا به خوبی رشد کنند. نهال‌ها در مراحل ابتدایی انتقال، هر دو روز یک بار و در مراحل بعدی هر 4 روز یک بار با محلول غذایی هوگلند تغذیه شدند. پس از رشد و استقرار نهال‌ها طی 8 هفته، نهال‌ها با غلظت‌های مختلف گلایسین بتائین (GB) (صفر (شاهد)، 5/2، 5، 5/7 و 10 میلیمولار) دو بار با فاصله زمانی 15 ساعت محلول‌پاشی برگی شدند. تیمار برگی در دمای 15 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 5±80 درصد صورت گرفت. پس از ناپدید شدن قطرات GB از سطح برگ، گیاهان به وسیله دستگاه انکوباتور قابل برنامه‌ریزی با رطوبت نسبی 5±75 درصد و نور بسیار کم در معرض تنش دمایی قرار گرفتند. به منظور سازگاری، نهال‌ها ابتدا به مدت یک هفته در دمای 15 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. طی 12 ساعت دما به 10 درجه کاهش یافت و 12 ساعت در آن دما باقی ماند. سپس، دما طی 12 ساعت به 6 درجه کاهش یافت و 12 ساعت در آن دما باقی ماند. در ادامه، طی 12 ساعت دما 2 درجه کاهش یافت و 12 ساعت در آن دما باقی ماند. تنش دمای پایین در دماهای 2، 0، 2-، 4- و 6- درجه سانتیگراد انجام گرفت. قبل از قرار دادن گلدان‌ها در اتاقک رشد و همچنین قبل از ورود به دمای زیر صفر نهال‌ها آبیاری شدند تا تحت تنش خشکی قرار نگیرند. نهال‌ها پس از قرار گرفتن در معرض تنش، به‌تدریج به دمای اتاق انتقال داده شده و به مدت 24 ساعت در این دما نگهداری شدند. سپس، نمونه‌گیری از برگ‌ها برای اندازه‌گیری صفات مختلف شامل فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز، سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداسیون لیپید، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی، پروتئین کل و نشت الکترولیتی انجام شد.
برای سنجش فعالیت آنزیم POD از روش Lin و همکاران (1996) استفاده شد. در این روش از بافر فسفات 50 میلیمولار، آب اکسیژنه 45 میلیمولار و گایاکول 225 میلیمولار استفاده گردید. جذب در طول موج 470 نانومتر خوانده شد.
سنجش فعالیت آنزیم SOD در مخلوط واکنش به حجم 5/1 میلی‌لیتر و دارای بافر فسفات 50 میلیمولار (اسیدیته=7)، EDTA 1/0 میلیمولار، متیونین 13 میلیمولار، NBT، ریبوفلاوین و 10 میکرولیتر عصاره آنزیم انجام گردید. جذب در طول موج 560 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Itd T80+UV/VIS, PG Instruments, UK) اندازه‌گیری شد (Giannopolitis and Rise, 1977).
برای سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدها از روش Heath و Packer (1968) بر مبنای اندازه‌گیری غلظت MDA استفاده شد.
ظرفیت آنتی‌اکسیدانی عصاره برگ لیموآب شیراز از طریق خاصیت خنثی‌کنندگی رادیکال آزاد DPPH
(2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) تعیین گردید (Brand-Williams et al., 1995).
برای اندازه‌گیری میزان پروتئین کل 1/0 گرم بافت برگ به وسیله نیتروژن مایع آسیاب گردید و به آن بافر فسفات 50 میلیمولار شامل 1 میلیمولار EDTA Na2 و 2 درصد (w/v) PVPP همگن شد. غلظت پروتئین کل با روش Brand-Williams (1976) و استفاده از سرم آلبومین گاوی به عنوان استاندارد اندازه‌گیری شد.
برای تعیین نشت الکترولیتی (EL) سه برگ کاملاً توسعه یافته بالایی از نهال‌ها جدا و از آنها برش‌هایی به قطر 1 سانتی‌متر تهیه شد، سپس برش‌ها در لوله‌های آزمایشگاهی قرار داده شد و 10 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه به آنها اضافه شد. لوله‌ها با سرپوش پلاستیکی بسته شد و در دمای ثابت 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. پس از 12 ساعت هدایت الکتریکی اولیه محیط (EC1) با استفاده از دستگاه EC سنج مدل Milwaukee Mi 306 اندازه‌گیری شد. پس از آن، نمونه‌ها در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت20 دقیقه جوشانده شدند تا به طور کامل بافت‌ها کشته شوند و همه الکترولیت‌ها آزاد شود. سپس، نمونه‌ها تا دمای 25 درجه سانتیگراد خنک شدند و هدایت الکتریکی ثانویه (EC2) اندازه‌گیری شد و EL با استفاده از رابطه 1 محاسبه شد.
