Document Type : Original Article
Authors
1 Ferdowsi University of Mashhad
2 Ferdowsi University of mashhad, Faculty of science
3 مشهد- بلوار وکیل آباد- دانشگاه فردوسی مشهد
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه.
گیاهان دارویی نقش بسزایی در سلامت افراد و جوامع بشری دارند. اهمیت دارویی این دسته از گیاهان در تولید ترکیبات ثانویه‌ای است که فرایندهای فیزیولوژیکی خاصی را در بدن انسان فعال می‌کنند (Padulosi and Hadj-Hassan, 1998). استفاده از متابولیت‌های گیاهی در صنعت داروسازی به درمان آسان‌تر و ارزان‌تر بیماریها کمک می‌کند و مانع خروج بخشی از سرمایۀ کشورها برای واردکردن این گونه ترکیبات می‌شود (Oksman-Caldentey and Inzé, 2004). برداشت مستمر گیاهان دارویی برای استخراج ترکیبات ارزشمند موجود در آنها، علاوه‌بر آسیب به گیاهان، تأثیر سوئی بر جوامع گیاهی و زیستگاه آنها دارد؛ از سویی، این ترکیبات ساختار پیچیدهای دارند و سنتز آنها با استفاده از روش‌های شیمیایی پرهزینه و مشکل است (Toivonen, 1993)؛ به‌همین‌علت، استفاده از روش‌های زیست‌فناوری کشت سلول و بافت گیاهی می‌تواند روش جایگزینی برای تولید این ترکیبات باشد (Rao and Ravishankar, 2002). از دیگر مزایای تولید متابولیت‌های ثانویه با استفاده از روش‌های مبتنی بر کشت بافت این است که نمونۀ گیاهی در آزمایشگاه تحت‌تأثیر عوامل محیطی نظیر اقلیم، آفت‌ها، بیماری‌های میکروبی، تنش‌های فصلی و جغرافیایی قرار نمی‌گیرد و می‌توان رشد سلول‌ها را در این شرایط کنترل و محصولات خالص‌تر و مفیدتری تولید و به بازار عرضه کرد (Bourgaud et al., 2002; Rao and Ravishankar, 2002).
کلپوره (Teucrium polium L.)، گیاهی علفی، گل‌دار، چندساله (پایا)، خودرو و متعلق به خانوادۀ نعناعیان (Lamiaceae) است که از اواسط تیرماه تا اواسط شهریورماه در مناطق فقیر از مواد غذایی و مواد آلی، سواحل سنگلاخی و ماسه‌زار نواحی مختلف اروپا، مدیترانه، شمال آفریقا و جنوب‌غربی آسیا ازجمله ایران میروید (Koocheki et al., 2009; Mashreghi and Niknia, 2012). این گیاه دارای طبیعت گرم است و سرشاخه‌های گل‌دار آن بهشکل داروی ضدتشنج با فعالیت‌های ضدانقباضی، ضدعفونی‌کنندگی و ترمیم‌کنندگی زخم در طب سنتی ایران استفاده می‌شوند (Nadimi et al., 2013)؛ همچنین ویژگی‌های ادرارآوری، تعریق‌آوری، ضد فشار خون، ضددرد و کاهندگی چربی و قند خون این گیاه در پژوهشها اثبات شده‌اند (Moghtader, 2009).
فنلها بزرگترین گروه متابولیت‌های ثانویۀ گیاهی و ترکیبات دهندۀ هیدروژن هستند که آثار و فواید زیستی گستردهای بهشکل آنتی‌اکسیدان ایدهآل در زمینۀ مواد غذایی، شیمی، داروسازی و پزشکی برای انسان دارند (Golluce et al., 2007; Raghavendra et al., 2010). فلاونوئیدها زیرمجموعهای از فنلها هستند که انتشار وسیعی در گیاهان دارند و با داشتن خاصیت آنتیاکسیدانی، نقش بسزایی در نمو و سیستم دفاعی گیاهان و محافظت آنها در برابر عوامل خارجی ازجمله اشعۀ ماوراءبنفش، عوامل بیماری‌زا و کرمهای گیاهی ایفا می‌کنند (Lev-Yadun, 2001; Myung-Min et al., 2009). فنلها و فلاونوئیدها سازوکارهای متعددی برای ایفای نقش آنتیاکسیدانی خود دارند که ازجمله می‌توان به پاکروبی رادیکالهای آزاد، دهندگی هیدروژن، خاموش‌کردن آنیون سوپر‌اکسید، کلات‌کردن یونهای فلزی، همکاری با پراکسیدازها، جمع‌آوری یا حذف پراکسیدهیدروژن در جهت روبندگی گونه‌های کنشگر اکسیژن (ROS) اشاره کرد (Chu et al., 2000; Kovacik et al., 2009).
