Document Type : Original Article
Authors
Department of Biology, Faculty of sciences, University of Sistan and Baluchestan, Zahedan, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه
به‌تازگی نگرانی‌ها دربارة افزایش غلظت فلزهای سنگین در خاک و آب رو به افزایش است (Zarcinas et al., 2004). آلودگی فلزهای سنگین ممکن است از فعالیت‌های طبیعی و انسانی مانند معادن، فرایندهای صنعتی و همچنین استفاده از کودهای حاوی فلزهای سنگین در کشاورزی ناشی شود (Dudka et al., 1996). روی (Zn2+) یکی از عناصر کم‌مصرف ضروری برای رشد گیاهان است. این عنصر نقش بسیار مهمی در متابولیسم گیاهان با متأثر‌کردن فعالیت آنزیم‌های مختلف ازجمله هیدروژناز و کربنیک انهیدراز، پایداری عملکرد ریبوزومی و سنتز سیتوکروم‌ها بر عهده دارد (Broadley et al., 2007). آنزیم‌های گیاهی که با روی فعال می‌شوند، بیشتر در متابولیسم کربوهیدرات‌ها، نیتروژن، لیپید و نوکلئیک اسید، حفظ یکپارچگی غشاهای سلولی، سنتز پروتئین‌های دخیل در فرایندهای متابولیک، فتوسنتز، تنظیم سنتز اکسین و تشکیل دانة گرده نقش دارند (Marschner, 1995). این عنصر تنها فلز موجود در هر شش گروه آنزیمی است (Broadley et al., 2007). روی در غلظت‌های مناسب، رشدونمو میوه‌ها و بهره‌وری گیاهان را افزایش می‌دهد (Vaillant et al., 2005). کمبود روی توسعة بسیاری از ناهنجاری‌ها را در رشد گیاهان مانند کلروزه‌شدن و کوچک‌ماندن برگ‌ها، کوتاه‌قدی و ایجاد حالت روزت در گیاهان سبب می‌شود. کمبود این عنصر همچنین بر کیفیت محصولات جمع‌آوری‌شده تأثیر می‌گذارد (Marschner, 1995). باوجود ضروری‌بودن عنصر روی برای گیاهان مقادیر بیش از حد آن بسیار مضر است. این عنصر در مقادیر بیشتر از نیاز تغذیه‌ای به‌سادگی، جذب گیاهان و سپس آسیمیله می‌شود. گیاهانی که در معرض غلظت‌های زیاد روی قرار می‌گیرند، علائم مسموم‌شدن مشابه با سایر فلزهای سنگین را از خود نشان می‌دهند. این آثار شامل کلروزه‌شدن برگ‌ها، ممانعت از جوانه‌زنی، کاهش رشد، کاهش تعداد و سطح برگ، کاهش عملکرد و کاهش تولید گل هستند. علاوه بر این، کاهش فتوسنتز، نقص در عملکرد آنزیم‌ها، اختلال در جذب عناصر غذایی، پژمردگی و تغییر در روابط آبی گیاه نیز مشاهده می‌شود (Prasad, 2004; Deng et al., 2006; Dhir et al., 2008; Borowiak et al., 2015). روی اضافی در عملکرد تعرقی، فتوسنتز و بیوسنتز کلروفیل اختلال ایجاد می‌کند (Richardson et al., 1993; Borowiak et al., 2015 که ممکن است با تشکیل رادیکال‌های آزاد اکسیژن مرتبط باشد و بر فعالیت فتوسنتزی و همچنین رشد گیاهان اثر بگذارد (Cuypers et al., 2001; Mukhopadhyay et al., 2013). سبزیجات و سایر گیاهان زراعی به مقادیر مختلف روی حساسیت نشان می‌دهند. به‌هرحال مسموم‌شدن با روی ممکن است بر جذب عناصر دیگر نیز اثر بگذارد (Samreen et al., 2017).
گیاه ریحان (Ocimum basilicum L.) از خانوادة نعناعیان (Lamiaceae) است. این گیاه علاوه‌بر استفادة غذایی، به‌دلیل داشتن ترکیبات معطر و روغن‌های ضروری در صنایع دارویی نیز کاربرد دارد. ترکیبات استخراج‌شده از این گیاه علاوه‌بر استفادة خام، پس از تعدیلات شیمیایی نیز استفاده می‌شوند (Ramawat and Merillon, 2008). این گیاه در پزشکی سنتی کاربرد فراوان دارد. روغن‌های ضروری O. basilicum خاصیت ضدمیکروبی بسیار زیادی دارند (Kashyap et al., 2011; Shafique et al., 2011; Hanif et al., 2011). این گیاه سالیان متمادی برای درمان ناهنجاری‌های گوارشی و عصبی کاربرد فراوان داشته است (Bunrathep et al., 2007). برگ‌ها و گل‌های این گیاه خواص دارویی مختلفی دارند ازجمله ضد اسپاسم، ضد نفخ، هاضم، اشتهاآور و نیروبخش هستند (Marwat et al., 2011). باوجود بررسی‌های متعدد بر ترکیب عنصری و دارویی این گیاه، تاکنون پژوهشی دربارة تأثیر عناصر معدنی بر رشد و ویژگیهای فیزیولوژیک این گیاه انجام نشده است؛ بنابراین، تصور می‌شود تغییر در میزان غلظت عناصر معدنی ممکن است خواص آنتی‌اکسیدانی و بیوشیمیایی گیاهان را تغییر دهد؛ بنابراین در پژوهش حاضر کوشش می‌شود ارتباط غلظت روی با برخی جنبه‌های مورفولوژیک، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه ریحان مشخص شود.
