Authors
1 Department of Agronomy, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Sciences, Golestan University, Gorgan, Iran
Abstract
Keywords
کدوی تخم کاغذی (Cucurbita pepo subsp. Pepo. Convar. var. styriaca Greb) گیاهی دارویی، یک‌ساله، علفی و متعلق به خانواده کدوئیان (Cucurbitaceae) است (Ghaderi-Far et al., 2011a). بذرهای این گیاه منبعی سرشار از پروتئین و روغن و حاوی مواد مؤثره ارزشمند نظیر اسیدهای چرب، فیتواسترول و ویتامین E (به ویژه گاما توکوفرول) است. مهم‌ترین اسید چرب موجود در روغن این گیاه لینولئیک اسید (45 تا 50 درصد) است. از مواد مؤثره بذرهای این گیاه، داروهایی مانند: پیونن، پپوسترین و گرونفینگ برای معالجه تورم پروستات و سوزش مجاری ادرار ساخته می‌شود (Aroiee and Omidbaigi, 2004).
از زمانی که بشر به اهلی کردن گیاهان پرداخت، نگهداری بذر از اهمیت خاصی برخوردار بوده است. کشاورزان مجبور بودند بذرها را از یک فصل رشد برای فصل رشد بعدی (به معنای انبارداری کوتاه مدت به مدت 3 تا 18 ماه) نگهداری کنند. همچنین در بانک‌های ژن لازم است که قابلیت حیات بذر برای دوره‌های نامشخص (10 تا 100 سال یا بیشتر) حفظ شود (Hong and Ellis, 1996).
بذرها همانند هر اندام دیگر پیر شده (زوال یافته) و از بین می‌روند. سرعت زوال بذر به عواملی از جمله: نوع، ساختار، محیط تولید و سلامت بذر و همچنین شرایط انبارداری بستگی دارد (Kalpana and Madhava Rao, 1996؛ (Abba and Lovato, 1999. دما و رطوبت نسبی (و به دنبال آن رطوبت بذر) از مهم‌ترین عوامل زوال بذر طی انبارداری هستند و کاهش دما و رطوبت نسبی طی انبارداری، به افزایش طول دوره انبارداری بذرها منجر می‌گردد (Basra et al., 2003؛ (Sharma et al., 2007. زوال بذر یک ویژگی ناخواسته در کشاورزی است و متأسفانه همه ساله بخش زیادی از بذرهای تولید شده طی انبارداری نامناسب از بین می‌رود Li et al., 2007)؛ Kapoor et al., 2011). بر اساس برآوردها، سالیانه حدود 25 درصد بذر یا بخش قابل توجهی از درآمد حاصل از آن، به دلیل کیفیت پایین از دست می‌رود (Benech-Arnold and Sanchez, 2004). به علاوه، این مقدار به طور قابل ملاحظه‌ای افزایش می‌یابد، وقتی که کاهش عملکرد گیاه زراعی حاصل از کاشت بذرهایی با کیفیت پایین نیز در نظر گرفته شود (McDonald, 1999). بنابراین، داشتن درک روشنی از مراحل زوال بذر ضروری است.
زوال بذر شامل برخی تغییرات بیوفیزیکی و بیوشیمیایی شامل تغییر در ساختار مولکولی نوکلئیک اسیدها، کاهش فعالیت برخی آنزیمهای کلیدی در جوانه‌زنی و افزایش فعالیت برخی از آنزیمهای هیدرولیز کننده، اختلال در یکپارچگی غشا و کاهش تنفس است که نتیجه این تغییرات به کاهش قدرت بذر، کاهش سرعت جوانه‌زنی و رشد گیاهچه، کاهش توانایی جوانه‌زنی بذرها تحت شرایط تنش‌زا، افزایش احتمال نمو گیاهچههای غیرطبیعی و کاهش درصد استقرار بوته در مزرعه و در نهایت باعث کاهش عملکرد منجر می‌گردد. همچنین، چنانچه شدت زوال زیاد باشد ممکن است هیچ بذری جوانه نزند (Roberts, 1986؛ TeKrony et al., 1993؛ Corbineau et al., 2002؛ (Mohammadi et al., 2011.
