Document Type : Original Article
Authors
1 PhD. Student, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Univestity of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran
2 Assistant Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran.
3 Associate Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran
4 Associate Professor, Department of Horticultural Science, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
.امروزه، تنش فلزات سنگین یکی از مهم‌ترین تنش‌های محیطی محسوب می‌شود که با ایجاد سمیت در خاک‌های کشاورزی رشد‌و‌نمو گیاهان زراعی به‌ویژه گیاهان دارویی را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد و سبب کاهش رشد، عملکرد و کیفیت این گیاهان می‌شود (Amani, 2008). مقدار عناصر سنگین درنتیجۀ فعالیت‌های شهری، صنعتی و مصرف کودهای شیمیایی حاوی فلزات سنگین افزایش می‌یابد و تجمع مقادیر زیاد آنها در خاک به جذب این عناصر توسط ریشۀ گیاهان و انتقال آنها به اندام‌های هوایی منجر و موجب اختلال در متابولیسم و کاهش رشد گیاهان می‌شود (Lee et al., 2003). افزایش غلظت فلزات سنگین ممکن است سبب تخریب ساختمان خاک، کاهش حاصلخیزی خاک و درنهایت، افت عملکرد و کیفیت محصولات (به‌علت زیادی غلظت فلزات سنگین در تولیدات کشاورزی) شود؛ درنهایت، ورود این عناصر به زنجیرۀ غذایی سبب آسیب به سلامتی انسان می‌شود (Lee and Kim, 2000; Cheng and Huang, 2006).
کادمیوم در بین فلزات سنگین یکی از سمی‌ترین عناصر برای اندام‌های زنده محسوب می‌شود. سمیت و تجمع این فلز به دلایل اکولوژیکی، تکاملی، تغذیه‌ای و محیطی نقش مهمی در به‌مخاطره‌انداختن سلامتی انسان دارد .(Megateli et al., 2009; Gerami, et al., 2018). کادمیوم موجود در خاک دوام زیستی زیادی دارد و سبب ایجاد بسیاری از تغییرات ریخت‌شناختی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و ساختاری در گیاهان ازجمله لوله‌ای‌شدن برگ‌ها، کاهش متابولیسم سلولی، کاهش تنفس و تعرق، مهار فعالیت آنزیم‌ها، کاهش جذب آب و مواد معدنی و کاهش رشد ریشه و ساقه می‌شود (Mishra et al., 2006). کادمیوم با تأثیر بر کلروفیل و آنزیمهای دخیل در تثبیت CO2 فرایند فتوسنتز و رشد گیاهان را کاهش می‌دهد (Shi and Cai, 2008) و در مرحلۀ جوانه‌زنی و سبزشدن موجب کاهش درصد و سرعت جوانه‌زنی، شاخص قدرت، طول و وزن خشک گیاهچه (Aziz-Khan et al., 2012) و کاهش طول ساقه‌چه (Siddhu and Khan, 2012) و ریشه‌چه (Dinakar et al., 2009) می‌شود. افزایش تولید گونه‌های اکسیژن فعال (Reactive Oxygen Species) مانند سوپراکسید، پراکسیدهیدروژن و رادیکال هیدروکسیل در گیاهان و ایجاد تنش اکسیداتیو یکی دیگر از آسیب‌های مهم بافتی است که در اثر قرارگرفتن گیاهان در معرض فلزات سنگین ازجمله کادمیوم رخ می‌دهد. اکسیژن‌های فعال معمولاً با آسیب‌‌رساندن به غشا و مولکول‌های زیستی نظیر لیپید‌ها، پروتئین‌ها و نوکلئیک‌اسید‌ها به‌ویژه DNA فرایندهای مختلف سلولی را مختل می‌کنند (Mishra et al., 2006; Zhang et al., 2009).
عناصر سنگین ازجمله کادمیوم یکی از مهم‌ترین تنش‌های محیطی در اکوسیستم‌های زراعی امروزی محسوب می‌شوند و بنابراین، یافتن روش‌هایی برای جلوگیری‌کردن از آثار زیان‌بار آنها یا کاهش‌دادن این آثار به‌ویژه در مرحلۀ جوانه‌زنی و رشد گیاهچهها اهمیت بسیاری دارد؛ استفاده از پیش‌تیمار بذر (Priming) یکی از این روش‌هاست. پیش‌تیمار بذر روشی معمول برای بهبودبخشیدن به جوانه‌زنی و سبزشدن بذرها در شرایط تنش محیطی مانند تنش فلزات سنگین است که موجب افزایش مقاومت گیاهچهها به تنش‌های یادشده می‌شود (Iqbal and Ashraf, 2007; Patade et al., 2011; Zanganeh et al., 2018). در این روش، ابتدا بذرها خیسانده و سپس خشکانده می‌شوند؛ به‌طوری‌که فرایندهای جوانه‌زنی آغاز می‌شوند ولی ریشه‌چه از بذر خارج نمی‌شود (Ashraf and Foolad, 2005). ازجمله فواید پیش‌تیمار بذر عبارتند از: افزایش سرعت و درصد جوانه‌زنی و سبزشدن، بهبود استقرار گیاهچهها حتی در شرایط نامساعد محیطی، بازسازی و ترمیم سلول‌های آسیب‌دیده، افزایش تحمل به تنش‌های محیطی در مرحلۀ جوانه‌زنی و سبزشدن، افزایش قدرت بذر و گیاهچهها و حذف و غیرفعال‌شدن انواع گونه‌های اکسیژن فعال از طریق افزایش فعالیت آنزیمهای پاداکساینده در شرایط تنش محیطی (McDonald, 2000; Ansari et al., 2012).