مواد و روش‌ها
مواد گیاهی و تیمار روی: بذر گیاه ریحان (Ocimum basilicum L.) از مرکز تحقیقات کشاورزی استان سیستان و بلوچستان تهیه و در سینی‌های حاوی کوکوپیت به‌صورت خزانه در گلخانه کشت شد. پس از سه هفته از کاشت، گیاهچه‌های دارای دو یا سه برگ، همسان شدند و به گلدان‌های پلاستیکی یک‌لیتری دارای مقادیر برابر کوکوپیت (یک کیلوگرم) منتقل شدند و در شرایط دمایی 27 درجة سانتی‌گراد (روز) و 22 درجة سانتی‌گراد (شب) و شدت نور 250 تا 300 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه قرار گرفتند. گیاهچه‌ها تا روز 30 پس از کاشت، با محلول غذایی هوگلند معمولی به‌طور مرتب آبیاری شدند. تیمار روی بر گیاهان در قالب طرح بلوک‌های کاملاً تصادفی با شش تکرار برای هر تیمار با اضافه‌کردن غلظت‌های صفر، 50، 100، 200، 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر روی سولفات (ZnSO4) به محلول غذایی هوگلند هر سه‌روز یکبار، به‌ازای هر گلدان 30 میلی‌لیتر و بهمدت 30 روز اعمال شد. گیاهانی که محلول هوگلند را با غلظت صفر روی دریافت کرده بودند، شاهد در نظر گرفته شدند. پس از این مدت، گیاهان برای بررسی پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی به غلظت‌های مختلف روی، جمع‌آوری و آزمایش شدند. نیمی از نمونه‌های گیاهی برای انجام بررسی‌های فیزیولوژیک شامل تعیین وزن تر و خشک، ارتفاع ریشه‌ها و بخش هوایی، سطح برگ، تعداد برگ و نسبت طول به پهنای برگ و برگ‌های نیم دیگر نمونه‌ها برای انجام آنالیزهای بیوشیمیایی استفاده شدند.
استخراج و اندازه‌گیری رنگیزه‌های فتوسنتزی: برای استخراج کلروفیل‌ها و کاروتنوئید کل، مقدار 1 گرم از بافت چهارمین برگ جوان گیاه ریحان در هاون سرد با 10 میلی‌لیتر استون 80 درصد ساییده و سپس از کاغذ صافی عبور داده شد. محلول صاف‌شده برای اندازه‌گیری میزان رنگیزه‌ها به کار رفت. بقایای حاصل از استخراج رنگیزه‌ها پس از خشک‌شدن برای اندازه‌گیری کربوهیدرات‌ها استفاده شدند. میزان کلروفیل با روش اسپکتروفوتومتری و با رابطه‌های 1 تا 3 اندازه‌گیری شد (Arnon, 1949).
رابطة 1
Chl a (mg ml-1) = 0.0127 A663- 0.00269 A645
رابطة 2
Chl b (mg ml-1) = 0.0229 A645 - 0.00468 A663
رابطة 3
Total Chl (mg ml-1) = A652/34.5
میزان کاروتنوئید کل نیز با روش Lichtenthaler و Buschmann (2001) در طول موج 470 نانومتر و با رابطة 4 اندازه‌گیری شد.
رابطة 4
Total Car (µg ml-1) = (1000A470-1.82Chl a-85.02Chl b)/198
استخراج و اندازه‌گیری قندهای محلول کل:استخراج قندهای محلول کل با روش Omokolo و همکاران (1996) انجام شد. بدین منظور، به 40 میلی‌گرم از بقایای بافتی عاری از رنگیزه‌های فتوسنتزی 5 میلی‌لیتر اتانول 80 درصد اضافه شد و بهمدت 10 دقیقه در حمام آب گرم (مدل WBN 29، شرکت Memmert، آلمان) با دمای 70 درجة سانتی‌گراد قرار گرفت. فاز رویی جدا شد. عمل استخراج با اتانول 80 درصد چهار مرتبة دیگر تکرار شد. عصاره‌های حاصل، با تبخیر اتانول تغلیظ شدند و به حجم مشخصی کاهش یافتند. این عصاره‌ها پس از سانتریفیوژ (مدل Universal 320، شرکت Hettich، آلمان) در g 5000 بهمدت 10 دقیقه، برای اندازه‌گیری قندهای محلول کل استفاده شدند.
قندهای محلول کل با روش آنترون ارزیابی شدند (McCready et al., 1950). برای اندازه‌گیری قند کل 2/0 میلی‌لیتر از عصارة تغلیظ‌شده با 3 میلی‌لیتر معرف آنترون (150 میلی‌گرم آنترون در 100 میلی‌لیتر سولفوریک اسید 13 مولار) مخلوط شدند و بهمدت 20 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 100 درجة سانتی‌گراد قرارگرفتند. میزان جذب نور هریک از نمونه‌ها پس از سردشدن، در طول موج 620 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان قندهای محلول کل با نمودار استاندارد گلوکز محاسبه شد.
استخراج و اندازه‌گیری پروتئین‌های محلول کل: استخراج پروتئین‌های محلول کل با بافر استخراج با ترکیب بافر فسفات پتاسیم (7=pH) 100 میلی‌مولار، اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 1 میلی‌مولار، پتاسیم کلرید (KCl) 10 میلی‌مولار، منیزیم سولفات (MgSO4) 1 میلی‌مولار، گلیسرول 10 درصد، پلی وینیل پلی پیرولیدون 1 درصد، تریتون X-100 1/0 درصد و بتا 2- مرکاپتواتانول 50 میلی‌مولار انجام شد (Einali and Valizadeh, 2015). میزان پروتئین با نمودار استاندارد آلبومین تعیین شد (Bradford, 1976).
