Document Type : Original Article
Authors
Department of Biology, Faculty of Sciences, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
Abstract
Keywords
بررسی کالوسزایی و توان آنتیاکسیدانی عصارۀ متانولی حاصل
از ریزنمونههای مختلف گیاه Teucrium polium
مرجان جاویدی مقدم، منیره چنیانی *، علی گنجعلی و مهرداد لاهوتی
گروه زیستشناسی، دانشکدۀ علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
چکیده
کلپوره (Teucrium polium L.) گیاه دارویی از خانوادۀ نعناع (Lamiaceae) است. روش کشت بافت این گیاه به سبب کوتاهبودن دورۀ رشد و خطر انقراض آن کارآمد به نظر میرسد. این گیاه با خاصیت آنتیاکسیدانی بالا، خواصّ درمانی بسیاری دارد. در پژوهش حاضر، اثر محیطکشت، غلظتهای مختلف هورمون D-4 و 2 و نوع ریزنمونه بر نرخ کالزایی گیاه کلپوره بررسی و مشخّص شد که تیمار مؤثّر برای افزایش وزن تر کالوس، ریزنمونۀ برگ در محیطکشت B5 دارندۀ غلظت 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر هورمون D-4 و 2 است. در تیمارهای بدون هورمون، درصد القای کالوس نسبت به بقیّه کمتر بود. بیشترین درصد کالزایی نیز در محیطکشتهای محتوی مقادیر بیشتری از این هورمون القا شد. بررسی ویژگیهای زیستشیمیایی (محتوای فنل کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی بر مبنای دو آزمون DPPH و PPM) نشان داد که میزان فنل کل در کالوس حاصل از ریزنمونۀ جوانۀ انتهایی در محیطکشت B5 بدون هورمون (66/ 82 میلیگرم GAE در 100گرم FW) بیشتر از بقیّه است. با آزمون DPPH، بیشترین فعّالیت روبشگری رادیکالهای آزاد، در برگ گیاه جمعآوریشده از رویشگاه و کالوس حاصل از ریزنمونۀ جوانۀ انتهایی در محیطکشت B5 با غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر D-4 و 2، مشاهده شد. با بررسی ظرفیت آنتیاکسیدانی کل نیز مشخّص شد که کالوس جوانۀ انتهایی محیطکشت MS با غلظت 2 میلیگرم در لیتر D-4 و 2 و برگ و ساقۀ گیاه جمعآوریشده از رویشگاه، فعّالیت بیشتری داشتند. این شرایط میتواند پیشنهاد استفاده از محیطهای کشت یادشده را برای افزایش تولید ترکیبات ثانویه با خاصیت آنتی اکسیدانی بالا ارائه دهد.
واژههای کلیدی: ترکیبات فنلی، توان آنتیاکسیدانی، کالزایی، کلپوره، هورمون D-4 و 2.
مقدمه.
گیاهان دارویی، ارزش و اهمّیت خاصّی در تأمین بهداشت و سلامت جوامع از جنبۀ پیشگیری و درمان بیماریها دارند. بزرگترین بخش بازار گیاهان دارویی دنیا به تولید و عرضۀ متابولیتهای ثانوی مشتق از این گیاهان مربوط میشود. بنابراین متابولیتهای ثانوی معمولاً ارزش افزودۀ بسیاربالایی دارند (Kashfi, 2010). کلپوره با نام علمی Teucrium polium L. گیاهی دارویی از خانوادۀ نعناع است (Tavakkoli Saberi and Sedaghat, 1993). برگهای کلپوره کاربرد غذایی و بهویژه دارویی دارند (Rabba’a et al., 2012). این گونۀ دارویی به صورت خودرو در برخی مناطق ایران از جمله خراسان مشاهده میشود. بهرهبرداریهای بیرویۀ انسان، چرای مفرط دام و همچنین تبدیلشدن مراتع به بومنظامهای زراعی از جمله دلایلی است که کلپوره را در معرض انقراض قرار داده است. بنابراین تمهیدات لازم برای حفظ این گیاه در عرصههای طبیعی و راهکارهایی برای تکثیرکردن آن ضروری است (Kochaki et al., 2009). در سالهای گذشته روشهای کشت بافت گیاهی به یک ابزار بسیار قوی برای تکثیر و بهنژادی بسیاری از گونههای گیاهی و تولید ترکیبات ثانوی در گیاهان دارویی تبدیل شده است (Al-Qudah et al., 2011). در یک بررسی درونآزمایشگاهی، درصد باززایی و ترکیبات ثانوی گیاه کلپوره از مریستم انتهایی ساقه در محیطکشت MS و در حضور ترکیبات هورمونی 6- بنزیلآدنین و 6- فورفوریلآمینوپورین ارزیابی شد (Al-Qudah et al., 2011). سایر پژوهشهای انجامشده برای تولید کالوس یا اندام و ارزیابی محتوای داخلی ترکیبات ثانوی در گونههای دیگر تیرۀ نعناعیان بوده است. از جمله میتوان به این موارد اشاره کرد: Mentha piperita(Ghanti et al., 2004)، Salvia fruticosa Mill (Arikat et al., 2004)،Salvia officinalis (Grzegorczyk et al., 2005)، Ocimum basilicum (Lukmanul hakim, et al., 2007)، Zataria mutiflora (Hasanpour et al., 2007). با توجّه به این که پژوهشهای اندکی در رابطه با کشت بافت و کالزایی گیاه کلپوره انجام شده است، استفاده از روش کشت درونآزمایشگاهی میتواند برای تسریع و افزایش تولید ترکیبات مؤثّر و دارویی آن مفید باشد.
