Document Type : Original Article
Authors
Biotechnology Department, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
فلات ایران یکی از خاستگاههای اولیۀ زیتون شناخته میشود (Besnard et al., 2002; López-Escudero and Mercado-Blanco, 2011). رقمهای مختلف زیتون ویژگیهای خاصی را برای سازگاری با هر اقلیم یافتهاند و رقمهای محلی، مواد گیاهی مناسبی از جنبههای اقتصادی و ویژگیهای ژنتیکیاند (Zacchini and De Agazio, 2004). رقم زرد یکی از ارقام بومی ایران است. قلمهزنی یکی از متداولترین رویکردهای تکثیر زیتون محسوب میشود (Fabbri et al., 2004; Foxhall, 2007; Wiesman, 2009) و اگرچه این روش یکنواختی ژنتیکی را تضمین میکند، با مشکلات فراوانی روبهروست (Roussos and Pontikis, 2002; Fabbri et al., 2004). باتوجهبه قدرت ریشهزایی متوسط رقم زرد و درنتیجه، کاهش میزان تکثیر آن از طریق قلمه از یک سو و اهمیت اقتصادی آن در تهیۀ کنسرو و روغن زیتون از سوی دیگر، استفاده از روشهای کشت بافت برای تکثیر کارآمدتر آن امری ضروریست.
اگرچه مدت بسیار طولانی از نخستین تلاشهای دانشمندان برای تکثیر درون شیشۀ زیتون میگذرد، هنوز تکثیر آن از طریق این روش با مشکلاتی روبهروست (Fabbri et al., 2004; Chaari-Rkhis et al., 2011)؛ زیرا امکان افزایش میزان نوساقهزایی در ریزنمونههای حاصل از کشت بافت آن فقط به چند رقم محدود است (Kitsaki and Drossopoulos, 2005). چیرگی انتهایی بسیار قوی ویژگی اصلی مرحلۀ نوساقهزایی زیتون است که با تیمارهای مختلف سایتوکینینی نیز از بین نمیرود (Fabbri et al., 2004; Mendoza-de Gyvez et al., 2008) و بنابراین لزوم استفاده از روشهای مختلف برای تعدیل چیرگی انتهایی کاملاً مشهود است.کنترل اثر چیرگی انتهایی با مواد شیمیایی بازدارندۀ انتقال اکسین مانند دایک گولاک سدیم (2,3:4,6-Di-O-isopropylidene- 2-keto-L-gulonic acid monohydrate). (Mendoza-de Gyvez et al., 2008; Kaya et al., 2011) غلبه بر این مشکل را ممکن کرده است؛ اما امکان کاربرد آن در رقمهای مختلف بهعلت پاسخ متفاوت ژنوتیپ متغیر است و باید از طریق آزمایشهای دقیق تعیین شود (Mendoza-de Gyves et al., 2008). نور قرمز علاوهبر افزایش رشد رویشی (Shahak et al., 2004)، افزایش رشد طولی ساقه (Poudel et al., 2008) و اندامزایی سبب آزادشدن جوانههای جانبی از چیرگی انتهایی (Hunter and Burritt, 2004) میشود؛ لامپهای سدیم با فشار زیاد (HPS) بهطور رایج برای نوردهی استفاده میشوند؛ هرچند نوردهی با این لامپها ازنظر کیفی و اثربخشی انرژیتیکی بهینه نیست. در سال 1990، دیودهای تابندۀ نور (LEDs) برای رشد گیاه به کار رفتند و امروزه بهطور روزافزون برای نوردهی گیاهان استفاده میشوند. دیودهای تابندۀ نور نسبت به شکلهای سنتی نوردهی در باغبانی مزایای بسیاری دارند؛ اندازۀ کوچک، دوام، طول عمر زیاد، دمای تابش سرد و گزینۀ انتخاب طول موجهای ویژه برای پاسخدهی هدفمند گیاه ازجمله ویژگیهاییاند که دیودهای تابندۀ نور را به گزینۀ مناسبتری نسبت به دیگر منابع نور برای گیاهان تبدیل کرده است (Brazaityte et al., 2009). نور LED در گیاهان کاربردهای گوناگونی دارد که مطالعۀ امکان تولید ریزغدۀ سیبزمینی در نورهای قرمز، آبی و سفید (Asadi et al., 2018) ازجملۀ این کاربردهاست؛ در بررسی یادشده، نور قرمز نسبت به نور سفید و آبی سبب تولید ریزغدههای بیشتری شد. در بررسی Ahmadi و همکاران (2017)، نور LED قرمز نسبت به نور آبی و سفید باعث افزایش میانگین ارتفاع و میزان رزمارینیکاسید در گیاه Melissa officinalis L. شد.
باتوجهبه کاهش رشد طولی ریزنمونهها در اثر کاربرد دایک گولاک سدیم (Mendoza-de Gyves et al., 2008)، در مقالۀ حاضر علاوهبر تعیین غلظت مناسب دایک گولاک سدیم برای افزایش شاخسارزایی ریزنمونههای رقم زرد، نور قرمز بهمنظور بررسی امکان افزایش میزان شاخسارزایی همراه با جلوگیری از کاهش رشد طولی رقم زرد استفاده شد. بر اساس اطلاعات ما، پژوهش حاضر نخستین گزارش در زمینۀ کاربرد همزمان دو عامل محرک رشد جوانههای جانبی در ریزنمونههای زیتون است؛ همچنین باتوجهبه اثر نامطلوب دایک گولاک سدیم بر میزان زندهمانی ریزنمونهها (Mendoza-de Gyves et al., 2008)، مدت زمان لازم برای اعمال اثر آن بر تحریک جوانههای جانبی نیز در پژوهش حاضر مطالعه شد.
