Molecular study of the chlorella algae and determining its functional features with the approach of hydrogenase gene expression

Mousavi, Seyedeh Tayebeh; Jafarian, Vahab; Bahari, Abbas

doi:10.22108/ijpb.2016.21033

Molecular study of the chlorella algae and determining its functional features with the approach of hydrogenase gene expression

Document Type : Original Article

Authors

¹ Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Zanjan, Zanjan, Iran

² Research Institute of Modern Biological Techniques, University of Zanjan, Zanjan, Iran

10.22108/ijpb.2016.21033

Abstract

Biohydrogen production by biological processes are known as a renewable energy source. The aim of the investigation was to find and optimize the most appropriate medium for the algae growth to produce the maximum amount of hydrogen. First of all, the bioinformatics and biosystematics studies were taken for identifying the collected microalgae which was detected as Chlorella with the following features: spherical appearance, spent protozoan, Cup-shaped chloroplast with no flagella. On the other hand, the molecular analysis by PCR and 18S sequence typing of interested microalgae demonstrated 100% similarity to that well known sequences for Chlorella vulgaris. Second, we assessed some culture media including BBM, Chu_10,TAP, and Sorokin and Krauss for optimum growth conditions for Chlorella vulgaris. In general, our results showed that BBM medium had the highest efficiency for producing microalgae biomass under following conditions: pH=8, temperature of 30 ° with 16 to 8 h light to darkness periods ratio.Third, we designed a more efficient photo-bioreactor apparatus toward inducing more powerful bio-hydrogen production by hydrogenase enzyme activity of our given microalgae. Then, the performance of the apparatus as well as the gene expression was scrutinized under different conditions (light, pH, sulphorous, etc.). For this, after extracting RNA and constructing cDNA, hydrogenase gene was amplified with PCR and the product was evaluated by agarose gel. However, the relative expression of the gene measured by Real Time PCR showed the influence of light, pH and sulphourous on the expression as compared with control.

Keywords

20.1001.1.20088264.1395.8.29.3.8

Full Text

بررسی مولکولی و تعیین ویژگی‌های عملکردی جلبک Chlorella
با رویکرد بیان ژن هیدروژناز

سیده ‌طیبه موسوی ¹، وهب جعفریان ¹* و عباس بهاری ²

¹ گروه زیست‌شناسی، دانشکدۀ علوم، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران

² پژوهشکدۀ فناوری نوین زیستی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران

چکیده

هیدروژن زیستی حاصل فرایندهای زیستی در جایگاه یک منبع تجدید شوندۀ انرژی مطرح است. هدف از این پژوهش، مقایسه و بهینه‌سازی بستر کشت مناسب برای پرورش ریزجلبک Chlorella برای تولید حداکثر هیدروژن است. در این پژوهش، بررسی‌های مولکولی به وسیلۀ PCR و تایپینگ توالی 18S rDNA نشان داد که جلبک پژوهش‌شده با جلبکChlorella vulgaris 100 درصد شباهت دارد. بعد از مرحلۀ انتخاب محیط کشت مناسب از بین محیط‌های کشت (BBM،Chu10،TAP ، Sorokin and Krauss) و بهینه‌سازی شرایط کشت، نتایج نشان داد که بالاترین بهره‌وری برای تولید زیست‌توده در محیط BBM با 8pH= و دمای 30 درجۀ سلسیوس با دورۀ نور/ تاریکی 16/ 8 ساعت است. در مرحلۀ بعد برای القای بیشتر بیان ژن هیدروژناز، دستگاه فتوبیوراکتوری با قابلیت تولید هیدروژن طرّاحی و ساخته شد. سپس عملکرد دستگاه و بررسی بیان ژن هیدروژناز در شرایط مختلف (نور، pH وگوگرد....) آزموده شد. به این منظور پس از استخراج RNA و ساختcDNA ، ابتدا تکثیر ژن هیدروژناز و ژن رفرنس با واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز انجام شد و محصول PCR ژن‌های مربوط روی ژل آگارز بررسی شد. در ادامه بیان نسبی ژن هیدروژناز با تکنیک Real Time PCR در تیمارهای یادشده در مقایسه با تیمار شاهد نیز نشان‌دهندۀ تأثیر شاخص‌های نور، PH و گوگرد در بیان این ژن بود.

واژه‌های کلیدی: بهینه‌سازی، بیان ژن، هیدروژناز ، Chlorella vulgaris ، Real Time PCR.

مقدمه.

در حال حاضر، انرژی یک جزء مهم از زندگی روزمره است. حدود 80 درصد از انرژی مورد نیاز جهان از سوخت‌های فسیلی تأمین می‌شود. مصرف انرژی فعلی در سراسر جهان نزدیک به 15 تریلیون وات است، در ‌حالی که نرخ مصرف انرژی در سال 2050 در حدود 27 تریلیون وات و در سال 2100، 40 تریلیون وات بر‌آورد شده است Lewis et al., 2006)). مسلّماً منابع انرژی‌های فسیلی نیز مانند تمام پدیده‌های طبیعی دیگر، روزی پایان خواهد یافت. علاوه ‌بر ‌این آلاینده‌های ناشی از احتراق این سوخت‌ها و افزایش غلظت دی‌اکسیدکربن در اتمسفر و پیامدهای آن، جهان را با تغییرات برگشت‌ناپذیر و تهدیدآمیزی روبه‌رو کرده است. تشدید اثرات گلخانه‌ای و افزایش دمای کرۀ زمین، تغییرات آب و هوایی و بالاآمدن سطح دریاها از جملۀ این پیامدها محسوب می‌شوندDas et al., 2001; Das et al., 2014) ). در نتیجه در جامعۀ پیشرفتۀ امروزی برای حفظ شیوۀ زندگی، دسترسی به منابع انرژی جایگزین و تجدید‌پذیر برای عرضۀ مداوم انرژی، ضروری به ‌نظر می‌رسد. سوخت‌های زیستی به طیف متنوّعی از فناوری‌هایی اشاره دارند که در آن تولید سوخت بر پایۀ سیستم زیستی انجام می‌شود Wigmosta et al., 2011)).

