Document Type : Original Article
Authors
1 Department of Biology, Faculty of Science, University of shahid Bahonar Kerman, kerman, iran
2 1Department of Biology, Faculty of Science, University of shahid Bahonar Kerman, kerman, iran
3 Department of Ecology, Research Center for Advanced Science and Technology and Environmental Sciences, Graduate University industrial and advanced technology kerman, Kerman, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
گیاه سویا با نام علمی (Glycine max L.) متعلق به خانوادة Fabaceae و گیاه علفی یکساله است که بهصورت بوتهای با شاخ و برگ بسیار رشد میکند. سویا دو مرحلة رویشی و زایشی دارد (McWilliams et al, 2004).
گیاه سویا نقش ویژهای در پیشگیری از خطر ابتلا به طیف وسیعی از بیماریهای خطرناک مانند سرطان سینه و پروستات دارد و مهمترین محصول جهان از نظر خواص پیشگیریکننده است(Hellal and (Abdelhamid, 2013.
گیاهان منبع بسیاری از موادشیمیایی هستند که مصرف دارویی دارند و فراوردههای حاصل از متابولیسم ثانویة گیاهی جزء گرانبهاترین ترکیبات شیمیایی گیاهی هستند. این ترکیبات منحصر به گونه یا حتی نژاد ویژهای هستند و اغلب در دورة رشدی و نموی ویژه در گیاه تولید میشوند. ترکیبات فنلی گروه عمدهای از ترکیبات شیمیایی گیاهی حاصل از مسیر فنیل پروپانویید هستند که اهمیت فیزیولوژیک و مورفولوژیک آنها ثابت شده است و گزارشهای زیادی از ویژگی آنتیاکسیدانی آنها و اثرشان بر حذف رادیکالهای آزاد وجود دارد. این ترکیبات بهطور گسترده در گیاهان وجود دارند؛ به رنگ، عطر و طعم میوهها کمک میکنند(Chang-Kui Ding et al, 2001)؛ در قسمتهای مختلف سلول گیاهی و در مراحل مختلف رشد گیاه تشکیل میشوند (Ewane et (al, 2012. بیشترین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز در گیاهان جوان و در حال نمو مشاهده شده است. فعالیت این آنزیم در مراحل مختلف رشد و نمو گیاه متفاوت است و بیشترین فعالیت آن درمرحلة جوانه زنی مشاهده شده است (Ziaei et al, 2012).
فلاونوئیدها گروه وسیعی از ترکیبات فنلی هستند که گسترة وسیعی از نقشهای زیستی را بهویژه در برابر تنشها دارند. و فعالیت آنتیاکسیدانی زیاد این ترکیبات نسبت به کاروتنوئیدها گزارش شده است (Lister and Lancaster, 1996) اکسین از تنظیمکنندگان رشد گیاهی است. ایندول 3- بوتیریک اسید (IBA) ترکیبی مصنوعی است که ریشهزایی را در گیاهان سبب میشود Strader and Bartel, 2011)). گزارشها نشان میدهند که ایندول 3-استیک اسید (IAA) نسبت به ایندول 3- بوتیریک اسید به نور و دما حساستر است (Zolman et al, 2000). همچنین ایندول 3- بوتیریک اسید در مسافتهای طولانی در گیاهان حرکت میکند و در طول انتقال دستنخورده باقی میماند. در ریشه، ساقه و سایر بافتها انتقال ایندول 3- استیک اسید از ایندول 3- بوتیریک اسید کاملاً متفاوت است (Korasick et al, 2013). عکسالعمل گیاه، به حساسیت اندام گیاهی بستگی دارد و پاسخ گیاه به اکسین به غلظت آن وابسته است (Jellin et al, 2008). همچنین تاثیر اکسین خارجی بر محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در گیاه Vigna اثبات شده است (Vats et al, 2012).
تیامین (ویتامین B1) جزء ویتامینهای محلول در آب است و تاثیر این ترکیب در تولید متابولیتهای ثانویه اثبات شده است(Abrahamian and Kantharajah, 2011). گزارشهای مبنی بر اثر تیامین بر افزایش محتوای رنگیزههای فتوسنتزی (Yousef and Talaat, 2003)، افزایش رشد ریشه و همچنین افزایش وزن تر و خشک گیاه وجود دارد (Abdel-Aziz et al, 2009).