تیمارهای مختلفی ازجمله پیش تیمار هورمونی برای پیش تیمار کردن بذر ها استفاده می‌شود. هورمون‌ها و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی شامل اکسین، جیبرلین، کینتین، آبسیزیک‌اسید، پلی‌آمین‌ها، اتیلن و سالیسیلیک‌اسید به‌طور معمول برای پیشتیمارکردن بذرها استفاده می‌شوند (Ashraf and Foolad, 2005). سالیسیلیک‌اسید ازجمله ترکیبات فنولی است که در تعدیل پاسخ‌های گیاه به تنش‌های محیطی نقش دارد. این ترکیب که توسط ریشه تولید می‌شود در دامنۀ وسیعی از گونه‌های گیاهی وجود دارد و در تنظیم فرایندهای جوانه‌زنی، رشد‌و‌نمو، جذب یون و فتوسنتز ایفای نقش می‌کند و از طریق کاهش گونه‌های اکسیژن فعال سبب افزایش مقاومت گیاهان نسبت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی می‌شود (El-Tayeb, 2005). پژوهشگران نشان داده‌اند سالیسیلیک‌اسید در شکستن خواب و افزایش جوانه‌زنی نقش دارد (Shakirovaet al., 2003). جیبرلین یکی دیگر از هورمون‌های مهم رشد گیاهی است که بیشترین دخالت مستقیم را در کنترل و تسهیل جوانه‌زنی بذر دارد (Afzal et al., 2006). جیبرلین از طریق فعال‌سازی متابولیسم، هضم مواد ذخیره‌ای و انتقال آنها به جنین و افزایش تقسیم و رشد سلولی موجب جوانه‌زنی بذرها می‌شود. افزایش جوانه‌زنی و رشد گیاهچهها با اعمال پیش‌تیمار آبی و غلظت‌های مختلف مواد تنظیم‌کنندۀ رشد گیاهی در شرایط تنش‌های محیطی را Ansari و همکاران (2012) در بذرهای چاودار و Ashraf و Rauf (2001) در بذرهای ذرت گزارش کرده‌اند.
سازوکارهای دفاعی گیاهان برای رویارویی با خسارت‌های ناشی از تنش اکسیداتیو و حذف گونه‌های اکسیژن فعال شامل آنزیمهای پاداکساینده و پاداکساینده‌‌هاست. سازوکارهای آنزیمی شامل کاتالاز، پراکسیداز، گلوتاتیون‌ردوکتاز و سوپر‌اکسید‌دیسموتاز است (Tabatabaei and Ansari, 2016) و پیش‌تیمار بذر باعث افزایش فعالیت آنزیمهای پاداکساینده مانند کاتالاز و پراکسیداز در بذرها می‌شود (Varier et al., 2010)؛ این آنزیم‌ها فرایند پراکسیداسیون لیپید طی جوانه‌زنی را کاهش می‌دهند و درنتیجه باعث افزایش درصد جوانه‌زنی می‌شوند. استفاده از پیش‌تیمار بذر سبب افزایش محتوای آمینواسید پرولین در شرایط تنش و غیرتنش می‌شود (Mahmoudi et al., 2017).
در بین گیاهان دارویی،گاوزبان اروپایی (Borago officinalis L.) جایگاه ویژه‌ای در طب سنتی دارد. اهمیت زیاد این گیاه از ویژگی‌های متعدد دارویی، صنعتی و علوفه‌ای آن ناشی می‌شود. امروزه، گاوزبان اروپایی در بیشتر نقاط دنیا به‌منظور استفاده‌های درمانی پرورش می‌یابد. گلبرگ‌ها و سرشاخه‌های این گیاه به‌عنوان آرام‌بخش، معرق، ضد سرفه و التهاب‌های ریه و برای تقویت قلب و اعصاب استفاده می‌شوند و دانه‌های گاوزبان یکی از منابع اصلی اسیدچرب گاما- لینولئیک‌اسید هستند که مصرف خوراکی و آرایشی دارد (Salehi Surmaghi, 2009).
با‌توجه‌به اهمیت دارویی گیاه گاوزبان اروپایی و مشکلات موجود در زمینۀ جوانه‌زنی و رشد گیاهچه‌های آن (به‌علت حساس و بحرانی‌بودن این مراحل)، استفاده از روش‌های اعمال‌شده پیش‌از کشت روی بذر گاوزبان اروپایی یکی از راهکارهاییست که به‌طور مستقیم و غیرمستقیم بر بهبود جوانه‌زنی و استقرار گیاهچه‌های این گیاه دارویی در شرایط مختلف محیطی تأثیر دارد؛ ازاین‌رو، ﻣﻄﺎلعۀ حاضر ﺑﺎ ﻫﺪف ﺑﺮرﺳﯽ واکنش جوانه‌زنی و رشد گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی به تنش ﮐﺎدﻣﯿوم و بررسی امکان بهبود جوانه‌زنی و رشد گیاهچهها با به‌کاربردن پیش‌تیمار آبی و هورمونی بذر در شرایط یادشده اﻧﺠﺎم ﺷﺪ.
مواد و روش‌ها
به‌منظور بررسی تأثیر پیشتیمارهای هورمونی و آبی بر جوانه‌زنی، رشد و ویژگی‌های بیوشیمیایی گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم، آزمایشی به‌شکل فاکتوریل بر پایۀ طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در دانشگاه محقق اردبیلی اجرا شد. فاکتورهای آزمایش شامل تنش کادمیوم در چهار سطح صفر (شاهد)، 10، 50 و 100 میلیگرمدرلیتر و انواع پیش‌تیمار بذر در چهار سطح پیش‌تیمار آب به‌مدت 48 ساعت، پیش‌تیمار بذر با غلظت 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت، پیش‌تیمار بذر با غلظت 4 میلی‌مولار سالیسیلیک‌اسید به‌مدت 60 ساعت و تیمار شاهد بود. غلظت و مدت زمان بهینه برای پیشتیمارکردن بذرهای گاوزبان اروپایی بر اساس نتایج پژوهش پیشین انتخاب شد (Mahmoudi et al., 2018). ابتدا بذرها به‌مدت 48 ساعت درون انکوباتوری (طب آشنای ممتاز، ایران) با دمای 10 درجۀ سانتی‌گراد در آب مقطر خیسانده شدند. به‌منظور اعمال پیش‌تیمار بذر با سالیسیلیک‌اسید و هورمون جیبرلین، ابتدا محلول‌های سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار و هورمون جیبرلین 150 پیپیام تهیه شدند؛ سپس بذرها به‌مدت 60 ساعت با محلول سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار و به‌مدت 48 ساعت با محلول هورمون جیبرلین 150 پیپیام تیمار و در انکوباتوری با دمای 10 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند. بذرهای پیشتیمارشده تا رسیدن به رطوبت اولیه در محیط آزمایشگاه خشکانده شدند.
