Document Type : Original Article
Authors
Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
خانوادۀ Valerianacea با حدود 200 گونۀ Valeriana به‌طور گسترده در سراسر جهان پخش شده است. در میان 9 جنس متعلق به این خانواده، تنها تعداد محدودی از گونه‌های جنس Valeriana با عنوان گیاهان دارویی معرفی شده‌اند که ازجملۀ آنها می‌توان به سنبل‌الطیب (Valeriana officinalis) اشاره کرد. سنبل‌الطیب، گیاهی با ارتفاع 80 تا 150 سانتی‌متر و دارای ریزوم‌های بسیار کوچک است (Omidbeigi, 1995) که به‌شکل مسکن، آرام‌بخش، خواب‌آور، درمان‌کنندۀ اسپاسم، هیستری، هیجان، میگرن و روماتیسم در پزشکی کاربرد دارد. ریشه‌های این گیاه دارویی دارای ترکیبات دارویی هستند که از مهم‌ترین آنها می‌توان به روغن‌های فرّار و مشتقات سزکوئی‌ترپنوئید (والرنیکاسید، والرنون و والرنال، والرنیل‌استات)، اپوکسی‌ایروئید‌استرها (والپوتریات‌ها) و مواد دیگر مانند بالدرینال، آمینواسیدها (آرژنین، گلوتامین و تیروزین) و آلکالوئیدها اشاره کرد (Omidbeigi, 1995).
ترپنها یا ترپنوئیدها بزرگ‌ترین گروه متابولیت‌های ثانویه در گیاهان را شامل می‌شوند. بیوسنتز ترپنها از استیل‌کوآنزیم A و از طریق مسیر موالونیک‌اسید (MVA) انجام می‌شود. ترپنها بر اساس واحدهای ایزوپرن (C5) تشکیل‌دهندۀ ساختار اسکلتی دسته‌بندی می‌شوند؛ این واحدهای ایزوپرنی شامل IPP (Isopentenyl diphosphate) و DMAPP (Dimethylallyl diphosphate) هستند که مادۀ اولیۀ سنتز سه پیش‌مادۀ ژرانیل‌دی‌فسفات (C10،-GPP)، فارنسیل‌دی‌فسفات (C15،-FPP) و ژرانیل‌ژرانیل‌دی‌فسفات (C20، GGPP) به شمار می‌آیند (Yeo et al., 2012). سزکوئی‌ترپن‌ها از فارنسیل‌دی‌فسفات (FPP) مشتق‌شده از مسیر MVA به وجود می‌آیند؛ درحالیکه مونوترپن‌ها و دی‌ترپن‌ها به‌ترتیب از ژرانیل‌دی‌فسفات و ژرانیل‌ژرانیل‌دی‌فسفات که از مشتقات مسیر DXP (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate) هستند، در پلاستیدها به وجود می‌آیند (Pyle et al., 2012). Pyle و همکاران (2012) مسیر سنتز والرنیکاسید را که به سزکوئی‌ترپن تعلق دارد، در گیاه سنبل‌الطیب بررسی کردند؛ طبق این بررسی، آنزیم VoTPS1 چندین محصول ازجمله جرماسرین C، جرماسرین D و جرماسرین B را سنتز می‌کند که جرماسرین C و D عمده‌ترین ترپنها هستند. جرماسرین C به مادۀ دیگری به نام عناصر δ تبدیل می‌شود که پایدارتر است؛ درحالیکه VoTPS2 به‌طور عمده valerena-4,7(11)-diene را سنتز می‌کند و این ماده به والرنیکاسید تبدیل می‌شود. هم‌زمان با Pyle و همکاران (2012)، پژوهشگران دیگری ازجمله Yeo و همکاران (2012) پیشنهاد کردند ژن VoTPS1 فارنسیل‌دی‌فسفات را به والرین 1-10 داین تبدیل می‌کند و والرین 1-10 داین طی مسیر اکسید و به والرنیکاسید تبدیل می‌شود (شکل 1).