باتوجهبهاینکه گیاه سویا اهمیت زیادی از نظر داشتن ترکیبات فنلی و فلانوئیدی بهویژه ایزوفلاونوئیدها دارد، هدف اصلی پژوهش حاضر، بررسی تاثیر متقابل تیمارهای هورمون ایندول 3- بوتیریک اسید و ویتامین تیامین بر محتوای ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی و آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در مراحل مختلف رشد رویشی گیاه سویا و تشخیص مناسبترین مرحلة تیماردهی برای افزایش این ترکیبات است.
مواد و روشها
در پژوهش حاضر، رقم DPX مطالعه شد. بذرهای مطلوب از نظر سالمبودن و مناسببودن اندازه و وزن برای کاشت انتخاب شدند. در نخستین هفته پس از کشت در گلدان، آبیاری با آب مقطر انجام شد. برای تامین املاح لازم برای گیاه، پس از یک هفته، آبیاری با محلول کامل غذایی هوگلند سه بار در هفته انجام شد. پس از گذشت سه هفته، نمونههای گیاهی در مرحلة 3 تا 5 برگی و 9 تا 11 برگی تا رسیدن به مرحلة زایشی تیمار شدند.تیمارهای لازم برای پژوهش حاضر، با افزودن ایندول 3-بوتیریک اسید و تیامین (ویتامین B1) به محلول غذایی تهیه شدند. محلول غذایی استفادهشده، هوگلند بود که به نسبت 5/0 و اسیدیتة مشخص 4/6 استفاده شد (Hoagland and Arnon, 1950). غلظتهای صفر، 50 و 200 میکرومولار تیامین و غلظتهای صفر، 10 و 50 میکرومولار ایندول
3- بوتیریک اسید و جمعا نه تیمار به دست آمد. جدول ترکیب تیمارهای استفادهشده در پژوهش حاضر، با آزمایش فاکتوریل تهیه شد.
گیاهان موجود، در ۲۷ گلدان کاشته شدند. پس از گذشت ۲۱ روز نمونهها تیمار شدند. از گلدانهای کاشتهشده، ۳ گلدان، شاهد و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شدند. تیمارها شامل
1- اکسین صفر+تیامین صفر (شاهد)؛
2- اکسین 10+تیامین 50 میکرومولار؛
3- اکسین 10+تیامین 200 میکرومولار؛
4- اکسین 50+تیامین 50 میکرومولار؛
5- اکسین 50، تیامین 200 میکرومولار؛
6- اکسین صفر+تیامین 50 میکرومولار؛
7- اکسین صفر+تیامین 200 میکرومولار؛
8- تیامین صفر+اکسین 10میکرومولار؛
و 9- تیامین صفر+اکسین 50 میکرومولار
بودند که در پژوهش حاضر، دو مرحلة رویشی 3 تا 5 برگی و 9 تا 11 برگی در نظر گرفته شدند. تیماردهی بهصورت یک روز در میان تا رسیدن گیاه به مرحلة زایشی ادامه پیدا کرد؛ سپس برگها و ریشههای گیاهان مد نظر برای مطالعه، در ازت مایع منجمد و برای سنجشهای بعدی به فریزر 20- درجة سانتیگراد منتقل شدند.
طول ساقه و ریشه با استفاده از خط کش میلی متری اندازه گیری شد. طول ساقه از یقه تا قسمت انتهایی ساقه، و طول ریشه از یقه تا انتهای ریشه در نظر گرفته شد. برای هر گروه تیماری سه تکرار، هر تکرار از میانگین سه نمونه محاسبه و بر اساس واحد میلی متر گزارش گردید.
اندازهگیری وزن تر اندام هوایی و ریشة گیاه:پس از جداکردن اندام هوایی و ریشه از یکدیگر، وزن هریک برحسب گرم با ترازو (مدل BPSIID، شرکت Sartorius، آلمان) با دقت 001/0 گرم اندازهگیری شد.
اندازهگیری طول اندام هوایی و ریشه: طول ریشه و ساقه با خطکش میلیمتری اندازهگیری شد. طول ساقه، از یقه تا قسمت پایانی ساقه و طول ریشه، از یقه تا پایان ریشه در نظر گرفته شد. اندازهگیری طول ساقه، برای هرگروه تیماری در سه تکرار انجام شد. هر تکرار از میانگین سه نمونه محاسبه و براساس واحد میلیمتر گزارش شد.