فناوری جلبک، نشان‌دهندۀ یک حوزۀ پژوهشی وسیع است که در دهه‌های گذشته به‌سرعت در حال گسترش است. ریز‌جلبک‌ها به‌ سبب توانایی رشد سریع، قابلیت بالای انجام فتوسنتز، نیاز به محیط کشت ارزان، بازدهی تولید بیشتر و قابلیت صنعتی‌شدن راحتتر، تنها منبعی هستند که می‌توان تا چند دهۀ دیگر از آن برای تولید سوخت زیستی استفاده کرد Deschamps et al., 2009)). فرایند فتوسنتز با تبدیل انرژی نورانی به انرژی شیمیایی و در نهایت تولید مواد اولیۀ مورد نیاز برای تولید سوخت‌های زیستی، جایگاه اصلی را در تولید همۀ سوخت‌های زیستی دارند. با توجّه به توانایی ریزجلبک‌ها در تثبیت گاز دی‌اکسید‌کربن‌، ‌میکروارگانیسم‌های یادشده به تولید چندین نوع مختلف‌ از سوخت‌های زیستی قادر هستند (Hankamera et al., 2007). از بین این سوخت‌ها، هیدروژن به دلایلی همچون چگالی انرژی بالا و زیست‌سازگاری، امیدوارکننده‌ترین سوخت برای آینده در نظر گرفته شده است (Hemschemeier et al., 2009). این سوخت به‌راحتی در پیل‌های سوختی برای تولید برق استفاده می‌شود و در اثر احتراق آن آب تولید می‌شود. در مجموع در حال حاضر تولید هیدروژن زیستی به سبب تولیدنکردن آلاینده‌ها و امکان تولید در دما و فشار پایین مقرون‌به‌صرفه است (Imran et al., 2011). انرژی یک کیلوگرم هیدروژن معادل 5/3 لیتر بنزین است و مقدار انرژی بیشتری را نسبت به سوخت‌های فسیلی تولید می‌کند. علاوه ‌بر ‌این، منابع دسترسی به هیدروژن، فراوان و قابل تجدید است. بنابراین تهیّۀ هیدروژن با روش زیستی از موضوعات بسیار مهم به حساب می‌آید. بخش شایان توجّهی از تولید هیدروژن در ریز‌جلبک‌ها به فعّالیت فتوسنتزی آن‌ها از جمله الکترون‌های حاصل از اکسیداسیون آب فتوسنتزی و آنزیم هیدروژناز بستگی دارد(Schenk et al., 2008 ). به آنزیم هیدروژناز و متابولیسم آن به بهترین وجه در جلبک سبز الگو، Chlamydomonas reinhardtii، توجّه شده است. در ریزجلبک‌ها سه مسیر تولید هیدروژن وجود دارد. اول مسیر وابسته به فتوسیستم 2 که در این مسیر، انتقال الکترون به صورت خطّی است و تولید فتوسنتزی اکسیژن و هیدروژن به‌‌طور هم‌زمان اتّفاق می‌افتد. در این مورد، الکترون‌های ایجادشده در اکسیداسیون آب به فرایند تولید هیدروژن با فعّالیت هیدروژناز وارد می‌شوند Ghirardim et al., 2000)). دوم، مسیرمستقل از فتوسیستم 2 که در این مسیر، جریان الکترون به ‌صورت چرخه‌ای است و منبع الکترون، پیروات و NAD(P)H است که در اثر اکسیدشدن آن‌ها الکترون‌های لازم برای تولید هیدروژن تأمین می‌شود (Burgess et al., 2011; Sharma et al., 2013) و سومین مسیر، مسیر پیوندخورده با تخمیر استDubini et al., 2015) ). اکسیژن تولیدشده در فتوسنتز، مانعی برای بیان ژن هیدروژناز است. برای حلّ این مشکل، یک راه حلّ دو مرحله‌ای به کار گرفته می‌شود. در مرحلۀ اول، جلبک‌ها در شرایط هوازی کشت داده می‌شوند و در حضور نور خورشید، دی‌اکسید‌کربن تثبیت و اکسیژن تولید می‌شود. در مرحلۀ دوم، جلبک‌ها در شرایط بی‌هوازی قرار داده می‌شوند و هیدروژن از طریق تخریب ترکیبات عالی ذخیره‌شده تولید می‌شود Rashid et al., 2011; Rashid et al., 2013)).

Gaffron (1939) متابولیسم هیدروژن را در جلبک کشف کرد. Gaffron و Jack (1942) مشاهده کردند که وقتی ریزجلبک Scenedesmus dimorphusدر شرایط بی‌هوازی و تاریکی قرار می‌گیرد، توانایی تولید هیدروژن را دارد. پژوهش‌ها در زمینۀ تولید هیدروژن فتوسنتزی به صورت یک منبع انرژی تجدیدپذیر در سال 1970 آغاز شد. Melis و همکاران (2000) فعّالیت تولید هیدروژن بالا و پایدار را درChlamydomonas reinhardtiiبا حذف گوگرد از محیط کشت گزارش کردند.

کشور ایران منابع وسیع و ناشناخته‌ای از ریز‌جلبک‌ها دارد که می‌تواند یکی از کشورهای پیشرو در زمینۀ تولید سوخت زیستی باشد. در حال حاضر، ریزجلبک Chlorella، یکی از منابع اصلی محصولات زیستی با ارزش مطرح شده است. هدف از این پژوهش، کاوش و ایجاد بسترهای لازم برای بهینه‌سازی تولید محصولاتی مانند سوخت‌های زیستی از جمله هیدروژن از گونۀ بومی این جلبک است. بیشتر بررسی‌های انجام‌شدۀ دنیا در این زمینه بر اساس جمع‌آوری و اندازه‌گیری گاز هیدروژن تولیدشده بر جلبک‌های بومی آن کشور است. بنابراین در این پژوهش علاوه بر معرّفی و تعیین ویژگی یک جلبک بومی جدید با قابلیت تولید هیدروژن، میزان بیان ژن هیدروژناز با تکنیک Real Time PCR در شرایط مختلف (نور، pH و گوگرد....) در یک فتوبیوراکتور طرّاحی‌شده برای این هدف نیز بررسی شده است.

مواد و روش‌ها.

تهیّۀ نمونه: ریز‌جلبک بررسی‌شده در این پژوهش (Chlorella) از پژوهشکدۀ آبزی‌پروری آب‌های داخلی در بندر انزلی تهیّه شد.

کشت ریزجلبک Chlorella: برای بررسی سیستماتیک و آلودگی، ریزجلبک مورد نظر در محیط کشت مایع و جامد TAP (تریس استات فسفات) با 7pH= کشت داده شد و ویژگی‌های ظاهری با میکروسکوپ نوری شناسایی شد. کشت در اتاق مخصوص کشت با دمای 30 درجۀ سانتیگراد و دورۀ نوری 16 ساعت، روشنایی و 8 ساعت، تاریکی انجام شد. روشنایی از طریق لامپ‌های فلورسانت با شدّت نور 120 میکرومول فوتون بر متر مربّع بر ثانیه تأمین شد.