علت اصلی زوال بذر و کاهش قابلیت حیات بذر طی انبارداری دقیقاً مشخص نیست اما چندین مطالعه جامع عامل اصلی زوال بذر را پراکسیداسیون لیپیدها دانستهاند Wilson and McDonald, 1986)؛ Hendry, 1993؛ Smith and Berjak, 1995؛ Walters, 1998؛ McDonald, 1999). پراکسیداسیون لیپیدها با تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن از طریق غیرآنزیمی (autoxidation) یا آنزیمی آغاز می‌شود (Clerkx et al., 2004). رادیکال آزاد شامل یک یا گروهی از اتم‌ها است که یک الکترون جفت نشده دارند. در روش آنزیمی، رادیکال آزاد توسط لیپوکسیژنازهایی که در بسیاری از بذرها وجود دارد، تولید می‌شود (Trawatha et al., 1995). سازوکار غیرآنزیمی اغلب به وسیله مولکول اکسیژن مجاور اسیدهای چرب غیراشباع نظیر اولئیک اسید و لینولئیک اسید که از رایج‌ترین اسیدهای چرب غشای بذر هستند، آغاز می‌شود. نتیجه این عمل آزاد شدن یک رادیکال آزاد است که غالباً هیدروژن (Ho) آزاد شده از یک گروه متیلنی مجاور پیوند دو گانه اسید چرب است. در سایر موارد، ممکن است رادیکال آزاد هیدروژن با سایر رادیکال‌های آزاد گروه‌های هیدروپراکسی (ROOH) ترکیب شود و در نتیجه رادیکال آزاد پراکسی (ROOo) تولید می‌شود. این رادیکال‌ها به تولید رادیکال‌های آزاد دیگر ادامه می‌دهند تا زمانی که با سایر رادیکال‌ها تلفیق شوند و این پایان واکنش است (McDonald, 1999). در این حال، رادیکال‌های آزاد به غشاها خسارت وارد می‌کنند و باعث تغییراتی در کیفیت روغن می‌شوند. در نتیجه، اسیدهای چرب با زنجیره طولانی به اجزای کوچک‌تر شکسته می‌شوند و برخی از آنها به‌صورت هیدروکربن‌های فرار آزاد می‌شوند Esashi et al., 1997)؛ Wilson and McDonald, 1986). پیامد نهایی این سلسله واکنش‌ها، اختلال ساختار غشا، نشت سلولی و اختلال در متابولیسم طبیعی سلول است. گیاهان دارای سیستم پاداکسایشی (antioxidant system) هستند که این سیستم وظیفه سمّزدایی رادیکال‌های آزاد اکسیژن را به عهده دارد که شامل: سوپراکسید دیسموتاز، آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز، کاتالاز و پراکسیداز هستند Asada, 1992)؛ Bowler et al., 1992؛ Kibinza et al., 2011). در واقع این آنزیم‌ها در شرایط معمول انبارداری وظیفه پالایش رادیکال‌های آزاد را به عهده دارند. طی زوال، فعالیت آنزیمهای پاداکسایشی کاهش و در نتیجه پراکسیداسیون لیپید افزایش می‌یابد
Bailly et al., 1996)؛ Torres et al., 1997؛ Rao et al., 2006). Bailly و همکاران (1996) و Torres و همکاران (1997) بیان داشتند که در بذرهای آفتابگردان افزایش پراکسیداسیون لیپید طی زوال با کاهش در فعالیت آنزیمهای پاداکسایشی مرتبط است.
پژوهش‌های متعددی به منظور درک بهتر سازوکارهای دخیل در زوال بذر صورت گرفته است Wilson and McDonald, 1986)؛ Smith and Berjak, 1995؛ Walters, 1998؛ McDonald, 1999؛ (Murthy et al., 2003. در اغلب پژوهش‌ها از آزمون تسریع پیری برای مطالعه زوال استفاده شده است Bailly et al., 1996)؛ Basra et al., 2003؛ (Kalpana and Madhava Rao, 1996. به این صورت که بذرها در یک دوره کوتاه مدت تحت تأثیر دمای بالا (38-45 درجه سانتیگراد) و رطوبت نسبی زیاد (حدود 100 درصد) قرار می‌گیرند Hsu et al., 2003)؛ (Pukacka and Ratajczak, 2005. به بیان دیگر، در تنها تأثیر یک دما و یک رطوبت نسبی طی دوره زوال بررسی می‌گردد. تحت این تیمار، بذرها سریعاً دچار زوال می‌شوند و با گذشت مدت زمان کوتاهی جوانه‌زنی آنها به شدت کاهش می‌یابد و به صفر میرسد. اما بذرها به ندرت در انبار تحت چنین شرایط محیطی قرار می‌گیرند. طی انبارداری دامنه دمایی و رطوبتی متفاوتی بر بذرها حاکم است و از سوی دیگر، در دماها و رطوبت‌های مختلف سازوکارهای زوال متفاوت هستند (Murthy et al., 2003). از این رو، برای درک بهتر سازوکارهای زوال بذر طی انبارداری باید از دامنه های متفاوتی از دماها و رطوبت بذر استفاده کرد. بنابراین، هدف از پژوهش حاضر درک اساسی از سازوکارهای زوال بذر کدوی تخم کاغذی طی پیری در دامنه دمایی و رطوبتی مختلف و ارتباط آن با پراکسیداسیون لیپیدها و فعالیت آنزیمهای پاداکسایشی کاتالاز و پراکسیداز است.