به‌منظور انجام آزمون جوانه‌زنی، 25 بذر به‌طور تصادفی و در سه تکرار از هر نمونه جدا و به روش روی کاغذ (Top of paper) در پتری‌دیش کشت شدند. نیترات‌کادمیوم Cd(NO3)2 برای اعمال سطوح مختلف تنش کادمیوم استفاده و پس‌از تهیۀ غلظت‌های صفر (شاهد)، 10، 50 و 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم، مقدار 4 میلی‌لیتر از محلول‌های تهیه‌شده به هر پتری‌دیش اضافه شد (برای تیمار شاهد از آب مقطر استفاده شد)؛ سپس نمونه‌ها به ژرمیناتوری با دمای 20 درجۀ سانتی‌گراد منتقل شدند. تعداد بذرهای جوانه‌زده به‌طور روزانه تا 10 روز شمارش شدند و ظهور ریشه‌چه به‌اندازۀ 2 میلی‌متر معیاری برای جوانه‌زنی بذرها در نظر گرفته شد. پس‌از اتمام مدت جوانه‌زنی، تعداد جوانه‌های طبیعی و غیرطبیعی و درصد جوانه‌زنی بذرها تعیین شد. رابطۀ Ellis و Roberts (1980) برای تعیین سرعت جوانه‌زنی استفاده شد. در پایان آزمون جوانه‌زنی (10 روز)، طول گیاهچه‌های طبیعی با خط‌کش (دقت 1 میلی‌متر) اندازه‌گیری شد. به‌منظور تعیین وزن خشک گیاهچه‌های طبیعی، 15 گیاهچه از هر تیمار و تکرار به‌طور جداگانه در پاکت‌های کاغذی ریخته و به‌مدت 24 ساعت در آونی با دمای 80 درجۀ سانتی‌گراد خشکانده شدند.
.عصاره‌گیری برای سنجش فعالیت آنزیمی: عصارۀ آنزیمی به روش Chang و Koa (1988) تهیه شد. به‌منظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز، 8/0 گرم مادۀ تر گیاهی از هر نمونه داخل هاون ریخته و کاملاً پودر شد؛ سپس 6 میلی‌لیتر بافر استخراج (Tris-HCl 05/0 مولار با اسیدیتۀ 7، MgCl2 3 میلی‌مولار و EDTA 1 میلی‌مولار) به آن اضافه شد. محلول به‌مدت 20 دقیقه با سرعت 10000 دوردردقیقه و دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ (Eppendorf, Germany) شد؛ پس‌از‌آن، محلول روشناور برای اندازه‌گیری آنزیم‌ها به فریزر منفی 70 درجۀ سانتی‌گراد منتقل شد.
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: فعالیت کاتالاز به روش Aebi (1984) اندازه‌گیری شد که بر پایۀ تجزیۀ پراکسیدهیدروژن توسط آنزیم کاتالاز است. مخلوط واکنش شامل 3 میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7)، 10 میکرولیتر پراکسیدهیدروژن 15 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر عصارۀ سلولی بود. پس‌از اضافه‌کردن عصاره، کاهش جذب در طول موج 240 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (Biorad, Smart Spec, USA) اندازه‌گیری شد؛ محلول جذب زمینه (بلانک) برای صفر‌کردن دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد که شامل تمام مواد واکنش به‌جز عصارۀ سلولی استخراج‌شده بود. رابطۀ زیر برای سنجش میزان فعالیت این آنزیم در اثر اعمال تیمارهای محرک استفاده شد.
Enzyme activity (Unit/ml)=
در این رابطه، df عامل رقیق‌سازی، عدد 3 حجم محلول مورد‌سنجش بر حسب میلی‌لیتر، 05/0 حجم عصارۀ آنزیمی، عدد 40 ضریب خاموشی پراکسیدهیدروژن و 240A∆ عدد خوانده‌شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 240 نانومتر را نشان می‌دهد. عدد به‌دست‌آمده میزان فعالیت آنزیم را بر حسب هر واحد آنزیم بیان می‌کند.
سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز:فعالیت پراکسیداز به روش Chance و Maehly (1955) و بر پایۀ تشکیل تتراگایاکول از گایاکول در حضور پراکسیدهیدروژن و گایاکول اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش شامل 3 میلی‌لیتر بافر پتاسیم‌فسفات 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7)، 50 میکرولیتر گایاکول 20 میلی‌مولار، 50 میکرولیتر پراکسیدهیدروژن 15 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر عصارۀ سلولی بود. پس‌از اضافه‌کردن عصارۀ سلولی، کاهش جذب در طول موج 470 نانومتر به‌مدت 1 دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی (Ɛ=26.6 mM-1cm-1) تتراگایاکول بر حسب واحد در میلی‌لیتر عصارۀ آنزیمی از طریق رابطۀ زیر محاسبه شد.
Enzyme activity (Unit/ ml) =
در این رابطه، ΔA470 میزان جذب خوانده‌شده برای هر نمونه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر، عدد 3 مقدار حجم واکنش، df عامل رقیق‌سازی، 6/26 ضریب خاموشی تتراگایاکول و 05/0 حجم عصارۀ آنزیمی استفاده‌شده برحسب میلی‌لیتر است.
سنجش مقدار پرولین: استخراج پرولین به روش Bates (1973) انجام شد؛ به‌این‌ترتیب که مقدار 1/0 گرم از نمونه در 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک‌اسید 3 درصد ساییده و به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 10000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. سپس در لولۀ جداگانه‌ای 2 میلی‌لیتر معرف نین‌هیدرین و 2 میلی‌لیتر استیک‌اسید گلاسیال خالص به 2 میلی‌لیتر از عصارۀ حاصل اضافه شد و لوله‌ها به‌مدت 1 ساعت در بنماری با دمای 100 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفتند؛ لوله‌ها پس‌از خارج‌شدن از بنماری و اضافه‌شدن 4 میلی‌لیتر تولوئن به هرکدام از آنها به‌مدت 15 تا 20 ثانیه ورتکس شدند. پس‌از تشکیل دو فاز جداگانه، فاز بالایی رنگی با دقت جدا و جذب نوری آن در طول موج 520 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد.