بهینه‌سازی شرایط کشت

انتخاب محیط‌کشت مناسب: با توجّه به این که در مقالات مختلف از محیط کشت‌های متفاوتی برای کشت ریزجلبک Chlorella استفاده شده است، برای انتخاب محیط کشت مناسب رشد بهتر و تولید بیشتر تودۀ سلولی، جلبک در چهار محیط کشت مختلف با ترکیبات شیمیایی متفاوت BBM،Chu₁₀ ، TAP وSorokin & Kraussکشت داده شد (جدول 1).

جدول 1- مواد مورد نیاز برای تهیّۀ محیط کشت: (A) ,TAP (B) ,BBM(C)(D) ,Sorokin & Krauss Chu₁₀ به حجم 1000 میلی‌لیتر

B		A
25 g	NaNO₃	40 g	NH₄CL
2.5 g	CaCl₂.2H₂O	5 g	CaCL₂.2H₂O
7.5 g	MgSO₄.7H₂O	10 g	MgSO₄.7H₂O
7.5 g	K₂HPO₄	14.34 g	K₂HPO₄
15 g	KH₂PO₄	2.26 g	KH₂PO₄
2.5 g	NaCL	242 g	Tris base
50 g	EDTA	100 ml	Acetic Acid
31 g	KOH	5 g	EDTA-Na₂
5 g	FeSO₄.7H₂O	11.14 g	H₃BO₃
11.5 g	H₃BO₃	22 g	ZnSO₄.7H₂O
9 g	ZnSO₄.7H₂O	5.1 g	MgCL₂.4H₂O
1.5 g	MnCL₂.2H₂O	5 g	FeSO₄.7H₂O
0.7 g	MoO₃	1.6 g	CaCL₂.6H₂O
1.5 g	CuSO₄.5H₂O	1.6 g	CuSO₄.5H₂O
0.5 g	CO(NO₃)₂.6H₂O	1.1 g	(NH4)₆Mo₇O₂₄
D		C
1000 ml	H₂O	1000 ml	H₂O
20 mg	Ca(NO₃)₂.4H₂O	1.25 g	KNO₃
25 mg	MgSO₄.7H₂O	1.25 g	KH₂PO₄
2.5 mg	H₃BO₃.4H₂O	1 g	MgSO₄.7H₂O
1.5 mg	MnCL₂.4H₂O	85 mg	CaCL₂
6 mg	KH₂PO₄	115 mg	H₃BO₃
20 mg	Na₂CO₃	50 mg	FeSO₄.7H₂O
25 mg	Na₂SiO₃	15 mg	MnCL₂.4H₂O
0.25 ml	HCL	90 mg	ZnSO₄.7H₂O
1 mg	(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O	7 mg	MOO₃
2 mg	EDTA	16 mg	CuSO₄.5H₂O
1 mg	FeCL₃	500 mg	EDTA-Na₂

محیط‌کشت‌ها پس از تهیّه در 7pH= تنظیم و در 121 درجۀ سانتیگراد به ‌مدّت 20 دقیقه اتوکلاو شدند تا از هرگونه آلودگی دور باشند. کشت در اتاق مخصوص کشت به ‌مدّت 4 هفته در دمای 30 درجۀ سانتیگراد انجام شد. دورۀ روشنایی (16 ساعت) و تاریکی (8 ساعت) در نظر گرفته شد. روشنایی از طریق لامپ‌های فلورسانت با شدّت نور 120 میکرومول فوتون بر متر مربّع بر ثانیه تأمین شد.

ارزیابی میزانرشد: چگالی نوری به وسیلۀ دستگاه اسپکتروفتومتر (DR2700, Hach, USA) در طول موج 680 نانومتر در زمان‌های مشخّصی اندازه‌گیری شد. طول موج درنظرگرفته‌شده از اسکن‌کردن نمونۀ مورد نظر با توجّه به محیط ‌کشت (شاهد) به ‌دست آمدSharma et al., 2011) ).

اندازه‌گیری میزان کلروفیل: برای اندازه‌گیری میزان کلروفیل، ابتدا به هر لولۀ سانتریفیوژ سه میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبک انتقال داده شد و سپس به وسیلۀ دستگاه سانتریفیوژ (UNIVERSAL 320 R, Hettich, Germany) به ‌مدّت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی به‌آرامی جدا شد و به رسوب جلبکی حاصل، سه میلی‌لیتر استون 80 درصد اضافه شد. پس از هم‌زدن کامل، دوباره به ‌مدّت 10 دقیقه عمل سانتریفیوژ تکرار شد. محلول رویی جدا شد و جذب نوری آن در طول موج‌های 663، 645 نانومتر اندازه‌گیری شد Meliset al.,2001)).

از طریق رابطه‌های ذیل، میزان کلروفیل a و b بر حسب میلی‌گرم در لیتر سوسپانسیون جلبکی محاسبه شد (.(Richmond, 2004

Ch.a: 7/14 ₍_A₆₆₃₎– 69/2₍_A₆₄₅₎

Ch.b: 9/22₍_A₆₄₅₎– 64/4₍_A₆₆₃₎

تعیین pHبهینه برای رشد جلبک: برای تعیین pH بهینه، محیط کشت BBM تهیّه و در pH های مختلف (6، 7، 8، 9، 10) تنظیم شد. پس از تلقیح، جلبک در محیط‌ کشت در دمای ثابت 30 درجۀ سانتیگراد در اتاق رشد قرار گرفت. نمونه‌برداری از محیط کشت در فواصل زمانی یک روز در شرایط استریل انجام و جذب نمونه‌ها در 680 نانومتر محاسبه شد.

بررسی مولکولی ریزجلبک از طریق تحلیل srDNA18: با توجّه به این که گونۀ ریزجلبک تهیّه‌شده مشخّص نبود و همچنین به ‌سبب تنوّع بسیار زیاد گونه‌های ریزجلبکی، ممکن است روش‌های معمول مانند مشاهدۀ میکروسکوپی و بررسی‌های مورفولوژی در شناسایی آن‌ها کافی نباشد. از سوی دیگر با توجّه به پیشرفت روزافزون روش‌های بیولوژی مولکولی و همچنین اطمینان و راحتی شناسایی از طریق مقایسۀ ژن‌های حفاظت‌شده در سطح جنس و گونۀ ریز جلبک‌ها، استفاده از تحلیل مولکولی s rDNA18 روشی مناسب است.