مواد و روش‌ها
برای اندازه‌گیری شاخص‌های بیوشیمیایی دخیل در زوال بذرهای کدوی تخم کاغذی از آزمایشهای انجام شده برای تعیین ضرایب پیش‌بینی انبارداری این گیاه استفاده شد (Ghaderi-Far et al., 2011b). برای این منظور از بذرهای تولیدی در شهرستان اردبیل در سال 1387 استفاده شد و پس از برداشت بذرها تا زمان آزمایش در یخچال نگهداری شدند. در آغاز آزمایش رطوبت اولیه بذر 5 درصد بود. دو تیمار دمایی و سه سطح رطوبتی و دو دوره زمانی از آزمایشهای پیشین انتخاب شد (Ghaderi-Far, 2009). تیمارهای دمایی در دو سطح 35 و 50 درجه سانتیگراد، تیمارهای رطوبتی در سه سطح 5، 8 و 14 درصد رطوبت بذر و تیمارهای زمان در دو سطح 2 و 4 روز تحت ترکیب شرایط دمایی و رطوبتی انتخاب گردید. بذرها درون فویل آلومینیومی و فویل‌ها درون ظرف‌های وکیوم قرار داده شدند. سپس، این ظرف‌ها در دماهای یاد شده قرار گرفتند و در زمان‌های مورد نظر از انکوباتور خارج شدند. درصد جوانه‌زنی، پراکسیداسیون لیپید، فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز و هدایت الکتریکی اندازه‌گیری شد.
آزمون جوانه‌زنی: برای انجام آزمون جوانه‌زنی در هر تیمار، سه تکرار 50 تایی از بذر شمارش و روی دو عدد کاغذ حوله‌ای به ابعاد 45×30 سانتی‌متر قرار گرفته، روی بذرها با کاغذی دیگر پوشانیده شد (Ghaderi-Far and Soltani, 2011). برای جلوگیری از کاهش رطوبت، کاغذهای حوله‌ای درون پلاستیک گذاشته، سپس درون انکوباتور با دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز قرار گرفتند. در روز هفتم درصد بذرهای جوانه زده اندازه‌گیری شد.
اندازه‌گیری پراکسیداسیون لیپیدها: اندازه‌گیری پراکسیداسیون لیپیدها با روش Heath و Packer (1968) همراه با تغییراتی انجام شد. در این روش، 2/0 گرم بذر کدوی تخم کاغذی با 5 میلی‌لیتر تری کلرو استیک اسید 1/0 درصد در هاون چینی کوبیده و همگن شد. عصاره همگن به لوله سانتریفیوژ منتقل و به مدت 15 دقیقه با سرعت g10000 و در دمای 20 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. فاز میانی در زیر لایه لیپیدی برای اندازه‌گیری میزان پراکسیداسیون لیپیدها مورد استفاده قرار گرفت. به 250 میکرولیتر از این عصاره، 2 میلی‌لیتر معرف تیوباربیتوریک اسید 25/0 درصد اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. بلافاصله پس از این مرحله لوله‌های آزمایش به مدت 15 دقیقه در یک ظرف یخ قرار گرفتند. پس از این مدت، محلول‌ها دوباره به مدت 10 دقیقه در دمای 20 درجه سانتیگراد با سرعت g10000 سانتریفیوژ شدند و میزان جذب نور نمونه‌ها در طول موج‌های 440، 532 و 600 نانومتر ثبت شد. محلول شاهد حاوی 250 میکرولیتر تری کلرو استیک 1/0 درصد بود که با 2 میلی‌لیتر معرف تیوباربیتوریک اسید 25/0 درصد مخلوط شده بود و تمامی تیمارها با محلول بلانک سنجیده شد. میزان پراکسیداسیون لیپیدها بر اساس مقدار مالون دی آلدهید (MDA) موجود در هر عصاره طبق رابطه 1 محاسبه گردید:
رابطه 1:
LP (nmol. ml-1) = [[(A532-A600) - [(A440-A600) . (MA)]] / 157000]106.
که MA جذب مولی سوکروز در غلظت‌های 1 تا 10 میلی‌مولار در 532 و 440 نانومتر است که به‌ترتیب 4/8 و 147 محاسبه شد که نسبتی برابر با 0571/0 است (Du and Bramlage, 1992). میزان پراکسیداسیون لیپیدها بر اساس نانومول مالون دی آلدهید موجود با ازای هر گرم بذر بیان گردید.
.استخراج و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز: برای استخراج آنزیم‌کاتالاز از روش Kar و Mishra (1976) استفاده شد. برای استخراج آنزیم یک گرم بذر کدوی تخم کاغذی با 3 میلی‌لیتر بافر استخراج در هاون چینی درون ظرف یخ کوبیده و همگن گردید. پس از آن محلول هموژن از دو لایه پارچه ململ عبور داده شد و عصاره حاصل در میکروتیوب ریخته شد. میکروتیوب‌ها به مدت 15 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ، فاز میانی در زیر لایه لیپیدی برای اندازه گیری فعالیت آنزیم استفاده شد. برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Luck (1962) استفاده شد. در این روش، 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش حاوی 8/2 میلی‌لیتر بافر فسفات مونوسدیک (50 میلی‌مولار) با اسیدیته برابر 8/6، 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی و 100 میکرولیتر آب اکسیژنه (15 میلی‌مولار) ترکیب و برای اندازه‌گیری استفاده شد. با اضافه کردن آب اکسیژنه به مخلوط واکنش فعالیت آنزیمی آغاز شد. محلول بلانک، حاوی 9/2 میلی‌لیتر بافر فسفات مونو سدیک (50 میلی‌مولار) با اسیدیته برابر با 8/6 و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی در نظر گرفته شد. کاهش جذب نور در طول موج 240 نانومتر برای مدت زمان 2 دقیقه اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم بر اساس آب اکسیژنه تجزیه شده در هر دقیقه به ازای هر گرم بذر با ضریب خاموشی (ε) برابر با L.mmol-1 cm-1 40 بیان شد.