باتوجهبه اینکه تولید متابولیت‌های ثانویه در بافت‌های تمایزیافته بیشتر است و بازده کم، تکرارپذیری کم کشت‌ها و بی‌ثباتی تولید، عوامل محدودکننده در زمینۀ کشت‌های تمایزنیافته مانند کالوس و سوسپانسیون سلولی هستند، امروزه از روش کشت ریشه‌مویین برای رفع این کمبودها استفاده می‌شود. رشد سریع، زمان دوبرابر‌شدن کم، سهولت نگهداری و توانایی سنتز طیف وسیعی از ترکیبات فیتوشیمیایی، کشت ریشه‌مویین را به منبع مستمری برای تولید متابولیت‌های ثانویۀ باارزش دارویی و افزودنی‌های مواد غذایی تبدیل کرده است. باتوجهبه توانایی ریشه‌های مویین در تولید فیتوهورمون‌های موردنیازشان، کشت ریشه‌مویین می‌تواند در محیط بدون هورمون انجام شود (Hu and Du, 2006). مطالعه‌های متعدد نشان داده‌اند فعالیت مسیرهای بیوسنتزی ثانویه و درنتیجه، تولید وتجمع متابولیت‌های ثانویه تحت‌تأثیر عوامل متعددی ازجمله عوامل محیطی و فیزیولوژیکی مانند محرک‌ها قرار می‌گیرد (Ahmadian Chashmi et al., 2010). محرک‌ها، ترکیباتی با منشأ زیستی یا غیرزیستی هستند که از طریق القای پاسخ‌های دفاعی سبب بیوسنتز و انباشت متابولیت‌های ثانویه در سلول‌ها می‌شوند؛ محرک از طریق گیرنده‌های موجود در غشای پلاسمایی دریافت می‌شود و از طریق سیستم‌های ترارسانی علامتی، نسخه‌برداری و بیان ژن‌های دخیل در بیوسنتز متابولیت‌ها را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد. متیلجاسمونات، ترکیب فرّار معطری است که برای نخستین بار در گیاه Jasminum grandiflorum شناسایی شد. جاسمونیک‌اسید و مشتقات آن مانند متیلجاسمونات ازجمله ترکیبات مهم در مسیر ترارسانی علامتی گیاهان هستند که در فرایندهای مختلف رشدی و فیزیولوژیکی ازجمله جلوگیری از رشد ریشه، القای پاسخ‌های دفاعی، گسترش گل، پاسخ به زخم و پیری درگیر هستند و در تحریک تولید متابولیت‌های ثانویه به‌طور گسترده استفاده می‌شوند (Zare et al., 2014; Taherkhani et al., 2019).
شکل 1- مسیر پیشنهادی برای بیوسنتز سزکوئی‌ترپن والرانون (3) و والرنیکاسید (4) در گیاه سنبل‌الطیب؛ مسیری چندمرحله‌ای که در اولین مرحله، فارنسیل‌دی‌فسفات (FPP) توسط سزکوئی‌ترپن‌سنتازها (TPS) به یکی از دو مادۀ جرماسرین C (1) و والرین10-1 داین (2) تبدیل می‌شود و سپس با هیدروکسیله‌شدن کاهشی جرماسرین C، والرانون ساخته می‌شود و با اکسیداسیون پی‌در‌پی والرین 1-10 داین، والرنیکاسید به وجود می‌آید (Yeo et al., 2012).
