Authors
Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Horticulture, Ilam University, Ilam, Iran
Abstract
Keywords
.
گونههای جنس پسته متعلق به تیره Anacardiaceae، به طور وسیعی در مناطق خاورمیانه رویش دارند. پسته وحشی یا بنه (Pistacia atlantica ssp. mutica) درختی دو پایه و سازگار با آب و هوای خشک است (Arefi et al., 2007). درختان بنه واقع در جنگلهای زاگرس، به دلیل داشتن ارزشهای متعدد زیستمحیطی و اقتصادی بودن صمغ و بذر دارای اهمیت ویژهای هستند. بنه دارای صمغ با ارزشی به نام سقز است که در مصارف مختلفِ دارویی، صنعتی و خوراکی نقش دارد (Jahanbazy-Gojani et al., 2006; 2012). اما عوامل متعددی از جمله: قطع درخت، چرای دام و بهرهبرداری بیرویه از میوه و شیرابه درختان بنه، رشد و تجدید حیات این گونه با ارزش را تهدید مینماید (Negahdar-Saber and Abbasi, 2010).
تکثیر بنه از طریق بذر با مشکلاتی از قبیلِ تولید میوههای پوک مواجه است. همچنین با توجه به دگرگشن بودن این گونهها، در نتاج حاصل از تکثیر جنسی تفرق صفات حاصل شده و نهالهای حاصله از نظر ویژگیهای ژنتیکی تغییر مییابند. بنابراین، از چند دهه پیش استفاه از تکثیر غیرجنسی برای توسعه باغات و گونههای درختی توصیه شده است. اما با توجه به این که تکثیر و ریشهزایی درختان بنه نسبت به گونههای درختی دیگر بسیار مشکل است (Onay, 2000; 2003) و همچنین با توجه به محدودیت منابع آب و خاک، استفاده از روشهای درون شیشهای و ریزازدیادی به منظور تکثیر انبوه و عاری از عوامل بیماریزا در مقیاس وسیع، به ویژه برای گونههای نر عقیم و ناسازگار، یا گیاهانی که ازدیاد غیرجنسی آنها با روشهای معمول غیرممکن یا مشکل است، ارزشمند و امری ضروری به نظر میرسد Akbari-Khabbaz 2007)؛ Rajabpoor et al., 2011). به طور کلی، هدف از ریزازدیادی، تکثیر انبوه و عاری از عوامل بیماریزا از یک گیاه در زمانی معین، در مقیاس وسیع و در عین حال ایجاد مجموعهای از گیاهان با ویژگیهای ژنتیکی یکسان و با صفات کمی و کیفی مورد نظر است (Modarres et al., 2012).
نخستین تلاشها برای تکثیر آزمایشگاهی و ریزازدیادی گونههای پسته توسط Barghchi (1982) انجام شد. سپس، استفاده از روشهای کشت بافت به عنوان جایگزینی برای روشهای سنتی به طور چشمگیر افزایش یافت. در بیشتر مطالعات انجام شده روی پسته، از ریزنمونههای جوان و رشد یافته در گلخانه برای استقرار کشتهای آزمایشگاهی استفاده شده است
Barghchi and Alderson, 1985)؛ Parfitt and Almehdi, 1994؛ (Ozden-Tokatli, 2004; 2006. در پژوهش حاضر، ریزازدیادی سریع پسته وحشی از روشهای کشت بافت بررسی شده است.
مواد و روشها.