.استخراج و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز: استخراج آنزیم پراکسیداز با روش Murthy و همکاران (2002) انجام شد. برای استخراج آنزیم یک گرم بذر کدوی تخم کاغذی با 3 میلی‌لیتر بافر استخراج در هاون چینی درون ظرف یخ کوبیده و همگن شد. پس از آن، محلول همگن از دو لایه پارچه ململ عبور داده شد و عصاره حاصل پس از انتقال به میکروتیوب، به مدت 15 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ، فاز میانی در زیر لایه لیپیدی برای اندازه گیری فعالیت آنزیم استفاده شد. اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز با روش Resende و همکاران (2002) با اندکی تغییرات انجام شد. مخلوط واکنش حاوی 750/2 میلی‌لیتر بافر فسفات مونو سدیک (25 میلی‌مولار) با اسیدیته برابر با 8/6، 100 میکرولیتر پیرو گالول (10 میلی‌مولار)، 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی و 100 میکرولیتر آب اکسیژنه (40 میلی‌مولار) به حجم نهایی 3 میلی‌لیتر بود. با اضافه کردن آب اکسیژنه به مخلوط واکنش فعالیت آنزیمی آغاز شد. در محلول بلانک به جای آب اکسیژنه از آب مقطر استفاده گردید. تغییرات جذب نور در اثر تولید پورپورو گالین از پیروگالول در طول موج 420 نانومتر برای مدت زمان 2 دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس ضریب خاموشی (ε) برابر با mM-1 cm-1 47/2 محاسبه گردید.
اندازه‌گیری هدایت الکتریکی بذرها: برای اندازه‌گیری هدایت الکتریکی در ظروف بشر 500 میلی‌لیتری مقدار 250 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه گردید. برای جلوگیری از آلودگی کلیه بشرها با فویل آلومینیومی پوشانیده شدند و پیش از قرار دادن بذرها در داخل آنها، به مدت 24 ساعت در انکوباتوری با دمای 20 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا از لحاظ دما به تعادل برسند. سه تکرار 50 تایی از هر نمونه بذر شمارش و وزن آنها تعیین شد و پس از توزین در بشرهای محتوی آب مقطر قرار گرفتند. سپس، کلیه بشرها به وسیله فویل آلومینیومی پوشانیده شد و در انکوباتور با دمای 20 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. در پایان، دوره 24 ساعت خیساندن بذر، هدایت الکتریکی نمونه‌ها با ECمتر اندازه‌گیری شد. میزان هدایت الکتریکی هر نمونه به ازای هر گرم بذر بر اساس رابطه 2 محاسبه شد (Hampton and TeKrony, 1995):
رابطه 2: هدایت الکتریکی= قابلیت هدایت الکتریکی (میکروزیمنس بر سانتی‌متر)/ وزن نمونه بذر (گرم)
تحلیل داده‌ها: محاسبات آماری و تحلیل داده‌ها با نرمافزار آماری SAS نسخه 1/9 به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد و مقایسه میانگین با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج
درصد جوانه‌زنی: بین دوره‌های زوال، دماها و رطوبت بذر و تأثیر متقابل دوره زوال و دما، دوره زوال و رطوبت بذر، دما و رطوبت بذر و تأثیر دوره زوال، دما و رطوبت بذر از لحاظ درصد جوانه‌زنی اختلاف معنی‌داری وجود داشت (جدول 1). با افزایش دوره زوال از 2 به 4 روز، درصد جوانه‌زنی کاهش یافت به طوری که درصد جوانه‌زنی در 2 و 4 روز زوال به ترتیب: 22/80 و 67/58 درصد بود. همچنین، با افزایش دما از 35 به 50 درجه سانتیگراد، درصد جوانه‌زنی نیز کاهش یافت به طوری که درصد جوانه‌زنی در دمای 35 و 50 درجه سانتیگراد به ترتیب: 33/87 و 56/51 درصد بود (جدول 1). بین سطوح رطوبت بذر نیز از لحاظ درصد جوانه‌زنی اختلاف معنی‌داری وجود داشت. با افزایش رطوبت بذر، درصد جوانه‌زنی برای رطوبت‌های بذر: 5، 8 و 14 درصد به ترتیب: 33/87، 0/66 و 0/55 درصد بود. در شکل 1 اثر متقابل دوره زوال، دما و رطوبت بذر بر درصد جوانه‌زنی کدوی تخم کاغذی ارایه شده است. همان طور که ملاحظه می‌شود در دمای 35 درجه سانتیگراد بین سطوح رطوبت بذر از لحاظ درصد جوانه‌زنی اختلاف معنی‌داری وجود نداشت و بذرها دارای درصد جوانه‌زنی مشابهی بودند در حالی که در دمای 50 درجه سانتیگراد با افزایش رطوبت بذر، درصد جوانه‌زنی به شدت کاهش یافت به طوریکه درصد کاهش در تیمار 4 روز زوال بیشتر از 2 روز زوال بود.