سنجش میزان کلروفیل و کاروتنوئید:برای سنجش میزان کلروفیل و کاروتنوئید از روش Lichtenthaler (1987) استفاده شد. 2/0 گرم از برگهای تازة گیاه در هاون چینی حاوی 1۵ میلیلیتر استون 80 درصد سائیده شد و پس از صافکردن با کاغذ صافی، جذب آن با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Visible (مدل Cary-50، شرکت Varian، استرالیا) در طول موجهای 8/۶۴۶، 20/۶۶3 و ۴70 نانومتر خوانده شد. برای تنظیم دستگاه، استون 80 درصد استفاده شد. غلظت رنگیزهها با رابطههای 1 تا 4 محاسبه شدند.
رابطة 1:
رابطة 2:
رابطة 3:
رابطة 4:
طبق رابطههای 1 تا 4 بهترتیب غلظت کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها (شامل: کاروتنها و گزانتوفیلها) محاسبه شدند. غلظت برحسب میلیگرم بر میلیلیتر عصارة گیاهی تعیین شد. نتایج حاصل از اندازهگیری مقدار رنگیزههای فتوسنتزی برحسب گرم وزن تر محاسبه و ارائه شدند.
سنجش میزان آنتوسیانینها:برای اندازهگیری مقدار آنتوسیانینهای برگ روش Wagner (1979) استفاده شد. 1/0 گرم از بافت برگی در هاون چینی با 10 میلیلیتر متانول اسیدی (متانول خالص و کلریدریک اسید خالص به نسبت حجمی (1:99) کاملا سائیده شد. عصاره در لولههای آزمایش سرپیچدار ریخته شد و بهمدت 2۴ ساعت در تاریکی و دمای 2۵ درجة سانتیگراد قرار گرفت؛ سپس بهمدت 10 دقیقه با سرعت ۴000 دور در دقیقه سانتریفیوژ (مدل 5804R، شرکت Eppendorf، آلمان) و جذب محلول رویی در طول موج ۵۵0 نانومتر اندازهگیری شد. برای محاسبة غلظت، ضریب خاموشی (ε) 33000 سانتیمتر بر مول در نظر گرفته شد.
سنجش میزان فلاونوئیدها:فلاونوئیدهای کل با روش اندازهگیری آلومینیوم کلرایدکالریمتری Zhishenو همکاران (۱۹۹۹) انجام شد.1/0گرم از نمونههای گیاهی در۱۰ میلیلیتر متانول۸۰ درصد بهخوبی ساییده شد و عصارة حاصل سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای آزمایشهای بعدی استفاده شد. ۵۰۰ میکرولیتر عصاره برداشته و با آب مقطر به حجم ۵ میلیلیتر رسانده شد. پس از ۵ دقیقه ۳۰۰ میکرو لیتر سدیم نیتریت ۵ درصد و ۶۰۰ میکرولیتر آلومینیوم کلرید ۱۰ درصد به محلول اضافه شد. پس از ۶ دقیقه، ۲ میلیلیتر سدیم هیدروکسید ۱ مولار با ۲ میلیلیتر آب مقطر به محلول اضافه شد. شدت جذب محلول با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۱۰ نانومتر خوانده شد.
اندازهگیری میزان فنل کل: محتوای ترکیبات فنلی کل با روش Tunc-Ozdemir (2009) استخراج شد. 1/0 گرم از برگ تر گیاه در ۵ میلیلیتر اتانول ۹۵ درصد سائیده و بهمدت ۲۴ ساعت در تاریکی نگهداری شد؛ سپس به ۱ میلیلیتر محلول رویی، ۱ میلیلیتر اتانول ۹۵ درصد اضافه شد و حجم محلول با آب مقطر به
۵ میلیلیتر رسانده شد؛ سپس 5/0 میلیلیتر معرف فولین ۵۰ درصد و ۱ میلیلیتر سدیم کربنات ۵ درصد به آن اضافه شد. مخلوط حاصل بهمدت ۱ ساعت در تاریکی نگهداری و سپس جذب هر نمونه در طول موج
۷۲۵ نانومتر خوانده شد و غلظت ترکیبات فنلی کل برحسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.