مواد و روشها.
مواد گیاهی:ریزنمونهها از نهالهای یکسالۀ رقم زرد مرکز تحقیقات کشاورزی استان قزوین، ایران تهیه شدند.
ضدعفونی: شاخههای سبز و نیمهخشبی شامل جوانههای جانبی به قطعههای کوچک حاوی دو جوانه تقسیم شدند. پساز حذف برگها و بهمنظور رفع آلودگیهای سطحی، قطعهها بهمدت 2 تا 3 ساعت در معرض آب جاری قرار گرفتند و سپس ضدعفونی طی چهار مرحله انجام شد:
1- اتانول 96 درصد (حجمی/حجمی) بهمدت 2 تا 3 ثانیه؛
2- یک مرتبه شستشو با آب مقطر استریل بهمدت 5 دقیقه؛
3- کلریدجیوه 1/0 درصد (وزنی/حجمی) به همراه دو قطره توئین 80 بهمدت 5 دقیقه؛
4- سه مرتبه شستشو با آب مقطر استریل، هر بار بهمدت 5 دقیقه.
کنترل چیرگی انتهایی و رشد طولی: اثر دایک گولاک سدیم (Litwinczuk and Prokop, 2010) بهمنظور کنترل و یا کاهش چیرگی انتهایی در غلظتهای صفر، 5/2، 5، 5/7 و 10 میلیگرمدرلیتر (غلظتها پساز آزمایشهای اولیه انتخاب شدند. جدولهای 2 و 3 انتخاب غلظتها از تأثیر کم تا اثر کشندگی را نشان میدهند) و در دو کیفیت نوری شامل نور فلورسنت سفید (شاهد، 5500 لوکس) که بهطور معمول در اتاقهای رشد استفاده میشود و LED قرمز (2000 لوکس) که در سالهای اخیر عاملی برای افزایش رشد رویشی و شاخسارزایی شناخته شده است (Poudel et al., 2008) بررسی شد. بهمنظور اعمال شرایط یکسان ازنظر شدت نور، فاصلۀ ریزنمونهها تا منبع نور متناسب با شدت نور اندازهگیریشده در نظر گرفته شد (Kurepin et al., 2007).
بررسی اثر دایک گولاک سدیم و کیفیت نور بر نوساقهزایی: دو آزمایش برای بررسی اثر دایک گولاک سدیم و کیفیت نور بر نوساقهزایی از جوانههای زیتون، رقم زرد انجام شد.
آزمایش اول (بهترین غلظت دایک گولاک سدیم):آزمایش اول با غلظتهای مختلف (صفر، 5/2، 5، 5/7 و 10 میلیگرمدرلیتر) دایک گولاک سدیم در نور قرمز و سفید بهطور مجزا و بهمدت یک هفته انجام شد. این آزمایش بهمنظور یافتن بهترین غلظت دایک گولاک سدیم برای تولید نوساقه انجام شد و شاخصهای رشد طولی، وزن تر، تعداد برگ و تعداد نوساقه بررسی شدند. در این آزمایش، زمان برای همه تیمارها یک هفته در نظر گرفته شد.
آزمایش دوم (مدت زمان لازم برای اثرگذاری دایک گولاک سدیم):در آزمایش دوم، غلظت ثابت دایک گولاک سدیم (5 میلیگرمدرلیتر که از آزمایش پیش به دست آمده بود) در دو نور قرمز و سفید بهطور جداگانه استفاده شد. علت استفادۀ همزمان از نور قرمز و دایک گولاک سدیم این بود که دایک گولاک سدیم رشد جوانههای انتهایی را باز دارد و باعث تحریک جوانههای جانبی شود (ازبینبردن چیرگی انتهایی) و همزمان نور قرمز باعث تحریک رشد طولی جوانههای جانبی شود؛ به عبارت دیگر، اینگونه پیشفرض شد که با کاربرد کوتاهمدت دایک گولاک سدیم و نور قرمز بتوان به نوساقهزایی بدون کاهش میزان رشد طولی جوانهها دست یافت. در این مرحله، جوانههای چهاربرگی تا پنج هفته در تیمارهای مختلف و در محیط OM (Rugini, 1984) قرار داده شدند.