مطالعه‌ها در زمینۀ گیاه کلپوره نشان داده‌اند ترکیبات مهم عصارۀ قطبی (عصاره‌گیری با حلال‌های قطبی مانند آب یا اتانول) آن به گروه گلیکوزیدهای فنیلپروپانوئید تعلق دارند و فلاونوئیدها (بهشکل مشتقات متوکسی) و ترکیبات آروماتیک به‌وفور در آن یافت می‌شوند (Alcazar et al., 1992; Bedir et al., 1999). محتوای زیاد فنل و فلاونوئید گیاه کلپوره موجب شده است عصارۀ آن بهشکل افزودنی غذایی جایگزین آنتیاکسیدانها استفاده شود (Goulas et al., 2012).
پژوهشهای اندکی در زمینۀ کشت بافت گیاه کلپوره به‌منظور تولید متابولیت‌های دارویی و اسانسی انجام شده‌اند. Al-Qudah و همکاران (2011) در بررسی‌های خود موفق به باززایی گیاه کلپوره در شرایط in vitro شدند؛ در این آزمایش، گیاهان باززایی‌شده در محیط MS حاوی 6- بنزیل‌آدنین و 1- نفتالین‌استات محتوای اسانسی بیشتری نسبت به گیاهان رشدیافته در محیط بدون هورمون داشتند.
عوامل بسیاری بر افزایش محتوای متابولیت‌های ثانویه تأثیر می‌گذارند که ازجملۀ آنها می‌توان به مواد تنظیم‌کنندۀ رشد، ریزنمونه، افزودن پیش‌سازها و استفاده از الیسیتورهای زیستی و غیرزیستی اشاره کرد (Sayed-Tabatabae and Omidi, 2011). اکسینها و سیتوکینینها ازجمله تنظیمکنندههای رشد گیاهی هستند که در سنتز متابولیت‌های ثانویه در شرایط کشت سلول- بافت نقش دارند، ولی غلظت بهینه و نسبت کاربردی آنها برای قطعه‌های مختلف جداکشت یک گونه و از گونه‌ای به گونۀ دیگر متفاوت است (Bagheri and Saffari, 2008) استفاده از الیسیتورهای زیستی و غیرزیستی مانند اشعۀ ماوراءبنفش، نمک فلزات سنگین، برخی از ترکیبات شیمیایی مانند جاسمونیک‌اسید، سالیسیلیک‌اسید، نیترات و همچنین کشت ریشههای موئین و مهندسی متابولیت ازجمله روش‌های بهینهسازی شرایط کشت برای افزایش تولید متابولیت‌های گیاهی هستند (Box, 1945; Rao and Ravishankar, 2002; Matkowski, 2008). ثابت شده است متیل‌جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید از مؤثرترین الیسیتورهای شیمیایی هستند که با مسیر علامترسانی اختصاصی سبب افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانینآمونیالیاز (PAL) و درنتیجه، فعال‌سازی مسیر فنیلپروپانوئیدی می‌شوند که پیامد آن، افزایش محتوای درونی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی است .(Shabani and Ehsanpour, 2010; Mehrabani et al., 2013).Javidi Moghadam و همکاران (2016) در بررسی توان کال‌زایی و آنتیاکسیدانی عصارۀ متانولی حاصل از کالوس‌های کلپوره، بیشترین وزن تر کالوس را در ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره و در محیط‌کشت MS حاوی غلظت‌های 5/0 و 1 میلیگرمبرلیتر 2 و 4- دی‌کلروفنوکسی‌استیک‌اسید (2,4-D) گزارش کردند؛ در این آزمایش، ریزنمونۀ برگ در محیط‌کشت MS حاوی 5/1 میلیگرمبرلیتر 2,4-D دارای بیشترین فعالیت آنتیاکسیدانی بود.
متأسفانه بهرهبرداری بی‌رویۀ انسان از گیاه کلپوره، چرای مفرط دام و تبدیل‌شدن مراتع به بوم‌نظام‌های زراعی، این گیاه را در معرض خطر انقراض قرار داده است؛ این موضوع نه‌تنها حفظ و تکثیر این گیاه در عرصه‌های طبیعی را بااهمیت می‌کند، بررسی روش‌های زراعی‌کردن آن را نیز اجتناب‌ناپذیر می‌کند (Koocheki et al., 2009). باتوجهبه اهمیت دارویی و غذایی گیاه کلپوره و ازآنجاکه بررسی‌های اندکی در زمینۀ کشت in vitro این گیاه وجود دارند، پژوهش حاضر با تکیه بر شیوۀ کشت in vitro و با هدف بررسی تأثیر الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و سالیسلیک‌اسید بر ظرفیت افزایش تولید متابولیت‌های ثانویۀ این گیاه انجام شد.