پس‌از اطمینان‌یافتن از نرمال‌بودن توزیع داده‌ها، تجزیه‌های آماری و مقایسۀ میانگین داده‌های حاصل با نرم‌افزار SAS 9.1 انجام شد. روش دانکن در سطح احتمال 5 درصد برای مقایسۀ میانگین‌ها استفاده شد. تجزیه واریانس داده‌ها بر اساس آزمایش فاکتوریل بر پایۀ طرح کاملاً تصادفی (یک سویه) با سه تکرار و رسم شکل و نمودارها با نرم‌افزار Excel انجام شد.
نتایج و بحث
درصد جوانه‌زنی:نتایج تجزیه واریانس داده‌ها (جدول 1) نشان می‌دهند درصد جوانه‌زنی به‌طور معناداری تحت‌تأثیر سطوح تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش کادمیوم×پیش‌تیمار بذر قرار دارد. تنش کادمیوم موجب کاهش درصد جوانه‌زنی بذرهای گاوزبان اروپایی از 33/81 درصد در تیمار شاهد به 66/58 درصد در تیمار 100 میلیگرمدرلیتر محلول کادمیوم شد (شکل 1). کاهش درصد جوانه‌زنی ممکن است به‌علت تجمع کادمیوم در سلول و درنتیجه، میل ترکیبی آن با گروه سولفیدریل پروتئین‌ها باشد که موجب کاهش سنتز و تولید پروتئین‌های ساختمانی و مورد‌نیاز فرایندهای رشد، تقسیم سلولی و جوانه‌زنی می‌شود (Siddhu and Khan, 2012). Shafiq و همکاران (2008) و Chaudhary و Sharma (2009) کاهش درصد جوانه‌زنی بذرها در حضور غلظت‌های زیاد فلز سنگین کادمیوم را ناشی از تأثیر این ماده بر فعالیت آنزیم آمیلاز می‌دانند که آنزیمی کلیدی در فرایند جوانه‌زنی است. کاهش درصد جوانه‌زنی بذرها در حضور کادمیوم را Egharevba (2010) در لوبیا چشم‌بلبلی و Munzuroglu و Geckil (2002) در گندم و خیار گزارش کرده‌اند.
در شرایط بدون تنش کادمیوم، میانگین درصد جوانه‌زنی بذرهای پیشتیمارشده به‌طور معناداری بیشتر از بذرهای شاهد بود و اگرچه اختلاف معناداری از‌نظر درصد جوانه‌زنی بین بذرهای پیشتیمارشده مشاهده نشد، درصد جوانه‌زنی بذرهای پیشتیمارشده با غلظت 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت بیشترین مقدار را داشت (شکل 1). به نظر می‌رسد هورمون جیبرلین با فعال‌سازی آنزیم آلفا- آمیلاز و هضم مواد ذخیره‌ای و تبدیل آنها به مواد قابل‌‌استفاده برای جنین موجب افزایش درصد جوانه‌زنی می‌شود .(Yadollahi Nooshabadi and Sharifzadeh, 2015). در هر سه غلظت کادمیوم (10، 50 و 100 میلیگرمدرلیتر) نیز افزایش درصد جوانه‌زنی بذرهای پیشتیمارشده در مقایسه با درصد جوانه‌زنی بذرهای شاهد معنادار بود؛ در این شرایط بین بذرهای پیشتیمارشده با غلظت 4 میلی‌مولار سالیسیلیک‌اسید به‌مدت 60 ساعت و بذرهای پیشتیمارشده با 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت اختلاف معناداری وجود نداشت (شکل 1). پیش‌تیمار بذر با جیبرلین در شرایط تنش سبب افزایش فعالیت آنزیمهای پاداکساینده در بذر می‌شود و این آنزیم‌ها فعالیت پراکسیداسیون لیپید طی جوانه‌زنی را کاهش می‌دهند و باعث افزایش درصد جوانه‌زنی می‌شوند (Alivand et al., 2011). اگرچه کاهش درصد جوانه‌زنی بذرها با افزایش غلظت کادمیوم از 50 به 100 میلیگرمدرلیتر معنادار بود، این کاهش در بذرهای پیشتیمارشده با غلظت 4 میلی‌مولار سالیسیلیک‌اسید به‌مدت 60 ساعت معنادار نبود (شکل 1)؛ این امر تأثیر مثبت پیش‌تیمار بذر با سالیسیلیک‌اسید را بر جوانه‌زنی بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش نشان می‌دهد.
جدول 1- تجزیه واریانس آثار تنش کادمیوم و پیش‌تیمار بذر بر صفت‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی بذرهای گاوزبان اروپایی
|
|
|
|
میانگین مربعات |
|
|
|
|
|||
|
پرولین |
آنزیم پراکسیداز |
آنزیم کاتالاز |
وزن خشک گیاهچه |
طول گیاهچه |
درصد گیاهچۀ غیرطبیعی |
سرعت جوانه‌زنی |
درصد جوانه‌زنی |
درجۀ آزادی |
منابع تغییر |
|
|
**063/0 |
**2/284 |
**003/0 |
**003/0 |
**76/28 |
**08/24 |
**063/0 |
**4/980 |
3 |
تنش کادمیوم |
|
|
**153/0 |
**12/38 |
**001/0 |
**012/0 |
**49/39 |
**52/65 |
**153/0 |
**96/404 |
3 |
پیش‌تیمار بذر |
|
|
**003/0 |
**7/2 |
**0006/0 |
**004/0 |
*81/3 |
**81/12 |
**003/0 |
**2/8 |
9 |
تنش کادمیوم×پیش تیمار |
|
|
007/0 |
45/0 |
004/0 |
004/0 |
44/1 |
75/5 |
007/0 |
81/6 |
32 |
خطا |
|
|
97/20 |
92/0 |
88/0 |
11/10 |
06/15 |
23/4 |
97/20 |
25/3 |
|
ضریب تغییرات (درصد) |
|
* و ** به‌ترتیب معنادار در سطح احتمال 5 درصد و 1 درصد
شکل 1- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر درصد جوانه‌زنی بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
.سرعت جوانه‌زنی:تأثیر سطوح تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش کادمیوم×پیش‌تیمار بذر روی صفت سرعت جوانه‌زنی معنادار بود. سرعت جوانه‌زنی بذرهای گاوزبان اروپایی با به‌کاربردن غلظت‌های 10 تا 100 میلی‌گرم کادمیوم حدود 51/14 تا 32/54 درصد نسبت به تیمار شاهد کاهش یافت که تأثیر منفی کادمیوم بر سرعت جوانه‌زنی بذرهای گاوزبان اروپایی را نشان می‌دهد (شکل 2). کاهش سرعت جوانه‌زنی بذرها در اثر به‌کاربردن کادمیوم نتیجۀ تأثیر این عنصر بر قدرت و کیفیت بذر است؛ زیرا هرچه بذر جوانه‌زنی بیشتری در زمان کمتری داشته باشد، کیفیت مطلوب و قدرت بیشتری دارد (Rabie and Bayat, 2008). طبق نظر Shafiq و همکاران (2008) کاهش سرعت جوانه‌زنی بذرها در اثر به‌کاربردن کادمیوم ممکن است به‌علت تجزیۀ مواد غذایی ذخیره‌شده در دانه باشد که این امر قدرت و کیفیت بذر را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد. Munzuroglu و Geckil (2002) کاهش سرعت جوانه‌زنی بذرهای گندم را در اثر کادمیوم گزارش کرده‌اند.