اندازه‌گیری میزان ترکیبات فنلی کل و تعیین فعالیت آنتی‌اکسیدانی گیاه: برای تعیین میزان ترکیبات فنلی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی از پودر خشک گیاه استفاده شد. میزان ترکیبات فنلی کل موجود در برگ‌های گیاه ریحان با معرف فولین اندازه‌گیری شد (Singleton et al., 1999). مقدار 05/0 گرم از پودر خشک برگ‌های گیاه پودرشده با آسیاب برقی (مدل AR10، شرکت Moulinex، فرانسه) و به دور از نور مستقیم خورشید، با یک میلی‌لیتر اتانول 96 درصد استخراج شد و پس از سانتریفیوژ در g 5000 بهمدت 10 دقیقه، 5/0 میلی‌لیتر از محلول رویی با 5/2 میلی‌لیتر معرف فولین 10 درصد مخلوط شد؛ سپس 5 دقیقه در درجه‌حرارت اتاق قرار گرفت و 2 میلی‌لیتر محلول سدیم بیکربنات (Na2CO3) 5 درصد به آن افزوده شد. مخلوط حاصل بهمدت 30 دقیقه در درجه‌حرارت اتاق و تاریکی نگهداری و سپس جذب آن در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. میزان ترکیبات فنلی با نمودار استاندارد گالیک اسید محاسبه و براساس میلی‌گرم بر گرم وزن خشک گیاه بیان شد.
میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های اتانولی برگ گیاه ریحان با خنثی‌کردن رادیکال دی فنیل پیکریل هیدرازیل با روش Kukic و همکاران (2008) با تغییرات جزئی اندازه‌گیری شد. مقادیری از عصاره‌های با غلظت‌های مختلف از 50 تا 200 میلی‌گرم بر لیتر با 1 میلی‌لیتر محلول 1/0 میلی‌مولار دی فنیل پیکریل هیدرازیل مخلوط شدند و حجم نهایی آنها با متانول به 3 میلی‌لیتر رسانده شد. مخلوط حاصل بهمدت 30 دقیقه در تاریکی قرار گرفت. میزان جذب در طول موج 517 نانومتر با بلانک متانول تعیین شد. مخلوطی بدون عصاره متشکل از 1 میلی‌لیتر محلول رقیق‌شدة دی فنیل پیکریل هیدرازیل در 2 میلی‌لیتر متانول برای کنترل استفاده شد. میزان خنثی‌کردن رادیکال دی فنیل پیکریل هیدرازیل (درصد ممانعت) در حضور غلظت‌های مختلف عصاره با رابطة 5 محاسبه شد.
رابطة 5
S (%) = (AC-AS) / AC × 100
در این رابطه، AC میزان جذب کنترل (محلول دی فنیل پیکریل هیدرازیل رقیق‌شده و بدون عصاره) و AS میزان جذب نمونة آزمایش‌شده است. درنهایت، نمودار درصد ممانعت دربرابر غلظت‌های مختلف عصاره برحسب میلی‌گرم بر لیتر رسم شد و مقدار IC50 که بیان‌کنندة غلظتی از عصاره است که در آن نیمی از رادیکال‌های دی فنیل پیکریل هیدرازیل خنثی می‌شوند؛ یعنی نصف درصد ممانعت به‌دست‌آمده از رابطة 5، از این نمودار به دست آمد و میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره در نظر گرفته شد. برای کنترل مثبت از آنتی‌اکسیدان‌های سنتزی مانند آسکوربیک اسید استفاده شد.
تعیین میزان عناصر معدنی: برای آزادشدن و اندازه‌گیری عناصر معدنی از روش هضم توسط اسید و میکروویو (مدل MG40، شرکت Samsung، کرة جنوبی) استفاده شد (Ravandeh et al., 2011). بدین منظور، مقدار 5/0 گرم از بافت برگ خشک‌شده در معرض هوا با 10 میلی‌لیتر نیتریک اسید مخلوط شد و 10 دقیقه در میکروویو قرار گرفت. میزان 5 میلی‌لیتر هیدروکلریک اسید غلیظ (12 نرمال) به مخلوط یادشده اضافه و بهمدت 5 دقیقة دیگر در میکروویو گذاشته شد. پس از هضم، مخلوط حاصل با کاغذ صافی واتمن شمارة 1 صاف شد و حجم نهایی آن با آب مقطر به 100 میلی‌لیتر رسانده شد. غلظت هریک از عناصر روی، آهن، پتاسیم، کلسیم و منیزیم با دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی (مدل PU9100X، شرکت Philips، هلند) تعیین شد.
تحلیل آماری: نتایج به‌صورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار (Standard deviation) برای هر تیمار بیان شدند. وجود اختلاف آماری معنی‌دار بین نمونه‌های شاهد و تیمارشده با غلظت‌های مختلف روی با تحلیل واریانس (ANOVA) و آزمون LSD در سطح 05/0 (P < 0.05) تعیین شد.