نانوبیوتکنولوژی، مجموعۀ جدیدی از ابزارهای دست‌کاری ژن با استفاده از نانوذرات، نانوالیاف و نانوکپسول را ارائه می‌دهد. نانوذرات به‌علت آثار خاص و ویژگی منحصر‌به‌فردی که دارند، در زیست‌شناسی گیاهی و کشاورزی برای تولید متابولیت‌های ثانویۀ گیاهی، تولید مولکول‌های مختلف لازم برای مقاومت در برابر بیماری‌های گیاهی، استفادۀ مؤثرتر از مواد مغذی و افزایش رشد گیاه کاربرد دارد (Nair et al., 2010). پژوهش‌هایی در زمینۀ تأثیر نانوذرات به‌عنوان محرک تولید متابولیت‌های ثانویه و نیز بیان ژن‌های درگیر در مسیر بیوسنتز برخی متابولیت‌های ثانویه انجام شده‌اند. نانواکسیدآهن به‌علت حضور فعال در فرایندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی سلول‌ها، بیشترین کاربرد را دارد (Aminizadeh et al., 2016; Hussain et al., 2017). در پژوهشی، اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدآهن بر تولید سولفورافان (SFN) در جوانه‌های هفت‌روزۀ گیاه Lepidium draba در فواصل زمانی مختلف (8 و 16 ساعت) بررسی شد و نتایج نشان دادند پس‌از 8 ساعت، محتوای SFN در تمام غلظت‌های نانواکسیدآهن افزایش می‌یابد (Aminizadeh et al., 2016)؛ همچنین Ahmadi Moghadam و همکاران (2013) گزارش کردند سنتز و تجمع دوپامین در ریشه‌های مویین Portulaca oleracea تیمارشده با متیلجاسمونات در مقایسه با ریشه‌های تیمار‌نشده حدود 3/4 برابر بیشتر است. در پژوهشی دیگر، تأثیر محرک‌های عصارۀ قارچی Fusarium graminearum، متیلجاسمونات و سالیسیلیک اسید بر تولید والرنیکاسید در ریشه‌های مویین Valeriana officinalis طی مدت 3 و 7 روز بررسی و گزارش شد تیمارهای عصارۀ قارچی و متیلجاسمونات بیشترین مقدار والرنیکاسید را طی 7 روز پس‌از اِعمال تیمار تولید می‌کنند (Dini Torkamani et al., 2014).
کاربرد پیش‌سازهای متابولیت‌های ثانویه ازجمله آمینواسیدها در محیط‌‌های کشت سلولی و ریشه‌های مویین در رشد و نمو سلول‌ها و تحریک مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه مؤثر است. افزایش آمینواسید ال-تیروزین به محیط‌کشت سوسپانسیون سلولی Papaver bracteatum سبب افزایش تولید متابولیت تبائین در این سلول‌ها می‌شود (Farjaminezhad et al. 2016)؛ علاوهبراین، اضافه‌کردن لوسین به ترکیب محیط‌کشت سبب افزایش مونوترپن‌های فرّار آلفا و بتا پینین در کشت‌های سلولی Perilla frutescens می‌شود (Mulder-Krieger et al., 1988)؛ بنابراین، پژوهش حاضر با هدف بررسی تأثیر نانواکسیدهای آهن و نیکل و متیلجاسمونات به‌تنهایی و در ترکیب با آمینواسید L-لوسین بر ویژگی‌های بیوشیمیایی و بیان برخی از ژن‌های درگیر در بیوسنتز سزکوئی‌ترپن‌ها در ریشه‌های مویین گیاه دارویی سنبل‌الطیب انجام شد.
مواد و روش‌ها.
مواد گیاهی و تهیۀ ریزنمونه‌ها: در پژوهش حاضر، بذرهای گونۀ Valeriana officinalis L. از شرکت پاکان‌بذر اصفهان تهیه و استفاده شدند. بهمنظور ضدعفونی‌کردن سطحی، بذرهای سنبل‌الطیب پس‌از شستشو با آب مقطر، ابتدا به‌مدت 30 ثانیه در اتانول 70 درصد غوطه‌ور شدند و پس از شستشو با آب مقطر استریل، به‌مدت 15 دقیقه با هیپوکلریت‌سدیم 2 درصد تیمار شدند. بذرهای ضدعفونی‌شده سه بار و هر بار به‌مدت 5 دقیقه با آب مقطر استریل آب‌کشی شدند و آب اضافی با کاغذ صافی استریل حذف شد. بذرهای ضدعفونی‌شده در ظرف‌های شیشه‌ای حاوی محیط‌کشت MS جامد کشت و در اتاقک رشد با شرایط دمایی 2±25 درجۀ سانتی‌گراد و دورۀ نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی با نور فلورسنت و شدت نور 1500 تا 2000 لوکس نگهداری شدند. پس‌از جوانه‌زنی بذرها و رشد گیاهچه‌ها (هفته سوم تا چهارم کشت)، ریز نمونه‌های برگ و دمبرگ سنبل‌الطیب با استفاده از اسکالپل تیز و استریل و زیر هود لامینار در قطعه‌هایی به اندازۀ 1 تا 2 سانتی‌متر بریده و بهمنظور تلقیح با Agrobacterium rhizogenesis استفاده شدند.