بذرهای بالغ بنه جمعآوری شده از رویشگاههای طبیعی استان ایلام پس از حذف پوسته بیرونی (پریکارپ) در گلدانهای محتوی خاک و ماسه با نسبت 1:1 کاشته شدند.گیاهچههای جوان به مدت 15 دقیقه با آب معمولی، 10 دقیقه با هیپوکلریت سدیم (یک درصد) و در نهایت سه بار با آب مقطر شستشو، ضدعفونی و گندزدایی شدند. دو نوع ریزنمونه شامل: مریستم نوک شاخساره (مریستم انتهایی) و قطعات گره (مریستم جوانه جانبی) از گیاهچههای ضدعفونی شده تهیه شد و درون لولههای آزمایش استریل حاوی 15 تا 20 میلیلیتر محیطکشت MS (Murashige and Skoog, 1962) تکمیل شده با ویتامینهای B5 (Gamborg et al., 1968)، تنظیمکنندههای رشد 6- بنزیل آمینوپورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) هر کدام 2 میلیگرم در لیتر و ترکیب هر یک از آنها با ایندول 3- استیک اسید (IAA) با غلظت 1 میلیگرم در لیتر، 3 درصد سوکروز، 200 میلیگرم در لیتر کازئین هیدولیزات، 7/0درصد آگار و 3/0 درصد زغال فعال مستقر شدند. اسیدیته محیط کشت روی 8/5 تنظیم شد. لولههای آزمایش توسط پنبه و فویل آلومینیوم استریل مسدود و در اتاقک رشد با دوره نوری 16:8 (L:D)، شدت نور برابر با 40 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه و دمای 1±25 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
ریزشاخههای باززا شده برای زدودن کاملِ بقایای آگار، با آب معمولی شسته و انتهای آنها با احتیاط خراشیده شد، سپس در تیمارهای مختلفِ شاهد، پودر ریزوپون (یک درصد) و محلول ایندول 3- بوتیریک اسید (IBA) با غلظت 1 گرم در لیتر فرو برده شدند. گیاهچهها به گلدانهای کوچک حاوی مخلوط استریل خاک، ورمیکولیت و پرلیت (1:1:1) منتقل شدند و به منظور ایجاد شرایط رطوبتی بالا توسط درپوشهای شفاف پوشانده و در شرایط نور غیرمستقیم نگهداری شدند.
تحلیل آماری: صفات تعداد و طول شاخه، تعداد برگ، تعداد و طول ریشه و درصد ریشهزایی اندازهگیری شدند و دادهها به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در پنج تکرار بررسی شدند. تحلیل دادهها با نرمافزار آماری SAS نسخه 2/9 و مقایسه میانگینها با آزمون چند دامنهای دانکن در سطح 5 درصد انجام شد.
نتایج.
هشت روز پس از استقرار کشتهای شاخهزایی، تکثیر ریزنمونهها آغاز شد (شکل 1- A تا D). نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که بین ریزنمونههای مختلف برای تمامی صفات بررسی شده تفاوت معنیدار وجود دارد. از سوی دیگر، محیط کشتهای مختلف و همچنین اثر متقابل آنها با انواع ریزنمونهها، تنها برای صفت طول شاخه اختلاف معنیدار داشت (جدول 1).
بر اساس نتایج به دست آمده از مقایسه میانگین تیمارهای مورد بررسی، ریزنمونه قطعات گرهی برای تمامی صفات ارزیابی شده بالاترین مقادیر را تولید کرد (شکل 2). از سوی دیگر، محیطکشت حاوی TDZ+IAA به عنوان بهترین محیطکشت برتی تولید بلندترین شاخههای تولید شده از ریزنمونه مریستم انتهایی در مقایسه با سایر ترکیبات هورمونی شناخته شد (شکل 3).
نتایج تجزیه واریانس نشان دهنده عدم وجود تفاوت معنیدار بین محیطکشتهای بررسی شده برای صفات تعداد شاخه و برگ بود. مطابق این نتایج، افزودن IAA به هورمونهای بررسی شده هیچ گونه تأثیر مثبت یا منفی بر این صفات نداشت (جدول 1).
با توجه به تجزیه واریانس برهمکنش تیمارهای مورد بررسی، کمترین مقادیر برای صفت طول شاخه مربوط به استفاده از TDZ و ریزنمونه مریستم انتهایی بود و افزودنِ IAA به این تنظیم کننده، تأثیر چشمگیری بر بهبود طول شاخههای تولید شده از این ریزنمونه داشت. به طوری که برهمکنش ریزنمونهها و تنظیمکنندههای مختلف برای صفت طول شاخه دارای اختلاف معنیدار در سطح یک درصد بود و بلندترین شاخهها با طول 13 میلیمتر با استفاده از ریزنمونه مریستم انتهایی و در محیطکشت حاوی TDZ+IAA تولید شدند. اما در مورد ریزنمونه قطعات گرهی این روند صادق نبود (جدول 1، شکل 3).