سنجش غلظت پروتئین:بهاینمنظور 1 گرم بافت تر در یک هاون چینی محتوی 3 میلیلیتر بافر تریس-ساکارز با ۵/7=pH بهطور کامل سائیده شد. محلول همگن بهدستآمده به لولة سانتریفیوژ منتقل و پس از 10 دقیقه سکون، بهمدت 2۵ دقیقه در g4000 سانتریفیوژ شد. در پایان مرحلة سانتریفیوژ، لولهها بهآرامی از دستگاه خارج و محلول رویی در چند لولة آزمایش توزیع شد. عصارههای حاصل برای سنجش غلظت پروتئین استفاده شدند. برای سنجش غلظت پروتئین به لولههای آزمایش مقدار 1/0 میلیلیتر عصارة پروتئینی و 5 میلیلیتر معرف بیوره افزوده و سریعاً ورتکس شد. پس از دو دقیقه و قبل از یک ساعت جذب آنها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵9۵ نانومتر خوانده شد (Bradford, 1976).
اندازهگیری میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL):اندازهگیری با روش Hahldbrock و Rogg (1975) انجام شد. برای تهیة عصارة آنزیمی، مقدار ۳۰۰ میلیگرم از بافت تازة برگی با5/6 میلیلیتر بافر تریس - هیدرو کلریک اسید ۵۰ میلیمولار با 8/8=pH حاوی بتا مرکاپتواتانول ۱۵ میلیمولار در هاون سرد ساییده شد؛ سپس عصارة بهدستآمده بهمدت ۳۰ دقیقه با سرعت ۵۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی برای برای سنجش آنزیم مد نظر استفاده شد.
آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز واکنش تبدیل فنیل آلانین را به سینامیک اسید کاتالیز میکند. در این روش فنیل آلانین گهرمایة آنزیم است و فعالیت آنزیم براساس سرعت تشکیل سینامیک اسید تعیین میشود. در لولة آزمایش، ۱ میلیلیتر از بافر استخراج با 5/0 میلیلیتر ال-فنیل آلانین ۱۰ میلیمولار، 4/0میلیلیتر آب دو بار تقطیر و ۱ میلیلیتر عصارة آنزیمی مخلوط و بهمدت ۶۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجة سانتیگراد نگهداری شد. واکنش با اضافهکردن 5/0 میلیلیتر تری کلرو استیک اسید ۱۰ درصد به پایان میرسد. غلظت سینامیک اسید با اندازهگیری میزان جذب در طول موج ۲۹۰ نانومتر و ضریب خاموشی معادل ۹۵۰۰ میلیمولار بر سانتیمتر به دست آمد. یک واحد از فعالیت این آنزیم معادل ۱ میکرومول از سینامیک اسید تولیدشده در دقیقه است.
نتایج
نتایج حاصل از تجزیة آماری بین سه عامل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین نشان داد که اثر متقابلی بین این سه عامل وجود داردکه این تاثیر متقابل سهگانه در سطح 5 درصد معنیدار است. در هر سه تیمار بیشترین مقدار وزن تر اندام هوایی مربوط به مرحلة نهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 و 50 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 1).
شکل 1- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر وزن تر اندام هوایی درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
در هر سه تیمار بیشترین مقدار طول ساقه مربوط به مرحلة نهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 50 میکرومولار بیشترین افزایش را داشت (شکل 2).
شکل 2 - تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر طول ساقه درگیاه سویا ، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
در هر سه تیمار بیشترین مقدارطول ریشه مربوط به مرحلة نهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 3).
شکل 3- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر طول ریشه درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
در هر سه تیمار بیشترین محتوای کلروفیل a مربوط به مرحلة نهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 4).
شکل 4- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای کلروفیل a درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
در هر سه تیمار بیشترین محتوای کلروفیل b مربوط به مرحلة سهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 50 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 5).
شکل5- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای کلروفیل b درگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
بیشترین محتوای کلروفیل b مربوط به مرحلة سهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 6).
شکل 6- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای کاروتنوئیدها درگیاه سویا- مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
در هر سه تیمار بیشترین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز مربوط به مرحلة سهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 7).
شکل 7- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) درگیاه سویا ، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
در هر سه تیمار بیشترین محتوای فنل کل مربوط به مرحلة نهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین صفر میکرومولار و تیامین صفر میکرومولار بیشترین افزایش را داشت (شکل 8).
شکل 8– تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای فنل کلدرگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
بیشترین محتوای فلاونوئید مربوط به مرحلة نهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین صفر میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 9).
شکل 9- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای فلاونوئیددرگیاه سویا، مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
بیشترین محتوای آنتوسیانین مربوط به مرحلة نهبرگی بود که در بیشترین حالت در تیمار اکسین10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بیشترین افزایش را نسبت به شاهد داشت (شکل 10).