کلپوره در طبّ سنتی در درمان بیماریهای مزمن معدی و نیز به صورت ادرارآور، ضدّ فشارخون، ضدّ باکتری، ضدّ نفخ، ضدّ اسهال، ضدّ دیابت و ضدّ تشنّج استفاده میشود (Ardestani et al., 2008؛Hasani-Ranjbar et al., 2010). همچنین عصارۀ این گیاه در کاهش قند و چربی خون و در درمان سرطان پروستات نیز اهمّیت دارد (Kandouz et al., 2010). بررسیها روی خواص دارویی این گیاه نشان داده است که عصارۀ آن خاصیت آنتیاکسیدانی و ضدّسرطانی بالایی دارد؛ از این رو در صنعت داروسازی و تغذیه، کاربرد وسیعی دارد (Ardestani et al., 2008؛Goulas et al., 2011). طبق بررسیهای انجامشده، گیاه کلپوره دو دستۀ مهم از ترکیبات ثانوی شامل ترکیبات فنلی و اسانسی را دربردارد. عصارۀ حاصل از گیاه کلپوره دربردارندۀ اپیژنین و روتین است که به سبب خاصیت آنتیاکسیدانی، اثر حفاظتی روی سلولهای نوع B لوزالمعده دارد (Esmaeili and Sadeghi, 2009). پژوهشها نشان داده است که عصارۀ کلپوره همچنین دارندۀ فنیل پروپانوئیدگلیکوزیدورباسکوزید، پلیموزوئید، فلاونهای اپیژنین و مشتقّات آن و فنوکسیفلاون است. فعّالترین ترکیب عصارۀ آن، پلیموزوئید است که شناساگر گونه T. polium محسوب میشود. 66 تا 80 درصد پتانسیل آنتیاکسیدانی این گونه به حضور فنیل پروپانوئیدها و بهویژه حضور پلیموزوئید مربوط است. دیفنوکسیکوئرستین و رباسکوزید نیز در روبندگی رادیکالهای آزاد نقش دارد ( Mihajilov-Krstev et al., 2009؛Goulas et al., 2011 ؛Zerroug et al., 2011). برای تعیین فعّالیت روبشگری رادیکالهای آزاد و ظرفیت آنتیاکسیدانی ترکیبات فنلی در گیاهان، آزمایشهای متعدّدی را مانند بررسی ظرفیت آنتیاکسیدانیکل با آزمون PPT (Phosphomolybdenum Test) و بررسی فعّالیت آنتیاکسیدانی ویژه با آزمون DPPH (2,2-diphenyl-1 Picrylhydrazyl Test) میتوان انجام داد (Dicko et al., 2006؛ (Matkowski and Wolniak, 2005. هدف از انجام این آزمایش بررسی نرخ کالزایی گیاه کلپوره در سطوح مختلف هورمون D-4 و 2 و ارزیابی محیطکشت مناسب برای افزایش تولید ترکیبات فنلی و سایر مواد مؤثّر دارویی این گیاه است.
مواد و روشها
آمادهسازی مواد گیاهی: گیاه کلپوره در شهریور ماه 1392 از ارتفاعات شهرستان بردسکن (استان خراسان رضوی)، جمعآوری شد و پس از شناسایی وتأیید آن، پژوهشکدۀ علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد از آن استفاده کرد. در ابتدا بذرهای رسیده از گیاه مادری جدا و ضدّ عفونی شد. با توجّه به جوانهزنی بسیار اندک بذرها از تیمارهای مختلف برای افزایش قدرت جوانهزنی بذرها استفاده شد. در نهایت از هورمون جیبرلیک اسید همراه با استراتیفیکاسیون و خراش در دمای 4 درجۀ سانتیگراد به مدّت 6 روز به صورت بهترین تیمار استفاده شد. سپس بذرها درون پتریدیشهای استریل شده محتوی کاغذ صافی و در ژرمیناتور در دمای 2±25 درجۀ سانتیگراد و در شرایط همیشه مرطوب قرار گرفتند. با ظاهرشدن ریشهچه و ساقهچه، دانهرستهای کلپوره به مدّت دو روز زیر نور 2000 میکرومول فوتون بر متر مربّع بر ثانیه و دمای 25 درجۀ سانتیگراد و در شرایط کاملاً مرطوب، قرار گرفتند تا اندام هوایی آنها، سبز شد و طول ریشهچهها افزایش یافت. به اینترتیب، دانهرستها برای قرارگرفتن در محیط هیدروپونیک محتوی محلول هوگلند (Arnon and Hoagland, 1940) آماده شدند و در اتاقک رشد با دمای 2±25 درجۀ سانتیگراد با دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند.
عملیات کشت: در بررسی حاضر، کشت سه نوع ریزنمونۀ برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه در دو نوع محیطکشت MS و B5 در تیمار با 5 غلظت هورمون D-4 و 2 (2، 5/1، 1، 5/0، 0 میلیگرم در لیتر) به صورت آزمایش فاکتوریل و در قالب طرح آماری کاملاً تصادفی و در سه تکرار انجام شد. به این منظور، قطعات ریزنمونه پس از جداسازی از گیاه مادری حاصل از کشت هیدروپونیک و شستشو به مدّت 5 دقیقه با آب جاری، زیر هود لامینار (مدل JTLVC2، Jaltajhiz، ایران) منتقل و پس از غوطهورشدن 30 ثانیهای در الکل 70درصد، 5 دقیقه با آب مقطر استریل، شستوشو و سپس به مدّت 3 دقیقه وارد هیپوکلریت سدیم 1 درصد شدند. در پایان، سه مرتبه با آب مقطر استریل به مدّت 15 دقیقه شستشو داده شدند و سپس روی کاغذ صافی استریل در پتریدیش، قرار گرفتند تا رطوبت آنها گرفته شود. سپس ریزنمونهها بهطور مساوی به قطعات یک سانتیمتری برشخورده و درون ویالهای دارندۀ محیطکشت MS و B5 با غلظتهای مختلف هورمون D-4 و 2 قرارگرفتند. ویالهای دربردارندۀ قطعات جداکشت در اتاقک رشد با دمای 2±25 درجۀ سانتیگراد با دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی گرفتند و به مدّت 8 هفته نگهداری شدند. در این مدّت سه بار عملیات واکشت نمونهها انجام شد. پس از متوقّفشدن تقریبی رشد کالوسها در پایان هفتۀ هشتم، درصد کالزایی ریزنمونهها بررسی و برای تعیین نرخ رشد، وزن تر آنها به وسیلۀ ترازوی دیجیتال (مدل TE313s، Sartorius، آلمان) اندازهگیری شد.
عصارهگیری: 5/0 گرم مادهۀ تازه از هر نمونه (شامل برگ، جوانۀ انتهایی، ساقه و کالوسهای حاصل از ریزنمونههای برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه) برای عصارهگیری با 20 میلیلیتر متانول 80 درصد، ساییده شد و پس از ریختن درون لولۀ آزمایش، در بنماری (بن ماری سرولوژی، Kavoosh Mega، ایران) با دمای60-55 درجۀ سانتیگراد به مدّت 3 ساعت قرار گرفت. سپس به مدّت 15 دقیقه با دستگاه سانتریفیوژ (مدل Z230 ،Berthold Hermle GmbH، آلمان) (3000 دور در دقیقه) سانتریفیوژ شد. در پایان، محلول رویی با کاغذ واتمن شمارۀ یک، صاف و به حجم ابتدایی رسانده شد. عصارۀ مورد نیاز برای سنجش میزان ترکیبات فنلی و خواص آنتیاکسیدانی، بدون فاصله قبل از انجام هر آزمایش تهیّه شد. این عصاره به مدّت یک ماه در دمای20- درجۀ سانتیگراد قابل نگهداری است.