در شرایط بدون تنش کادمیوم، سرعت جوانه‌زنی بذرهای گاوزبان اروپایی با پیشتیمارکردن بذرها حدود 26/1 تا 56/1 برابر نسبت به بذرهای شاهد افزایش یافت. در شرایط تنش کادمیوم نیز سرعت جوانه‌زنی بذرهای پیشتیمارشده به‌طور معناداری بیشتر از بذرهای شاهد بود و کمترین سرعت جوانه‌زنی در شرایط تنش در بذرهای شاهد به دست آمد (شکل 2). افزایش سرعت جوانه‌زنی در اثر اعمال پیش‌تیمار بذر نشان‌دهندۀ افزایش قدرت بذرهای پیشتیمارشده در شرایط بدون تنش و تنش کادمیوم است که این امر موجب بهبود سرعت رشد گیاهان و افزایش کیفیت و کمیت عملکرد آنها می‌شود (Ghasemi-Golezani et al., 2009). بیشترین سرعت جوانه‌زنی در تمام سطوح تنش کادمیوم در اثر استفاده از سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌مدت 60 ساعت حاصل شد که به‌طور معناداری بیشتر از سایر تیمار‌ها بود (شکل 2). پیش‌تیمار بذرها با سالیسیلیک‌اسید موجب افزایش 9/1 تا 1/2 برابری سرعت جوانه‌زنی در شرایط اعمال تنش کادمیوم (10 تا 100 میلیگرمدرلیتر) نسبت به تیمار شاهد شد. سرعت زیاد و یکنواختی جوانه‌زنی درنتیجۀ به‌کاربردن سالیسیلیک‌اسید به‌عنوان پیش‌تیمار بذر ممکن است ناشی از افزایش فعالیت‌های متابولیکی در بذرهای تیمارشده باشد. افزایش سرعت جوانه‌زنی بر اثر پیش‌تیمار با سالیسیلیک‌اسید در بذرهای بامیه را Hussein (2015) و در بذرهای کلزا را Alivand و همکاران (2011) گزارش کرده‌اند که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.
شکل 2- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر سرعت جوانه‌زنی بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی:طبق نتایج تجزیه واریانس داده‌ها (جدول 1) تأثیر کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش کادمیوم×پیش‌تیمار روی درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی معنادار بود و درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی با افزایش شدت تنش کادمیوم به‌طور معناداری افزایش یافت (شکل 3). کمترین و بیشترین درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی به‌ترتیب به تیمارهای شاهد و غلظت 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم مربوط بودند؛ به‌طوری‌که درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی با به‌کاربردن غلظت 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم حدود 15/1 تا 65/3 برابر نسبت به تیمار شاهد افزایش یافت (شکل 3). افزایش درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی با به‌کاربردن کادمیوم در بذرهای لوبیا چشم‌بلبلی (Egharevba, 2010) وگندم و خیار (Munzuroglu and Geckil, 2002) گزارش شده است.
درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی حاصل از بذرهای شاهد در شرایط بدون تنش کادمیوم به‌طور معناداری بیشتر از بذرهای پیشتیمارشده بود (شکل 3). در شرایط بدون تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر موجب کاهش 44/23 تا 77/68 درصدی گیاهچه‌های غیرطبیعی شد؛ در این شرایط، کمترین درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی بین پیشتیمارهای بذری به بذرهای پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌مدت 60 ساعت مربوط بود. در تیمارهای فلز سنگین کادمیوم نیز درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی حاصل از بذرهای پیشتیمارشده به‌طور معناداری کمتر از گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد بود (شکل 3). پیش‌تیمار بذر موجب کاهش 35/11 تا 66/48 درصدی گیاهچه‌های غیرطبیعی در شرایط تنش کادمیوم شد؛ به‌طوری‌که کمترین درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی در بذرهای پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌مدت 60 ساعت حاصل شد (شکل 3). بهبود جوانه‌زنی و کاهش درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی درنتیجۀ اعمال پیش‌تیمار بذر احتمالاً از فعال‌شدن سازوکارهای ترمیمی و فرایندهای متابولیکی ناشی می‌شود که طی جذب آب رخ می‌دهند (Siddhu and Ali Khan, 2012).