نتایج و بحث
اثر غلظت‌های مختلف روی بر رشد گیاه و سطح برگ: افزایش غلظت روی تا میزان 200 میلی‌گرم بر لیتر در گیاه ریحان افزایش رشد این گیاهان را سبب شد؛ به‌طوری‌که همگام با افزایش غلظت روی، میزان وزن تر و خشک بخش‌های هوایی و ریشه، ارتفاع بخش‌های هوایی و ریشه و تعداد برگ در هر بوته در مقایسه با گیاهان شاهد به‌طور معنی‌دار افزایش یافت (جدول 1). باوجود کاهش شدید شاخص‌های رشد در غلظت‌های 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر روی، میزان این کاهش در برخی از شاخص‌ها در گیاهان تیمارشده با غلظت 400 میلی‌گرم بر لیتر روی به‌اندازة شاهد نبود. نسبت طول به پهنای برگ در غلظت‌های مختلف روی ازنظر آماری تغییری نکرد که نشان می‌دهد طول و پهنای برگ متناسب با غلظت روی تغییر پیدا نمی‌کنند. سطح برگ گیاه ریحان نیز متناسب با افزایش غلظت روی زیاد شد و در غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر به بیشترین میزان خود رسید (شکل 1). افزایش غلظت روی به 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر کاهش سطح برگ گیاه را سبب شد؛ به‌طوری‌که در غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر، سطح برگ کمتر از شاهد بود. وزن تر و خشک، طول ریشه‌ها و بخش‌های هوایی و همچنین سطح برگ، متغیرهای مفیدی در تعیین میزان رشد گیاهان به شمار می‌روند. غلظت بهینة روی برای رشد گیاه ریحان در شرایط معمولی، 200 میلی‌گرم بر لیتر در نظر گرفته شد به‌دلیل بیشترین میزان رشد ریحان در این غلظت. به‌هرحال غلظت‌های بیشتر که رشد را کاهش دادند نشان‌دهندة مسموم‌شدن گیاه با این عنصر هستند؛ ولی این کاهش در بسیاری از شاخص‌ها در مقایسه با شاهد بسیار کمتر بود که نشان‌دهندة مقاومت بسیار زیاد این گیاه دربرابر تنش ناشی از فلز روی است. کاهش رشد گیاه درنتیجة غلظت‌های زیاد روی ممکن است از تأثیر روی اضافی بر فتوسنتز و همچنین تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن ناشی شود. کاهش رشد بخش‌های مختلف گیاه ناشی از سمی‌بودن روی، در گیاهان مختلف گزارش شده است (White et al., 1974; Baker, 1978; Symeonidis et al., 1985; Bert et al., 2000). غلظت‌های 200 میکرومولار و بالاتر روی در لوبیا کاهش وزن تر، سطح برگ و سایر شاخص‌های رشد را سبب شده است (Vassilev et al., 2011). در تأیید نتایج به‌دست‌آمده، بررسی تأثیر روی بر رشد و شاخص‌های بیوشیمیایی دو گیاه Abelmoschus esculentus و Cyamopsis tetragonolobus نشان داد روی تا غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر به‌صورت مادة غذایی عمل و رشد را تحریک می‌کند؛ ولی در غلظت‌های بیشتر به‌صورت معکوس عمل می‌کند و رشد را کاهش می‌دهد (Mangal et al., 2013).
اثر غلظت‌های مختلف روی بر میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی برگ‌ها: میزان کلروفیل a و کل بلافاصله با اضافه‌کردن روی به محیط‌کشت در همة غلظت‌ها در مقایسه با شاهد به‌طور معنی‌داری افزایش یافت و در غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر به بیشترین میزان خود رسید (شکل‌های 2-A و C). غلظت کلروفیل b نیز در پاسخ به افزایش غلظت روی زیاد شد؛ ولی بین میزان کلروفیل b در غلظت‌های 100 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تفاوت معنی‌دار مشاهده نشد (شکل 2-B). به‌هرحال
جدول 1- ویژگیهای رشد گیاهچه‌های ریحان در پاسخ به غلظت‌های مختلف روی- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند. nd نشان‌دهندة نبود تفاوت معنی‌دار است.
|
غلظت روی (mg.L-1) |
وزن تر (گرم) |
وزن خشک (گرم) |
ارتفاع (سانتی‌متر) |
تعداد برگ در هر بوته |
نسبت طول به پهنای برگ |
|||
|
|
بخش هوایی |
ریشه |
بخش هوایی |
ریشه |
بخش هوایی |
ریشه |
||
|
0 |
3.80±0.24b |
1.36±0.21b |
0.93±0.04b |
0.22±0.01a |
30.57±1.00a |
7.57±0.72a |
31.33±1.53ab |
2.32±0.31nd |
|
50 |
4.85±0.58c |
2.04±0.13c |
1.08±0.04c |
0.43±0.03c |
35.93±1.25b |
13.10±1.91b |
42.67±2.52c |
2.03±0.41nd |
|
100 |
6.49±0.37d |
2.35±0.41c |
1.19±0.03d |
0.62±0.05d |
43.40±2.48c |
20.37±3.01c |
49.33±3.21d |
1.76±0.16nd |
|
200 |
9.33±0.11e |
5.09±0.09d |
1.52±0.09e |
0.84±0.02e |
52.87±2.80d |
23.43±3.10c |
57.33±2.08e |
1.84±0.18nd |
|
400 |
5.45±0.45c |
0.85±0.03a |
0.79±0.06a |
0.34±0.02b |
41.27±0.67c |
15.80±1.48b |
34.67±1.53b |
2.05±0.10nd |
|
800 |
2.81±0.25a |
0.83±0.02a |
0.71±0.04a |
0.21±0.01a |
28.17±2.11a |
6.67±0.47a |
27.67±2.52a |
2.60±0.77nd |
شکل 1- اثر غلظت‌های مختلف عنصر روی بر سطح برگ گیاه ریحان- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند.