.شرایط کشت:تمام آزمایشها در ظرفهای شیشهای 130 سانتیمترمکعبی حاوی حدود 25 میلیلیتر محیطکشت OM (Rugini, 1984) دارای 3 میلیگرمبرلیتر زاتین (Duchefa, Netherlands)، 5/0 میلیگرمبرلیتر BA (Duchefa, Netherlands).(Binet et al., 2007) 36 گرمبرلیتر مانیتول (Duchefa, Netherlands) و 2/6 گرمبرلیتر فایتوآگار (Duchefa, Netherlands). (Mendoza-de Gyves et al., 2008) انجام شدند. گزارشهای متعددی از تأثیر بهتر مانیتول بر رشد زیتون وجود دارند (Roussos and Pontikis, 2002; Zacchini and De Agazio, 2004)؛ ازاینرو در مطالعۀ اولیه، مقدار 30 گرمبرلیتر ساکارز و میزان 36 گرمبرلیتر مانیتول بررسی شد و مانیتول اثر بهتری بر شاخصهای رشدی نشان داد (نتایج ارائه نشدهاند). قندهایی که به محیطکشت اضافه میشوند ممکن است برای اعمال فشار اسمزی یا منبع کربن استفاده شوند. اگرچه مانیتول اغلب برای اعمال فشار اسمزی استفاده میشود، برخی سلولهای گیاهی آن را جذب و متابولیزه میکنند؛ بنابراین، مانیتول به روشی متفاوت از دیگر قندها باعث رشد سلولی میشود (Leva et al., 1994). اسیدیتۀ محیطهای کشت پیشاز اتوکلاو (121 درجۀ سانتیگراد بهمدت 20 دقیقه) روی 75/5 تنظیم شد. زاتین و دایک گولاک سدیم با استفاده از فیلتر 22 میکرومتر سترون و به محیطکشت افزوده شدند (Sigma-Aldrich, USA). ریزنمونهها پساز کشت، در اتاق رشدی با دورۀ نوری 16/8 (روشنایی/تاریکی) ساعت و دمای 2±25 درجۀ سانتیگراد بهمدت 45 روز (Mazinani, 2009) نگهداری شدند.
تجزیهوتحلیل آماری:آزمایشها بهطور فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی با 4 تکرار و 4 نمونه در هر تکرار انجام شدند. نرمافزارهای SAS 9.1 و SPSS 16.00 برای تجزیهوتحلیل دادهها استفاده شدند (P≤0.05). پیشاز تجزیهوتحلیل دادهها، باقیماندۀ دادههای خام محاسبه و نرمالبودن آنها با آزمونهای Ryain-Jainer، Kolmogorov-Smironv، Cramer-Vonmises، Anderson-Darling و Chi-Sqare بررسی و برای داده شمارشی از تبدیل لگاریتمی استفاده شد.
نتایج و بحث
آزمایش اول (بهترین غلظت دایک گولاک سدیم):اختلاف بسیار معناداری در کیفیت نوری، غلظتهای دایک گولاک سدیم و اثر متقابل این دو عامل برتمام صفتهای مطالعهشده در سطح 01/0>P مشاهده شد (جدول 1). تعداد نوساقههای ایجادشده اثر منفی نور قرمز را بر نوساقهزایی ریزنمونههای تحتتأثیر غلظت ثابت دایک گولاک سدیم و در مقایسه با نور فلورسنت سفید نشان داد. بیشترین میانگین نوساقهزایی (22/0±10/3 عدد بهازای هر ریزنمونه) در غلظت 5 میلیگرمبرلیتر دایک گولاک سدیم و نور فلورسنت سفید مشاهده شد (شکل 1، A) و پسازآن، میانگین نوساقهزایی در غلظت 5/7 میلیگرمبرلیتر دایک گولاک سدیم به 19/0±15/2 عدد بهازای هر ریزنمونه رسید و این کاهش در تعداد ساقه با کاهش رشد طولی همراه بود؛ به عبارت دیگر، افزایش غلظت دایک گولاک سدیم نهتنها سبب کاهش تولید میزان نوساقهزایی شد، رشد طولی گیاه را نیز تحتتأثیر قرار داد. در کیفیت نور ثابت، افزایش غلظت دایک گولاک سدیم با رشد طولی ریزنمونهها رابطۀ معکوس داشت؛ بهطوریکه میانگین طول ریزنمونهها روند نزولی را از 33/0±30/16 و 31/0±15/20 میلیمتر بهترتیب در نور فلورسنت سفید و قرمز (شکل 1، B) برای تیمار شاهد تا 25/0±10/8 و 27/0±70/9 میلیمتر در غلظت 10 میلیگرمبرلیتر طی کرد (جدول 2). درمجموع، میزان رشد طولی ریزنمونهها در نور قرمز و غلظت ثابت دایک گولاک سدیم در مقایسه با نور فلورسنت سفید بیشتر بود. به نظر میرسد نور قرمز بر رشد طولی جوانهها اثر مثبت داشته و تا حدی از اثر منفی دایک گولاک سدیم بر رشد طولی جوانهها کاسته است. افزایش تعداد نوساقه در نور قرمز تنها در غلظت 5/7 میلیگرمبرلیتر (09/0±20/1 عدد بهازای هر ریزنمونه) مشاهده شد. استفاده از دایک گولاک سدیم در غلظت 10 میلیگرمبرلیتر در نور فلورسنت سفید (09/0±25/1 عدد بهازای هر ریزنمونه) و همچنین نور قرمز (15/0±85/0 عدد بهازای هر ریزنمونه) سبب کاهش میانگین تعداد نوساقه شد (جدول 2). نور قرمز در مقایسه با نور فلورسنت تنها در افزایش میزان رشد طولی ریزنمونهها (بهترتیب 45/0±13/15 و 31/0±34/11میلیمتر) مؤثر بود (شکل 2).