شکل 10- تاثیر سه عامل دورة رویشی، اکسین و تیامین بر محتوای آنتوسیانین درگیاه سویا - مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشترک بیانکنندة تفاوت معنیدار در سطح 0.05>P است.
بحث
Fuchs (2001) گزارش کرد که رقم گیاه و هورمون اکسین بر ریشهزایی و رشد ریشه در قلمههای ساقة گل رز هیبرید موثر است. غلظت بیش از حد اکسین؛ زردشدن و ریزش برگها، سیاهشدن ساقه و خشکشدن قلمهها را موجب میشود. Abdel-Aziz و همکاران (2009) نشان دادند که کاربرد تیامین، شاخصهای رشد، ازجمله وزن تر و خشک گیاه رزماری را بهطور معنیداری افزایش داد.
در پژوهش حاضر طبق شکل (1) تیمارهای همزمان اکسین و تیامین و مرحلة رویشی تاثیر معنیداری بر وزن تر اندام هوایی داشت، بیشترین افزایش مربوط به تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود که در مرحلة 9 تا 11 برگی مشاهده شد. همچنین طبق شکل (3) تیمارهای همزمان اکسین و تیامین تاثیر معنیداری بر طول ریشه بین دو مرحلة رشد رویشی داشت که بیشترین تاثیر مربوط به اکسین10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة 9 تا11 برگی بود .علاوهبراین، طبق شکل (2) مشخص شد که تیمار اکسین، تیامین و مرحلة رویشی تاثیر معنیداری بر طول ساقه داشتند که بیشترین افزایش در مرحلة 9 تا 11 برگی در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 50 میکرومولار مشاهده شد.
نتایج بررسی ما با نتایج تحقیق بر گیاه گل داوودی، گل رز و گیاه تاتوره مطابقت دارد (Abdel-Aziz et al, 2009). بنابراین، به نظر میرسد کاربرد تیامین و اکسین بیشترین تاثیر را بر شاخصهای رشد گیاه در مرحلة 9 تا 11 برگی داشته است.
نتایج حاصل از بررسی رنگیزههای فتوسنتزی نشان داد تیمارهای مختلف اکسین و تیامین در مراحل مختلف رشد رویشی تاثیر معنی داری بر محتوای کلروفیل دارد که حداکثر میزان کلروفیل a مربوط به مرحلة 5 تا 7 برگی در تیمار همزمان اکسین 50 و تیامین 200 میکرومولار بود (شکل 4) و محتوای کلروفیل b در مرحلة 9 تا 11 برگی افزایش چشمگیری داشت ( شکل 5). همچنین بررسی محتوای کاروتنوئیدها نشان داد که بیشترین غلظت مربوط به مرحلة 3 تا 5 برگی و در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود و اختلاف معنیداری بین دو مرحلة رویشی مطالعهشده در تیمارهای مختلف مشاهده شد.
گزارش شده است که کاربرد تیامین افزایش معنیدار محتوای کربوهیدراتهای گیاهان رزماری را باعث شد که ممکن است ناشی از نقش مهم آن در بیوسنتز مولکولهای کلروفیل باشد که محتوای کلروفیل را تغییر میدهد(Youssef and Talaat, (2003. همچنین نتایج بررسیها بر گلابی نشان داده است که اکسین در غلظتهای مناسب از شکستهشدن کلروفیل جلوگیری میکند(Frenkel and Dyck, 1973).
در پژوهش حاضر طبق شکل (7) بین سه عامل مرحلة رویشی، تیمار اکسین و تیامین تفاوت معنیداری وجود دارد و بیشترین مقدار آنزیم مربوط به مرحلة 3 تا 5 برگی در تیمار اکسین 50 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود.
بیشترین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در گیاهان جوان و در حال نمو دیده میشود و اغلب در بلوغ با کاهش مقدار آنزیم همراه است(Ziaei et al, 2012).
بررسی بر گیاه ریحان نشان داد که بهطورکلی بیان ژن و فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در مراحل مختلف رشد متفاوت است و فعالیت این آنزیم در مراحل ابتدایی رشد گیاه، بیشترین مقدار است که با نتایج ما مطابقت دارد (Ziaei et al, 2012). گزارش شده است که اکسین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز را در گیاه توتفرنگی افزایش میدهد و همچنین نقش اساسی در ایجاد مقاومت در گیاهان ضمن مراحل ابتدایی رشد ایفا میکند. به نظر میرسد زیادبودن میزان آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در مرحلة 3 تا 5 برگی، مقاومت گیاه را در مراحل ابتدایی رشد افزایش میدهد که با کاربرد اکسین و تیامین دیده شده است.