افزایش غلظت روی به 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر کاهش شدید میزان کلروفیل‌ها را سبب شد؛ با وجود این، میزان کلروفیل a و کل در این غلظت‌ها در مقایسه با شاهد همچنان بیشتر بود؛ درحالی‌که میزان کلروفیل b نسبت به شاهد بسیار کمتر بود. میزان رنگیزه‌ها در گیاهان، یکی از مشخصه‌های هر گونه است. پژوهش‌های مختلف نشان داده‌اند میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی، بازتابی از حساسیت گیاه به شرایط تنشی مانند فلزهای سنگین است (Borowiak et al., 2015). بررسی‌های مختلف نشان‌دهندة کاهش میزان کلروفیل در گونه‌های مختلف گیاهی در معرض تنش فلزهای سنگین هستند (Prasad and Strzalka, 1999; Mishra and Dubey, 2005; Aggarwal et al., 2012). این کاهش به‌علت تداخل یون‌های فلزهای سنگین با بیوسنتز کلروفیل با جانشینی آنها با یون منیزیم یا ممانعت مستقیم مراحل آنزیمی دخیل در بیوسنتز کلروفیل رخ می‌دهد (Cenkci et al., 2010; Pourraut et al., 2011)؛ برعکس، گیاهان ریحان تیمارشده با غلظت‌های مختلف روی، میزان بیشتری از کلروفیل‌ها را به‌ویژه کلروفیل a و کل در مقایسه با شاهد نشان دادند. این افزایش میزان کلروفیل‌ها سازوکاری دفاعی در برابر مسموم‌شدن ناشی از این فلز تلقی می‌شود؛ بنابراین، متابولیسم اولیه بر اثر سمی‌بودن روی دستخوش تغییر نمی‌شود؛ بلکه احتمالاً سمی‌بودن این فلز با سازوکارهای منتج به تجمع کلات‌های فلزی در واکوئل برطرف می‌شود (Borowiak et al., 2015). تجمع کلروفیل در گیاهانی که با روی تیمار شده‌اند به تحمل آن گیاه نسبت به مسموم‌شدن با روی بستگی دارد. به‌هرحال گزارش‌هایی مبنی بر افزایش غلظت رنگیزه‌ها پس از قرار گرفتن در معرض فلزها وجود دارند (Stiborova et al., 1986; Mishra and Dubey, 2005; Borowiak et al., 2015) . نسبت کلروفیل a/b که شاخص تنش در نظر گرفته می‌شود معمولاً در گیاهانی که در معرض غلظت‌های زیاد فلزها قرار دارند کاهش می‌یابد (Borowiak et al., 2015). در بررسی حاضر این نسبت در همة غلظت‌های کمتر از 200 میلی‌گرم بر لیتر نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری نداشت و حتی در مقایسه با غلظت‌های بیشتر از این مقدار، بسیار کمتر بود که بیان‌کنندة افزایش کمتر کلروفیل a در برابر کلروفیل b در غلظت‌های کمتر از 200 میلی‌گرم بر لیتر روی است (شکل 2-D). این افزایش بیشتر، در میزان کلروفیل b نشان می‌دهد کلروفیل برای شکل‌گیری صحیح کمپلکس‌های جمع‌آوری‌کنندة نور در کلروپلاست‌های گیاهان عالی و جلبک‌های سبز ضروری است (Eggink et al., 2001; Eggink et al., 2004; Biswal et al., 2012). علاوه بر این، کلروفیل b بیان یک‌سری از پروتئین‌های ویژة غشای تیلاکوئیدی را تنظیم می‌کند و بدین‌ترتیب افزایش اندازة کمپلکس‌های آنتنی و درنتیجه افزایش میزان انتقال الکترون را سبب می‌شود (Tanaka et al., 2001; Biswal et al., 2012). افزایش شدید این نسبت در غلظت‌های بیشتر از 200 میلی‌گرم بر لیتر روی نشان‌دهندة کاهش کمتر کلروفیل a در برابر کلروفیل b است. درحقیقت کاهش شدید میزان کلروفیل b در غلظت‌های 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر روی در مقایسه با شاهد دلیل افزایش نسبت کلروفیل a/bدر این غلظت‌ها است. افزایش این نسبت در گونه‌های مختلف بید (Salix spp.) در معرض غلظت‌های مختلف روی (Borowiak et al., 2015)، گیاهچه‌های لوبیا (Phaseolus vulgaris) در معرض غلظت‌های مختلف کادمیوم، مس و سرب(Zengin and Munzuroglu, 2005) و برگ‌های گیاه سنگروی سیاه (Empetrum nigrum) در معرض غلظت‌های مختلف مس و نیکل (Monni et al., 2001) نیز گزارش شده است.
شکل 2- اثر غلظت‌های مختلف روی بر میزان کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C) و نسبت کلروفیل a/b (D)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند.
روندی مشابه با کلروفیل a دربارة تأثیر غلظت‌های مختلف روی بر میزان کاروتنوئیدهای کل نیز مشاهده می‌شود که نشان‌دهندة محافظت سلول‌ها دربرابر تغییرات اکسیداتیو است (شکل 3-A). در پژوهش‌های پیشین بر سایر گونه‌ها نیز نتایج مشابهی به دست آمده‌اند (Tewari et al., 2002; Borowiak et al., 2015). کاروتنوئیدها در بسیاری از جنبه‌های فتوسنتز دخیل هستند. این رنگیزه‌ها علاوه‌بر عملکردشان به‌صورت رنگیزه‌های کمکی در جذب نور، عملکرد آنتی‌اکسیدانی نیز دارند و با فروکش‌کردن کلروفیل برانگیخته از تشکیل رادیکال‌های آزاد اکسیژن و پراکسیداسیون لیپیدها در شرایط تنش جلوگیری و بدین‌ترتیب ساختارهای فتوسنتزی را دربرابر آسیب‌های اکسیداسیون نوری محافظت می‌کنند (Kenneth et al., 2000; Hou et al., 2007; Sengar et al., 2008)؛ با وجود این، کاهش نسبت کلروفیل به کاروتنوئید (شکل 3-B) در همة غلظت‌ها بجز غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر روی بیان‌کنندة تجمع بیشتر کاروتنوئیدها دربرابر کلروفیل‌ها در این غلظت‌ها است. این نسبت، شاخص اختصاصی برهم‌کنش فلزها با رنگیزه‌ها در نظر گرفته می‌شود و مقدار آن به نوع فلز و مرحلة رشد گیاه استفاده‌شده بستگی دارد (Mysliwa-Kurdziel and Strzalka, 2002). افزایش این نسبت در غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر نیز از کاهش بیشتر کاروتنوئیدها در مقایسه با کلروفیل‌ها در این غلظت ناشی می‌شود. کاهش
شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف روی بر میزان کاروتنوئید کل (A) و نسبت کلروفیل به کاروتنوئید (B)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند.