نخستین ریشهها 12 روز پس از آغاز آزمایش پدیدار شدند (شکل 1- E تا F). با توجه به نتایج مقایسه میانگین، تفاوت معنیداری بین تیمارهای IBA و ریزوپون برای هیچ کدام از صفات اندازهگیری شده مشاهده نشد. به طوری که هر دو تیمار در مقایسه با تیمار شاهد، تأثیر مطلوبی بر ریشهزایی داشتند، به نحوی که استفاده از پودر ریزوپون و محلول IBA به ترتیب موجب 90 و 60 درصد ریشهزایی شد (شکل 4).
شکل 1- باززایی بنه با استفاده از ریزنمونه قطعات گرهی و تنظیمکنندههای رشد مختلف: (A BAP؛ (B BAP+IAA؛ (C TDZ؛
(D TDZ+IAA؛ (E ریشهزایی تحت تأثیر ریزوپون؛ (F ریشهزایی تحت تأثیر محلول IBA.
جدول 1- تجزیه واریانس تیمارهای مختلف و برهم کنش آنها بر صفات شاخهزایی. ** تفاوت معنیدار در سطح P<0.01، * تفاوت معنیدار در سطح P<0.05 و ns عدم تفاوت معنیدار.
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
||
|
تعداد شاخه |
تعداد برگ |
طول شاخه (میلیمتر) |
||
|
ریزنمونه |
1 |
02/38** |
*02/42 |
10/84** |
|
محیطکشت |
3 |
29/1ns |
36/10ns |
93/25* |
|
ریزنمونه×محیطکشت |
3 |
ns56/1 |
ns56/2 |
77/51** |
|
اشتباه آزمایشی |
32 |
14/1 |
97/7 |
98/6 |
|
شکل 2- تأثیر ریزنمونههای مختلف بر صفات مربوط به شاخهزایی |
||
|
شکل 3- اثر متقابل تنظیم کنندههای مختلف و نوع ریزنمونه بر صفت طول شاخه. ﻣﻘﺎدﻳﺮ، میانگین 5 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن است. |
|
شکل 4- مقایسه تیمارهای مختلف (شاهد، ریزوپون و IBA) بر صفات ریشهزایی پسته وحشی. ﻣﻘﺎدﻳﺮ، میانگین 5 تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن است. |
||
بحث.
توسعه و تکثیر گونههای چوبی نظیر پسته، با روشهای سنتی، زمانبر و پُر هزینه است (Can et al., 2006)، بنابراین، تکنیک کشت بافت می تواند نقش مؤثری بر باززایی سریع این گونهها داشته باشد.
کشت آزمایشگاهی ریزنمونههای گرفته شده از درختان بالغ به خاطر وضعیت فیزیولوژیک آنها بسیار دشوار است و واکنش بافتها سریع نیست. برای غلبه بر این مانع، استفاده از ریزنمونههای گیاهچهای میتواند مؤثر باشد (Yildrim, 2012). در بررسی حاضر، از گیاهچههای جوان بنه برای تهیه ریزنمونههای مریستم انتهایی و قطعات گرهی (مریستم جانبی) استفاده شد. تکثیر شاخه با استفاده از این ریزنمونهها عمومیترین روش در ریزازدیادی گونههای جنگلی محسوب میشود (Akbari-Khabbaz et al., 2007).