استخراج :DNAاستخراج DNA با روش دلاپورتا انجام شدDellaporta et al., 1983) ). حدود یک میلی‌لیتر سوسپانسیون سلولی (زمانی‌که جلبک در مرحلۀ رشد تصاعدی است) به یک میکروتیوپ 5/1 میلی‌لیتر استریل، منتقل و سانتریفیوژ (5000 دور در دقیقه به ‌مدّت 5 دقیقه) شد. سپس 300 میکرولیتر بافر استخراج‌شده (دربردارندۀ غلظت 100 میلی مولار تریس با 8pH=، غلظت 50 میلی‌مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید با 8pH=، غلظت 500 میلی‌مولار کلرید سدیم و غلظت 10 میلی‌مولار بتا مرکاپتو اتانول) به تودۀ سلولی اضافه و به ‌مدّت 20 دقیقه در دمای 65 درجۀ سانتیگراد انکوبه شد. 150 میکرولیتر استات پتاسیم 5 مولار، فنل و کلروفرم اضافه شد و به ‌مدّت 10 دقیقه در دمای 27 درجۀ سانتیگراد قرار داده شد. سپس سوسپانسیون سلولی، سانتریفیوژ و فاز بالایی جدا شد. یک میلی‌لیتر ایزوپروپانل به آن اضافه شد و مجدداً سانتریفیوژ انجام شد. فاز رویی جدا‌شده با اتانول 70 درصد شستشو داده شد. در نهایت، رسوب به‌دست‌آمده در 30 میکرولیتر آب، حل شد. برای اطمینان از استخراج DNA، 5 میکرولیتر از نمونه روی ژل 1 درصد آگارز برده شد و باندهای DNA تخلیص‌شده به کمک دستگاه نمایانگر ژل (UVITECBTS-20-MS, UVitec, UK) مشاهده شد.

طرّاحی پرایمر: برای شناسایی توالیs rDNA 18 ابتدا لازم بود که پرایمرهای کاملاً منحصر به ‌فرد و اختصاصی طرّاحی شود؛ به ‌طوری که پرایمرهای بالادست و پایین‌دست فقط توالی هدف را شناسایی و تکثیر کنند. به این منظور پرایمرهای F و R با استفاده از سایت‌های BLAST و CLUSTAL و نرم‌افزار GeneRunner طرّاحی و برای سنتز به شرکت تکاپوزیست ارسال شد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): برای تکثیر توالی مورد نظر از جفت پرایمر پیشرو (5-ACC TGC TTG ATC CTG CCA G-3) و پیرو (5-AGG GCA GGG ACG TAA TCA AC-3) استفاده شد که در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، یک ناحیه به طول تقریبی 1700 جفت باز از توالیs rDNA 18 را تکثیر می‌کنند. مخلوط واکنش با حجم کلّی 25 میکرولیتر تهیّه شد. برنامۀ چرخه‌های ترموسایکلر به ‌این صورت طرّاحی شد: مدّت زمان 5 دقیقه، دمای 94 درجۀ سانتیگراد و 35 سیکل شامل یک دقیقه در دمای 94 درجۀ سانتیگراد، یک دقیقه در دمای 50 درجۀ سانتیگراد، 2 دقیقه در دمای 72 درجۀ سانتیگراد و مرحلۀ پایانی، ده دقیقه در دمای 72 درجۀ سانتیگراد قرار گرفت. بدون فاصله پس از پایان مرحلۀ تکثیر توالی و انجام PCR، محصول واکنش به ‌وسیلۀ الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد دارندۀ اتیدیوم برماید، جداسازی و رنگ‌آمیزی شد.

توالی‌یابی و تطبیق: برای تعیین توالی، محصول PCR پس از تخلیص به وسیلۀ کیت تخلیص محصول PCR به شرکت تکاپو زیست فرستاده شد و به منظور مقایسۀ میزان شباهت توالی، s rDNA18 حاصل از تعیین توالی با توالی‌های موجود در NCBIتطبیق داده شد.

طرّاحی و ساخت دستگاه فتو بیوراکتور.

آنزیم هیدروژناز در حضور غلظت‌های کم اکسیژن مهار می‌شود و اﻳﻦ ﻃﺒﻴﻌﺖ اﻛﺴﻴﮋن و ﻫﻴﺪروژن در واﻛﻨﺶ‌ﻫﺎی فتوﺳﻨﺘﺰ، ﺑﺎﻋﺚ ﺷﺪه است ﺗﺎ در ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻫﻴﺪروژن جلبک‌ﻫﺎی ﺳﺒﺰ در ﺷﺮاﻳﻂ محیطی، ﭘﻴﺸﺮفتی ﺣﺎﺻﻞ ﻧﺸﻮد. در نتیجه برای بررسی روند تولید هیدروژن از ریزجلبک‌ها، دستگاه فتوبیوراکتوری با قابلیت کشت و تولید هیدروژن در مقیاس آزمایشگاهی طرّاحی و ساخته شد. هدف از طرّاحی و ساخت دستگاه، ارائۀ یک سیستم جامع تولید هیدروژن زیستی و در کنار آن زیست‌تودۀ جلبک با امکان کنترل تعدادی از عوامل فیزیکی و شیمیایی مؤثّر در عملکرد سیستم از قبیل شدّت نور،pH ، جریان محیط، کنترل تولید اکسیژن و هیدروژن بود. فتوبیوراکتور ساخته‌شده مزیت‌هایی داشت، از جمله، سیستم بستۀ تولید هیدروژن، تولید نرخ بیشتری از تودۀ زیستی در محیط کاملاً استریل و بدون آلودگی، کشت سایر میکروارگانیسم‌های فتوسنتز‌کننده مانند سیانوباکتری‌ها.

بررسی بیان ژن هیدروژناز.

تهیّۀ پیش‌کشت: از آن جا که مدّتی طول می‌کشد تا ریزجلبک‌ها به محیط تازه‌ای که وارد آن می‌شوند سازگار شوند، برای به‌دست‌آوردن تودۀ سلولی مطلوبی که در مرحلۀ رشد فعّال است به تهیّۀ پیش‌کشت اقدام شد. به این منظور، محیط‌کشتBold's Basal Medium ) BBM) به حجم 500 میلی‌لیتر تهیّه و جلبک مورد پژوهش در آن کشت داده شد. سپس به ‌مدّت دو هفته در اتاق رشد با شرایط دمایی 30 درجۀ سانتیگراد و نور ممتد (با توجّه به فتوسنتز‌کننده‌بودن ریزجلبک‌ها برای به‌دست‌آوردن حداکثر تودۀ سلولی) قرار داده شد. پس از دو هفته، تودۀ سلولی از طریق سانتریفیوژ جمع‌آوری شد.