شکل 3- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر درصد گیاهچه‌های غیرطبیعی حاصل از بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
وزن خشک گیاهچه:وزن خشک گیاهچهها به‌طور معناداری تحت‌تأثیر تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش کادمیوم×پیش‌تیمار بذر قرار گرفت (جدول 1). وزن خشک گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی با افزایش غلظت کادمیوم کاهش یافت؛ به‌طوری‌که کمترین میانگین وزن خشک گیاهچهها در تیمار 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم مشاهده شد که به‌طور معناداری کمتر از شرایط بدون تنش بود (شکل 4). علت کاهش وزن خشک گیاهچهها در اثر به‌کاربردن کادمیوم احتمالاً از کاهش انتقال مواد غذایی از لپه به محور جنینی ناشی می‌شود؛ زیرا عواملی که رشد محور جنینی را تحت‌تأثیر قرار می‌دهند بر انتقال مواد غذایی از لپه به محور جنینی اثر می‌گذارند. بر اساس نظر Ramos و همکاران (2002) تجمع عنصر کادمیوم در ریشه‌چه یکی دیگر از دلایل کاهش وزن خشک گیاهچهها در شرایط تنش این عنصر است؛ به‌شکلی‌که این مادۀ سمی سازوکارهای فیزیولوژیکی عادی را مختل می‌کند و از این طریق بر وزن خشک گیاهچه اثر منفی می‌گذارد (Balestrasse et al., 2001). کاهش وزن خشک گیاهچهها در شرایط تنش کادمیوم در بذرهای فلفل شیرین (Aziz-Khan et al., 2012)، بذرهای جو (Tiryakioglu et al., 2006) و بذرهای آهار (Thamayanthi et al., 2011) گزارش شده است که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.
وزن خشک گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده در تمام سطوح تنش کادمیوم به‌طور معناداری بیشتر (22/1 تا 08/5 برابر) از گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد بود و در این شرایط، وزن خشک گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌مدت 60 ساعت به‌طور معناداری بیشتر از سایر تیمارهای بذری بود؛ کمترین وزن خشک گیاهچهها در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد مشاهده شد (شکل 4). پیش‌تیمار بذر با کم‌کردن مدت زمان لازم برای جذب آب موجب افزایش سرعت جوانه‌زنی بذرها و درنتیجه، تولید گیاهچه‌های بزرگ‌تر می‌شود (Mahmoudi et al., 2017). ازآنجاکه بذرهای پیشتیمارشده سرعت جوانه‌زنی بیشتری نسبت به بذرهای شاهد دارند، سریع‌تر جوانه می‌زنند و مادۀ خشک بیشتری تولید می‌کنند (Shekari et al., 2010). باوجود کاهش وزن خشک گیاهچهها در حضور کادمیوم، پیش‌تیمار بذر با سالیسیلیک‌اسید موجب کاهش آثار سوء تنش کادمیوم و حتی افزایش وزن خشک گیاهچهها در حدود 9/2 تا 1/5 برابر نسبت به گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد شد (شکل 4). بهبود ویژگی‌های جوانه‌زنی و رشد گیاهچهها در اثر تیمار بذر با سالیسیلیک‌اسید در شرایط تنش فلزات سنگین ممکن است از افزایش پایداری غشای سلول (Mishra and Choudhuri, 1999)، تغییر تعادل هورمونی (Shakirova et al., 2003) و بی‌تحرکی یون‌های کادمیوم (Metwally, 2003) ناشی شود.
شکل 4- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر وزن خشک گیاهچه‌های حاصل از بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
طول گیاهچه:نتایج تجزیه واریانس داده‌ها (جدول 1) نشان دادند طول گیاهچهها به‌طور معناداری تحت‌تأثیر سطوح تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش کادمیوم×پیش‌تیمار قرار دارد. طول گیاهچه‌های حاصل از بذرهای گاوزبان اروپایی با اعمال تنش کادمیوم به‌طور معناداری کاهش یافت؛ به‌طوری‌که این کاهش با به‌کاربردن غلظت 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم حدود 48 تا 82/75 درصد نسبت به تیمار شاهد بود. بیشترین طول گیاهچه در شرایط بدون تنش مشاهده شد و به‌طور معناداری بیشتر از شرایط تنش کادمیوم بود (شکل 5). ازآنجاکه محل اولیۀ تجمع کادمیوم ریشه‌چه است و مقداری از آن به اندام هوایی منتقل می‌شود، این امر سبب کاهش طول گیاهچه‌های قرارگرفته در معرض تنش کادمیوم می‌شود (Aziz-Khan et al., 2012). درنتیجۀ کاهش فعالیت آنزیمهای هیدرولیتیک به‌واسطۀ عناصر سنگین، میزان مواد غذایی رسیده به ساقه‌چه و ریشه‌‌چه‌ها کاهش می‌یابد و طول گیاهچهها را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد (Kabir et al., 2008). Akbari و همکاران (2007) کاهش طول گیاهچهها در گندم را نتیجۀ تجمع کادمیوم گزارش کرده‌اند و این کاهش را با افزایش تجمع فلزات در گیاه متناسب دانسته‌اند.
در شرایط بدون تنش کادمیوم، طویل‌ترین گیاهچهها از بذرهای پیشتیمارشده با غلظت 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت به‌دست آمد که به‌طور معناداری بیشتر از گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد بود؛ هرچند اختلاف معناداری با گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌مدت 60 ساعت نداشت (شکل 5). افزایش طول گیاهچهها در اثر پیش‌تیمار بذر با هورمون جیبرلین از افزایش فعالیت آنزیم آلفا- آمیلاز ناشی می‌شود که موجب افزایش انتقال مواد غذایی به محور جنینی و افزایش طولی گیاهچهها می‌شود (Alivand et al., 2011). در شرایط تنش کادمیوم نیز طول گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده به‌طور معناداری بیشتر از طول گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد بود. در شرایط تنش 10 و 50 میلیگرمدرلیتر کادمیوم، بیشترین طول گیاهچهها به بذرهای پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید تعلق داشت و به‌کاربردن سالیسیلیک‌اسید باعث افزایش حدود 6/1 تا 2 برابری طول گیاهچهها نسبت به تیمار شاهد شد (شکل 5)؛ علت این امر آنست که پیش‌تیمار بذر با سالیسیلیک‌اسید از طریق کاهش آثار منفی تنش کادمیوم، افزایش برخی هورمون‌های محرک مانند اکسین و سیتوکینین (Shakirova et al., 2003) و کاهش نشت یونی (Borsani et al., 2001) موجب افزایش سرعت جوانه‌زنی بذرها (شکل 2) و طویل‌شدن گیاهچهها نسبت به گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد می‌شود. طول گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد در شرایط تنش 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم به‌طور معناداری کمتر از طول گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده بود؛ اختلاف آماری معناداری بین گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده در صفت یادشده مشاهده نشد. پیش‌تیمار آبی و هورمونی بذر با افزایش‌دادن انتقال مواد ذخیره‌ای بذر به محور جنینی و فعال‌کردن تنظیم‌کننده‌های رشد سبب رشد بیشتر محور جنینی و درنتیجه افزایش سرعت جوانه‌زنی می‌شود (Tavakkol Afshari et al., 2012)؛ بنابراین، هرچه بذرها سرعت جوانه‌زنی بیشتری داشته باشند، گیاهچه‌های حاصل طویل‌تر می‌شوند و وزن خشک بیشتری دارند که این امر موجب استقرار بهتر و تولید گیاهچه‌های قوی‌تر می‌شود (Shekari et al., 2010).