مواد و روشها.
آمادهسازی مواد گیاهی و عملیات کشت:بذر گیاه کلپوره (Teucrium polium L.) در آبان‌ماه ۱۳۹۵ از منطقۀ سد طرق، ابتدای روستای عارفی، استان خراسان رضوی (ارتفاع 1344 متر، طول جغرافیایی˝711 320º 59 و عرض جغرافیایی 842´80º 36) جمع‌آوری و پس‌از اینکه متخصصان پژوهشکدۀ علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد آن را شناسایی کردند و با شمارۀ هرباریومی (FUMH) 20955 ثبت شد، به‌منظور استفاده در پژوهش حاضر نگهداری شد. به‌منظور از‌بین‌بردن خواب بذر، مناسبترین تیمار شامل خراش و هورمون جیبرلیک‌اسید (غلظت ۵۰۰ میلی‌گرم‌در‌لیتر) در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت شش روز استفاده شد (Javidi Moghadam et al., 2016)؛ سپس بذرها با محلول هیپوکلریت‌سدیم ۱ درصد (حجمی/حجمی) به‌مدت ۵ دقیقه ضدعفونی شدند و پس‌از شستشو با آب مقطر استریل به‌مدت ۱۵ دقیقه، درون پتریدیشهای استریل دارای کاغذ صافی شمارۀ 1 قرار گرفتند و در اتاق کشت (شرایط تاریکی با دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد) نگهداری شدند. پس‌از ظاهرشدن ریشۀ اولیه و محور زیرلپه، دانهرستهای کلپوره به‌مدت دو روز در نور ۲۰۰۰ لوکس و دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد و شرایط کاملاً مرطوب قرار گرفتند. پس‌از سبزشدن اندام هوایی و افزایش طول ریشۀ اولیه، دانهرستها به محیط هیدروپونیک حاوی محلول غذایی هوگلند (Arnon and Hoagland, 1940) منتقل و در اتاقک رشد با دمای2±25 درجۀ سانتی‌گراد و دورۀ نوری ۱۶ ساعت روشنایی/8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. گیاه رشدیافته در محیط یادشده بهشکل گیاه مادری برای تهیۀ ریزنمونه استفاده شد.
.بررسی تأثیر الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و .سالیسیلیک‌اسید بر محتوای ترکیبات فنلی و ظرفیت آنتیاکسیدانی کالوس: ازآنجاکه بررسی‌های پیش، برگ را بهترین ریزنمونۀ کالوسدهنده معرفی کرده‌اند (Javidi moghadam et al., 2016)، در پژوهش حاضر از ریزنمونۀ برگ (جداکشت اولیه) برای تولید کالوس استفاده شد. ریزنمونۀ برگ در محیط‌های کشت MS دارای تیمار مجزا و ترکیبی دو هورمون 2, 4-D (غلظت‌های صفر، 5/0، 1 و 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر) و بنزیل‌آمینوپورین (BAP) (غلظت‌های صفر، 5/0، 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر) قرار گرفت؛ به این منظور، قطعه‌های برگ بخشهای رأسی ساقه پس‌از جداسازی از گیاه مادری به‌مدت ۵ دقیقه با آب شستشو و سپس به‌مدت 30 ثانیه در الکل ۷۰ درصد (حجمی/حجمی) غوطه‌ور شدند و درنهایت، 5 دقیقه با آب مقطر استریل شستشو و استریل شدند؛ در ادامه، ریزنمونه‌ها به قطعه‌های 5/0 سانتی‌متری برش داده شدند و روی محیط‌کشت MS با غلظت‌های هورمونی یادشده قرار گرفتند و در اتاقک رشد با دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد و دورۀ نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی نگهداری شدند. در پایان روز چهلم و باتوجهبه ویژگی‌های ریخت‌شناختی و میزان کال‌زایی در هر تیمار، کالوس‌های سبز حاصل از محیط‌های کشت حاوی 5/1 و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP برای بررسی‌های بعدی انتخاب شدند. کالوس‌های منتخب به محیط‌های کشت MS حاوی الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید (غلظت‌های 50 و 100 میکروگرم‌در‌لیتر) منتقل شدند. پس‌از پایان روز بیستم، وزن خشک کالوس‌ها (معیار رشد) اندازه‌گیری و کالوس‌ها با دستگاه فریز درایر (مدلChrist Alfa 1.2 LD Plus، آلمان) طی 24 ساعت کاملاً خشک شدند.