جدول 1- خلاصه نتایج تجزیه واریانس و مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی، پراکسیداسیون لیپید و هدایت الکتریکی کدوی تخم کاغذی در دماها و سطوح رطوبت بذر در دو دوره زمانی زوال (2 و 4 روز). * و ** به ترتیب معنی‌دار در سطح احتمال یک و 5 درصد، ns. غیرمعنی‌دار.
|
منابع تغییر |
درصد جوانه‌زنی |
پراکسیداسیون لیپید |
هدایت الکتریکی |
|
خلاصه تجزیه واریانس |
|
|
|
|
دوره زوال |
** |
* |
** |
|
دما |
** |
** |
Ns |
|
رطوبت بذر |
** |
ns |
** |
|
اثر متقابل دوره زوال و دما |
** |
* |
ns |
|
اثر متقابل دوره زوال و رطوبت بذر |
** |
* |
ns |
|
اثر متقابل دما و رطوبت بذر |
** |
* |
ns |
|
اثر متقابل دوره زوال و دما و رطوبت بذر |
* |
* |
ns |
|
تیمار |
درصد جوانه‌زنی |
پراکسیداسیون لیپید |
هدایت الکتریکی |
|
دوره زوال (روز) |
|
|
|
|
2 |
a22/80 |
b92/16 |
b02/36 |
|
4 |
b67/58 |
a97/22 |
a67/40 |
|
LSD (0.05) |
45/5 |
03/5 |
13/3 |
|
دما (درجه سانتیگراد) |
|
|
|
|
35 |
a33/87 |
b99/13 |
b95/36 |
|
50 |
b56/51 |
a90/25 |
a73/39 |
|
LSD (0.05) |
44/5 |
03/5 |
13/3 |
|
درصد رطوبت بذر |
|
|
|
|
5 |
a33/87 |
a11/21 |
b62/34 |
|
8 |
b00/66 |
a62/18 |
b41/36 |
|
14 |
c00/55 |
a62/20 |
a00/44 |
|
LSD (0.05) |
67/6 |
17/6 |
83/3 |
پراکسیداسیون لیپید: بر اساس جدول تجزیه واریانس، بین دوره‌های زوال و دماها و تأثیر متقابل دوره زوال و دما، دوره زوال و رطوبت بذر، دما و رطوبت بذر و تأثیر سه گانه دوره زوال، دما و رطوبت بذر از لحاظ میزان پراکسیداسیون لیپیدها بذرهای کدوی تخم کاغذی اختلاف معنی‌داری وجود داشت (جدول 1). بین سطوح دوره زوال از لحاظ پراکسیداسیون لیپید اختلاف معنی‌داری وجود داشت. میزان پراکسیداسیون در دوره زوال 2 و 4 روز به ترتیب: 92/16 و 97/22 نانومول مالون دی آلدهید بر گرم بذر بود. با افزایش دما از 35 به 50 درجه سانتیگراد نیز پراکسیداسیون لیپید افزایش یافت، به طوری که مقدار آن در دماهای 35 و 50 درجه سانتیگراد به ترتیب: 99/13 و 90/25 نانومول مالون دی آلدهید بر گرم بذر بود (جدول 1). در شکل 2 واکنش پراکسیداسیون لیپید در سطوح دمایی و رطوبتی در بذرهای کدوی تخم کاغذی ارایه شده است. در 2 روز زوال و در دمای 35 درجه سانتیگراد با افزایش رطوبت بذر میزان پراکسیداسیون لیپید چندان تغییری نداشت و تقریباً مقدار آن مشابه بود اما در دمای 50 درجه سانتیگراد بین سطوح رطوبت از لحاظ این صفت اختلاف معنی‌داری وجود داشت، به طوری که میزان آن در رطوبت 14 درصد بیشتر از رطوبت‌های 5 و 8 درصد بود. اما در 4 روز زوال و در دمای 35 درجه سانتیگراد با افزایش سطوح رطوبت بذر، مقدار پراکسیداسیون لیپید کاهش یافت به طوری که میزان آن در سطوح رطوبت 5، 8 و 14 درصد به ترتیب: 23/26، 93/9 و 41/6 نانومول مالون دی آلدهید بر گرم بذر بود و در دمای 50 درجه سانتیگراد میزان پراکسیداسیون لیپید افزایش یافت و میزان آن در سطوح رطوبت بذر 5، 8 و 14 درصد به ترتیب: 56/26، 41/38 و 04/30 نانومول MDA بر گرم بذر بود. همچنین، میزان پراکسیداسیون لیپید در تیمار 4 روز زوال بیشتر از 2 روز زوال بود (شکل 2).