جدول 1- تجزیه واریانس اثر کیفیت نور و سطوح مختلف دایک گولاک سدیم بر صفتهای بررسیشده
|
MS |
درجۀ آزادی |
S. O. V. |
|||
|
تعداد برگ |
وزن تر |
تعداد نوساقه |
رشد طولی |
||
|
**62/15 |
**07/0 |
**31/0 |
**20/718 |
1 |
نور |
|
**02/64 |
**11/0 |
**23/0 |
**55/618 |
4 |
دایک گولاک سدیم |
|
**48/4 |
**02/0 |
**13/0 |
**29/56 |
4 |
نور × دایک گولاک سدیم |
|
08/0 |
0001/0 |
0007/0 |
10/1 |
30 |
خطای نمونهبرداری |
|
21/0 |
0002/0 |
007/0 |
65/1 |
160 |
خطای کل |
|
10/9 |
89/11 |
76/7 |
72/9 |
|
% C.V |
**اختلاف معنادار در سطح 01/0=α
|
A |
|
B |
شکل 1- اثر دایک گولاک سدیم بر رشد جوانههای جانبی ریزنمونهها؛ A. نور فلورسنت سفید و غلظت 5 میلیگرمبرلیتر دایک گولاک سدیم (پیکانها ساقههای توسعهیافته از جوانههای جانبی را نشان میدهند)، B. نور قرمز و غلظت صفر دایک گولاک سدیم
جدول 2- مقایسه میانگین و انحراف معیار نوساقهزایی در آزمایش بررسی اثر کیفیت نور و سطوح مختلف دایک گولاک سدیم
|
|
صفتهای آزمایششده |
سطوح نوری |
سطوح دایک گولاک سدیم (میلیگرمبرلیتر) |
|||||||
|
|
|
صفر |
5/2 |
5 |
5/7 |
10 |
|
|||
|
رشد طولی (میلیمتر) |
فلورسنت |
a33/0±30/16 |
b29/0±85/11 |
b17/0±80/11 |
c19/0±65/8 |
c25/0±10/8 |
|
|||
|
قرمز |
a31/0±15/20 |
a40/0±55/19 |
b25/0±35/15 |
c23/0±90/10 |
d27/0±70/9 |
|
||||
|
تعداد نوساقه (بهازای هر ریزنمونه) |
فلورسنت |
d00/0±00/1 |
d05/0±05/1 |
a22/0±10/3 |
b19/0±15/2 |
c09/0±25/1 |
|
|||
|
قرمز |
c00/0±00/1 |
c00/0±00/1 |
c00/0±00/1 |
b09/0±20/1 |
a11/0±40/1 |
|
||||
|
وزن تر (گرم) |
فلورسنت |
a003/0±24/0 |
c004/0±13/0 |
b002/0±22/0 |
d003/0±10/0 |
e003/0±06/0 |
|
|||
|
قرمز |
a002/0±16/0 |
b002/0±13/0 |
c002/0±11/0 |
d004/0±08/0 |
e003/0±07/0 |
|
||||
|
تعداد برگ (بهازای هر ریزنمونه) |
فلورسنت |
b23/0±85/11 |
c28/0±05/11 |
a19/0±75/12 |
d17/0±75/6 |
e32/0±95/5 |
|
|||
|
قرمز |
a16/0±95/11 |
b17/0±20/10 |
20/0±65/8 |
d16/0±75/5 |
e24/0±30/5 |
|
||||
مقادیر میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار هستند. حرفهای مشترک عدماختلاف معنادار در سطح 05/0α< را بر اساس آزمون دانکن نشان میدهند.
شکل 2- فعالشدن جوانههای جانبی در هفتۀ چهارم در نور فلورسنت سفید و تیمار غلظت 5 میلیگرمبرلیتر دایک گولاک سدیم
نور قرمز و سفید بهتنهایی (بدون دایک گولاک سدیم) تفاوت چندانی در تعداد نوساقه، وزن تر و تعداد برگ نشان ندادند؛ اما در رشد طولی جوانههای جانبی، نور قرمز نسبت به نور سفید اثر مثبت داشت و میتوان نتیجهگیری کرد استفادۀ همزمان از دایک گولاک سدیم و نور قرمز روی نوساقهزایی اثر مثبتی نداشته است. نور سفید توانست میزان نوساقهزایی را در غلظت 5 میلیگرمدرلیتر دایک گولاک سدیم نسبت به نور قرمز تا 1/3 نوساقه افزایش دهد؛ درنتیجه، نور سفید در این غلظت دایک گولاک سدیم بر چیرگی انتهایی غلبه کرده و باعث تولید نوساقههای جدید شده است. احتمالاً اثر ترکیبی این دو عامل بهشکلی متابولیسم جوانهها را تغییر داده است که آنها بیشتر به تولید جوانههای جدید متمایل شوند تا اینکه رشد طولی یابند.