عصاره‌گیری ترکیبات فنلی: مقدار 1/0 گرم از پودر خشک هر نمونه با 2 میلیلیتر حلال متانول 80 درصد (حجمی/حجمی) مخلوط و به‌مدت 36 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک (مدل Parsonic 2600 s، ایران) در دمای 20 درجۀ سانتی‌گراد و فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفت و درنهایت، نمونههای با غلظت 1 میلیگرمدرمیلیلیتر به دست آمدند؛ سپس عصاره‌ها با کاغذ واتمن شمارۀ 1 صاف شدند و محلول حاصل به‌منظور حذف حلال متانول، به‌مدت 24 ساعت زیر هود (شیمی طوس، ایران) و در شرایط کاملاً تاریک قرار گرفت و برای ارزیابی ترکیبات بیوشیمیایی استفاده شد.
بررسی محتوای فنل کل: محتوای ترکیبات فنلی کل به روش Singleton و همکاران (1999) بررسی شد؛ به این منظور، مقدار 100 میکروگرم‌در‌لیتر عصارۀ متانولی تهیه‌شده از هر نمونه با 2 میلیلیتر آب مقطر و 1 میلیلیتر محلول فولینسیوکالچو مخلوط و پس‌از ۳ دقیقه استراحت، مقدار 1 میلیلیتر محلول ۲۰ درصد Na2Co3 (وزنی/حجمی) به آن افزوده و پس‌از 45 دقیقه گرماگذاری در شرایط تاریکی، جذب نوری مخلوط در ۷۲۵ نانومتر خوانده شد. محتوای فنل کل بر حسب میلیگرم گالیک‌اسید بر گرم وزن خشک نمونه به کمک منحنی استاندارد حاصل از غلظت‌های مختلف (10 تا 300 میلی‌گرم‌در‌لیتر) گالیک‌اسید تعیین شد.
بررسی محتوای فلاونوئید کل: محتوای ترکیبات فلاونوئیدی کل بر اساس اندازه‌گیری کالریمتری آلومینیوم‌کلرید (Zhishen et al., 1999) بررسی شد؛ به این منظور، مقدار 1 میلیلیتر عصارۀ متانولی تهیه‌شده از هر نمونه با 4 میلیلیتر آب مقطر و 300 میکرولیتر محلول 5 درصد NaNo2 (وزنی/حجمی) مخلوط شد و پس‌از 5 دقیقه استراحت، مقدار 300 میکرولیتر محلول 10 درصد AlCl3 (وزنی/حجمی)، 2 میکرولیتر محلول 1 مولار NaOH و 10 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه و پس از 30 دقیقه گرماگذاری در تاریکی، جذب آن در 510 نانومتر خوانده شد. محتوای فلاونوئید کل نمونه‌ها بر حسب میلیگرم کاتچین در گرم وزن خشک نمونه به کمک منحنی استاندارد حاصل از غلظت‌های مختلف (10 تا 400 میلی‌گرم‌در‌لیتر) کاتچین محاسبه شد.
بررسی ظرفیت آنتیاکسیدانی کل به روش احیای یون آهن (FRAP) III:به‌منظور اندازه‌گیری توان آنتیاکسیدانی عصاره‌ها از روش Benzie و Strain (1996) استفاده شد که مبتنی بر کاهش کمپلکس فریکتریپیریدیلتریآزین (TPTZ) بهشکل فروس در مجاورت آنتیاکسیدانهاست (Shahwar et al., 2012; Chaouche et al., 2013)؛ به این منظور، پس‌از تهیۀ محلولهای 300 میلیمولار بافر استات‌سدیم، 10 میلیمولار TPTZ در 40 میلیمولار HCl و 20 میلیمولار کلرید‌آهن سه‌آبه، عمل مخلوط‌کردن آنها برای تهیۀ محلول FRAP به نسبتهای حجمی1:1:10 انجام شد. به‌منظور سنجش، مقدار 50 میکرولیتر عصارۀ متانولی با 5/1 میلیلیتر محلول FRAP تازه‌تهیه‌شده ترکیب و پس‌از 4 دقیقه استراحت، جذب محلول در 593 نانومتر خوانده شد. محتوای آنتیاکسیدانی کل نمونه‌ها برحسب میلیگرم محلول سولفات‌آهن ɪɪ در گرم وزن خشک نمونه به کمک منحنی استاندارد حاصل از غلظت‌های مختلف (10 تا 400 میکروگرم‌در‌میلی‌لیتر) محلول سولفات‌آهن II رسم شد.