رابطه 1 EL=(EC1/EC2)×100
نتایج مقایسه میانگین‌ها نشان داد که فعالیت آنزیم POD با افزایش غلظت GB در سطوح مختلف تنش سرمایی به غیر از دمای 2 درجه سانتیگراد، به طور معنی‌داری افزایش یافته است (جدول 1). با این وجود، در میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در دمای 2- درجه سانتیگراد و در غلظت 10 میلیمولار GB تفاوت معنی‌داری با گیاهان شاهد مشاهده نشد. در حالی که میزان فعالیت این آنزیم طی تنش سرما در غلظت‌های صفر (شاهد) و 5/2 میلیمولار GB کمتر از سایر غلظت‌ها بود. همچنین، نهال‌های تیمار شده با 5/7 و 10 میلیمولار GB بیشترین فعالیت آنزیم POD را نشان دادند. به طور مشابه Demiral و Turkan (2004) نشان دادند که تیمار GB فعالیت آنزیم‌های POD و CAT را در گیاهان برنج تحت تنش شوری افزایش می‌دهد. این آنزیم‌ها در تصفیه رادیکال‌های تولید شده در تنش شوری و سرما نقش دارند. GB به طور مؤثری ساختار چهارگانه آنزیم‌ها و مجموعه پروتئین‌ها را تثبیت کرده، وضعیت بسیار پایدار غشا را در دماهای غیرفیزیولوژیک حفظ می‌کند (Chen and Murata, 2008). با این وجود، نتایج نشان می‌دهد که افزایش فعالیت POD نتوانسته است آثار مخرب تنش دمای پایین را کاهش دهد که با نتایج Gülen و همکاران (2008) مطابقت دارد. ولی اثر حفاظتی GB بر آنزیم POD بیشتر بوده است و مانع تخریب آن در دماهای پایین شده است. به نظر می‌رسد کاهش دما آنزیم POD را زودتر تخریب می‌کند و ترکیب سازگاری مانند GB می‌تواند باعث پایداری آن گردد.
تیمار GB میزان فعالیت SOD را افزایش نداد (جدول 1). کمترین میزان فعالیت SOD مربوط به تیمار 10 میلیمولار GB در دمای صفر درجه بود. به بیان دیگر، شاید با رویارویی دماهایی زیر صفر آنزیم SOD که از جمله آنزیم‌های تصفیه کننده ROS است توانسته آنیون سوپر اکسید را به پر اکسید هیدروژن تبدیل کند. تصفیه ROS فرآیندی لازم برای بقا و تولید محصول است. مطابق با نتایج پژوهش حاضر، Hoque و همکاران (2007) نشان دادند که کاربرد GB تأثیری بر فعالیت SOD در گیاهان تحت تنش شوری ندارد.
بیشترین میزان پروتئین کل در دماهای 2 و 4- درجه سانتیگراد به ترتیب با تیمارهای 5/2 و 10 میلیمولار GB مشاهده شد (جدول 1). در دمای 6- درجه، تفاوت معنی‌داری بین غلظت‌های 10 و 5 میلیمولار GB مشاهده نشد. در دمای صفر درجه به رغم افرایش میزان پروتئین کل، تفاوت معنی‌داری بین غلظت‌های 10، 5/7 و 5 میلیمولار GB مشاهده نگردید. مطابق با نتایج دست آمده، Yancy (1994) نشان داد که کاربرد GB ساختار چهارگانه مجموعه پروتئینی تحت تنش اسمزی را تثبیت می‌کند. Mäkela و همکاران (2000) گزارش کردند که کاربرد GB سبب افزایش میزان کلروفیل، میزان پروتئین کل، میزان و فعالیت روبیسکو در گیاهان گوجه فرنگی تحت تنش خشکی یا شوری شده است. همچنین کاربرد GB از فعالیت زنجیره فتوسیستم II آزاد کننده اکسیژن محافظت می‌کند (Harinasut et al., 1996؛ (Feller et al., 2008. با توجه به این که در بررسی حاضر، در دماهای پایین میزان پروتئین حفظ شده است به نظر می‌رسد GB در حفاظت از نوکلئیک اسیدها، پروتئین‌ها و پایداری آنزیم‌ها مؤثر بوده است.