تجمع کاروتنوئیدها در پاسخ به غلظت‌های زیاد روی (Mangal et al., 2013) و سایر فلزهای سنگین (Baszynski et al., 1988) پیش‌تر نیز گزارش شده است.
اثر غلظت‌های مختلف روی بر میزان قندها و پروتئین‌های محلول کل: میزان قندهای محلول با افزایش غلظت روی در محیط‌کشت افزایش یافت و در غلظت 400 میلی‌گرم بر لیتر به بیشترین میزان خود رسید (شکل 4-A). میزان قندهای محلول در گیاهان تیمارشده با غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر روی کاهش یافت؛ ولی این کاهش در مقایسه با شاهد و غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر بسیار اندک بود؛ بنابراین، میزان قندهای محلول در غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر در مقایسه با این غلظت‌ها بسیار بیشتر بود. بررسی بر گونه‌های مختلف گیاه بید (Salix spp.) نیز نشان داده است تنش فلز روی افزایش قندهای محلول را در این گیاه سبب شده است (Borowiak et al., 2015). در متابولیسم گیاهی، محصولات فتوسنتزی در برگ‌ها تولید و پس از انتقال به بافت‌های مختلف، در پاسخ به ارتباطات منبع - مخزن تنظیم‌شده با بخش‌بندی کربن در مسیرهای بیوسنتزی سوکروز و نشاسته ذخیره می‌شوند (Taiz and Zeiger, 2006).معمولاً تنش فلزها تغییر در غلظت کربوهیدرات‌ها را در برگ‌های گیاهان سبب می‌شود. نتایج به‌دست‌آمده نشان دادند فلزهای سنگین مانند نیکل و مس بر تجمع قندهای محلول در برگ‌ها تأثیر می‌گذارند (Drzewiecka et al., 2012; Gasecka et al., 2012). در برگ‌های Camellia sinensis، مقادیر اضافی روی، افت قندهای محلول و احیاکننده را سبب شده‌اند (Mukhopadhyay et al., 2013). علاوه بر این مشخص شده است سایر فلزها مانند نیکل و مس تجمع قندها را در برگ‌های گونه‌های مختلف بید (Salix spp.) و نوعی کاج (Pinus sylvestris) تحریک می‌کنند (Roitto et al., 2005; Drzewiecka et al., 2017). افزایش غلظت قند در برگ‌ها احتمالاً درنتیجة اختلال در هیدرولیز نشاسته رخ می‌دهد (Taiz and Zeiger, 2006; Drzewiecka et al., 2012). سایر پژوهش‌ها نشان داده‌اند نتیجة تجمع ترکیبات فتوسنتزی، تغییر در میزان فتوسنتز و همچنین بروز اختلال در تعادل منبع - مخزن در گیاه است که درنهایت به پیری زودرس منجر می‌شود (Wingler et al., 2006; Tholen et al., 2007). در سایر پژوهش‌ها بیان شده است قندها مولکول‌های سیگنال کنترل‌کنندة بیان ژن‌ها و فرایندهای تکوینی در گیاهان هستند (Morkunas et al., 2005; Hanson and Smeekens, 2009).
میزان پروتئین‌های محلول کل همگام با افزایش غلظت روی در محیط‌کشت به‌صورت معنی‌داری در مقایسه با شاهد افزایش یافت (شکل 4-B). بیشترین میزان پروتئین در غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر روی مشاهده شد. وجود همبستگی مثبت بین غلظت روی و میزان پروتئین‌های محلول بیان‌کنندة دخالت این عنصر در سنتز پروتئین‌ها یا افزایش انحلال پروتئین‌ها است. این همبستگی مثبت در گیاهان خردل (Samreen et al., 2017) و ذرت (Hisamitsu et al., 2001) نیز مشاهده شده است. اثر مثبت تیمار روی بر میزان پروتئین‌های دانه‌های خردل نیز گزارش شده است (Krishna, 1995). عنصر روی، جزء ساختاری و کاتالیتیک پروتئین‌ها و آنزیم‌ها و درنتیجه برای رشدونمو معمول گیاهان ضروری است (Broadley et al., 2007). به‌هرحال وجود همبستگی بین غلظت روی و میزان ازت در گیاه چغندرقند (Beta vulgaris L.) رشدیافته در شرایط کشت هیدروپونیک نیز گزارش شده است (Sagardoy et al., 2009).
اثر غلظت‌های مختلف روی بر میزان فنل کل و قدرت آنتی‌اکسیدانی گیاه: میزان فنل کل همگام با افزایش غلظت روی در محیط‌کشت افزایش یافت و در غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر به بیشترین میزان خود رسید (شکل 5-A). با افزایش غلظت روی به 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر، میزان فنل کل کاهش پیدا کرد؛ با وجود این، میزان فنل‌ها در این غلظت‌ها در مقایسه با شاهد و غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر همچنان بیشتر بود. افزایش میزان فنل‌ها بر اثر روی نشان‌دهندة نقش مهم این ترکیبات در پاسخ گیاه ریحان به تنش ناشی از عنصر روی برای انجام سازوکارهای سم‌زدایی است. تجمع ترکیبات فنلی ناشی از تنش عنصر روی، در
شکل 4- اثر غلظت‌های مختلف روی بر میزان قندهای محلول کل (A) و پروتئین‌های محلول کل (B) برگ‌های گیاه ریحان- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند.