ترکیبات فنلی ازجمله آنتوسیانینها و فلاونوئیدها که حاصل از مسیر فنیل پروپانویید هستند در سازوکارهای فیزیولوژیک مانند رشد، تولید مثل، رویش دانه و ایجاد مقاومت در گیاه نقش اساسی دارند (Ewane et al, 2012).
براساس نتایج پژوهش حاضر تیمار اکسین و تیامین بر محتوای فنلی کل در مراحل مختلف رشد تاثیر معنیداری داشت که بیشترین تاثیر در مرحلة 9 تا 11 برگی گیاهان شاهد و سپس در تیمارهای اکسین صفر و تیامین 50 میکرومولار دیده شد.
محققان نشان دادند در چهار مرحلة فنولوژیک (ابتدای دورة رویشی، پایان دورة رویشی، جوانهزدن گل و گل کامل) در پونة کوهی محتوای فنلی افزایش یافت (Sellami et al, 2009). برخی گزارشها نشان میدهند که ضمن مراحل رشد در گیاه گردو ترکیبات فنلی بهتدریج تغییر مییابند و ارتباط مهمی بین میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و تجمع محتوای فنلی و فلاونوئیدی وجود دارد (Malmir, 2014).
همچنین مطالعات نشان میدهند که تغییرات فنیل آلانین آمونیالیاز ممکن است براساس کاربرد اکسین تاثیر عکس بر سنتز پلیفنلها داشته باشند. بهعلاوه، کاربرد ایندول 3- بوتیریک اسید تغییرات بر دیگر آنزیمها ازجمله پلیفنل اکسیداز را باعث شده است که این آنزیم در تقسیم، تمایز و نمو موثر است (Lukatkin, 2002). کاربرد خارجی اکسین ایندول
3- بوتیریک اسید ممکن است برفعالیت دو آنزیم پراکسیداز و پلیفنل اکسیداز موثر باشد(Basak et al, 2000). همچنین محققان گزارش کردند تیمار تیامین در افزایش مقاومت به قارچ در گیاه انگور موثر است و این ویتامین بیان ژن آنزیمهای مسیر فنیل پروپانویید را فعال میکند و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی افزایش مییابند (Boubakri et al, 2013). افزایش محتوای فنلی با کاربرد تیامین در گیاهان سویا (Abdel-(Monaim, 2011، بابونه و سرو به اثبات رسیده است (Abdel-Aziz et al, 2009).
برخی محققان بیان کردندکه غلظت ترکیبات فنلی در فصول مختلف و در مراحل مختلف رشد متفاوت است و این ترکیبات در مراحل ابتدایی رشد، چیره هستند (Kui-Ding et al, 2001). در پژوهش حاضر نیز اکسین و تیامین بر محتوای ترکیبات فنلی در دو مرحلة رشد رویشی اثر معنیدار داشت (شکل 8) که بیشترین تاثیر در مرحلة 9 تا 11 برگی بود.
در پژوهش حاضر تفاوت معنیداری در میزان غلظت فلاونوئیدها در مرحلة 9 تا 11 برگی در تیمار اکسین 50 میکرومولار بهتنهایی در مرحله3 تا 5 برگی مشاهده شد (شکل 9). در میوة توتفرنگی گزارشی دربارة فنل کل، فلاونوئیدها، تاننها و ارتباطشان با فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز هنگام نمو میوه دیده نشد (Cheng and Breen, 1991) که با نتایج ما همخوانی داشت. همچنین اختلاف آشکار بین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز، میزان فنل و فلاونوئید کل در توتفرنگی دیده شد که ممکن است ناشی از تجمع فنلها قبل از گردهافشانی باشد زیرا بیشترین میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز یک هفته قبل از گردهافشانی مشاهده شد. در گیاه سیب درختی نیز ارتباط و همبستگی معنیداری بین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز در سه مرحلة رشد و غلظت فلاونوئیدها وجود ندارد (Lister and Lancaster, 1996)؛ اما در گیاه گردو مشاهده شده است که تجمع ترکیبات فنلی بهطور غیرمستقیم با فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز تنظیم میشود (Jay-Allemand et al, 1989). همچنین تاثیر اکسین خارجی بر محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در گیاه Vigna گزارش شده است (Vats et al, (2012. گزارش شده است که میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در برگها در مراحل مختلف رشد، به تعادل سوخت و ساز این ترکیبات بستگی دارد. همچنین میزان فلاونوئیدها در برگ با افزایش رشد زیاد میشود (Malmir, 2014) و به نظر میرسد در مرحلة 3 تا 5 برگی میزان ساختهشدن این ترکیبات بیشتر از سایر مراحل باشد.