تعیین محتوای فنل کل: سنجش میزان ترکیبات فنلی کل با روش Gao و همکاران (2000) انجام شد. به این منظور ابتدا 200 میکرولیتر معرّف فولین - سیوکالچو به 100 میکرولیتر عصاره (25 میلیگرم در لیتر) در هر لولۀ آزمایش اضافه شد. سپس مخلوط واکنش با 2 میلیلیتر آب دوبار تقطیر، رقیق و مخلوط شد. پس از یک مکث 3 دقیقهای، 1 میلیلیتر سدیم کربنات 20 درصد به آن افزوده شد و پس از یک ساعت وقفه، جذب نوری مخلوط واکنش با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis1800،JASCO، آلمان) در طول موج 765 نانومتراندازهگیری شد. سنجش میزان ترکیبات فنلی کل در عصارههای متانولی استخراجشده از کالوسهای حاصل از سه اندام برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه در دو نوع محیطکشت MS و B5 تیمارشده با غلظتهای مختلف هورمون D-4 و 2 و همچنین سه اندام برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه از گیاه مادری در رویشگاه طبیعی و همچنین گیاهان رشدیافته در محیط هیدروپونیک با سه تکرار برای هر نمونه انجام شد. مقدار کلّ ترکیبات فنلی موجود در عصارهها با کمک منحنی استاندارد گالیک اسید، محاسبه و بر حسب معادل میلیگرم گالیک اسید در 100 گرم وزن تر نمونه تعیین شد.
تعیین فعّالیت آنتیاکسیدانی با آزمون DPPH: ابتدا غلظت 5/12 میلیگرم در میلیلیتر عصارۀ هر نمونۀ مورد بررسی، تهیّه و از آن به صورت محلول پایه استفاده شد. سپس از محلول پایه، 10 طیف غلظتی 5/12، 25/6، 125/3، 562/1، ... میلیگرم در لیتر تهیّه شد. آزمون DPPH با روش Yang و همکاران (2011) و در ظروف ویژۀ 96 خانهای انجام شد. در هر خانه، 100 میکرولیتر از غلظتهای مختلف عصارۀ هر یک از نمونهها و 100 میکرولیتر از محلول 008/0 درصد DPPH (w/v) متانولی به آن اضافه شد. از مخلوط 100 میکرولیتر عصاره و 100 میکرولیتر متانول به صورت بلانک و از مخلوط 100 میکرولیتر متانول و 100 میکرولیتر محلول 008/0 درصد DPPH برای شاهد استفاده شد. نمونهها به مدّت 30 دقیقه در تاریکی و دمای 25 درجۀ سانتیگراد قرار گرفت. پس از گذشت زمان مورد نظر، جذب در طول موج 517 نانومتر با دستگاه ELISA Reader (مدل Statfax-2100، Bioblock Scientific، امریکا) خوانده شد. به دلیل حساسبودن محلول DPPH به نور، این آزمایش در اتاق تاریک انجام شد. شاخص آنتیاکسیدانی (Antioxidant Index) بر مبنای رابطۀ 1 و 2 Yang et al., 2011) ) و برای سه تکرار از هر نمونه محاسبه شد.
رابطۀ 1: AI (%) = (1 – AT / AC) × 100
شاخص آنتیاکسیدانی (AI): AT: جذب خالص نمونۀ آزمایششده، AC: جذب شاهد.
رابطۀ 2: AT = AS – AB
جذب خالص نمونۀ آزمایششده (AT): AS: جذب خام نمونۀ آزمایششده، AB: جذب بلانک.
بررسی ظرفیت آنتیاکسیدانی کل با آزمونPPT: این آزمون با روش Prieto (1999) انجام شد. حجم های مختلف (10، 50، 100، 200 و300 میکرولیتر) از عصاره (25 میلیگرم در لیتر) تهیّه و با متانول به حجم 300 میکرولیتر رسانده شد. 3 میلیلیتر از محلول معرّف (سولفوریک اسید 6/0 مولار، سدیم فسفات 28 میلیمولار و آمونیوم مولیبدات 4 میلیمولار) نیز به آنها اضافه شد. پس از 90 دقیقه قراردادن در بنماری (مدل بنماری سرولوژی، Kavoosh Mega، ایران)(دمای 95 درجۀ سانتیگراد)، جذب آن در طول موج 695 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis1800،JASCO، آلمان) خوانده شد. در نهایت ظرفیت آنتیاکسیدانی کل در غلظت خاصی (25 میلیگرم در لیتر) بر اساس همارزی با آسکوربیک اسید (بر حسب میلیگرم ASA در 100 گرم بافت تر نمونه) ارائه و با یکدیگر مقایسه شدند.
تجزیه و تحلیل آماری دادهها: تجزیه و تحلیل آماری دادهها با نرمافزار SPSS نسخۀ 16 انجام شد و برای مقایسه میانگین دادهها از آزمون چنددامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد (05/0P≤) استفاده شد و نمودارهای مربوط به وسیلۀ نرمافزارEXCEL Microsoft (Office 2007) رسم شد.
نتایج.