|
شکل 1- تأثیر دما و رطوبت بذر بر درصد جوانه‌زنی بذرهای کدو تخم کاغذی در 2 و 4 روز زوال. مقادیر میانگین 3 تکرار ±SE است. اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است. |
|
|
|
|
|
شکل 2- تأثیر دما و رطوبت بذر بر مقدار پراکسیداسیون لیپید بذرهای کدو تخم کاغذی در 2 و 4 روز زوال. مقادیر میانگین 3 تکرار ±SE است. اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است. |
|
هدایت الکتریکی بذرهای زوال یافته: بین دماها و تأثیر متقابل دوره زوال و دما، دوره زوال و رطوبت بذر، دما و رطوبت بذر تأثیر متقابل سه گانه دوره زوال، دما و رطوبت بذر از لحاظ هدایت الکتریکی بذرهای کدوی تخم کاغذی اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما بین دوره زوال و سطوح رطوبت بذر از لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری وجود داشت (جدول 1). با افزایش دوره زوال از 2 به 4 روز هدایت الکتریکی افزایش یافت. همچنین، با افزایش سطوح رطوبت از 5 به 14 درصد، هدایت الکتریکی بذرهای کدوی تخم کاغذی افزایش یافت که میزان آن در رطوبت‌های 5، 8 و 14 درصد به ترتیب: 62/34، 41/36 و 0/44 میکروزیمنس بر سانتی‌متر بر گرم بود. شکل 3 مقدار هدایت الکتریکی بذر در سطوح دمایی و رطوبتی را نشان می‌دهد. همان طور که ملاحظه می‌شود در 2 روز زوال در هر دو دما با افزایش رطوبت بذر، هدایت الکتریکی بذرها افزایش یافت که میزان آن در دمای 35 درجه سانتیگراد در رطوبت‌های 5، 8 و 14 درصد به ترتیب: 31، 34 و 39 میکروزیمنس بر سانتی‌متر بر گرم و در دمای 50 درجه سانتیگراد به ترتیب: 33، 35 و 43 میکروریمنس بر سانتی‌متر بر گرم بود. در 4 روز زوال نیز در هر دو دما با افزایش رطوبت بذر، هدایت الکتریکی به طور خطی افزایش یافت و میزان آن در دمای 35 درجه سانتیگراد و رطوبت 5، 8 و 14 درصد به ترتیب: 35، 39 و 43 میکروزیمنس بر سانتی‌متر بر گرم و در دمای 50 درجه سانتیگراد به ترتیب: 39، 38 و 51 میکروزیمنس بر سانتی‌متر بر گرم بود. به طور کلی، در تیمار 4 روز زوال در کلیه سطوح دمایی و رطوبتی مقدار هدایت الکتریکی بذرها بیشتر از تیمار 2 روز زوال بود.
|
شکل 3- تأثیر دما و رطوبت بذر بر هدایت الکتریکی بذرهای کدو تخم کاغذی در 2 و 4 روز زوال. مقادیر میانگین 3 تکرار ±SE است. اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است. |
|
فعالیت آنزیم‌کاتالاز: در شکل 4 میزان فعالیت آنزیم‌کاتالاز در تیمارهای 35 درجه سانتیگراد، 5 درصد رطوبت بذر و 2 روز زوال ( به عنوان شاهد) با تیمار حداکثر زوال (50 درجه سانتیگراد، 14 درصد رطوبت و 4 روز زوال) ارایه شده است. میزان فعالیت آنزیم‌کاتالاز در تیمار زوال یافته کمتر از تیمار شاهد بود که این کاهش از لحاظ آماری معنی‌دار بود. میزان فعالیت آنزیم‌کاتالاز در تیمار شاهد و زوال به ترتیب: 25/524 و 25/365 نانومول بر دقیقه بر گرم بذر بود.
فعالیت آنزیم پراکسیداز: میزان فعالیت این آنزیم نیز همانند آنزیم‌کاتالاز در تیمار شاهد بیشتر از تیمار زوال بود که اختلاف این دو تیمار از لحاظ آماری معنی‌دار بود (شکل 5). مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار شاهد و زوال به‌ترتیب: 15/9009 و 87/4695 نانومول بر دقیقه بر گرم بذر بود. به بیان دیگر، میزان فعالیت این آنزیم‌در تیمار زوال در حدود 45 درصد کمتر از تیمار شاهد بود.
|
شکل 4- مقایسه میزان فعالیت آنزیم‌کاتالاز در کدوی تخم کاغذی در تیمار 1 (35 درجه، رطوبت 5 درصد و 2 روز زوال) با تیمار 2 (50 درجه، رطوبت 14 درصد و 4 روز زوال). مقادیر میانگین 3 تکرار ±SE است. اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است. |
شکل 5- مقایسه میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در کدوی تخم کاغذی در تیمار 1 (35 درجه، رطوبت 5 درصد و 2 روز زوال) با تیمار 2 ( 50 درجه، رطوبت 14 درصد و 4 روز زوال). مقادیر میانگین 3 تکرار ±SE است. اختلاف معنی‌دار در سطح P≤0.05 است. |
بحث
با افزایش دما و رطوبت بذر و طول دوره زوال، درصد جوانه‌زنی کاهش یافت (شکل 1). کاهش درصد جوانه‌زنی بذر در هر دو تیمار مدت زوال، با افزایش دما و رطوبت بیشتر بود. همچنین، در کلیه سطوح دمایی و رطوبتی درصد جوانه‌زنی در تیمار 4 روز زوال کمتر از 2 روز زوال بود. کاهش درصد جوانه‌زنی طی زوال بذر در گیاهان مختلف گزارش شده است (Kalpana and Madhava Rao, 1994؛ Shekaramurthy et al., 1994؛ Trawatha et al., 1995؛ Basra et al., 2003؛ Freitas et al., 2006).