در تحقیق حاضر، برای استقرار کشتها از محیطکشت MS همراه با ویتامینهای B5 استفاده شد زیرا معروفترین محیطکشت برای گونههای درختی سخت چوب، محیطکشت MS و انواع رقیق شده آن است (Bonga and Von-Aderkas, 1992) و پژوهشگران مختلف برای ریزازدیادی گونههای جنس پسته از این محیطکشت به همراه ویتامینهای B5 نتایج مطلوبی به دست آوردهاند Tilkat et al., 2009)؛ Benmahioul et al., 2012؛ (Yildrim, 2012. یکی از عوامل اصلی محدود کننده در استقرار و تثبیت کشتهای آزمایشگاهی برای بسیاری از درختان از جمله پسته، قهوهای شدن ریزنمونه است که یک پدیده خودکاتالیزوری است و به دنبال ترشح مواد فنلیِ از بافتهای کشت شده ایجاد میشود. این ترکیبات پس از صدمه دیدن بافت در حین جداسازی ریزنمونه، با فعالیت پلی فنل اکسیدازها اکسید شده، موجب قهوهای یا سیاه شدن بافت مزبور میگردند. محصولات این اکسیداسیون فعالیت آنزیمی را متوقف نموده، ریزنمونه را میکشند و موجب تیره شدن بافتها در محیطکشت میشوند که این امر تثبیت ریزنمونه را به شدت تحت تأثیر قرار میدهد (Gercheva et al., 2008)، بنابراین در آزمایش حاضر از مواد پاداکساینده مانند زغال فعال استفاده شد.
در تحقیق حاضر از 7 گرم در لیتر آگار برای جامد ساختن محیطکشت استفاده شد زیرا میزان جذب تنظیمکنندهها توسط ریزنمونه به میزان سفتی محیطکشت بستگی دارد. به طوری که نرم بودن محیطکشت باعث جذب بهتر آنها و تولید شاخههای بیشتر میشود (Bonga and Von-Aderkas, 1992). این میزان آگار توسط محققان پیشین برای ریزازدیادی گونههای پسته استفاده شده است (Vatanpour Azghandi et al., 2005؛ Benmahioul et al., 2012؛ (Yildrim, 2012. در بررسی حاضر، تمامی ترکیبات هورمونی از جمله BAP، برای صفات تعداد شاخه و برگ دارای کارآیی مطلوب و یکسانی بودند. پیش از این، Sheibani و Villiers (1995) و Ghoraishi (2006) پس از بررسی غلظتهای مختلف BAP نشان داده بودند که مطلوبترین محیطکشت برای گونههای پسته، محیط MS به ترتیب همراهِ با 5 میلیگرم در لیتر و 20 میکرومولار BAP است. Behboodi (2002)، Benmahioul و همکاران (2012) و Yildrim (2012) تأثیر مطلوب تنظیمکننده BAP بر تکثیر آزمایشگاهی گونههای را تأیید نمودند.
در مطالعات گذشته تأثیر هورمون TDZ بر ریزازدیادی گونههای جنس پسته بررسی نشده است، اما برای ریزازدیادی جنسهای دیگر نظیرِ Salvia برتری هورمون BAP نسبت به TDZ گزارش شده است. مطابق این نتایج، هورمون BAP بیشترین تأثیر را بر افزایش تعداد ساقهها به ازای هر ریزنمونه داشت (Arikat et al., 2004؛ Misic et al., 2006؛ Echeverrigaray et al., 2010). برخلاف نتایج سایر پژوهشگران، در مطالعه حاضر استفاده از دو هورمون BAP و TDZ و ترکیب آنها با هورمون IAA کارآیی مشابهی برای ریزازدیادی (تعداد شاخه و برگ) داشتند.
بررسی حاضر نشان داد که ترکیبِ TDZ+IAA باعث تولید بلندترین شاخههای ریزنمونه مریستم انتهایی شد و TDZ به تنهایی برای صفت طول شاخه این ریزنمونه کارآیی چندانی نداشت. در حالی که افزودنِ IAA به BAP بر بهبود شاخهزایی مریستم انتهایی تأثیری نداشت.