نتایج حاصل از تحلیل واریانس دادهها نشان دادکه اثر نوع ریزنمونه، محیطکشت و اثر متقابل این دو بر وزن تر کالوس و محتوای ترکیبات فنلی کل و ظرفیت آنتیاکسیدان کلّ نمونهها معنیدار (05/0P≤) است. همچنین اثر غلظت هورمون و اثر متقابل غلظت هورمون و محیطکشت، غلظت هورمون و ریزنمونه، غلظت هورمون و محیطکشت و ریزنمونه نیز در هر چهار شاخص نرخ کالزایی، وزن تر کالوس، محتوای فنل کل و ظرفیت آنتیاکسیدان کل، معنیدار بود (جدول 1). گیاه رشدیافته در شرایط هیدروپونیک و شکل ظاهری کالوسهای حاصل از ریزنمونههای مختلف در شکل (1) نشان داده شده است. مقایسۀ شکل ظاهری کالوسها نشان داد که کالوسهای حاصل از ریزنمونۀ برگ در مقایسه با کالوسهای حاصل از ریزنمونههای جوانۀ انتهایی و ساقه وضعیت شیشهای و گرهدار داشتند (شکل 1). ارزیابی نرخ کالزایی در غلظتهای مختلف هورمون D-4 و 2 در دو محیطکشت B5 و MS نشان داد که در غلظت 2 میلیگرم در لیتر هورمون D-4 و 2 در محیط MS، بیشترین درصد کالزایی (100 درصد) برای هر سه ریزنمونۀ برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه وجود داشت؛ اگر چه افزایش این فرایند در مقایسه با نرخ کالزایی ریزنمونههای برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه در غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر هورمون D-4 و 2 محیط B5 معنیدار نبود (شکل A-2). بررسی وزن تر کالوسهای حاصل نشان داد که کالوس برگی محیطکشت B5، در دو غلظت 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر هورمون D-4 و 2 بالاترین شاخص را دارند (شکل B-2). با مقایسۀ کلّی دو محیطکشت، مشخّص شد که محیطکشت B5 در تولید کالوسهای با وزن تر بیشتر و محیطکشت MS در روند کالزایی بیشتر، موفّق هستند. بررسی تأثیر غلظت هورمون، نوع محیطکشت و برهمکنش این دو عامل در هریک از کالوسهای حاصل از ریزنمونۀ برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه بهطور جداگانه نشان داد که این عوامل بر محتوای فنل کل، ظرفیت آنتیاکسیدانی کل و توان آنتیاکسیدانی ویژۀ هر یک از کالوسها تأثیر معنیدار داشتند (دادهها نیامده است).
شکل 1- نمایی از گیاه رشدیافته در شرایط هیدروپونیک (A)، کالوسهای حاصل از ریزنمونۀ برگ در محیطکشت MS (B) وB5 (C)، کالوسهای حاصل از ریزنمونۀ جوانۀ انتهایی در محیطکشت MS (D) و B5(E) و کالوسهای حاصل از ریزنمونۀ ساقه در محیطکشت MS (F) و B5(G). نماد خطّی بیانکنندۀ یک سانتیمتر است.
جدول 1- میانگین مربّعات منابع تغییر مربوط به برخی صفات کالوسهای حاصل از ریزنمونههای گیاه کلپوره
|
منبع تغییر |
درجۀ آزادی |
نرخ کالزایی |
وزن تر کالوس |
فنل کل |
ظرفیت آنتیاکسیدانی کل |
|
ریزنمونه |
2 |
ns 833/755 |
*558/47 |
*524/712 |
*502/2916 |
|
محیطکشت |
1 |
ns 278/100 |
*462/28 |
*564/649 |
*153/2847 |
|
غلظت هورمون |
4 |
*056/11328 |
*237/12 |
*156/545 |
*374/2785 |
|
محیطکشت × ریزنمونه |
2 |
ns 611/183 |
*861/7 |
*762/656 |
*686/2878 |
|
غلظت هورمون × ریزنمونه |
8 |
*139/1205 |
*102/7 |
*074/673 |
*864/2878 |
|
غلظت هورمون × محیطکشت |
4 |
*889/1748 |
*550/3 |
*198/695 |
*039/2950 |
|
هورمون × محیطکشت × ریزنمونه |
8 |
*389/1061 |
*063/4 |
*627/602 |
*073/2820 |
|
خطا |
60 |
056/448 |
898/0 |
013/0 |
002/0 |
ns و * بهترتیب نشاندهندۀ نبودن معنیداری و معنیداری در سطح احتمال خطای 5 درصد (05/0P≤) است.
ارزیابی میزان فنل کلّ کالوسهای حاصل از ریزنمونههای مختلف در محیطهای کشت مورد بررسی، نشاندهندۀ موفّقبودن محیطکشت B5 نسبت به محیطکشت MS، به طور ویژه در شرایط بدون تیمار هورمونی بود (شکلC و B ،A-3). از سوی دیگر مشخّص شد که کالوسهای جوانۀ انتهایی با اختلاف معنیداری، فنل کلّ بیشتری نسبت به کالوسهای برگ و ساقه داشت. نکتۀ قابل توجّه این بود که با افزایش غلظت هورمون در محیطکشت B5 از محتوای فنل کل در کالوسهای حاصل از ریزنمونۀ برگ و جوانۀ انتهایی کاسته شد. به علاوه عصارۀ اندامهای مختلف گیاه جمعآوریشده از رویشگاه طبیعی نسبت به گیاه رشدیافته در محیط هیدروپونیک به صورت معنیداری (05/0P≤)، فنل بیشتری داشت (شکل D-3). بررسی توان آنتیاکسیدانی ویژه نشان داد که بهترین کالوس برگ با فعّالیت آنتیاکسیدانی بالا به محیطکشت MS (غلظت 5/1 میلیگرم در لیتر هورمون D-4 و 2)( 13/0 میلیگرم در میلیلیتر) متعلّق بود (شکل A-4). همچنین بهترین عصارۀ کالوس جوانۀ انتهایی برای روبشگری رادیکالهای آزاد به محیطکشت B5 با غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر هورمون یاد شده مربوط بود (04/0 میلیگرم در میلیلیتر IC50=) (شکلB-4). آنچه از آزمون ذکرشده روی کالوسهای حاصل از ریزنمونۀ ساقه بهدست آمد، گویای فعّالیت آنتیاکسیدانی بالای عصارۀ این کالوسها از محیطکشت B5 بدون هورمون بود (07/0 میلیگرم در میلیلیترIC50=) و مشخّص شد که با افزایش غلظت هورمون D-4 و 2 ، IC50 افزایش یافت (شکل C-4). همانطور که شکل (4) نشان میدهد، کالوسهای حاصل از محیطکشت B5 نسبت به MS با تفاوت زیادی، فعّالیت آنتیاکسیدانی ویژۀ بیشتری داشتند. بررسی میانگین دادهها نیز نشان داد که بهترتیب، عصارۀ برگ، جوانۀ انتهایی و ساقۀ گیاه جمعآوریشده از رویشگاه نسبت به گیاه هیدروپونیک، خاصیت آنتیاکسیدانی بیشتری دارند (شکل D-4).
بررسی ظرفیت آنتیاکسیدانی کل نیز نشان داد که کالوس حاصل از جوانۀ انتهایی در بهترین شرایط قرار داشت؛ به طوری که تأثیر هورمون در محیط MS (با غلظت 2 میلیگرم در لیتر D-4 و 2) بیشتر از سایر غلظتهای هورمونی محیطهای کشت بود (شکل C و B ،A-5). با مقایسۀ نمونههای حاصل از رویشگاه طبیعی و محیط هیدروپونیک و کالوسهای شرایط آزمایشگاهی، مشخّص شد که اندامهای طبیعی گیاهان، ظرفیت آنتیاکسیدانی کلّ بهتری در مقایسه با کالوسها دارند (شکل D-5).