کشت ریزجلبک در فتو بیوراکتور: ابتدا محیط‌ کشت BBM با 8 pH= به حجم 4000 میلی‌لیتر تهیّه شد Rashid et al., 2013)). سپس کشت جلبک‌ها در راکتور به ‌مدّت سه روز در نور مطلق با شدّت نور 120 میکرومول فوتون بر متر مربّع بر ثانیه، دمای 30 درجۀ سانتیگراد و هوا دهی با گاز دی‌اکسیدکربن 5 درصد انجام شد. برای اطمینان از جلوگیری رشد باکتری در محیط، از آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین (100 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و کانامایسین (50 میکروگرم بر میلی‌لیتر) در غلظت نهایی استفاده شد (شکل 1).

شکل 1- کشت ریزجلبک در فتوبیوراکتور

شمارش سلول های جلبکChlorella: شمارش سلول‌ها با لام هموسایتومتر انجام شد. به این‌ ترتیب‌ که برای شمارش تعداد سلول‌ها ابتدا ارلن به‌آرامی حرکت دورانی داده می‌شود تا جلبک‌ها به‌ صورت یکنواخت پخش شوند. آن گاه یک میلی‌لیتر سوسپانسیون جلبکی به یک لولۀ آزمایش منتقل و 10 میکرولیتر محلول لوگل دارندۀ ید به هر لولۀ آزمایش اضافه می‌شود تا جلبک‌ها از حرکت باز ایستند و ثابت بمانند. سپس یک قطره از سوسپانسیون جلبکی، روی محفظۀ مخصوص لام هموسایتومتر ریخته می‌شود و پس از قراردادن لامل، تعداد سلول‌ها در فواصل زمانی معیّن به وسیلۀ میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 40 شمارش و سپس تعداد جلبک‌ها در یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون، محاسبه شد.

القای بیان ژن هیدروژناز: زمانی‌که تراکم سلولی به 10⁷×1 رسید، تودۀ سلولی از طریق سانتریفیوژ جداسازی شد. محیط‌کشت BBM به حجم ml 3000 با 8pH= تهیّه شد. در تهیّۀ محیط کشت جدید برای تحریک بیان ژن هیدروژناز، گوگرد از محیط کشت حذف شد؛ به این طریق که به جای نمک‌های گوگردی از نمک‌های کلریدی استفاده شد. تودۀ سلولی به‌دست‌آمده در محیط کشت بدون گوگرد در شرایط دمایی 37 درجۀ سانتیگرادSong et al., 2011))، دورۀ نوری متناوب 24 ساعت تاریکی و 48 ساعت روشنایی، شدّت نور 120 میکرومول فوتون بر متر مربّع بر ثانیه و هوادهی با گاز آرگون، کشت داده شد. در این مرحله از گلوکز 30 میلی‌مولار به‌ عنوان منبع کربن استفاده شد.

نمونه‌گیری برای استخراج RNA و ساخت cDNA: در سوّمین روز القا که محیط، کاملاّ بی‌هوازی شده بود و بیان ژن هیدروژناز، بیشترین نرخ خود را داشت، نمونه‌گیری برای جداسازی RNA و ساخت DNA انجام شد.

استخراج RNA: نمونه‌گیری در روز سوم کشت برای استخراج RNA انجام شد. استخراج RNA طبق دستورعمل آورده‌شده در کیت RiboEx^TM تهیّه‌شده از شرکت پیشگام انجام شد. پیش از شروع کار، همۀ مواد و وسایل مورد استفاده از جمله تیوپ‌ها و سر سمپلر در دمای 121 درجۀ سانتیگراد و فشار 121 بار اتوکلاو شدند. سپس تعیین غلظت RNA با استفاده از دستگاه نانودرآپ (مدل، کشور) انجام شد.

ساخت cDNA: برای سنتز cDNA از کیت RT Premix CycleScript تهیّه‌شده از شرکت تکاپو زیست که دربردارندۀ مواد مورد نیاز برای سنتز cDNA است، استفاده شد. به ‌این ‌منظور، ابتدا ترکیب موجود در کیت در 19 میکرولیتر آب دپس، حل شد و یک میکرولیتر از RNA استخراج‌شده به آن اضافه و بر‌اساس دستورعمل موجود در کیت در شرایط واکنش قرار داده شد. برای تکثیر cDNA از دستگاه ترموسایکلر (مدل C1000^TM، شرکت (C1000™Thermal Cycle, Biorad, USA) استفاده شد و برنامۀ چرخه‌های ترموسایکلر به ‌این صورت طرّاحی شد: 12 سیکل شامل 30 ثانیه در دمای 20 درجۀ سانتیگراد، 5 دقیقه در دمای 42 درجۀ سانتیگراد، 55 ثانیه در دمای 55 درجۀ سانتیگراد و مرحلۀ پایانی، 5 دقیقه در دمای 95 درجۀ سانتیگراد در نظر گرفته شد.

طرّاحی پرایمر: در این پژوهش برای بررسی بیان ژن هیدروژناز، پرایمرهای کاملاً منحصر به ‌فرد و اختصاصی طرّاحی شد. همچنین از ژن رفرنس gapdh به ‌عنوان شاهد داخلی در اندازه‌گیری بیان ژن با روش exon junction targeting در نرم‌افزارBeacon Designer ver8 استفاده شد. (جدول 2).

جدول 2- توالی آغازگرهای استفاده‌شده در واکنش PCR

ژن

توالی آغازگرها

هیدروژناز

رفت GCTGACCTGACCATTATGGAGGAGG-3`-5`

برگشت 5`-CATGGGCAGTGGCTCCTCCTTGTTG-3`

خانه دار

رفت CTTGGAAGCTAGGAGTATGTC-3` -5`

برگشت 5`-GATCTTAATCTTGCCACTCATTC-3`

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز: مراحل PCR شامل این موارد بود: واسرشت‌سازی اولی در دمای 94 درجۀ سانتیگراد و به ‌مدّت 3 دقیقه، سپس 45 چرخه به‌ صورت دمای 94 درجۀ سانتیگراد و به ‌مدّت 1 دقیقه، دمای اتّصال به‌ترتیب برای رفرنس و هیدروژناز 52 و 58 درجۀ سانتیگراد به ‌مدّت 45 ثانیه و دمای 72 درجۀ سانتیگراد به ‌مدّت 1 دقیقه و در مرحلۀ آخر، دمای 72 درجۀ سانتیگراد به ‌مدّت 10 دقیقه.