در پژوهش حاضر، تفاوت معنیدار در محتوای آنتوسیانین بین دو مرحلة رویشی وجود داشت و بیشترین غلظت مربوط به مرحلة 9 تا 11 برگی و در تیمار اکسین 10 میکرومولار و تیامین 200 میکرومولار بود (شکل 10) که با نتایج حاصل از تحقیق بر گیاه سیب درختی هماهنگی داشت (Lister and (Lancaster, 1996. تنوع گستردهای در میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز، آنتوسیانین و فلاونوئید کل در ارقام مختلف سیب در مراحل مختلف رشد مشاهده شد؛ اما همبستگی معنیداری بین فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز در سه مرحلة رشد و غلظت آنتوسیانین نهایی دیده نشد که با نتایج ما مطابقت داشت. همچنین گزارش شده است که اگرچه تولید آنتوسیانین اغلب با افزایش فنیل آلانین آمونیالیاز همراه است، نمونههای زیادی از فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز بدون تولید آنتوسیانین وجود دارند (Lister and Lancaster, 1996. Li) و همکاران (2001) گزارش کردندکه مقادیر اندک آنتوسیانینها باوجود افزایش میزان آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز، بهعلت فعالیتنکردن آنزیمهای بیوسنتزی آنتوسیانینها در مرحلهای خاص است و افزایش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز به تشکیل دیگر ترکیبات فنلی منجر میشود.
نتایج پژوهش حاضر نشان داد بین عوامل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین با وزن تر اندام هوایی، طول ساقه و طول ریشه، اثر متقابل معنیداری وجود دارد. در تیمار همزمان اکسین 50 و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة رویشی نه تا یازدهبرگی بیشترین وزن تر، در تیمار همزمان اکسین 50 و تیامین 50 میکرومولار در مرحلة رویشی نه تا یازدهبرگی بیشترین طول ساقه و در تیمار همزمان اکسین 10 و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة نه تا یازدهبرگی بیشترین طول ریشه مشاهده شدند. بین رنگیزههای فتوسنتزی و سه عامل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین نیز ارتباط معنیدار وجود داشت. دربارة اثر این سه عامل بر محتوای فنلی دیده شد که تنها مرحلة رویشی و تیمار تیامین بهتنهایی اثر معنیدار بر محتوای فنلی داشت و بیشترین افزایش مربوط به مرحلة نه تا یازده برگی و گیاهان شاهد بود. دربارة تاثیر متقابل مرحلة رویشی، اکسین و تیامین هر سه عامل با هم تاثیر معنیداری بر محتوای فلاونوئید داشتند و بیشترین افزایش مربوط به مرحلة نه تا یازدهبرگی بود. دربارة تاثیر تیمارها بر محتوای آنتوسیانین دیده شد که هر سه عامل با هم تاثیر معنیداری بر محتوای آنتوسیانین داشتند و بیشترین افزایش غلظت مربوط به تیمار همزمان اکسین 10 و تیامین 200 میکرومولار در مرحلة رویشی 9 تا 11 برگی بود. دربارة تاثیر تیمارها بر محتوای آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز، هر سه عامل تاثیر معنیداری داشتند و بیشترین آن مربوط به اکسین 50 + تیامین 50 میکرومولار در مرحلة سه تا پنج برگی بود.
جمعبندی
باتوجه به نتایج بررسی حاضر، به نظر میرسد کاربرد همزمان اکسین و تیامین بر افزایش ترکیبات فنلی در مراحل مختلف رشد گیاه زراعی و دانة روغنی موثر است.
سپاسگزاری
نگارندگان از گروه زیستشناسی دانشگاه شهید باهنر کرمان بابت همکاری صمیمانه در اجرای پژوهش حاضر سپاسگزاری میکنند.
)