شکل 2- تأثیر غلظتهای مختلف هورمون D-4 و 2 و محیطهای کشت MS وB5 بر درصد کالزایی (A) و وزن تر کالوس (B) ریزنمونههای برگ، جوانۀ انتهایی و ساقۀ گیاه کلپوره. میانگینهایی که در هر ستون، حداقل یک حرف مشترک دارند، مطابق آزمون دانکن تفاوت معنیداری ندارند (05/0P≤).
شکل 3- مقایسۀ میانگین محتوای ترکیبات فنلی کل در کالوسهای ریزنمونههای برگ (A)، جوانۀ انتهایی (B) و ساقه (C) گیاه کلپوره در محیطهای کشت MS وB5 و اندامهای مختلف گیاه در رویشگاه طبیعی و محیط هیدروپونیک (D). میانگینهایی که در هر ستون، حداقل یک حرف مشترک دارند، مطابق آزمون دانکن تفاوت معنیداری ندارند (05/0P≤).
شکل 4- مقایسۀ میانگین میزان فعّالیت آنتیاکسیدانی بر مبنای آزمون DPPH در کالوسهای ریزنمونههای برگ (A)، جوانۀ انتهایی (B) و ساقه (C) گیاه کلپوره در محیطهای کشت MS وB5 و اندامهای مختلف گیاه در رویشگاه طبیعی و محیط هیدروپونیک (D). میانگینهایی که در هر ستون، حداقل یک حرف مشترک دارند، مطابق آزمون دانکن تفاوت معنیداری ندارند (05/0P≤).
شکل 5- مقایسۀ میانگین میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی کل بر مبنای آزمون PPM در کالوسهای ریزنمونههای برگ (A)، جوانۀ انتهایی (B) و ساقه (C) گیاه کلپوره در محیطهای کشت MS وB5 و اندامهای مختلف گیاه در رویشگاه طبیعی و محیط هیدروپونیک (D). میانگینهایی که در هر ستون، حداقل یک حرف مشترک دارند، مطابق آزمون دانکن تفاوت معنیداری ندارند (05/0P≤).
بحث
گزارشها تأیید کردهاند که وجود هورمونهای اکسین و سیتوکینین میتوانند برای تشکیل کالوس الزامی باشند (Kandouz et al., 2010). در این میان، هورمونهای گروه اکسین، جایگاه بسیار مهمّی را در کنترل تقسیم و تمایز سلولهای گیاهی دارند (Shakeran and Keyhanfar, 2015؛Hosseini et al., 2015). بررسیهای مختلف پژوهشگران تأیید میکند که هورمون D-4 و 2 بر القای تشکیل کالوس، اثر ویژهای دارد (Amiri et al., 2011؛ Davarpanah et al., 2015)؛ بهطوری که هورمون D-4 و 2 از نظر تحریک تولید کالوس نسبت به هورمون NAA موفّقتر گزارش شده است (Dixon and Gonzales, 2002). نتایج این پژوهش نشان داد که در هر سه ریزنمونه (برگ، جوانۀ انتهایی و ساقه)، هر چند با افزایش غلظت هورمون D-4 و 2، درصد القای تشکیل کالوس نیز افزایش یافت، ولی محیط بهینه در افزایش وزن تر کالوسها در غلظتهای 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر از این هورمون بود. این موضوع میتواند نشان دهد که شاید تأثیر مثبت D-4 و 2 در القا و رشد کالوس هر گیاه بررسیشده، یک حدّ آستانه دارد و افزایش غلظت هورمون بیش از این حد بر میزان تقسیم سلولی اثر بازدارندگی خواهد داشت و در نتیجه کاهش وزن تر و خشک کالوسها را موجب خواهد شد (Pasternak et al., 2000 ). داورپناه و همکاران (2015) نیز در پژوهش خود بیان کردند که هر چند اجزای غلظت و ترکیب تنظیمکنندههای رشد گیاهی جایگاه بسیار مهمی در القای کالوس دارند، اما معمولاً محیط دارای 2-1 میلیگرم در لیتر D-4 و 2 یا ترکیب آن با سایر تنظیمکنندههای رشد گیاهی، این ویژگی را دارد. از آنجا که بیشترین درصد کالزایی در ریزنمونۀ برگ و سپس در ریزنمونۀ جوانۀ انتهایی مشاهده شد و نیز بیشترین مقدار وزن تر کالوسها از ریزنمونۀ برگ و سپس ساقه و جوانۀ انتهایی حاصل شده بود، باید احتمال وجود تعداد متفاوت گیرندههای اکسین در بخشهای مختلف گیاه را در توجیه این موضوع، مرتبط دانست. حاصل بررسی پژوهشگران نیز نشان داده است که گیرندههای اکسین در بافتهای مختلف گیاهان، متناسب با نوع اکسین، تخصّصیافتگی دارند؛ به طوری که تعداد و نوع گیرندههای اکسین در بافتهای مختلف یک گیاه، متفاوت گزارش شده است (Moore, 1989). نتایج این پژوهش نشان داد که محیطکشت B5 در افزایش وزن تر کالوسها بهطور قابل توجّهی نسبت به محیطکشت MS مؤثّرتر بود. دلایل توجیحی این مشاهده میتواند متنوّع باشد که از آن جمله میتوان به رقیقتربودن عناصر معدنی در محیط B5 اشاره کرد. از سوی دیگر، کارایی بهتر نوع آهن بهکاررفته در محیطکشت B5 (نمک تکسدیمی EDTA) نسبت به نوع آهن کاربردی در محیط MS (نمک دوسدیمی EDTA) برای تکثیر و رشد از دلایل دیگر آن شناخته شده است (Jacob and Malpathak, 2005). ویتامینهای محیط B5 از ویتامینهای محیط MS متفاوت است و غلظت بالاتری از ویتامین تیامین دارد. تیامین در فرایندهای بیوسنتز و متابولیسم سلولی، جایگاه بسیار مهمی دارد (Willims, 1995)؛ از این رو ویتامینهای محیط B5 و بهویژه تیامین نیز عوامل تأثیرگذار بر موفّقیت این محیط گزارش شدهاند (White, 1937).