محصول PCR روی ژل 2 درصد الکتروفورز و با رنگ اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی شد. برای دیدن ژل از دستگاه ترانس لومینومتر (دستگاه مولّد UV با طول موج 245-365 نانومتر) (UVITECBTS-20-MS, UVitec, UK) استفاده شد.

بررسی بیان ژن هیدروژناز با استفاده از :Real Time PCR در تکمیل نتایج حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، بیان ژن هیدروژناز به وسیلۀ Real Time PCR نیز بررسی شد. به این‌ منظور از پرایمرهای ژن هیدروژناز و gapdh استفاده شد (جدول 2). چرخه‌های دمایی مراحل مختلف Real Time PCR در دو مرحله انجام شد: واسرشت سازی اولی در 94 درجۀ سانتیگراد به ‌مدّت 2 دقیقه و 45 چرخه در دماهای 94 درجۀ سانتیگراد 1 دقیقه، 58 درجۀ سانتی‌گراد 40 ثانیه و 72 درجۀ سانتیگراد به ‌مدّت 40 ثانیه. پس از آن، تحلیل ذوب نیز برای تأیید اختصاصی‌بودن واکنش استفاده شد.

نتایج.

با توجّه به پژوهش‌های سیستماتیک، جلبک بررسی‌شده بر اساس خصوصیات ظاهری (کروی، تک‌یاخته، کلروپلاست فنجانی و بدون تاژک) شناسایی و به‌ عنوان جلبک Chlorella تأیید شد (شکل 2).

شکل 2- شکل میکروسکوپی ریزجلبک با بزرگ‌نمایی 40

برای بررسی آلودگی، ریزجلبک در محیط‌کشت جامد TAP کشت داده شد. پس از مدّت زمان دو هفته به همراه نمونۀ جلبکی کلونی‌های باکتری مشاهده شد. از‌ آن جا ‌که جلبک‌های سبز با توجّه‌ به ساختار دیواره‌شان به سطح بالای اشعۀ ماورای بنفش نسبت به باکتری‌ها مقاوم هستند (Holzinger and et al., 2006) برای پاک‌سازی محیط از باکتری، ابتدا از اشعۀ ماورای بنفش با تابش 20000 میکرووات بر ثانیه بر سانتی‌متر مربّع به ‌مدّت 20 دقیقه استفاده شد و در نهایت از آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین (100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) و کانامایسین (50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) هنگام تهیّۀ محیط‌کشت به‌‌طور هم‌زمان استفاده شد و از این طریق آلودگی باکتریایی از بین برده شد.

در مرحلۀ انتخاب محیط ‌کشت مناسب، نتایج حاصل از تحلیل واریانس نشان داد که اثر زمان و محیط کشت بر میزان کلروفیل a، کلروفیل b و رشد ریزجلبک (جذب680 نانومتر) در سطح 1 درصد معنی‌دار است (جدول 3).

جدول 3- تحلیل واریانس (میانگین مربعات) زمان و محیط کشت از نظر سه صفت بررسی‌شده در ریزجلبک Chlorella

میانگین مربعات
جذب (680)	کلروفیل b	کلروفیل a	درجۀ آزادی	منابع تغییر
^**134/0	^** 576/1	^** 301/5	7	زمان
^** 058/0	^**349/0	^** 526/8	3	محیط کشت
^** 020/0	^**226/0	^**034/1	21	محیط کشت × زمان
0006/0	024/0	003/0	31	اشتباه آزمایشی
498/12	961/20	115/4		ضریب تغییرات (درصد)

^** و ^ns به‌ترتیب اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد و غیر معنی‌دار

مقایسۀ میانگین رشد ریزجلبک در چهار محیط‌ کشت مختلف نشان داد که محیط ‌کشت BBM بالاترین میزان تولید تودۀ زیستی را در بین محیط‌کشت‌های دیگر دارد (شکل 3).

شکل 3- مقایسۀ میانگین رشد ریزجلبک Chlorella در چهار محیط ‌کشت بررسی‌شده (حروف یکسان نشان‌دهندۀ نبودن اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است که با آزمون چنددامنه‌ای دانکن انجام شده است).

همچنین با مقایسۀ میانگین کلروفیل a (شکل 4) و b (شکل 5) در چهار محیط‌ کشت مختلف، بالاترین میزان تولید کلروفیل در محیط‌ کشت BBM برای کلروفیل a برابر با 361/4 میلی‌گرم در لیتر و کلروفیل b برابر با 205/2 میلی‌گرم در لیتر به‌ دست آمد که این نیز نشانۀ ‌بودن محیط‌ کشت BBM برای کشت ریز‌جلبک بررسی‌شده است.

شکل 4- مقایسۀ میانگین کلروفیل a در ریزجلبک Chlorella در چهار محیط‌ کشت بررسی‌شده (حروف یکسان، بیان‌کنندۀ نبودن اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است که با آزمون چنددامنه‌ای دانکن انجام شده است).

شکل 5- مقایسۀ میانگین کلروفیل b در ریزجلبک Chlorella در چهار محیط‌ کشت بررسی‌شده (حروف یکسان، نشان‌دهندۀ نبودن اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است که با آزمون چنددامنه‌ای دانکن انجام شده است).

رشد ریزجلبک نه‌ تنها به درجۀ حرارت و نور مناسب نیاز دارد، بلکه موادّ مغذّی در دسترس و مقدار آن در محیط ‌کشت نیز تأثیر مستقیم روی رشد دارد.

در مرحلۀ تعیین pH بهینه، نتایج تحلیل واریانس نشان داد که اثر زمان و pH بر میزان رشد ریز‌جلبک در سطح 1 درصد، معنی‌دار است (جدول 4).

جدول 4- تحلیل واریانس (میانگین مربعات) زمان و pH از نظر صفت بررسی‌شده در جلبک

میانگین مربعات
جذب (680)	درجۀ آزادی	منابع تغییر
^** 0.1072	7	زمان
^** 0.1249	4	pH
^** 0.0041	28	pH × زمان
0.0018	39	اشتباه آزمایشی
19.509		ضریب تغییرات (درصد)

^** و ^ns به‌ترتیب اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد و غیر معنی‌دار

همچنین مقایسۀ میانگین محیط‌ کشت BBM با pH های مختلف نشان داد که pH بهینۀ رشد 8pH= است (شکل 6).

شکل 6- مقایسۀ میانگین محیط ‌کشت BBM با pH های مختلف (حروف یکسان، بیان‌کنندۀ نبودن اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است که با آزمون چنددامنه‌ای دانکن انجام شده است).