میزان زیستتودۀ تولیدشده تحتتأثیر دایک گولاک سدیم در محیطکشت کاهش درخور توجهی را در غلظتهای 5/7 و 10 میلیگرمبرلیتر نشان داد (جدول 2) و افزایش غلظت دایک گولاک سدیم در نور فلورسنت سفید نسبت به شاهد سبب کاهش تعداد برگ شد؛ هرچند این امر در غلظت 5 میلیگرمبرلیتر (19/0±75/12 عدد بهازای هر ریزنمونه) صادق نبود. روند کاهش تعداد برگ با افزایش غلظت دایک گولاک سدیم ادامه و میانگین تعداد برگ در غلظت 5/7 میلیگرمبرلیتر تقریباً به نصف کاهش یافت. در نور قرمز نیز روند کاهش تعداد برگ با افزایش غلظت دایک گولاک سدیم مشاهده شد (جدول 2). میزان زندهمانی ریزنمونهها در نور قرمز با افزایش غلظت دایک گولاک سدیم کاهش یافت؛ بهطوریکه میزان زندهمانی در غلظت 5/7 میلیگرمبرلیتر به 80 درصد و در غلظت 10 میلیگرمبرلیتر به 40 درصد رسید. آسیب بافتی ریزنمونهها در نور فلورسنت فقط در غلظت 10 میلیگرمبرلیتر مشاهده شد (جدول 3).
جدول 3-درصد زندهمانی جوانهها در آزمایش بررسی اثر کیفیت نور و سطوح مختلف دایک گولاک سدیم
|
سطوح دایک گولاک سدیم (میلیگرمبرلیتر) |
سطوح نوری |
||||
|
10 |
5/7 |
5 |
5/2 |
صفر |
|
|
45 |
100 |
100 |
100 |
100 |
نور فلورسنت |
|
40 |
80 |
100 |
100 |
100 |
نور قرمز |
باتوجهبه درصد زندهمانی جوانهها به نظر میرسد دایک گولاک سدیم در نور فلورسنت تا غلظت 5/7 میلیگرمدرلیتر اثر منفی نداشته و تنها در غلظت 10 میلیگرمدرلیتر باعث کاهش شدید درصد زندهمانی شده است؛ این اثر در نور قرمز و در غلظت 5/7 میلیگرمدرلیتر دایک گولاک سدیم مشاهده شد و درنتیجه در نور قرمز، اثر منفی دایک گولاک سدیم بر زندهمانی جوانهها در غلظت کمتری بروز میکند.
آزمایش دوم (مدت زمان لازم برای اثرگذاری دایک گولاک سدیم): در بررسی مدت زمان لازم برای تأثیر دایک گولاک سدیم بر افزایش بازده رشد جوانههای جانبی، تمام صفتها در سطح 01/0>P معنادار شدند (جدول 4). افزایش رشد طولی با گذشت زمان کاملاً مشهود بود و در هفتۀ چهارم در هر دو نور به بیشترین میزان خود (22/0±55/22 میلیمتر برای نور سفید و 2/0±7/25 میلیمتر برای نور قرمز) رسید. مشاهده میشود رشد طولی از هفتۀ اول تا چهارم درحال افزایش بوده و پسازآن، کاهش رشد در هر دو نور دیده شده است؛ این امر ممکن است بهعلت بروز اثر منفی دایک گولاک سدیم پساز چهار هفته باشد. Poudel و همکاران (2008) گزارش کردند گیاهان انگوری که در نور LED قرمز رشد کنند، ساقههای بلندتر و فاصلۀ بینگرهی بیشتری دارند. در پژوهش حاضر نیز نور LED قرمز نسبت به نور سفید توانست اثر بیشتری روی رشد طولی ساقهها داشته باشد و این در حالیست که در نور سفید، میانگین تعداد ساقههای رشدیافته در ابتدای هفتۀ چهارم با تأثیر دایک گولاک سدیم افزایش (15/0±80/3 عدد بهازای هر جوانه) یافت و تعداد ساقههای مشابهی (17/0±7/3 عدد بهازای هر جوانه) نیز در هفتۀ پنجم به دست آمد؛ جالب است این افزایش تعداد نوساقه در مدت زمان کوتاهی رخ داده است. تعداد نوساقه در نور قرمز نتوانست از 1 عدد بیشتر شود؛ به این معنا که نور قرمز قادر به غلبه بر اثر بازدارندگی دایک گولاک سدیم نبود (جدول 4).
جدول 4- تجزیه واریانس اثر مدت زمان لازم برای اثر دایک گولاک سدیم بر صفتهای بررسیشده
|
تعداد برگ |
وزن تر |
تعداد نوساقه |
رشد طولی |
|
|
|
**34/323 |
**08/0 |
**74/0 |
**38/901 |
4 |
زمان |
|
51/0 |
0001/0 |
001/0 |
34/0 |
30 |
خطای نمونهبرداری |
|
88/0 |
0002/0 |
004/0 |
30/1 |
160 |
خطای کل |
|
35/13 |
85/10 |
97/22 |
19/6 |
|
% C.V |
**اختلاف معنادار در سطح 01/0= α
روند افزایش تعداد نوساقهها در نور سفید در ابتدای هفتۀ پنجم نیز ادامه داشت؛ هرچند طی این مدت از رشد طولی جوانهها نسبت به هفتۀ چهارم کاسته شد و به میانگین 19/0±05/20 میلیمتر رسید و این امر ممکن است درنتیجۀ استفادۀ طولانیتر از دایک گولاک سدیم در محیطکشت باشد (جدول 5).