نتایج این پژوهش نشان داد که بیشترین مقدار فنل در کالوس حاصل از ریزنمونۀ جوانۀ انتهایی در محیطکشت B5 بدون هورمون بود. همچنین مشخّص شد که میزان فنل کل در کالوسهای حاصل از جوانۀ انتهایی، بیشتر از برگ و در برگ نیز بیشتر از ساقه بود. در مقایسۀ اثر محیطکشت بر روند افزایشی فنل کل مشاهده شد که کالوسهای جمعآوریشده از محیط B5 با اختلاف اندکی نسبت به گیاه کلپوره، بیشترین مقدار را داشتند. بر اساس این بررسی، میتوان شرایط درون شیشه را زمینۀ مناسب برای تولید سطوح بالاتر ترکیبات ثانوی از جمله فنلها معرّفی کرد. عوامل مختلفی مقدار ترکیبات فنلی موجود در بافتهای گیاهی را در تأثیر قرار میدهند که از آن جمله میتوان به عوامل ژنتیکی، میزان تابش خورشید، شرایط محیطی، آب و هوا، تنشها، عملیات پس از برداشت و شرایط نگهداری اشاره کرد ( Faller and Fialho, 2009؛Rajaeian et al., 2015). به این ترتیب با کنترل این عوامل در شرایط تنظیمشدۀ آزمایشگاهی میتوان زمینۀ تولید بالاتر ترکیبات ثانوی را فراهم کرد.
از آن جا که ترکیبات و متابولیتهای ثانوی از طریق ساز و کارهای مختلفی به ارائۀ ویژگیهای آنتیاکسیدانی اقدام میکنند، واضح است که تنها یک روش نمیتواند پیشبینی جامعی از تأثیر تمام شاخصهای درگیر در عملکردهای آنتیاکسیدانی ارائه دهد. در پژوهش حاضر از دو روش PPT و DPPH برای سنجش فعّالیت آنتیاکسیدانی عصارۀ متانولی نمونهها استفاده شد. آزمون PPT، روشی برای ارزیابی فعّالیت آنتیاکسیدانی کل، نشأتگرفته از ترکیبات مختلف از جمله فنلها، آسکوربیک اسید، توکوفرولها و کاروتنوئیدها در گیاه است (Abbasi et al., 2010 ؛Muanda et al., 2009)؛ در حالی که آزمون DPPH، فعّالیت آنتیاکسیدانی ویژۀ فنلها و آنتوسیانینها را محاسبه میکند ( Muanda et al., 2009 ؛ Nikhat et al., 2009؛Abbasi et al., 2010). نتایج پژوهش حاضر نشان داد که روند تغییرات ظرفیت آنتیاکسیدانی کلّ عصارهها، کاملاً با روند تغییرات ترکیبات فنل کل متناسب بوده است؛ بهطوری که بیشتربودن محتوای ترکیبات فنلی، دلیل اصلی بالابودن فعّالیت آنتیاکسیدانی بعضی از عصارههاست که از گروههای هیدروکسیل موجود در ساختار آنها ناشی میشود. مجموعۀ گزارشهایی که بر اهمّیت ساختار ترکیبات فنلی و شیوۀ دخالت آن در فعّالیت آنتیاکسیدانی تأکید دارد، بسیار است (Olabinri et al., 2010 ؛Stojanovic et al., 2010 ).
آزمون DPPH بهطورگسترده برای ارزیابی توانایی ترکیبات مختلف در روبش رادیکالهای آزاد و سنجش میزان فعّالیت آنتیاکسیدانی ویژه آنها به کار میرود (Koleva et al., 2002 ؛Qureshi et al., 2010). الکترون اضافی موجود در ساختار رادیکال آزاد DPPH، جذب بالایی را در 517 نانومتر ایجاد میکند و به ایجاد رنگ بنفش منجر میشود. این رنگ بنفش هنگام احیای DPPH و جفتشدن این الکترون اضافی با هیدروژن و تبدیل آن از رادیکال آزاد DPPH به یک ترکیب احیاشده DPPH-H به رنگ زرد تبدیل میشود (Sharma and Bhat, 2009). نتایج این پژوهش نشان داد که برگ جمعآوریشده از رویشگاه طبیعی و کالوس حاصل از ریزنمونۀ جوانۀ انتهایی در محیطکشت B5 بدون هورمون، بیشترین میزان فعّالیت آنتیاکسیدانی ویژه را داشت. همچنین مشاهده شد که با افزایش محتوای فنل کلّ اندازهگیریشده، خاصیت روبشگری رادیکالهای آزاد نیز افزایش مییابد؛ به طوری که این خاصیت در کالوسهای جوانۀ انتهایی، بیشتر از برگ و ساقه بود و با نتایج حاصل از سنجش فنل کل، همارزی داشت. در بسیاری از گیاهان، فعّالیت آنتیاکسیدانی با میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی رابطۀ مستقیم دارد. عصارۀ نعناع (Mentha piperita) به سبب داشتن ترکیبات فنلی بالا، فعّالیت آنتیاکسیدانی خوبی را نشان میدهد (Swetie et al., 2007). ثابت شده است که عصارۀ رزماری (Rosmarinus officinalis) نیز فعّالیت آنتیاکسیدانی بالایی دارد و این فعّالیت با محتوای ترکیبات فنلی گیاه رابطۀ مستقیم دارد (Elmasta et al., 2006). Jamshidi و همکاران (2010) و Jafari و همکاران (2015)، عصارۀ متانولی چند گیاه بومی مازندران را از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی بررسی کردند. آنها نشان دادند که بین توان آنتیاکسیدانی و ترکیبات فنلی گیاهان بررسیشده، ارتباط مستقیمی وجود دارد. در بررسی فعّالیت آنتیاکسیدانی جوی دوسر (Avena sativa) با روش DPPH و میزان فنل کل، مشخّص شد که بین میزان ترکیبات فنلی و فعّالیت آنتیاکسیدانی رابطۀ مستقیم وجود دارد (Peterson et al., 2001). فعّالیت آنتیاکسیدانی زیرۀ سیاه (Carum carvi) با روش DPPHنیز نشان داد که خاصیت روبشگری رادیکالهای آزاد آن به ترکیبات فنلی، مربوط است (Bamdad et al., 2006). در چند گزارش بیان شد که ترکیبات فنلی موجود در گیاهان علفی به طور قابل توجّهی به خواص آنتیاکسیدانی آنها کمک میکند (., 2005 Shan et al ؛Wu et al., 2006).