شکل 5- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر طول گیاهچه‌های حاصل از بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
فعالیت آنزیم کاتالاز:نتایج تجزیه واریانس داده‌ها (جدول 1) نشان دادند فعالیت آنزیم کاتالاز به‌طور معناداری تحت‌تأثیر سطوح تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش کادمیوم×پیش‌تیمار بذر قرار دارد. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی با افزایش شدت تنش کادمیوم به‌طور معناداری کاهش یافت؛ به‌طوری‌که بیشترین و کمترین مقدار فعالیت این آنزیم به‌ترتیب در شرایط بدون تنش و تنش 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم به دست آمد (شکل 6) و به‌کاربردن 10 تا 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم موجب کاهش حدود 33/3 تا 92/87 درصدی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی شد. به نظر می‌رسد با افزایش شدت تنش فلزات سنگین ازجمله کادمیوم به بیشتر از حد آستانه و یا در سطوح تنش بسیار شدید، فعالیت آنزیمهای پاداکساینده مانند کاتالاز به‌علت خسارت واردشده به سیستم‌های دفاعی کاهش می‌یابد (Bakalova et al., 2004). Noorani Azad و Kafilzadeh (2010) کاهش فعالیت آنزیمهای پاداکساینده ازجمله کاتالاز در گلرنگ را در شرایط تنش کادمیوم گزارش کرده‌اند که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.
شکل 6- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچه‌های حاصل از بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
میانگین فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده در تمام سطوح تنش کادمیوم (صفر، 10، 50 و 100 میلیگرمدرلیتر) به‌طور معناداری بیشتر از گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد بود (شکل 6). آنزیم کاتالاز یکی از مهم‌ترین اجزای سیستم پاداکساینده است که میزان فعالیت آن با پیشتیمارکردن بذرها افزایش می‌یابد. افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز به مهار انواع اکسیژن فعال ازجمله پراکسیدهیدروژن تجمع‌یافته طی تنش کادمیوم منجر می‌شود (Zhang et al., 2009; Gerami, et al., 2018). در شرایط بدون تنش و تنش کادمیوم، بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده با غلظت 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت به دست آمد که به‌طور معناداری بیشتر از سایر تیمار‌ها بود (شکل 6). در شرایط اعمال تیمارهای مختلف کادمیوم، پیش‌تیمار آبی و هورمونی بذر موجب افزایش 1/1 تا 3/14 برابری فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به شاهد شد. Ansari و همکاران (2013) گزارش کرده‌اند پیش‌تیمار بذر با هورمون جیبرلین باعث افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهچه‌های چاودار کوهی می‌شود. افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز درنتیجۀ به‌کاربردن پیش‌تیمار آبی در بذرهای نخود را Fateh و همکاران (2009) و در بذرهای پنبه را Varier و همکاران (2010) گزارش کرده‌اند. در تیمارهای بدون تنش و تنش کادمیوم، اگرچه میزان فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌طور معناداری بیشتر از گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد بود، میزان فعالیت این آنزیم در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده با غلظت 4 میلی‌مولار سالیسیلیک‌اسید به‌طور معناداری کمتر از گیاهچه‌های حاصل از سایر پیشتیمارهای بذری بود. کم‌بودن فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط یادشده ممکن است از این ناشی شود که سالیسیلیک‌اسید با داشتن اکسیژن گروه هیدروکسیل آزاد روی حلقۀ بنزوئیک می‌تواند آهن موجود در کاتالاز را کلاته‌کند (Shi and Zhu, 2008)؛ بنابراین، سالیسیلیک‌اسید سبب بازدارندگی فعالیت آنزیم کاتالاز (آنزیم پاکسازی‌کنندۀ پراکسیدهیدروژن است) می‌شود. این نتایج با یافته‌های Farhoudi و همکاران (2011) در خربزه مطابقت دارند.
فعالیت آنزیم پراکسیداز:تأثیر سطوح تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش×پیش‌تیمار بذر روی فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچهها معنادار بود (جدول 1). میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچه‌های حاصل از بذرهای گاوزبان با افزایش شدت تنش کادمیوم کاهش یافت؛ به‌طوری که کمترین و بیشترین فعالیت این آنزیم به‌ترتیب به تیمارهای 100 میلیگرمدرلیتر و شاهد مربوط بود (شکل 7). Noorani Azad و Kafilzade (2010) نیز کاهش فعالیت آنزیم پراکسیداز در اثر کادمیوم را در گلرنگ گزارش کرده‌اند. علت کاهش فعالیت آنزیمهای پاداکساینده در اثر تنش کادمیوم به تکمیل ظرفیت فعالیت این آنزیم‌ها برای رادیکال‌های آزاد، تأثیر منفی افزایش تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن و همچنین تأثیر منفی احتمالی کادمیوم در تولید این آنزیم‌ها در غلظت‌های زیاد کادمیوم نسبت داده می‌شود (Dell Rio et al., 2003).