میزان زیستتوده و تعداد برگ (جدول 5) نیز طی زمان افزایش یافت و در هفتۀ پنجم به بیشترین مقدار خود (بهترتیب 001/0±15/0 گرم و 12/0±72/11 عدد بهازای هر جوانه) رسید. اگرچه تمایل بسیاری برای توسعه و بهبود روشهای نوین تکثیر زیتون از طریق ریزازدیادی وجود دارد و تاکنون تلاشهای گستردهای در این زمینه انجام شده است، همچنان پاسخ متفاوت ارقام به شرایط کشت بافت، سرعت کم رشد و ...(Roussos and Pontikis 2002; Leva, 2011) اجازه نداده است این روش جایگزین روشهای سنتی شود؛ درنتیجه، کاربرد آن در سطح تجاری توسعۀ چندانی نیافته است. مطالعههای اخیر ریزازدیادی زیتون را با هزینۀ کمتر و در مقیاس وسیعتر ممکن کردهاند (Micheli et al., 2009; Wiesman, 2009). هدف در شرایط کشف بافت، افزایش بازده نوساقهزایی برای رسیدن به سطوحی از تولید با توجیه اقتصادی است. مطالعههای بسیاری وجود چیرگی انتهایی قدرتمند را در ریزنمونههای زیتون و در شرایط درون شیشه (In vitro) تأیید میکنند؛ بهطوریکه این امر سبب ایجاد محدودیت رشد و ازدیاد شاخههای جانبی میشود (Mendoza-de Gyves et al., 2008; Micheli et al., 2009). رشد ساقه ترکیبی از رشد میانگره و نمو واحدهای تشکیل ساقه (Phytomer) است (Muleo and Morini, 2008)؛ همچنین میزان نوساقهزایی محصول القای جوانهها و رهاشدن آنها از چیرگی انتهایی است. تلاشهایی که برای کنترل چیرگی انتهایی در کشت بافت انجام شدهاند به سه دستۀ روش فیزیکی یا ریزهرسی، استفاده از ترکیبات شیمیایی و تأثیر عوامل محیطی بهویژه کیفیت نور تقسیم میشوند. اگرچه ریزهرسی یا حذف جوانۀ انتهایی هنگام واکشت در برخی از ارقام زیتون مؤثر گزارش شده است، عموماً بازده زندهمانی ریزنمونههای زیتون از طریق اکسیداسیون بافتی به ترکیبات فنلی نسبت داده میشود. باتوجهبه اینکه آسیب بافتی خود محرک تولید ترکیبات فنلی است (Roussos et al., 2007; Roussos and Pontikis, 2001)، این روش برای افزایش نوساقهزایی در ریزازدیادی زیتون مناسب به نظر نمیرسد. استفاده از ترکیباتی که با اتصال و جداشدن اکسین از جایگاههای انتقال آن هنگام عبور از عرض غشای پلاسمایی تداخل میکنند ( Gaither, 1975; Donthineni et al. 2014) از دیگر راهکارهاست. اگرچه استفاده از ترکیبات یادشده بهمنظور غلبه بر چیرگی انتهایی در شرایط درون شیشه (In vitro) طی سالیان گذشته رو به افزایش بوده است .(Ebrahim, 2004; Elhiti and Stasolla, 2010; Pumisutapon et al., 2011)، استفاده از دایک گولاک سدیم بهطور محدود و تنها در چند رقم زیتون گزارش شده است (Mendoza-de Gyves et al., 2008; Kaya et al., 2011). دایک گولاک سدیم مادهای مصنوعی است که چندین اثر بر رشد گیاه دارد و بازدارندگی رشد میانگرهها ازجملۀ آنهاست. این ماده بهسرعت به جوانۀ انتهایی منتقل میشود و در آنجا با سنتز DNA وابسته به جیبرلیکاسید و احتمالاً اکسین اثر متقابل دارد و اثر بازدارندگی دیگر آن بیشتر روی RNA پلاستیدی است تا RNA سیتوپلاسمی؛ حتی در غلظتهای زیاد نیز بهسختی سلولهای درحال سکون را باز میدارد، اما سلولهای درحال تقسیم بهشدت نسبت به آن حساسند (Bhattacharjee and Gupta, 1981; Sun et al., 2015).