نتیجهگیری کلّی
اهمّیت دارویی گیاه کلپوره و دورۀ رویشی کوتاهمدّت آن در طول سال از یکسو و خطر انقراض این گونۀ گیاهی به دست انسان و چرای مفرط دام از سوی دیگر، ایجاد تمهیدات لازم برای حفظ و تکثیر آن را ضروری میکند. با توجّه به نتایج این پژوهش، بهترین شرایط افزایش درصد جوانهزنی بذر این گیاه، استفاده از تیمارهای همزمان فیزیکی و شیمیایی شامل استراتیفیکاسیون و خراش همراه با هورمون جیبرلیک اسید معرّفی میشود. محیطکشت B5 و هورمون D-4 و 2 نیز در افزایش تولید کالوس، تأثیر بهسزایی داشتند. بهترین محیطکشت که در آن بیشترین میزان فنل مشاهده شد، به محیطکشتهای دارای مقدار کمتر از هورمون D-4 و 2 مربوط بود. به دنبال آن، روند تغییرات فعّالیت آنتیاکسیدانی و ظرفیت آنتیاکسیدان کل که بهترتیب با آزمونهای DPPH و PPM بررسی شد با روند تغییرات ترکیبات فنلی، متناسب بود. این شرایط میتواند پیشنهاد استفاده از محیطهای کشت ذکرشده را برای افزایش تولید ترکیبات ثانوی با خاصیت آنتیاکسیدانی ارائه دهد.
سپاسگزاری
نگارندگان از حوزۀ معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد برای تأمین هزینههای مالی سپاسگزاری میکنند.
منابع
Abbasi, M. A., Zafar, A., Riaz, T., Rehman, A., Arshad, S., Shahwar, D., Jahangir, M., Siddiqui, S. Z., Shahzadi, T. and Ajaib, M. (2010) Evaluation of comparative antioxidant potential of aqueous and organic fractions of Ipomoea carnea. Journal of Medicinal Plants Research 4: 1883-1887.
Al-Qudah, T. S., Shibli, R. A. and Alali, F. Q. (2011) In vitro propagation and secondary metabolites production in wild germander (Teucrium polium L.). In vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 47: 496-505.
Amiri, S., Kazemitabar, S. K., Ranjbar, G. A. and Azadbakht, M. (2011) In vitro propagation and whole plant regeneration from callus in Datura (Datura stramonium. L). African Journal of Biotechnology 10: 442-448.
Ardestani, A., Yazdanparast, R. and Jamshid, S. (2008) Therapeutic effects of Teucrium polium extracts on oxidative stress in pancreas of streptozotocin-induced diabetes rats. Journal of Medical Food 11: 525–532.
Arikat, N. A., Jawad, F. M., Karam, N. S. and Shibli, R. A. (2004) Micropropagation and accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.). Scientia Horticulturae 100: 193-202.
Arnon, D. and Hoagland, D. (1940) Crop production in artificial culture solutions and in soils with special reference to factors influencing yields and absorption of inorganic nutrients. Journal of Soil Science 50: 463-485.
Bamdad, F., Kadivar, M. and Keramat, J. (2006) Evaluation of phenolic content and antioxidant activity of Iranian caraway in comparison with clove and BHT using model systems and vegetable oil. Food Science Technology 41: 7-20.
Davarpanah, S. J., Lahouti, M. and Karimian, R. (2015) Study of callus initiation and growth crireria at different concentrations of 2,4-D and kinetin in Taxus baccata L. embryo culture. Iranian Journal of Plant Biology 7(23): 41-50 (in Persian).
Dicko, M. H., Gruppen, H., Traore, A. S., Voragen, A. G. and Berkel, W. J. H. (2006) Phenolic compounds and related enzymes as determinates of Sorghum for food use. Biotechnology and Molecular Biology Review 1: 21-38.
Dixon, R. A. and Gonzales, R. A. (2002) Plant cell culture. Plant physiology 13: 456-460.
Elmasta, M., Drirtas, I., Isildak, O. and Aboul-Enein, H. Y. (2006) Antioxidant activity of S-Carone isolated from Spearmint (Mentha Spicata L.). Liquid Chromato Related Technology 29: 1465-1475.
Esmaeili, M. A. and Sadeghi, H. (2009) Pancreatic Β-cell protective effect of rutin and apigenin isolated from Teucrium Polium. Pharmacology online 2: 341-353.
Faller, A. L. K. and Fialho, E. (2009) The antioxidant capacity and polyphenol content of organic and conventional retail vegetables after domestic coking. Food Research International 42: 210-215.
Gao, X., Ohlander, M., Jeppsson, N. and Trajkovski, V. (2000) Changes in antioxidant effects and their relationship to phytonutrients in fruits of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) during matura-tion. Journal of the Agricultural and Food Chemistry 48: 1485–1490.
Ghanti, K., Kaviraj, C., Venugopal, R., Jabeen, F. and Rao, S. (2004) Rapid regeneration of Mentha piperita L. from shoot tip and nodal explants. Indian Journal of Biotechnology 3: 594-598.
Goulas, V., Gomez-Caravaca, A. M., Exarchou, V., Gerothanassis, I. P., Segura-Carretero, A. and Gutiérrez, A. F. (2011) Exploring the antioxidant potential of Teucrium polium extracts by HPLC-SPE-NMR and on-line radical scavenging activity detection. LWT-Food Science and Technology 46: 104-109.
Grzegorczyk, I., Bilichowski, I., Mikiciuk-Olasik, E. and Wysokińska, H. (2005) In vitro cultures of Salvia officinalis L. as a source of antioxidant compounds. Acta Societatis Botanicorum Poloniae 74: 17-21.
Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B. and Abdollahi, M. (2010) A systematic review of the efficacy and safety of Teucrium species; from anti-oxidant to anti-diabetic effect. International Journal of Pharmacology 6: 315–325.
Hasanpour, H., Bernard, F. and shaker, H. (2007). Optimizing callus culture in Zataria mutiflora boiss for rosmarinic acid production. Iranian Jornal of Janglands and Forests Plant Breeding and Genetic Research 15: 1-9.
Hosseini, B., Salimi, A. and Sharafi, A. (2015) A survey of the effect of explants type, plant growth regulators and activated charcoal on callus induction in Papaver bracteatum. Iranian Journal of Plant Biology 7(25): 29-42 (in Persian).
Jacob, A. and Malpathak, N. (2005) Manipulation of MS and B5 components for enhancement of growth and solasodine production in hairy root cultures of Solanum khasianum Clarke. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 247- 257.
Jafari, N., Naderi, P. and Ebrahimzadeh, M. A. (2015) Evaluation of phenolic content, total flavonoid and survey of antioxidant activity of leaves of Ficus carica and Pterocarya fraxinifolia trees using spectrophotometry and high performance liquid chromatogragh methods. Iranian Journal of Plant Biology 7(25): 1-16 (in Persian).