چندین مطالعه جامع علت اصلی زوال بذر را پراکسیداسیون لیپید ناشی از افزایش رادیکال‌های آزاد اکسیژن گزارش کرده‌اند Priestley, 1986)؛ Smith and Berjak, 1995؛ (Walters, 1998. رادیکال‌های آزاد شامل آنیون سوپراکسید، هیدروژن پراکسید، رادیکال‌های هیدروژن و اکسیژن منفرد هستند که هر کدام از این رادیکال‌های آزاد از راه‌های متفاوتی به سلول خسارت وارد می‌کنند McDonald, 1999)؛ (Blokhina et al., 2003. تعیین مقدار مالون دی آلدهید به عنوان یکی از محصولات جانبی تولید شده از اسیدهای چرب غیر اشباع طی فرآیند پراکسیداسیون، روشی رایج برای کمّی‌سازی مقدار پراکسیداسیون لیپیدها است Stewart and Bewley, 1980)؛ Bhattacharjee and Mukherjee, 1998؛ Chang and Sung, 1998). در دمای 35 درجه سانتیگراد، در رطوبت کمتر از 6 درصد، میزان پراکسیداسیون لیپید افزایش یافت اما میزان آن در رطوبت‌های بالاتر کاهش یافت، در حالی که در دمای 50 درجه سانتیگراد میزان پراکسیداسیون لیپیدها تا رطوبت 8 درصد افزایش یافت و با افزایش رطوبت از 8 به 14 درصد میزان پراکسیداسیون لیپیدها کاهش یافت (شکل 2). همچنین، در دمای 50 درجه سانتیگراد با افزایش دوره زوال از 2 به 4 روز در رطوبت 5 و 8 درصد میزان پراکسیداسیون لیپید افزایش یافت اما در رطوبت بذر 14 درصد تغییر چندانی نداشت. در مطالعه‌ای که در بذر گیاه ماش صورت گرفت، Murthy و همکاران (2003) گزارش کردند که در رطوبت بذر بین 8 تا 14 درصد پراکسیداسیون لیپید افزایش و در رطوبت بالاتر از 16 درصد، پراکسیداسیون لیپید کاهش می‌یابد. در پژوهش حاضر در رطوبت بذر حدود 14 درصد، میزان پراکسیداسیون لیپید نسبت به رطوبت 8 درصد کمتر بود که گویای این مطلب است که در گیاه کدوی تخم کاغذی با افزایش رطوبت بذر از 8 به 14 درصد نقش پراکسیداسیون لیپید در کاهش زوال بذر کمتر است و عوامل دیگری در زوال بذر این گیاه دخیل است. به هر صورت، گزارش‌هایی وجود دارد که نشان می‌دهد پراکسیداسیون لیپید نقش مهمی در زوال بذر برخی از گونه‌ها نظیر: دال عدس (Kalpana and Madhava Rao, 1996)، گندم (Girard and Le Meste, 1992) و ذرت (Linn and Pearce, 1990) ندارد. در بذرهای آفتابگردان نیز در برخی از دامنه‌های رطوبتی رابطه مستقیمی بین زوال و پراکسیداسیون لیپید وجود ندارد (Kibinza et al., 2006). باید دانست که مالون دی آلدهید برآوردی از میزان پراکسیداسیون لیپید است و برای بررسی دقیق‌تر باید محصولات ناشی از پراکسیداسیون لیپید مانند لیپید-هیدروپراکسیدها را اندازه‌گیری کرد، زیرا مالون دی آلدهید تنها از اسیدهای چرب با سه یا تعداد بیشتری پیوند دوگانه شکل می‌گیرد در صورتی که بافت‌های گیاهی اغلب دارای سطوح بالایی از اسیدهای چرب با دو پیوند دوگانه هستند (Griffiths et al., 2000). همچنین، ممکن است در این محدوده رطوبتی سیستم‌های ترمیمی فعال شوند زیرا در این محدوده پراکسیداسیون لیپیدها در حداقل مقدار خود است و رطوبت کافی برای عمل بافری آب در مقابل حمله رادیکال‌های آزاد که سبب اکسیداسیون خودبه‌خودی می‌شوند وجود دارد اما رطوبت کافی برای عمل آنزیم لیپوکسیژناز و تولید رادیکال‌های آزاد حاصل از آن وجود ندارد (McDonald, 1999).