برگ‌های گونه‌های مختلف بید (Salix spp.) و گیاه Camellia sinensis نیزمشاهده شده است (Mukhopadhyay et al., 2013; Borowiak et al., 2015). علاوه بر این، افزایش میزان فنل‌ها در برگ‌های نوعی بید (Salix viminalis) در معرض غلظت‌های مختلف مس و نیکل (Drzewiecka et al., 2012; Gasecka et al., 2012) و گیاه Vaccinium myrtillus بر اثر غلظت‌های مختلف روی و سرب (Bialonska et al., 2007) نیز گزارش شده است. بررسی ظرفیت خنثی‌کردن رادیکال دی فنیل پیکریل هیدرازیل با عصاره‌های برگی ریحان تیمارشده با غلظت‌های مختلف روی نشان داد میزان شاخص IC50، غلظتی از عصاره که در آن نیمی از رادیکال‌های دی فنیل پیکریل هیدرازیل خنثی می‌شوند، متناسب با افزایش غلظت روی در محیط‌کشت کاهش یافت و در غلظت‌های 200 و 400 میلی‌گرم بر لیتر روی به کمترین میزان خود رسید (شکل 5-B). باوجود افزایش این شاخص در غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر، این میزان در مقایسه با شاهد و غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر روی بسیار کمتر بود. کمتر‌بودن شاخص IC50
شکل 5- اثر غلظت‌های مختلف روی بر میزان فنل کل (A) و قدرت آنتی‌اکسیدانی (B) برگ‌های گیاه ریحان- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند.
نشان‌دهندة بیشتربودن ظرفیت خنثی‌کردن رادیکال دی فنیل پیکریل هیدرازیل و درنتیجه بیشتربودن قدرت آنتی‌اکسیدانی عصارة برگی است. مقایسة بین میزان ترکیبات فنلی و ظرفیت خنثی‌کردن رادیکال دی فنیل پیکریل هیدرازیل (شکل‌های 5-A تا B) نشان‌دهندة وجود همبستگی مثبت بین افزایش میزان فنل‌ها با کاهش شاخص IC50 و درنتیجه افزایش قدرت آنتی‌اکسیدانی گیاه است. گیاهان، منبع مهم تغذیه‌ای و دارویی به شمار می‌روند. ارزش دارویی گیاهان بیشتر از میزان متابولیت‌های ثانویه و ترکیب عنصری آنها ناشی می‌شود (Valdez-Solana et al., 2015). نقش گیاهان دارویی در ممانعت از بیماری‌ها یا تنظیم آنها به ویژگیهای آنتی‌اکسیدانی آن گیاهان مربوط می‌شود که به میزان پلی‌فنل‌های موجود در آنها بستگی دارد (Demiray et al., 2009). ترکیبات فنلی، یک یا چند حلقة آروماتیک یا چندین گروه هیدروکسیل دارند (Rice-Evans et al., 1995) این ترکیبات، ازنظر زیستی فعال و به‌دلیل داشتن ویژگیهای آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضدسرطانی در فرایندهای دفاع دخیل هستند (Lee et al., 2004; Fresco et al., 2006). ویژگی آنتی‌اکسیدانی ترکیبات فنلی بیشتر به‌دلیل فعالیت‌های اکسید و احیای آنها، توانایی زیاد برای جمع‌آوری رادیکال‌های آزاد اکسیژن و کلات‌کردن یون‌های فلزی است (Rice-Evans et al., 1995; Rice-Evans et al., 1997; Fresco et al., 2006). به همین دلیل، میزان ترکیبات فنلی با ظرفیت آنتی‌اکسیدانی گیاه مرتبط است. این نتایج نشان می‌دهند فعالیت دارویی گیاهان که بیشتر به ترکیبات فعال موجود در گیاهان وابسته است، به محل رشد و عوامل اقلیمی و تغذیه‌ای بستگی دارد؛ بنابراین، ترکیب عناصر معدنی و غلظت آنها در محلول خاک بر میزان متابولیت‌های ثانویه و ویژگیهای آنتی اکسیدانی و تغذیه‌ای گیاه مؤثر است.
اثر غلظت‌های مختلف روی بر محتوای روی و آهن برگ‌ها: اندازه‌گیری محتوای عنصر روی برگ‌های گیاه ریحان در معرض غلظت‌های مختلف روی نشان داد با افزایش غلظت روی در محیط‌کشت گیاه، محتوای روی برگ‌ها به‌طور معنی‌دار افزایش یافت و در غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر به بیشترین مقدار خود رسید (شکل 6-A). باوجود کاهش محتوای روی در گیاهان تیمارشده با غلظت‌های 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر، میزان این عنصر در غلظت 400 نسبت به شاهد و غلظت 50 و 100 میلی‌گرم بر لیتر روی و در غلظت 800 نسبت به شاهد و غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر روی بیشتر بود. کاهش جذب روی در غلظت‌های بیشتر از 200 میلی‌گرم بر لیتر ممکن است از اشباع نسبی جایگاه‌های جذب این عنصر در ریشه ناشی شود. به‌هرحال بیشتربودن محتوای روی در این غلظت‌ها در مقایسه با گیاهان شاهد و تیمارشده با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر روی (شکل 6-A) نشان‌دهندة توانایی زیاد این گیاه در انباشتن فلز روی در برگ‌ها در مناطق آلوده به این عنصر است. تأثیر مثبت غلظت‌های مختلف عنصر روی بر محتوای روی گیاه خردل نیز مشاهده شده است (Samreen et al., 2017). بررسی‌های انجام‌شده دربارة ارتباط بین عنصر روی و فسفر در گیاه Thlaspi caerulescens نشان دادند محتوای کل روی در بخش‌های هوایی با اضافه‌کردن روی به محیط کشت گیاه افزایش می‌یابد (Zhao et al., 1998).