Jamshidi, M., Ahmadi, H. R., Rezazadeh, Sh., Fathi, F. and Mazanderani, M. (2010) Study on phenolic and antioxidant activity of some selected plant of Mazandaran province. Medical Plant 9: 177-183.
Kandouz, M., Alachkar, A., Zhang, L., Dekhil, H., Chehna, F., Yasmeen, A. and Moustafa, A. E. A. (2010) Teucrium polium plant extract inhibits cell invasion and motility of human prostate cancer cells via the restoration of the E-cadherin/catenin complex. Journal of Ethnopharmacology 129: 410-415.
Kashfi, A. (2010) Economic comparative advantage and trade cultivation of medicinal plants in Iran and its value on world markets. Journal of Agriculture and Animal Husbandry 2(56): 36 (in Persian).
Kochaki, A. and Nasiri Mahallati, M. (2009) Evaluation of agroecological needs of Teucrium polium L. Agricultural Research Magazine of Iran 6(2): 29-41 (in Persian).
Koleva, T. A., De Groot, A. and Evstatieva, L. N. (2002) Screening of plant extracts for antioxidant activity: a comparative study on three testing methods. Phytochemical Analysis 13: 8-17.
Lukmanul hakim, F., Gowri Shankar, C. and Girija, S. (2007) Chemical composition and antioxidant property of holy basil (Ocimum sanctum L.) leaves, stem and inflorescence and their in vitro callus cultures. Jornal of Agricultural and Food Chemistry 55: 9109-9117.
Matkowski, A. and Wolniak, D. (2005) Plant phenolic metabolites as the free radical sc
avengers and mutagenesis inhibitors. BMC Plant Biology 5(Suppl 1): S23.
Mihajilov-Krstev, T., Radnović, D., Kitić, D., Zlatković, B., Ristić, M. and Branković, S. (2009) Chemical composition and antimicrobial activity of Satureja hortensis L. essential oil. Central European Journal of Biology 4: 411-416.
Moore, T. C. (1989) Biochemistry and physiology of plant hormones. Springer-Verlag, New York.
Muanda, F., Kone, D., Dicko, A., Soulimani, R. and Younos, Ch. (2009) Phytochemical composition and antioxidant capacity of three Malian medicinal plant parts. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine (eCAM) 7: 1-8.
Nikhat, F., Satynarayana, D. and Subhramanyam, E. V. S. (2009) Isolation, characterization and screening of antioxidant activity of the roots of Syzygium cuminii (L.) skeel. Asian Journal of Research in Chemistry 2: 218-221.
Olabinri, B. M., Eniyansoro, O. O., Okoronkwo, C. O., Olabinri, P. F. and Olaleye, M. T. (2010) Evaluation of chelating ability of aqueous extract of Tetracarpidium conophorum (African walnut) in vitro. International Journal of Applied Research in Natural Products 3: 13-18.
Pasternak, T., Miscolzi, P., Ayaydin, F., Dudits, T. and Feher, A. (2000) Exogenous auxin and cytokinin dependent activation of CDKs and cell division in leaf protoplast-drived cells of alfalfa. Plant Growth Regulators 32: 129-141.
Peterson, D. M., Emmons, C. L. and Hibbs, A. (2001) Phenolic antioxidant activity in pearling fractions of oat groats. Cereal Science 33: 97-103.
Prieto, P., Pineda, M. and Aguilar, M. (1999) Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry 269: 337-341.
Qureshi, M. N., Kuchekar Bhanudansh, S., Logade Nadeem, A. and Haleem, M. (2010) In vitro Antioxidant and In-vivo epatoprotective activity of Leucas ciliata leaves. Records Natural Products 4: 124-130.
Rabba’a, M. M., Shibli, R. A. and Shatnawi, M. A. (2012) Cryopreservation of Teucrium polium L. shoot-tips by vitrification and encapsulation-dehydration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 110: 371-382.
Rajaeian, S., Ehsanpour, A. A. and Toghyani, A. (2015) Changes in phenolic compound, TAL, PAL activity of Nicotiana rustica triggered by ethanolamine pretreatment under in vitro salt stress condition. Iranian Journal of Plant Biology 7(26): 1-12 (in Persian).
Shakeran, Z. and Keyhanfar, M. (2015) Callogenesis in root explants of four spcies of the family Solanaceae after inducing by Agrobacterium rhizogenesis. Iranian Journal of Plant Biology 7(25): 69-84 (in Persian).
Shan, B., Cai, Y. Z., Sun, M. and Corke, H. (2005) Antioxidant capacity of 26 spice extracts and characterization of their phenolic constituents. Journal of the Agricultural and Food Chemistry 53: 7749–7759.
Sharma, O. P. and Bhat, T. K. (2009) DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry 113: 1202-1205.
Stojanovic, G., Stojanovic, I., Stankov-Jovanovic, V., Mitic, V. and Kostic, D. (2010) Reducing power and radical scavenging activity of four Parmeliaceae species. Central European Journal of Biology 5: 808-813.
Swetie, R., Raesh, Ch. and Arun, S. (2007) Antioxidant potential of mint (Mentha Spicata L.) in radiation processed lamb meat. Food Chemistry 100: 451-458.
Tavakkoli Saberi, M. and Sedaghat, H. (1993) Medicinal plants. Gulshan publications 23-27 (in Persian).
White, P. R. (1937) Vitamin B1 in the nutrition of excised tomato roots. Plant Physiology 12: 803-811.
Willims, R. R. (1995) The chemical microenvironment and its effects. In: Automation and environmental control in plant tissue culture (eds. Aitken-Christie, J., Kozai, T., and Smith, M. A. L.). 405- 439. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Wu, C. Q., Chen, F., Wang, X., Kim, H. J., He, G. Q., Haley-Zitlin, V. and Huang, G. (2006) Antioxidant constituents in feverfew (Tanacetum parthenium) extract and their chromatographic quantification. Food Chemistry 96: 220-227.
Yang, H., Yuqong Shi, D., Huijing, P. and Xiaobo, L. (2011). Antioxidant compounds from propolis collected in Anhi, China. Journal of Molecules 16: 3444-3455.
Zerroug, M. M., Zouaghi, M., Boumerfeg, S., Baghiani, A. and Nicklin, J. (2011) Antibacterial activity of extracts of Ajuga Iva and Teucrium polium. Advances in Environmental Biology 5: 491-495.
)