در بررسی مولکولی ریزجلبک از طریق تحلیل s rDNA18 پس از استخراج DNA (شکل7- (A، تکثیر و تعیین توالی ژن کد‌کنندۀ s rDNA18 انجام شد و محصول PCR ژن‌ مربوط روی ژل آگارز برده شد (شکل 7-B). اندازۀ قطعۀ تکثیرشده حدودbp 1700 مشاهده شد.

شکل 7- الکتروفورز ژل آگارز DNA ژنومی و s rDNA18 استخراج‌شده از نمونۀ جلبک:

A) باند مربوط به استخراج DNA و B) باندهای 1،2،3 مربوط بهbp) 1700) s rDNA18

شرکت Bionee کره جنوبی، تعیین توالی محصول PCR را با پرایمرهای F و R را انجام داد. پس از تعیین توالی و انطباق آن در NCBI در نهایت، ریزجلبک مورد نظر، همسانی 100 درصد را با ریزجلبک Chlorella vulgaris نشان داد و در بانک جهانی ژن به نام KU720636 ثبت شد.

در مرحلۀ بررسی بیان ژن هیدروژناز پس از استخراج RNA و ساخت cDNA، تکثیر ژن هیدروژناز و ژن رفرنس با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، انجام شد و محصول PCR ژن‌های مربوط روی ژل آگارز برده شد. باند مربوط به ژن هیدروژناز هم در نمونۀ تیمارشده و هم در نمونۀ شاهد در محدودۀ bp 100 مشاهده شد، اما قوی‌بودن باند هیدروژناز در نمونۀ تیمارشده نشان‌دهندۀ افزایش بیان ژن هیدروژناز در این نمونه است. مشاهده‌شدن باند مربوط به ژن هیدروژناز در نمونۀ شاهد نشان می‌دهد که ژن هیدروژناز موجود در جلبک بررسی‌شده به اکسیژن مقاوم است و در شرایط طبیعی و در حضور اکسیژن نیز بیان می‌شود (شکل 8).

شکل 8- محصول PCR توالی ژن هیدروژناز: نشان‌دهندۀ bp 100 (1)، باند مربوط به ژن هیدروژناز: نمونۀ شاهد (2)، نمونۀ تیمارشده (4) و نمونۀ شاهد منفی (6). باند مربوط به ژن رفرنس (gapdh): نمونۀ شاهد (3) نمونۀ تیمارشده (5)، نمونۀ شاهد منفی (7).

در تکمیل نتایج حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، بیان ژن هیدروژناز به وسیلۀ Time PCR نیز بررسی شد. نتایج به‌دست‌آمده از این روش نیز نشانۀ بیان بیشتر ژن هیدروژناز در شرایط بهینه‌شده نسبت به گروه‌های شاهد بود. نمودار‌های تکثیر واکنشReal Time PCR ژن هیدروژناز و ژن رفرنس در شکل‌های (9) و (10) نشان داده شده‌ است.

شکل 9- نمودار منحنی تکثیر (amplification curves) ژن هیدروژناز در دستگاه qPCR. خطّ آستانه برای به‌دست‌آوردن سیکل آستانه (Ct) بر مبنای پایین‌ترین جایی که همۀ منحنی‌های مربوط به گروه‌های تیمار و کنترل، وارد مرحلۀ لگاریتمی شده بودند، ترسیم شد. Ct های حاصل بر مبنای غلظت cDNA و Ct مربوط به spike DNA نرمال شد و در نهایت، بیان نسبی ژن هیدروژناز در گروه تیمار نسبت به گروه کنترل به وسیلۀ Ctهای به‌دست‌آمده برای ژن رفرنس gapdh و با روش Pfaffl در نرم‌افزار REST 2009 محاسبه شد (Pfaffl, 2001).

شکل 10- نمودار منحنی تکثیر ژن رفرنس gapdh در دستگاه Real Time PCR. ژن رفرنس هدف به‌دست‌آمده در پژوهش حاضر ابتدا برای اطمینان توالی‌یابی شد. آزمون RT^- (واکنش PCR با الگوقراردادن RNA به جای cDNA) برای کنترل آلودگی DNA ژنومی انجام شد. در هر Run، دستگاه cDNA متناظر برای ژن هدف (هیدروژناز) و ژن رفرنس به کار گرفته شد. در نهایت از Ctهای gapdh در جایگاه کنترل داخلی (internal control) در بیان ژن هیدروژناز استفاده شد.

همچنین نتایج تحلیل منحنی ذوب نشان داد که واکنش Real Time PCR از هر گونه تکثیر غیراختصاصی و پرایمر دایمر به دور است (نتایج نیامده است).

نتایج حاصل از بررسی تغییرات بیانی ژن هیدروژناز در نرم‌افزار REST نشان‌دهندۀ افزایش کمّی بیان ژن هیدروژناز به میزان 37/1 نسبت به گروه شاهد است (جدول 5).

جدول 5- نتایج بررسی تغییرات کمّی بیان ژن هیدروژناز

ژن	نوع	کارایی واکنش	نسبت بیان	نتیجه
هیدروژناز	هدف	79/0	37/1	افزایش بیان
gapdh	خانه دار	7275/0	00/1

در پژوهش حاضر برای بیان ژن هیدروژناز، طبق یافته‌های ملیس و همکاران (2001) گوگرد از محیط حذف شد. محرومیت از گوگرد در جلبک‌های سبز، مهار برگشت‌پذیر فتوسنتز به ‌سبب مانع‌شدن از بیوسنتز پروتئین‌ها را موجب می‌شود. فتوسیستم 2 غیر فعّال و محیط، بی‌هوازی می‌شود و شرایط برای بیان ژن هیدروژناز فراهم می‌شود Meliset al.,2001)). همچنین با توجّه به مطالعات رشید و همکاران (2011) از غلظت گلوکز 30 میلی‌مولار به صورت منبع کربن در محیط کشت بدون گوگرد استفاده شد. آن‌ها مشاهده کردند که به نسبت کاهش گلوکز در محیط، میزان بیشتری از هیدروژن تولید می‌شود و استفاده از غلظت‌های بالای گلوکز (40 و50 میلی‌مولار) مناسب نیست؛ زیرا با توجّه به شرایط اعمال‌شده (منبع غنی از کربن و شرایط بی‌هوازی) احتمال این که مسیر به سمت بیوسنتز چربی پیش رود وجود دارد. همچنین برای دست‌یابی به بالاترین سطح تولید هیدروژن از چرخۀ نوری متناوب 24 ساعت تاریکی- 48 ساعت روشنایی، استفاده شد؛ زیرا در شدّت نور بالا با ایجاد مهار نوری، تولید اکسیژن کاهش و شرایط بالقوۀ بی‌هوازی ایجاد می‌شود. شدّت نور بالا، تخریب نشاسته و پروتئین‌های ذخیره‌شده در مرحلۀ یک (رشد در شرایط هوازی) را موجب می‌شود؛ در نتیجه افزایش تولید هیدروژن را دربردارد. علاوه بر این، مصرف گوگرد باقی‌مانده در محیط در شدّت نور بالا نسبت به تاریکی، سریعتر اتّفاق می‌افتد Melis et al., 2001)).