تجزیهوتحلیل آماری دادهها: تجزیهوتحلیل آماری دادهها با نرمافزار SPSS، نسخۀ 16 انجام و برای مقایسۀ میانگین دادهها از آزمون چنددامنه‌ای دانکن استفاده شد. نمودارهای مربوطه با نرمافزار Excel (Office 2013) رسم شدند.
نتایج
ارزیابی سنجش سطوح مختلف هورمون‌های 2,4-D و BAPدر میزان کال‌زایی: تحلیل واریانس دادهها نشان داد کاربرد هورمون‌های 2,4-D و BAP بر درصد کال‌زایی ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره معنادار (01/0P≤) است (جدول 1). بر اساس نتایج، بیشترین درصد کال‌زایی (100 درصد) به محیط‌کشت بدون هورمون 2,4-D و دارای غلظت‌های 5/1 و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP تعلق دارد (شکل 1) و کمترین درصد کال‌زایی (3/8 درصد) به ترکیب تیماری 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر هورمون 2,4-D و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر هورمون BAP مربوط است (شکل 2).
جدول 1- نتایج تجزیه واریانس درصد کال‌زایی ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط‌کشت MS در سطوح مختلف هورمون‌های 2,4-D و BAP
|
F |
میانگین مربعات (MS) |
درجۀ آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
منبع تغییرات (S.O.V) |
|
**83/13 |
43/2862 |
3 |
29/8587 |
2,4-D |
|
**99/4 |
86/1031 |
4 |
42/4127 |
BAP |
|
**98/9 |
491/2066 |
12 |
89/24797 |
BAP × 2, 4-D |
|
- |
206/88 |
40 |
8275/1 |
خطا |
|
- |
- |
59 |
70/45787 |
کل |
** بیان‌کنندۀ معناداری در سطح احتمال خطای 1 درصد (P≤0.01) است.
شکل 1- نمایی از کالوس‌های حاصل از ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط‌کشت MS حاوی 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP (الف) و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP (ب) چهل روز پس‌از کشت
شکل 2- مقایسۀ میانگین درصد کال‌زایی ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط‌کشت MS در کاربرد هم‌زمان سطوح مختلف هورمون‌های BAP و 2,4-D. مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنادار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.
نتایج بررسی تغییرات ترکیبات بیوشیمیایی متأثر از .سطوح مختلف متیل‌جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید:تجزیه واریانس دادههای فنل کل نشان داد تنها اثر عامل الیسیتور (متیل‌جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید) بر محتوای این دسته از ترکیبات معنادار (01/0≥P) است. مقایسۀ میانگین دادهها نشان داد کاربرد غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید سبب تولید بیشترین محتوای فنل کل (80/86 میلیگرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) در کالوس‌های حاصل می‌شود که 5/2 برابر نمونۀ شاهد (بدون الیسیتور) (52/33 میلیگرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) است. در کاربرد الیسیتور متیل‌جاسمونات، تیمار 50 میکروگرم‌در‌لیتر سبب افزایش حدود 9/1 برابری محتوای فنل کل کالوس (91/61 میلیگرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) نسبت به نمونۀ بدون الیسیتور (52/33 میلیگرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) شد و پس‌از‌آن، محتوای فنل کل کالوس کاهش یافت (شکل3).
شکل 3- مقایسۀ میانگین محتوای فنل کل در کالوس حاصل از ریزنمونۀ برگ گیاه کلپوره در محیط MS در سطوح مختلف الیسیتورهای سالیسیلیک‌اسید و متیل‌جاسمونات (میکروگرم‌در‌لیتر). مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنادار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.
تجزیه واریانس دادهها در ارزیابی محتوای فلاونوئید کل نشان داد اثر متقابل BAP و الیسیتور بر محتوای فلاونوئید کل کالوس معنادار (05/0≥ P) است. نتایج مقایسۀ میانگین دادهها نشان دادند غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید دارای بیشترین تأثیر (75/133 میلیگرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) بر محتوای فلاونوئید کل کالوس‌های رشدیافته در محیط دارای 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP است و تفاوت آن با تیمار شاهد (55/48 میلیگرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) معنادار است ( افزایش حدود 7/2 برابری نسبت به تیمار شاهد) (شکل 4). مقایسۀ تأثیر دو الیسیتور بر کالوس‌های تولید‌شده روی محیط BAP نشان داد اثر القایی الیسیتور سالیسیلیک‌اسید بر محتوای فلاونوئید کل کالوس‌ها بیشتر از اثر القایی متیل‌جاسمونات در محیط‌های یادشده است (شکل 4).
ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل: نتایج تجزیه واریانس دادهها در ارزیابی ظرفیت آنتیاکسیدانی کل نشان دادند تنها آثار سادۀ هورمون BAP و الیسیتور بر ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل کالوس معنادار (01/0≥P) است. بر اساس نتایج، غلظت 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP بهطور معناداری سبب افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی کل (85/13 میکروگرم در 100 گرم وزن خشک) در مقایسه با غلظت 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP (75/10 میکروگرم در 100 گرم وزن خشک) می‌شود (شکل 5). کاربرد غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید (46/25 میکروگرم در 100 گرم وزن خشک کالوس) بهطور معناداری ظرفیت آنتیاکسیدانی کل را نسبت به تیمار بدون الیسیتور (85/5 میکروگرم در 100 گرم وزن خشک) افزایش داد (افزایش 3/4 برابری نسبت به تیمار شاهد). در کاربرد متیل‌جاسمونات، بیشترین ظرفیت آنتیاکسیدانی کل کالوس (94/13 میکروگرم در 100 گرم وزن خشک) در تیمار با غلظت 50 میکروگرم‌در‌لیتر این الیسیتور مشاهده شد (شکل 6).
شکل 4- مقایسۀ میانگین محتوای فلاونوئید کل کالوس حاصل از برگ گیاه کلپوره در محیط MS حاصل از تأثیر متقابل هورمون BAP و الیسیتورها. مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنادار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.
شکل 5- مقایسه میانگین ظرفیت آنتیاکسیدانی کل کالوس حاصل از برگ گیاه کلپوره در محیط MS در سطوح مختلف هورمون BAP. مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنادار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.
شکل 6- مقایسه میانگین آثار سادۀ الیسیتورهای سالیسیلیک‌اسید و متیل‌جاسمونات برظرفیت آنتیاکسیدانی کل کالوس حاصل از برگ گیاه کلپوره در محیط MS. مقادیر، میانگین سه تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نبود اختلاف معنادار در سطح01/0P≤ را نشان می‌دهند.
بحث.
نتایج بررسی درصد کال‌زایی نشان دادند در محیط‌های کشت بدون هورمون 2,4-D و دارای روند افزایشی غلظت هورمون BAP، درصد کال‌زایی ریزنمونه‌ها افزایش می‌یابد؛ به‌طوری‌که بیشترین غلظت‌های به‌کار‌رفتۀ BAP (5/1 و 2 میلی‌گرم‌در‌لیتر)، مؤثرترین نتیجه را بر درصد کال‌زایی دارند. سیتوکینینها تشدیدکنندۀ تقسیم‌های سلولی و ترغیب‌کنندۀ فرایند نمو سلولهای حاصل هستند که فرایند اول از طریق افزایش بیان ژنهای متعلق به سیکلین‌های نوع D (Ikeuchi et al., 2013) و فرایند دوم با افزایش و تجمع پورین‌های ضروری برای تقسیم‌های سلولی و سنتز پروتئین‌ها انجام می‌شود (Kumar Verma et al., 2016). کاربرد هم‌زمان دو هورمون نه‌تنها تأثیر مثبتی بر میزان کال‌زایی ریزنمونه‌ها نداشت، محیط‌های کشت دارای غلظت‌های زیاد این دو هورمون (2 میلی‌گرم‌در‌لیتر BAP و 5/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر 2,4-D) سبب کاهش درصد کال‌زایی شدند؛ این یافته با نتایج پژوهش Mirshekar و همکاران (2014) در زمینۀ گیاه آویشن (Thymus daenensis) مطابقت دارد. اگرچه مطالعه‌های بسیاری به القای کالوس در تیمار هم‌زمان دو هورمون اکسین و سیتوکینین اشاره دارند (Dronne et al., 1999; Soltanipool et al., 2011; Fan et al., 2012; Sahraroo et al., 2014)، نتایج متفاوت و حتی کاهشی کاربرد هم‌زمان تنظیمکنندههای رشد اکسین و سیتوکینین بر تولید کالوس ممکن است به‌علت تفاوت در تعداد و نوع گیرندههای هورمونی یا محتوای متفاوت هریک از تنظیمکنندههای رشد گیاهی موجود در بافتهای مختلف کشت‌شده (ریزنمونه) باشد (Sarkheill et al., 2009)؛ به‌طوری‌که افزایش غلظت هورمونها بیشتر از میزان بهینه در محیط‌کشت دارای اثر ممانعت‌کننده بر هورمون‌های داخلی ریزنمونه است و کاهش میزان تولید کالوس را در پی دارد (Dixon and Gonzales, 1996; Afshari poor, 1993).