جدول 5- مقایسه میانگین و انحراف معیار نوساقهزایی در آزمایش بررسی مدت زمان لازم برای اثر دایک گولاک سدیم
|
مدت زمان (هفته) |
|
صفتهای آزمایششده |
||||
|
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
سطح نوری |
|
|
b19/0± 05/20 |
a22/0± 55/22 |
c26/0± 40/16 |
d19/0±65/13 |
e25/0±80/9 |
فلورسنت |
رشد طولی (mm) |
|
b24/0±30/23 |
a20/0±70/25 |
c30/0±00/21 |
21/0±60/17 |
e26/0±20/14 |
قرمز |
|
|
a17/0±70/3 |
a15/0±80/3 |
b06/0± 10/1 |
b00/0±00/1 |
b00/0±00/1 |
فلورسنت |
تعداد نوساقه (بهازای هر ریزنمونه) |
|
a10/0±30/1 |
a09/0±25/1 |
b00/0± 00/1 |
b00/0±00/1 |
b00/0±00/1 |
قرمز |
|
|
a001/0± 15/0 |
b003/0± 14/0 |
c003/0± 10/0 |
d002/0±08/0 |
e003/0±05/0 |
فلورسنت |
وزن تر (گرم) |
|
a001/0±20/0 |
b002/0± 17/0 |
c001/0± 16/0 |
d002/0± 13/0 |
e005/0±07/0 |
قرمز |
|
|
a15/0± 80/11 |
a19/0± 75/7 |
a22/0± 40/6 |
a18/0±85/5 |
a17/0±70/4 |
فلورسنت |
تعداد برگ (بهازای هر ریزنمونه) |
|
a20/0±65/11 |
a19/0±50/7 |
a31/0±85/5 |
a18/0±20/5 |
a14/0±90/3 |
قرمز |
|
مقادیر میانگین 4 تکرار ± انحراف معیار هستند. حرفهای مشترک عدماختلاف معنادار در سطح 05/0α< را بر اساس آزمون دانکن نشان میدهند.
Antonopoulou و همکاران (2018) اثر دایک گولاک سدیم را بر تحریک جوانههای جانبی رقم Chondorola Chalkidikis زیتون بررسی کردند. در مطالعۀ آنها، 9/8 میکرومولار ایندول 3 بوتریک(بوتیریک) اسید همراه با 5/100 میکرومولار دایک گولاک سدیم (تقریباً 30 میلیگرمدرلیتر) توانست باعث تکثیر جوانههای جانبی و نوساقهزایی شود؛ اما تأکید آنها بر این بود که نتایج آنها نتایج اولیه است و باید این موضوع در رقمهای مختلف زیتون نیز بررسی شود. در مطالعۀ حاضر نیز مقدار 5 میلیگرمدرلیتر (تقریباً 16 میکرومولار) توانست باعث تکثیر جوانههای جانبی در رقم زرد زیتون شود که با نتیجۀ Antonopoulou و همکاران (2018) متفاوت است؛ به این معنا که رقم زرد نسبت به رقم Chondorola Chalkidikis به یکششم میزان دایک گولاک سدیم برای نوساقهزایی نیاز دارد.
کنترل چیرگی انتهایی (Hunter and Burritt, 2004) یکی از کاربردهای کیفیتهای نوری مختلف است؛ البته گفتنی است گزارشی در زمینۀ بررسی اثر کیفیت نوری بر رشد جوانههای جانبی زیتون در منابع یافت نشد. نور یکی از عوامل محیطی است که روی گیاهان عمل میکند و نهتنها بهعنوان منبع انرژی، بهشکل منبع اطلاعات خارجی نیز بر رشدونمو آنها اثر میگذارد. گیاهان به آرایههایی از گیرندههای نوری مجهزند که پاسخهای متفاوت آنها را به شاخصهای نوری مانند طیف، شدت، جهت و مدت زمان کنترل میکنند. این گیرندههای نور شامل فیتوکرومهای جذبکنندۀ نور قرمز و مادون قرمز، کریپتوکرومهای جذبکنندۀ نور UVA و آبی، فتوتروپینها و دیگر گیرندههای نوری در محدودۀ UVA و نور سبز هستند. تغییر نوردهی، پاسخهای فتوسنتزی و ریختشناختی متفاوتی را برمیانگیزد که بین گونههای گیاهی مختلف متفاوت است (Urbonaviciute et al., 2007). فیتوکرومها به دو شکل فعال Pfr و غیرفعال Pr وجود دارند. شکل Pfr فعال از سیتوپلاسم به هسته منتقل میشود و با عوامل رونویسی واکنش میدهد تا تغییراتی را در فیزیولوژی گیاه سبب شود. شکل فعال Pfr توازن بین فیزیولوژی تنش و رشد را در گیاهان تعیین میکند. در نور مستقیم خورشید که غنی از نور قرمزاست، Pfr تشکیل میشود و به فرستادن مجصولات فتوسنتزی در جهت رشد گیاه تمایل دارد؛ برخلاف آن، نور منعکسشده از پوشش گیاهی مجاور که غنی از نور مادون قرمز است، Pfr فعال را از بین میبرد و باعث میشود محصولات فتوسنتزی بهسمت فیزیولوژی تنش بروند (Devlin, 2016). نورهای مختلف اثرهای متفاوتی بر فیزیولوژی و عملکرد گیاهان دارند و این اثرها ممکن است در گیاهان مختلف یکسان نباشند؛ برای نمونه، یک طیف نوری در گیاهی باعث گلدهی شود، اما در گیاه دیگر اثر عکس داشته باشد. در همین راستا، Hirai و همکاران (2006) عنوان کردند نور آبی سبب افزایش چشمگیر رشد طولی ساقه در گیاه بادمجان میشود و دیگر نورها ازجمله قرمز و سبز چنین اثری را از خود نشان نمیدهند؛ هرچند نور قرمز در گیاه کاهو همین اثر را دارد. آنها نتیجهگیری کردند اثر نور بر رشد طولی ساقه به گونۀ گیاه بستگی دارد.