عنصر روی اثر منفی بر میزان آهن و جذب آن در گیاه ریحان دارد؛ به‌طوری‌که همگام با افزایش غلظت روی، میزان آهن گیاه کاهش می‌یابد (شکل 6-B). میزان آهن گیاهان تیمارشده با غلظت 800 میلی‌گرم بر لیتر روی در مقایسه با شاهد 84 درصد کاهش یافت. تأثیر منفی افزایش غلظت روی بر جذب آهن در گیاهان ماش (Samreen et al., 2017) و لیموترش (Rajaie et al., 2009) نیز گزارش شده است. بررسی‌های مختلف نشان داده‌اند استفاده از عنصر روی اثر منفی بر غلظت آهن در بافت‌های گیاهی دارد (Mousavi et al., 2012). گیاهان دچار کمبود روی، در بخش هوایی خود مقادیر بیشتر آهن را در مقایسه با گیاهان رشدیافته در مقادیر کافی این عنصر دارند (Imtiaz et al., 2003). مشخص شده است عنصر روی بر عملکرد متابولیک آهن به‌شدت تأثیر می‌گذارد. در حقیقت حضور بیش از حد یکی از این دو عنصر در جذب عنصر دیگر اختلال ایجاد می‌کند (Francois and Goodin, 1972).کاهش آهن ممکن است
شکل 6- اثر غلظت‌های مختلف روی بر محتوای روی (A) و آهن (B) برگ‌های گیاه ریحان- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند.
به‌دلیل برهم‌کنش‌های رقابتی با عنصر روی در جایگاه‌های جذب موجود در ریشه‌های گیاه باشد. احتمالاً کمبود روی، تنظیم جذب یون‌های غذایی مختلف را ازجمله آهن مختل می‌کند و تجمع این یون‌ها را در بافت‌های گیاهی سبب می‌شود (Lonergan et al., 1982)؛ بنابراین روی، نقش اساسی در کارایی غشای سلول‌های ریشه دارد (Graham et al., 1987). به همین دلیل، در پژوهش حاضر افزایش غلظت روی، میزان آهن را در بافت برگ گیاه ریحان کاهش داد.
اثر غلظت‌های مختلف روی بر محتوای پتاسیم، منیزیم و کلسیم برگ‌ها: محتوای پتاسیم برگ‌های گیاه ریحان با افزایش غلظت روی در محیط‌کشت افزایش یافت؛ در غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر به بیشترین مقدار خود رسید و در غلظت‌های بیشتر روی کاهش یافت (شکل 7-A).
|
a |
|
a |
|
a |
|
a |
|
a |
|
a |
شکل 7- اثر غلظت‌های مختلف روی بر محتوای پتاسیم (A)، کلسیم (B) و منیزیم (C) برگ‌های گیاه ریحان- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح P < 0.05 با آزمون LSD هستند.
باوجود این کاهش، میزان پتاسیم در گیاهان تیمارشده با غلظت‌های 400 و 800 میلی‌گرم بر لیتر روی نسبت به شاهد و غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر روی به‌طور معنی‌داری بیشتر بود؛ برعکس، تأثیر غلظت‌های مختلف روی بر میزان کلسیم برگ‌های گیاه ریحان مانند تأثیر این عنصر بر محتوای آهن، منفی بود و با افزایش غلظت روی در محیط‌کشت، محتوای کلسیم برگ‌ها کاهش یافت و در غلظت‌های 200 و 400 میلی‌گرم بر لیتر روی به کمترین مقدار خود رسید (شکل 7-B)؛ درنتیجه ممکن است هردو عنصر روی و کلسیم با سازوکار مشابهی جذب شوند و بنابراین، مقادیر اضافی یک عنصر از جذب عنصر دیگر ممانعت کند. برخلاف تأثیر مثبت غلظت‌های زیاد روی بر جذب عنصر منیزیم در گیاه خردل (Samreen et al., 2017)، در برگ‌های ریحان تیمار با غلظت‌های مختلف روی، تأثیر معنی‌داری بر جذب منیزیم در این گیاه نداشت (شکل 7-C).
جمع‌بندی
نتایج حاصل از پژوهش حاضر نقش دوگانة روی را نشان می‌دهند؛ به‌طوری‌که تیمار گیاه ریحان با غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر این عنصر افزایش معنی‌دار رشد، سطح برگ، میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی، قندها، پروتئین‌های محلول کل، ترکیبات فنلی، قدرت آنتی‌اکسیدانی گیاه و محتوای عناصری مانند روی و پتاسیم را سبب شد؛ درحالی‌که غلظت‌های بیشتر و کمتر روی، عوامل یادشده را کاهش دادند. محتوای آهن و کلسیم گیاه متناسب با افزایش غلظت روی به‌شدت کاهش یافت؛ ولی میزان منیزیم هیچ تغییری نکرد. در غلظت‌های زیاد روی، کاهش رشد، میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی و ترکیبات فنلی مشاهده شد؛ ولی میزان آنها به مقدار شاهد نرسید و بیشتر از آن بود که نشان می‌دهد گیاه ریحان مقاومت بسیار زیادی نسبت به تنش فلز روی دارد و با رشد در نواحی آلوده به این عنصر نقش مؤثری در تغذیة روی در انسان ایفا می‌کند. تجمع قندها و پروتئین‌های محلول کل به‌صورت پیوسته همگام با افزایش غلظت روی اتفاق افتاد. به‌طورکلی نتایج پژوهش حاضر نشان‌دهندة نقش مهم روی در پایداری و محافظت از گیاه ریحان دربرابر رادیکال‌های آزاد اکسیژن هستند.
سپاسگزاری
در اینجا از معاونت پژوهشی دانشگاه سیستان و بلوچستان بابت حمایت مالی از مقالة حاضر سپاسگزاری می‌شود.
)