نتایج نشان داد که غلظت‌های مختلف GB نتوانسته طی تنش سرما ظرفیت آنتی‌اکسیدانی را بالا ببرد. در دمای 4- درجه سانتیگراد با وجود این که میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی با تیمار 10 میلیمولار GB بیشتر از سایر تیمار‌ها است، تفاوت معنی‌داری با دیگر تیمارهای به کار رفته در این سطح تنش مشاهده نشد. ویتامین C، کارتنوئید، ترکیبات فنلی، کلروفیل، آنزیم‌های متعدد دیگر از جمله عوامل مؤثر بر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل هستند. بیشترین میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاهان در دمای 2- درجه سانتیگراد با تیمارهای صفر و 5/2 میلیمولار GB مشاهده شد و با افزایش شدت تنش و کاربرد GB در غلظت‌های مختلف تفاوت معنی‌داری در ظرفیت آنتی‌اکسیدانی مشاهده نشد. هر چند که گیاهان تیمار شده با 5/2 میلیمولار GB در دمای 6- درجه سانتیگراد، کمترین میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی را داشتند (جدول 1). عملکرد GB تاکنون بحث انگیز بوده و به طور کامل شناخته نشده است (Ashraf and Foolad, 2007) برخی گزارش‌ها گویای آن است که این ترکیب فعالیت آنتی‌اکسیدانی ندارد (Parvaiz and Satyawati, 2008) که با یافته‌های حاصل از پژوهش حاضر مطابقت دارد. Okuma و همکاران (2004) معتقدند GB تنها یک اسمولیت سازگار است و از گروه اسمولیت‌های سازگار تصفیه‌کننده ROS به محسوب نمی‌شود.
نتایج نشان داد که با کاهش دما، بر میزان پراکسیداسیون لیپید افزوده شد ولی غلظت‌های مختلف GB اثر معنی‌داری بر کاهش پراکسیداسیون لیپید در سطوح دمایی نداشتند (جدول 1).Hoque و همکاران (2007) نشان دادند که تیمار GB سلول‌های توتون کشت شده تحت تنش شوری تأثیری بر میزان مالون دی‌آلدیید نداشت. در صورتی که Demiral و Turkan (2006) گزارش کردند که سطح پراکسیداسیون لیپید در گیاهان حساس و مقاوم به شوری گیاهچه‌های برنج در شرایط تنش شور، با تیمار GB کاهش یافت. این نتایج بیانگر آن است که آثار متفاوت GB می‌تواند به ژنوتیپ مربوط باشد. یا آن که GB نتوانسته از غشا به خوبی محافظت کند به رغم آن که گزارش‌هایی وجود دارد که از مولکول‌های بزرگ و برخی اجزای سلول محفاظت می‌کند. از سوی دیگر نتوانسته نقش آنتی‌اکسیدانی برای حفظ غشا داشته باشد (Parvaiz and Satyawati, 2008).
جدول 1- مقایسه میانگین صفات اندازه‌گیری شده در برگ‌های لیموآب شیراز تحت سطوح مختلف تنش سرمایی. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون توکی است.