نتایج بررسی متابولیت‌های ثانویۀ فنل و فلاونوئید کل نشان دادند اگرچه تیمار غلظت 50 میکروگرم‌در‌لیتر متیل‌جاسمونات تأثیر افزایشی بر محتوای این ترکیبات شیمیایی کالوس‌ها دارد، تیمار با غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر این الیسیتور سبب کاهش محتوای فنل و فلاونوئید کل می‌شود؛ در تأیید این یافته، Goyal و Ramawat (2008) نتیجه گرفته‌اند تیمار با غلظت‌های کمتر متیل‌جاسمونات (40 میکرومولار) در مقایسه با سایر تیمارها (50، 100، 200 و 400 میکرومولار) در کشت سوسپانسیون سلول گونۀ Tuberosa pueraria تأثیر بیشتری بر افزایش تولید ایزوفلاونوئیدها دارد. بر اساس پژوهش Thiem و Krawczyk (2010)، تیمار با غلظت‌های 50 و 100 میکرومولار متیل‌جاسمونات در مقایسه با غلظت 200 میکرومولار آن دارای اثر افزایشی بر محتوای ایزوفلاونوئیدهای کشت سوسپانسیون سلول گیاه کودزو (Pueraria tuberosa) است.
پژوهشهای Samadi و همکاران (2014) در زمینۀ گیاه کنگر فرنگی (ynara scolymus L.) نشان داده‌اند کاربرد مقادیر زیاد متیل‌جاسمونات نه‌تنها افزایش محتوای فنل و فلاونوئید کل کالوس را در پی ندارد، تولید این ترکیبات را کم یا متوقف می‌کند. پژوهشها نشان داده‌اند استفاده از الیسیتورها سبب افزایش تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویه در شرایط in vitro می‌شود که اغلب از طریق فعال‌سازی سازوکار دفاعی در برابر آن الیسیتور است (Mewis et al., 2011). متیل‌جاسمونات ازجمله الیسیتورهای زیستی است و می‌تواند تولید ROS را القا کند (Zhang and Xing, 2008) و اگرچه این ترکیبات در نقش پیامبر ثانویه در پاسخهای سلولی شرکت دارند، مقادیر زیاد آنها سبب آسیب شدید به سلول می‌شود (Mittler et al., 2011)؛ به‌این‌ترتیب که رادیکالهای آزاد تولید‌شده در غلظت‌های زیاد الیسیتور در واکنش با پروتئین‌ها، لیپیدها و DNA سبب تغییر فعالیت یا غیرفعال‌شدن آنها می‌شوند و درنهایت، مرگ سلولی را القا می‌کنند (Chen et al., 2008).