ریشهزایی در شرایط خارج از آزمایشگاه می تواند به عنوان روشی ساده و کم هزینه به کار گرفته شود، به طوری که در این روش تعداد ریشه و کیفیت سیستم ریشهای گیاهچههای باززایی شده دارای کارآیی بالایی است (Huang et al., 2011). این سیستم برای گونههای چوبی دیگر نظیرِ: Quercus robur (Meier-Dinkel et al., 1993)، Fraxinus spp. (Kim et al., 1998) و Ceratonia siliqua (Romano et al., 2002) نیز به کار گرفته شده است.
تأثیر مثبت ریزوپون (2 درصد) بر ریشهزایی پسته اهلی (P. vera) برای نخستین بار توسط Benmahioul و همکاران (2012) مطالعه شده است. نتایج آنها نشان داد که 78 درصدِ گیاهچههای تیمار شده با ریزوپون، 8/3 ریشه تولید کردند. در مطالعه حاضر نیز استفاده از هر دو تیمار ریزوپون و محلول IBA به افزایش درصد ریشهزایی منجر شد. علاوه بر این، در گزارشهای Benmahioul و همکاران (2012)، ریشهزایی 2 تا 3 هفته پس از اجرای آزمایش صورت گرفت، در حالی که در آزمایش حاضر ریشهزایی در مدت زمان کوتاهتر و پس از 10-12 روز انجام گرفت. بنابراین، به نظر میرسد که گونههای مختلف جنس پسته پاسخهای نسبتاً متفاوتی به ریزوپون نشان میدهند.
جمعبندی.
تکثیر ﻏﯿﺮﺟﻨﺴــﯽﮔونههای پسته ﺑﺎ روشﻫﺎی ﻣﻌﻤﻮل ﻣﺸﮑﻞ ﯾﺎ ﻏﯿﺮﻣﻤﮑﻦ اﺳــﺖ. از سوی دیگر، استفاده بیش از حد و غیر اصولی از درختان پسته وحشی به منظور استخراج عصاره و استفادههای دیگر، تکثیر آن را با مشکل مواجه ساخته است (Bahrani et al., 2010). تا جایی که سن اغلب درختان پسته وحشی بیش از 50 سال است و در سالهای اخیر باززایی آنها، به جز در برخی مناطق که خارج از دسترس حیوانات اهلی هستند با مشکل مواجه است (Pourreza et al., 2008)، بنابراین، اﺳﺘﻔﺎده از روشﻫﺎی ﺟﺎﯾﮕﺰﯾﻦ ﺑﺮای ﺗﮑﺜﯿﺮ اﯾﻦﮔﻮﻧﻪ اﻣﺮی ﺿﺮوری اﺳﺖ.
با توجه به نتایج بررسی حاضر و مطالعات گذشته مشخص میشود که استفاده از تنظیمکننده BAP به منظور شاخهزایی ریزنمونهها کارآیی مطلوبی دارد.
انجام مراحل ریشهانگیزی و طویل شدن ریشه در خارج از شیشه، روشی معمولتر است و برای بسیاری از گونهها که به راحتی ریشه نمیدهند و سازگار نمیشوند به ویژه گونههای چوبی، ریزقلمهها در شرایط خارج از آزمایشگاه ریشهزا میشوند. علاوه بر این، تعداد ریشهها،کیفیت و کمیت ریشههای تولید شده در این روش بهتر خواهد بود و هنگام انتقال به مزرعه نیز دارای نسبت بقای بالاتری خواهند بود. در این حالت، از کشتهای درون شیشهای فقط برای تولید پایههای عاری از بیماری یا گیاهان تغییر یافته استفاده میشود (Benmahioul et al., 2012).
بنابراین میتوان گفت که ریشهزایی در شرایط گلخانهای مناسبتر از ریشههای تشکیل شده در آزمایشگاه است. به علاوه، ریشهزایی گلخانهای میتواند به عنوان یک فرصت برای بهبود کارآیی ریزازدیادی از دیدگاه زیستی و اقتصادی مطرح شود.
سپاسگزاری.
نگارندگان از حمایت و همکاری مسؤولان و کارکنان دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام تشکر و قدردانی مینمایند.
)