|
پراکسیداسیون لیپید |
ظرفیت آنتی‌اکسیدانی |
پراکسیداز |
سوپراکسیددیسموتاز |
پروتئین کل |
غلظت گلایسین بتائین (میلیمولار) |
سطوح تنش سرما (درجه سانتیگراد) |
|
19/0 bc |
16/6 ab |
3/10 ab |
253/4 ab |
86/86 defg* |
0 |
2 |
|
21/4 abc |
23/7 ab |
3/94 a |
282/7 ab |
144/95 a |
5/2 |
|
|
17/2 bc |
16/7 ab |
3/27 ab |
257/3 ab |
112/98 bcd |
5 |
|
|
22/2 abc |
20/9 ab |
3/63 ab |
269/0 ab |
79/17 defg |
5/7 |
|
|
17/5 bc |
17/0 ab |
3/32 ab |
311/4 a |
110/07 bcd |
10 |
|
|
20/0 abc |
23/7 ab |
1/94 c |
240/9 ab |
59/76 jk |
0 |
0 |
|
18/5 bc |
18/4 ab |
1/30 c |
268/0 ab |
65/04 jk |
5/2 |
|
|
20/9 abc |
26/0 ab |
1/47 c |
243/2 ab |
74/78 ijk |
5 |
|
|
16/4 c |
20/9 ab |
2/17 ab |
322/7 a |
72/68 ghijk |
5/7 |
|
|
19/4 abc |
18/1 ab |
3/41 ab |
169/1 b |
98/35 defg |
10 |
|
|
22/4 abc |
27/0 a |
1/59 c |
234/3 ab |
48/62 k |
0 |
2- |
|
19/6 abc |
22/7 ab |
1/35 c |
226//2 ab |
93/37 cdef |
5/2 |
|
|
21/4 abc |
27/1 ab |
3/57 ab |
239/8 ab |
65/91 efghij |
5 |
|
|
22/4 abc |
24/6 ab |
3/36 ab |
288/8 ab |
99/58 cde |
5/7 |
|
|
21/4 abc |
21/7 ab |
1/69 c |
243/2 ab |
80/47 defghi |
10 |
|
|
22/4 abc |
18/2 ab |
1/50 c |
238/9 ab |
74/13 efghij |
0 |
4- |
|
23/8 abc |
22/5 ab |
1/69 c |
233/5 ab |
56/41 hijk |
5/2 |
|
|
20/6 abc |
21/3 ab |
1/77 c |
223/6 ab |
73/11 efghij |
5 |
|
|
27/0 a |
20/5 ab |
3/21 ab |
315/6 a |
83/48 fghijk |
5/7 |
|
|
24/3 ab |
26/9 ab |
2/94 b |
292/9 ab |
137/49 ab |
10 |
|
|
22/8 abc |
23/9 ab |
1/82 c |
249/2 ab |
81/46 defghi |
0 |
6- |
|
21/7 abc |
14/4 b |
1/71 c |
307/4 a |
60/99 ghijk |
5/2 |
|
|
23/6 abc |
22/5 ab |
3/40 ab |
202/3 ab |
102/23 cde |
5 |
|
|
22/4 abc |
16/5 ab |
3/46 ab |
326/0 a |
81/15 defg |
5/7 |
|
|
24/8 ab |
16/8 ab |
3/37 ab |
282/5 ab |
123/82 abc |
10 |
با افزایش غلظت GB میزان نشت یونی کاهش یافت ولی تفاوت معنی‌داری بین غلظت‌های GB مشاهده نشد. همچنین، بیشترین میزان نشت یونی در گیاهان شاهد به دست آمد (شکل 1). با افزایش شدت تنش بر میزان نشت یونی افزوده شده است. اگر چه میزان نشت یونی در دمای 4- درجه سانتیگراد بیشترین میزان است، با این وجود، با سطوح دیگر تنش یخ‌زدگی تفاوت معنی‌داری نداشت (شکل 2). نشت الکترولیتی شاخص فیزیولوژیکی مناسبی برای ارزیابی میزان مقاومت گیاهان به تنش‌های محیطی است. Moshtaghi و همکاران (2009) با کاربرد GB روی دو ژنوتیپ نخود متحمل و حساس به تنش دمای پایین مشاهده کردند که نشت یونی در گیاهان متحمل کاهش یافت ولی در گیاهان حساس کاربرد GB بر کاهش میزان EC تأثیری نداشته است.
نتایج این پژوهش نشان می‌دهد که GB برحفظ و پایداری برخی پروتئین‌ها مانند پراکسیداز‌ها و پروتئین کل مؤثر بوده است. میزان سوپراکسیددیسموتاز تغییرات معنی‌داری با کاهش دما یا تیمار با GB نداشت. همچنین تیمار این ترکیب سازگار باعث افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی نشد. شاید به همین دلیل در جلوگیری از پراکسیده شدن لیپید غشا چندان تأثیری نداشت. ولی ممکن است بر حفظ و پایداری کلروفیل، سایر آنتی‌اکسیدان‌ها یا آنزیم روبیسکو تأثیر داشته باشد.
|
شکل 1- میزان نشت یونی در برگ‌های لیموآب شیراز تیمار شده با غلظت‌های مختلف GB |
شکل 2- میزان نشت یونی در برگ‌های لیموآب شیراز تحت سطوح مختلف دمای پایین |
)