سویۀ باکتری و تلقیح ریزنمونه‌ها: Agrobacterium rhizogenesis سویۀ A4 (تهیه‌شده از آزمایشگاه بیوتکنولوژی، دانشکدۀ کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه محقق اردبیلی) بهمنظور القای ریشه‌های مویین در گیاه دارویی سنبل‌الطیب استفاده شد. بهمنظور کشت باکتری از محیط‌کشت جامد MYA (Sahu et al., 2013) همراه با 50 میلیگرمبرلیتر آنتی‌بیوتیک ریفامپسین استفاده شد. یک کلنی به 10 میلی‌لیتر محیط‌کشت MYA مایع حاوی 50 میلیگرمبرلیتر ریفامپسین منتقل و در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد روی شیکر‌انکوباتور با سرعت 120 دوردردقیقه در تاریکی تکثیر شد؛ سپس حدود 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتری به 50 میلی‌لیتر محیط‌کشت MYA مایع تازۀ حاوی 50 میلیگرمبرلیتر ریفامپیسین اضافه و تا رسیدن به OD600 برابر با 6/0 تا 8/0 در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد رشد داده شد. سوسپانسیون باکتری یادشده برای تلقیح ریزنمونه‌های گیاهی استفاده شد. ریزنمونه‌های تهیه‌شده از گیاه به‌مدت 10 دقیقه در سوسپانسیون باکتری غوطه‌ور شدند و پس‌از حذف باکتری اضافی با کاغذ صافی استریل، روی محیط‌کشت MS بدون هورمون و آنتی‌بیوتیک به‌مدت 48 ساعت و در دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد در تاریکی هم‌کشت شدند. پس‌از سپری‌شدن مدت زمان هم‌کشتی، ریزنمونه‌ها به محیط‌کشت MS جامد بدون هورمون و حاوی 500 میلیگرمبرلیتر آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند. ریشه‌های مویینی که به اندازۀ 2 سانتی‌متر یا بیشتر رشدکرده بودند، از ریزنمونه‌ها جدا و در محیط‌کشت MS مایع بدون هورمون و حاوی 500 میلیگرمبرلیتر آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم کشت شدند. کشت‌ها روی شیکر با سرعت 120 دوردردقیقه و شرایط دمایی 25 درجۀ سانتی‌گراد در تاریکی نگهداری شدند. رده‌ای از ریشه‌های مویین که دارای بیشترین و سریع‌ترین رشد بودند، برای مطالعه‌های بعدی انتخاب و در محیط‌کشت MS مایع (با همان شرایط یادشده) تکثیر شدند.
تجزیهوتحلیل مولکولی ریشه‌ها با استفاده از روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): استخراج DNA ژنومی ریشه‌های تراریخت احتمالی با استفاده از روش Saghai-maroof و همکاران (1984) انجام شد. بهمنظور اثبات مولکولی ماهیت تراریختی ریشه‌های مویین از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگر اختصاصی ژن rol B (آغازگر رفت با توالی5’-gctcttgcagtgctagattt-3’ و آغازگر برگشت با توالی5’-gaaggtgcaagctacctctc-3’) استفاده شد. محصولات PCR روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز و سپس با دستگاه ژل‌داک مشاهده و بررسی شدند.