نتایج بررسی میزان زندهمانی ریزنمونهها در شرایط استفادۀ همزمان دایک گولاک سدیم و نور قرمز دو جنبه از پاسخ رقم زرد را نشان میدهد: اولاً در غلظت 10 میلیگرمبرلیتر دایک گولاک سدیم و در هر دو کیفیت نوری، میانگین تعداد نوساقهها و زیستتودۀ ایجادشده کاهش مییابد که این امر آثار نامناسب این ماده بر رقم زرد را در این محدودۀ غلظتی نشان میدهد؛ البته Mendoza-de Gyves و همکاران (2008) کاهش میزان زندهمانی ریزنمونهها در این غلظت را در ارقام Rosciola و Paintone de Moiano نیز گزارش کردهاند. ثانیاً باتوجهبه افزایش میزان تلفات در نور قرمز، این عامل را میتوان محرک ایجاد مرگ سلولی در رقم زرد و در غلظتهای زیاد دایک گولاک سدیم در نظر گرفت؛ زیرا میزان زندهمانی ریزنمونهها در کیفیتهای نوری مختلف بسته به نوع رقم متفاوت است (Donini et al., 2008). از سوی دیگر، مشاهدۀ کاهش تمام شاخصهای رشد بهجز رشد طولی دلیلی بر آثار منفی نور قرمز بر رشد ریزنمونههای رقم زرد قرارگرفته در معرض نور قرمز در مقایسه با نور فلورسنت سفید است؛ هرچند افزایش رشد طولی در نور قرمز باتوجهبه تعداد برگ تولیدشده و در مقایسه با نور فلورسنت نشان میدهد افزایش ارتفاع مشاهدهشده نتیجۀ افزایش طول میانگرههاست.
نتایج نشان میدهند استفاده از نور قرمز و دایک گولاک سدیم بهمنظور تولید ساقههای دارای گرۀ بیشتر مؤثر نیست. اگرچه بیشترین میزان رشد طولی در غلظتهای 5/2 و 5 میلیگرمبرلیتر (در نور فلورسنت) مشاهده شد، بیشترین میزان نوساقهزایی در غلظت 5 میلیگرمبرلیتر به دست آمد؛ همچنین میزان رشد طولی در این تیمار اختلاف درخور توجهی نسبت به تیمار شاهد نشان داد. ترکیب زئاتین با دایک گولاک سدیم از طریق تحریک تقسیم سلولی و افزایش رشد طولی سلول سبب افزایش رشد بافت میشود و تنها غلظتهای کم دایک گولاک سدیم، امکان فعالیت زئاتین را بهعنوان محرک تقسیم سلولی فراهم میکنند و افزایش غلظت آن بهعلت ماهیت اصلی دایک گولاک سدیم سبب میشود بهشکل بازدارندۀ رشد باعث توقف تقسیم سلولی (Mendoza-de Gyves et al., 2008) و درنتیجه کاهش بیشتر رشد طولی یا آسیب بافتی و کاهش زندهمانی شود. همانطور که مشاهده شد کاربرد دایک گولاک سدیم در محیطکشت بهمدت 21 روز تأثیر مناسبتری نسبت به کاربرد طولانیمدت آن بر افزایش میزان نوساقهزایی دارد. حداکثر میزان رشد طولی در هفتۀ چهارم مشاهده شد؛ هرچند تأثیر طولانیمدتتر دایک گولاک سدیم تنها کاهش رشد طولی ریزنمونههای را در پی داشت.
تعداد برگ ریزنمونههای مطالعهشده با افزایش غلظت دایک گولاک سدیم (بهجز غلظت 5 میلیگرمبرلیتر) نسبت به شاهد کاهش یافت. افزایش تعداد برگ در غلظت 5 میلیگرمبرلیتر در اثر افزایش میزان نوساقههای تولیدشده بود و کاهش دوبارۀ این شاخص با افزایش غلظت دایک گولاک سدیم ممکن است از آغاز ایجاد آسیب بافتی در اثر کاربرد دایک گولاک سدیم ناشی شود؛ این نتیجه با مشاهدۀ آسیب تعداد درخور توجهی از ریزنمونهها در غلظت 10 (زندهمانی برابر با 45 درصد) اثبات شد. روند کاهش تعداد برگ با افزایش غلظت دایک گولاک سدیم در نور قرمز رابطۀ مستقیم داشت که این وضعیت احتمالاً بر اثر افزایشنیافتن نوساقهزایی در این کیفیت نور است.
جمعبندی
نتایج پژوهش حاضر نشان میدهند دایک گولاک سدیم و نور قرمز بهنوعی در تقابل با یکدیگر اثر بازدارندگی اعمال میکنند و اثر دایک گولاک سدیم در افزایش نوساقهزایی فقط در نور فلورسنت سفید مشاهده میشود. همچنین هنگام استفاده از دایک گولاک سدیم، نور قرمز فقط در افزایش میزان رشد طولی نسبت به نور فلورسنت مؤثر است. گفتنی است گزارشی در زمینۀ کاربرد دایک گولاک سدیم در نور قرمز یافت نشده است.
سپاسگزاری
از حمایت گروه بیوتکنولوژی، دانشکدۀ کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه بینالمللی امام خمینی (ره) از پژوهش حاضر سپاسگزاری میشود.
)