برای مطالعه دقیق‌تر تأثیر زوال بذر بر فعالیت آنزیمهای پاداکسایشی، از مقایسه تیمار شاهد و تیمار حداکثر زوال (50 درجه سانتیگراد و 14 درصد رطوبت و 4 روز زوال) استفاده شد. در شکل‌های 3 و 4 میزان فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز در تیمارهای شاهد و حداکثر زوال ارایه شده است. میزان فعالیت این دو آنزیم در بذرهای این گیاه تحت تأثیر زوال تغییر کرد. همان طور که مشاهده می‌شود میزان فعالیت این آنزیم‌ها در تیمار زوال یافته در مقایسه با شاهد کمتر بود. میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار زوال یافته نسبت به شاهد بیشتر از کاتالاز تحت تأثیر زوال قرار گرفته بود. گزارش‌های متعدد گویای آن است که با کاهش فعالیت آنزیمهای پالاینده اکسیژن فعال میزان رادیکال‌های آزاد اکسیژن افزایش می‌یابد (Chiu et al., 1995؛ Bailly et al., 1996؛ Hsu and Sung, 1997؛ Torres et al., 1997؛ (Rao et al., 2006. در شرایط معمول برای جلوگیری از آسیب رادیکال‌های آزاد، سیستم‌های دفاعی پاداکسایشی در گیاهان وجود دارد (Alscher et al., 2002) . این سیستم‌ها شامل آنزیم‌هایی نظیر: کاتالاز، سوپر اکسید دیسموتاز، آسکوربات پراکسیداز، دی هیدرو آسکوربات ردوکتاز و گلوتاتیون ردوکتاز و ترکیبات پاداکسایشی نظیر: آسکوربات و گلوتاتیون هستند (Gillham and Dodge, 1986؛ Smit et al., 1989؛ (Asada, 1992. در شرایط تنش اکسیداتیو موازنه بین تولید رادیکال‌های آزاد و این سیستم‌های دفاعی مختل می‌شود، در نتیجه میزان رادیکال‌های آزاد افزایش می‌یابد. Chang و Sung (1998) گزارش کردند که در بذرهای ذرت، با افزایش طول دوره زوال میزان فعالیت آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز و گلوتاتیون پراکسیداز کاهش و میزان پراکسیداسیون لیپید افزایش می‌یابد. همچنین، در بذرهای آفتابگردان زوال طی انبارداری به کاهش فعالیت آنزیمهای سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون ردوکتاز منجر شد Bailly et al., 1996)؛ (Kibinza et al., 2006. در بادام زمینی نیز با افزایش دوره زوال (تسریع پیری) فعالیت آنزیمهای سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز کاهش یافت (Sung and Jeng, 1994). همچنین، کاهش فعالیت آنزیمهای پالاینده اکسیژن در گیاه ماش نیز گزارش شده است (Murthy et al., 2002).
با کاهش فعالیت آنزیمهای پالاینده اکسیژن فعال، میزان رادیکال‌های آزاد افزایش می‌یابد. تولید و انباشتگی رادیکال‌های آزاد به خسارت به اسیدهای چرب غیر اشباع غشاهای سلولی منجر شده، در ادامه رادیکال‌های آزاد دیگری تولید می‌شوند که این رادیکال‌ها با یکدیگر ترکیب می‌شوند و در نهایت، کلیه این تغییرات به اختلال در عملکرد غشا، افزایش ویسکوزیته غشا، افزایش نفوذپذیری و نشت مواد از بذر طی آبگیری و افزایش هدایت الکتریکی منجر می‌شوند (Priestly, 1986). همان طور که در شکل 3 ملاحظه می‌شود با افزایش دوره زوال از 2 به 4 روز میزان هدایت الکتریکی افزایش یافت. همچنین، با افزایش رطوبت بذر و دما هدایت الکتریکی افزایش یافت. افزایش هدایت الکتریکی بذر ناشی از اضمحلال غشا به علت حمله رادیکال‌های آزاد به اسیدهای چرب غیر اشباع است که به از بین رفتن انسجام غشایی منجر می‌شود از این رو، سرعت واکنش‌های اکسیداتیو به میزان غیر اشباعی بودن اسیدهای چرب بستگی دارد و هر چه میزان آن بیشتر باشد تنش اکسیداتیو نیز بیشتر خواهد شد (Braccini et al., 2000).
به طور کلی، نتایج پژوهش حاضر نشان داد که طی زوال بذرهای کدوی تخم کاغذی، فعالیت آنزیمهای پالاینده رادیکال‌های آزاد اکسیژن کاهش می‌یابد که نتیجه آن افزایش رادیکال‌های آزاد اکسیژن و به دنبال آن افزایش پراکسیداسیون لیپید و تخریب غشا سلولی است. مجموعه این عوامل باعث کاهش کیفیت بذر طی زوال در این گیاه می‌گردد. این نتایج به روشنی بیانگر این مطلب است که بین کاهش فعالیت آنزیمهای پالاینده رادیکال‌های آزاد، پراکسیداسیون لیپید و زوال بذر کدوی تخم کاغذی طی پیری ارتباط وجود دارد و می‌توان بیان داشت که یکی از علت‌های اصلی زوال در بذر کدوی تخم کاغذی طی انبارداری پراکسیداسیون لیپیدها است.
سپاسگزاری
نگارندگان از معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان به خاطر فراهم نمودن امکانات اجرای این طرح، قدردانی می‌نمایند.
)