شکل 7- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچه‌های حاصل از بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد در تمام سطوح تنش کادمیوم (صفر تا 100 میلیگرمدرلیتر) به‌طور معناداری کمتر از گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده بود. دلیل افزایش فعالیت آنزیمهای پاداکساینده مانند کاتالاز و پراکسیداز در اثر پیشتیمارکردن بذرها در تنش‌های محیطی ازجمله تنش کادمیوم (شکل‌های 5 و 6) ممکن است به‌واسطۀ بهبود و تسریع ساخت DNA در بافت‌های جنینی طی مدت پیشتیمارکردن بذرها باشد (Jie et al., 2002). در تیمارهای مختلف کادمیوم، بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده با غلظت 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت به دست آمد که به‌طور معناداری بیشتر از گیاهچه‌های حاصل از سایر بذرهای پیشتیمارشده و بذرهای شاهد بود (شکل 7). به نظر می‌رسد پیش‌تیمار بذر با افزایش حدود 2/1 تا 2 برابری میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و 1/1 تا 3/14 برابری آنزیم کاتالاز گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم نسبت به پیش‌تیمارنشدن موجب افزایش تحمل گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی به تنش کادمیوم می‌شود؛ درنتیجه در شرایط تنش کادمیوم نیز بذرها جوانه‌زنی (شکل‌های 1 و 2) و رشد گیاهچۀ (شکل‌های 4 و 5) مطلوب‌تری نسبت به بذرهای شاهد دارند.
پرولین:مطابق نتایج جدول تجزیه واریانس داده‌ها (جدول 1) تأثیر تنش کادمیوم، پیش‌تیمار بذر و اثر متقابل تنش کادمیوم×پیش‌تیمار بذر بر محتوای آمینواسید پرولین گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی معنادار است. مقدار آمینواسید پرولین گیاهچهها با افزایش غلظت کادمیوم به‌طور معناداری افزایش یافت؛ به‌طوری‌که بیشترین میانگین محتوای پرولین گیاهچهها در شرایط تنش 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم مشاهده شد که به‌طور معناداری بیشتر از شرایط بدون تنش بود (شکل 8). تولید پرولین یکی از سازوکارهای مهم سمیت‌زدایی فلزات سنگین سمی در بیشتر گیاهان است و تجمع پرولین در گیاهچه‌های قرارگرفته در معرض تنش فلزات سنگین ازجمله کادمیوم موجب کاهش آسیب به غشا و پروتئین‌ها می‌شود (Abraham et al., 2003). Zhang و همکاران (2009) نتیجه گرفته‌اند ارتباط مثبتی بین تجمع پرولین و مقدار پاداکسایندۀ بافت وجود دارد؛ به‌طوری‌که مقدار رادیکال آزاد درنتیجۀ تنش‌های مختلف افزایش می‌یابد و باعث تجمع پرولین در بافت گیاهی می‌شود.
مقدار آمینواسید پرولین گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده در شرایط بدون تنش کادمیوم و کاربرد کادمیوم به‌طور معناداری بیشتر از گیاهچه‌های حاصل از بذرهای شاهد بود (شکل 8). در تمام سطوح تنش کادمیوم، مقدار آمینواسید پرولین گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیشتیمارشده با سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌مدت 60 ساعت بیشترین مقدار را داشت؛ اما در شرایط بدون تنش و تنش 100 میلیگرمدرلیتر کادمیوم اختلاف معناداری با تیمار بذری 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت دیده نشد (شکل 8). افزایش مقدار پرولین در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پیش‌تیمار‌شدۀ ماشک (Zhang et al., 2009; Gerami et al., 2018) نیز گزارش شده است که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. Tabatabaei و Ansari (2016) افزایش پرولین درنتیجۀ پیشتیمارکردن بذرهای کلزا با سالیسیلیک‌اسید در شرایط تنش فلزات سنگین را یکی از راهکارهای تحمل بیشتر نسبت به شرایط تنش در مرحلۀ جوانه‌زنی می‌دانند که سبب بهبود رشد گیاهچهها در شرایط تنش و حتی پس‌از رفع تنش می‌شود. تنش کادمیوم موجب افزایش 1/1 تا 7/1 برابری پرولین در مقایسه با تیمار شاهد شد؛ در‌حالی‌که استفاده از پیش‌تیمار آبی و هورمونی موجب افزایش حدود 1/1 تا 5/1 برابری مقدار پرولین گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی شد.
شکل 8- تأثیر پیشتیمارهای بذر بر مقدار پرولین گیاهچه‌های حاصل از بذرهای گاوزبان اروپایی در شرایط تنش کادمیوم (حرف‌های متفاوت اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون چنددامنه‌ای دانکن را نشان می‌دهند)
جمع‌بندی
یافته‌های پژوهش حاضر نشان می‌دهند اگرچه جوانه‌زنی و رشد گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی با افزایش غلظت کادمیوم کاهش می‌یابد، استفاده از پیش‌تیمار آبی و هورمونی موجب افزایش قابلیت جوانه‌زنی بذر و رشد گیاهچه‌های گاوزبان اروپایی در شرایط بدون تنش (شاهد) و تنش عنصر سنگین کادمیوم می‌شود. دلیل بهبود جوانه‌زنی و رشد گیاهچهها در شرایط بدون تنش و تنش کادمیوم از افزایش فعالیت آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز و مقدار آمینواسید پرولین ناشی می‌شود؛ به‌طوری‌که استفاده از پیش‌تیمار آبی به‌مدت 48 ساعت، غلظت 150 پیپیام جیبرلین به‌مدت 48 ساعت و سالیسیلیک‌اسید 4 میلی‌مولار به‌مدت 60 ساعت با تحریک فعالیت آنزیمهای پاداکساینده و افزایش مقدارآمینواسید پرولین در شرایط تنش کادمیوم سبب کاهش و تعدیل آثار منفی تنش می‌شود. درکل، استفاده از پیش‌تیمار آبی و هورمونی در بذرهای گاوزبان اروپایی با افزایش قدرت بذر و بهبودبخشیدن به ویژگی‌های بیوشیمیایی گیاهچهها تا حدی از آثار منفی تنش فلز سنگین کادمیوم طی مراحل جوانه‌زنی و رشد گیاهچهها می‌کاهد و تحمل گیاهچهها نسبت به شرایط تنش کادمیوم را افزایش می‌دهد.
)