محتوای فنل و فلاونوئید کل در کالوس‌های تیمارشده با غلظت 100 میلی‌گرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید افزایش یافت؛ به‌طوری‌که رابطۀ مستقیمی بین افزایش محتوای این دسته از ترکیبات و روند افزایشی غلظت الیسیتور یادشده مشاهده شد. در پژوهش Samadi و همکاران (2014) روی گیاه کنگر فرنگی (Cynara scolymus) مشخص شد با افزایش غلظت سالیسیلیک‌اسید تا 100 میکروگرم‌در‌لیتر، تجمع ترکیبات فنیلپروپانوئیدی مشاهده می‌شود. مشخص شده است سالیسیلیک‌اسید با ایجاد تنش کاذب سبب افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانینآمونیالیاز (PAL) می‌شود که در مسیر تولید ترکیبات محافظتی قوی مانند فلاونوئیدها، فیتوآلکسینها و دیگر ترکیبات فنلی نقش دارد. ازآنجاکه مسیر سنتز سالیسیلیک‌اسید (ترکیب فنلی طبیعی) با سایر ترکیبات فنلی مشترک است و این ترکیب نقش مهمی در بیوسنتز سایر ترکیبات فنلی دارد، افزایش آن در محیط‌کشت یکی از دلایل مقدماتی افزایش سنتز ترکیبات مسیر فنیلپروپانوئیدی در کالوس تلقی می‌شود (Dixon and Paiva, 1995; Mahdavian et al., 2008; Shabani and Ehsanpour, 2010)؛ باوجوداین، پژوهشها نشان داده‌اند سالیسیلیک‌اسید همانند متیل‌جاسمونات می‌تواند در غلظت‌های زیاد وضعیت اکسایشی گیاه را بیش از حد توان آن تحت‌تأثیر قرار دهد و سبب مرگ گیاه شود؛ اما این تأثیر به عواملی نظیر گونۀ گیاهی، مرحلۀ نموی گیاه، شیوۀ اعمال تیمار و درنهایت، غلظت و مدت زمان اعمال تیمار سالسیلیک‌اسید وابسته است (Kovacik et al., 2009). به موازات تغییرات بیشینۀ محتوای فنل و فلاونوئید کل کالوس‌ها، بیشترین ظرفیت آنتیاکسیدانی کل درنتیجۀ کاربرد غلظت‌های مختلف متیل‌جاسمونات به غلظت50 میکروگرم‌در‌لیتر متیل‌جاسمونات و درنتیجه کاربرد غلظت‌های مختلف سالیسیلیک‌اسید به غلظت 100 میکروگرم‌در‌لیتر سالیسیلیک‌اسید تعلق داشت که ارتباط تنگاتنگ تغییرات ظرفیت آنتیاکسیدانی کل با تجمع ترکیبات فنلی را نشان می‌دهد. گزارش‌های متعددی مبنی بر رابطۀ مستقیم محتوای فنلی عصارههای گیاهان رزماری (Rosmarinasofficinalis) (Elmasta et al., 2006)، نعناع (Mentha Spicata L.) (Swetie et al., 2007)، زنجبیل (Zingiberofficinale) (Ghasemzadeh et al., 2010) و مریم گلی (Salvia miltorhiza) (Dong et al., 2010) با توان آنتیاکسیدانی آنها وجود دارند. Siddharthan و همکاران (2007) در بررسی محتویات فنلی کل و ظرفیت آنتیاکسیدانی 133 گونه گیاه دارویی (از 64 خانواده در هند) به رابطۀ مستقیم بین فعالیت آنتیاکسیدانی و محتوای فنلی کل این گیاهان اذعان داشته‌اند. پژوهشهای Swetie و همکاران (2007) نشان داده‌اند فعالیت آنتیاکسیدانی با محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی گیاهان رابطۀ مستقیم دارد. بررسی Kimو همکاران (2006) نشان داده است افزایش خاصیت آنتیاکسیدانی عصارههای فنلی گیاه ریحان (Ocimum basilicum L.) در پی تیمار با متیل‌جاسمونات رخ می‌دهد؛ دلیل این ارتباط به ویژگی الکتروندهی فنلها و تمایل به خنثی‌سازی ROSها نسبت داده می‌شود (Sadeghi et al., 2015).
نتیجهگیری
کلپوره، گیاهی ارزشمند ازنظر ویژگی‌های دارویی است و هر روشی که با ایجاد کمترین آسیب و تغییر سبب تولید ترکیبات مفید دارویی آن شود، کارآمد و درخور توجه است. پژوهش حاضر نشان داد الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و سالیسیلیک‌اسید میتوانند موجب افزایش تولید متابولیت‌های ثانویۀ این گیاه در محیط‌کشت شوند؛ باوجوداین، افزایش غلظت این الیسیتورها تا غلظت بهینه می‌تواند تولید ترکیبات ثانویه را تحریک کند و کاربرد غلظت‌های بیشتر آن به دلایل مختلف ازجمله کاهش توانایی سلول‌ها در پاسخ به افزایش غلظت الیسیتور و اثر تخریبی ناشی از آن، نه‌تنها سبب افزایش این ترکیبات نمی‌شود، کاهش آنها را نیز در پی دارد؛ بنابراین، گذشته از نقش مفیدی که الیسیتورهای یادشده در تولید ترکیبات مؤثر دارویی این گونه گیاهان دارند، توجه به غلظت آنها مهم و ضروری است و کاربرد مقادیر بهینۀ ترکیبات یادشده در راستای بیش‌تولید متابولیت‌های دارویی اجتناب‌ناپذیر است و بایستی به آن توجه شود.
سپاسگزاری
نگارندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد برای تأمین هزینه‌های پژوهش حاضر از محل اعتبارات متمرکز این معاونت (با شماره کد طرح 40430/3) سپاسگزاری می‌کنند.
)