جمعبندی.

با توجّه به نتایج به‌دست‌آمده در پژوهش حاضر، مشخّص شد که ریز‌جلبک بررسی‌شده بر مبنای پژوهش‌های سیستماتیک و مولکولی‌Chlorella vulgaris از جنبۀ تولید هیدروژن، قابل بررسی است.شرایط بهینۀ رشد این ریز‌جلبک با توجّه به تحلیل واریانس، محیط کشت BBM با 8 pH= است. با بررسی عملکرد دستگاه فتوبیوراکتور و بیان ژن هیدروژناز با روش Real time PCR به‌وضوح مشخّص شد که ژن بررسی‌شده در شرایط بهینۀ اعمال‌شده بیان بیشتری دارد. از این طریق صحّت عملکرد دستگاه فتوبیو‌ راکتور (از جنبۀ کنترل بسته‌بودن سیستم و کنترل اثر مهاری گاز اکسیژن بر بیان ژن هیدروژناز) نیز تأیید شد.در نهایت پیشنهاد می‌شود با توجّه به عملکرد مناسب این جلبک در تولید هیدروژن زیستی، این جلبک در تولید هیدروژن استفاده شود.

سپاسگزاری.

پژوهش حاضر با حمایت مالی معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه زنجان انجام شد.

منابع

Burgess, S. J., Tamburic, B., Zemichael, F., Hellgardt, K. and Nixon, P. J. (2011) Solar-driven hydrogen production in green Algae. Advances in Applied Microbiology 75: 71–110.

Das, D. and Vezirolu, T. N. (2001) Hydrogen production by biological process: a survey of literature. International Journal of Hydrogen Energy 26: 13-28.

Das, D., Khanna, N. and Dasgupta, C. N. (2014) Biohydrogen production: fundamentals and technology advances. CRC Press, Boca Raton.

Deschamps, P. and Moreira, D. (2009) Signal conflicts in the phylogeny of the primary photosynthetic eukaryotes. Molecular Biology and Evolution 26(12): 2745–2753.

Dellaporta, S. L., Wood, J. and Hicks, J. B. (1983) A rapid method for DNA extraction from plant tissue. Plant Molecular Biology Reporter 1: 19-21.

Dubini, A. and Ghirardi, M. (2015) Engineering photosynthetic organisms for the production of biohydrogen. Photosynthesis Research 123(3): 241–253.

Ghirardim, M. L., Zhang, L., Lee, J. W., Flynn, T., Seibert, M., Greenbaum, E. and Melis, A. (2000) Microalgae: a green source of renewable H₂. Trends in Biotechnology 18(12): 506-511.

Gaffron, H. (1939) Reduction of CO₂ with H₂ in green plants. Nature 143: 204–205.

Gaffron, H. and Rubin, J. (1942) Fermentative and photochemical of hydrogen in algae. Journal of General Physiology 26: 219-240.

Hankamera, B., Lehrb, F., Rupprechta, J., Jan, H. M., Postenb, C. and Kruse, O. (2007) Photosynthetic biomass and H₂ production by green algae, from bioengineering to bioreactor scale-up. Physiologia Plantarum 131: 10–21.

Hemschemeier, A., Melis, A. and Happe, T. (2009) Analytical approaches to photobiological hydrogen production in unicellular green algae. Photosynthesis Research 102(2-3): 523–540.

Holzinger, A. and Lu¨tz, C. (2006) Algae and UV irradiation: effects on ultrastructure and related metabolic functions. Micron 37: 190–207.

Imran, A., Sudip, R. and Lakkhana, K. (2011) Biohydrogen production from microalgae of Chlorellasp. In:The International Conference on Sustainable Community Development,UN Headquarters, New York, USA.

Lewis, N. S. and Nocera, D. G. (2006) Powering the planet: Chemical challenges in solar energy utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences 103(43): 15729-15735.

Melis, A., Zhang, L., Forestier, M., Ghirardi, M. L. and Seibert, M. (2000) Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology 122: 127–135.

Melis, A. and Happe, T. (2001) Hydrogen production, green algae as a source of energy. Plant Physiology 127: 740-748.

Pfaffl, M. W. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR.Nucleic Acids Research 29(9): 2002-2007.

Rashid, N., Lee, K. and Mahmood, Q. (2011) Bio-hydrogen production by Chlorella vulgaris under diverse photoperiods. Bioresource Technology 102: 2101–2104.

Rashid, N., Lee, K., Han, J. and Gross, M. (2013) Hydrogen production by immobilized Chlorella vulgaris: optimizing pH, carbon source and light. Bioprocess Biosystem Engineering 36: 867–872.

Richmond, A. (2004) Handbook of microalgal culture: Biotechnology and applied phycology. Blackwell Science. Oxford, UK.

Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., Stephens, E., Marx, U. C., Mussgnug, J. H., Posten, C., Kruse, O. and Hankamer, B. (2008) Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production. Bioengineering Research 1: 20–43.

Sharma, S., Singh, R. N. and Satyendra, T. (2013) Biohydrogen from Algae: fuel of the future. International Research Journal of Environment Sciences 2(4): 44-47.

Sharma, R., Rekha, R., Singh, G. P. and Sharma, V. K. (2011) Comparison of different media formulations on growth, morphology and chlorophyll content of green alga, Chlorella vulgaris. International Journal of Pharma and Bio Sciences 2(2): 509-516

Song, W., Rashid, N., Choi, W. and Lee, K. (2011) Biohydrogen production by immobilized Chlorella sp. using cycles of oxygenic photosynthesis and anaerobiosis. Bioresource Technology 102: 8676–8681.

Wigmosta, M. S., Coleman, A. M., Skaggs, R. J., Huesemann, M. H. and Lane, L. J. (2011) National microalgae biofuel production potential and resource demand. Water Resources Research 47(3): 1-13.

References