اِعمال تیمارهای محرک (Elicitor) بر کشت ریشه‌های مویین: پس‌از تکثیر ریشه‌های مویین، تیمارهای 100 و 200 میکرومولار متیل جاسمونات (Sigma-Aldrich; Product Number: W341002) به‌تنهایی و به‌شکل ترکیب با 1 میلی‌مولار L-لوسین و 30، 60 و90 میلیگرمبرلیتر نانواکسید آهن (20-40 nm) و نانواکسید نیکل (10-20 nm) به‌تنهایی و به‌شکل ترکیبی با L-لوسین و 1 میلی‌مولار L-لوسین در روز پانزدهم پس‌از واکشتی بر کشت‌های ریشه‌مویین اِعمال شدند. نانواکسیدهای آهن و نیکل به‌شکل پودر از شرکت پیشگامان نانو‌مواد ایرانیان تهیه شدند. سوسپانسیون (مخلوط) یکنواخت این نانواکسید‌ها در آب دیونیزه و با استفاده از امواج فراصوت (دستگاه پروب التراسوند، مدل H UP100، شرکت Hielscher، سوئیس) تهیه و پس‌از اتوکلاو استفاده شد. غلظت‌های محرک‌ها بر اساس پژوهش‌های Soltani (2015)، Ghorbanpour و همکاران (2014) و Aminizadeh و همکاران (2016) انتخاب شدند. در دوره‌های زمانی 24 و 72 ساعت پس‌از اِعمال تیمار، نمونه‌برداری از ریشه‌ها انجام شد. در پژوهش حاضر، فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز، میزان پروتئین کل، میزان پرولین، میزان فلاونوئید و همچنین میزان بیان ژن‌های کد‌کنندۀ برخی از آنزیم‌های مسیر بیوسنتز سزکوئی‌ترپن‌ها (ژن‌های VoTPS1 و VoTPS6) بررسی شد.
.ارزیابی ویژگی‌های بیوشیمیایی در ریشه‌های مویین تحت‌تأثیر تیمارهای محرک: اندازه‌گیری میزان پروتئین با استفاده از روش Bradford (1976) انجام شد. بهمنظور تهیۀ عصارۀ پروتئینی، نمونۀ ریشۀ مویین پس‌از پودر‌شدن در ازت مایع، در 3 میلی‌لیتر بافر فسفات‌پتاسیم 100 میلی‌مولار به‌شکل هموژن درآمد؛ سپس نمونه‌ها به‌مدت30 دقیقه با سرعت 1000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند؛ محلول رویی عصاره برای سنجش غلظت پروتئین کل و فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و گایاکول‌پراکسیداز استفاده شد. اندازه‌گیری میزان پروتئین با استفاده از روش Bradford (1976) انجام شد؛ به‌این‌ترتیب که میزان جذب نوری عصارۀ پروتئینی در طول موج 595 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر BIORAD, SmartspecTM plus)، ساخت کشور آمریکا( اندازه‌گیری شد. محلول واکنش شامل 50 میکرولیتر عصارۀ پروتئینی، 50 میکرولیتر معرف برادفورد و 900 میکرولیتر بافر فسفات بود. از تمام مواد یادشده به‌غیر‌از عصارۀ پروتئینی گیاه برای بلانک دستگاه اسپکتروفتومتر و از غلظت‌های مختلف BSA برای کمّی‌سازی غلظت پروتئین استفاده شد.
سنجش میزان فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و گایاکول‌پراکسیداز با استفاده از روش Chen و همکاران (2015) انجام شد. فعالیت آنزیم کاتالاز از طریق ارزیابی کاهش مقدار پراکسیدهیدروژن 30 درصد در حضور آنزیم اندازه‌گیری شد. محلول واکنش شامل بافر فسفات‌سدیم 20 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 7 و 20 میکرولیتر پراکسیدهیدروژن (H2O2) 5 میلی‌مولار بود که 60 میکرولیتر عصارۀ پروتئینی در حمام یخ به آن اضافه و تغییرات جذب نوری در طول موج 240 نانومتر به‌مدت 2 دقیقه خوانده شد. میزان فعالیت کاتالاز بر حسب واحد در میلی‌گرم پروتئین بیان شد.
در اندازه‌گیری فعالیت گایاکول‌پراکسیداز، مخلوط واکنش شامل 81/0 میلی‌لیتر بافر پتاسیم 100 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7)، 20 میکرولیتر عصارۀ پروتئینی، 90 میکرولیتر گلایکول (10 میلی‌مولار) و 90 میکرولیتر آب‌اکسیژنه (5 میلی‌مولار) بود. تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر به‌مدت 1 دقیقه با استفاده از اسپکتروفتومتر ثبت شدند. مخلوط واکنش در کووت ریخته وتغییرات جذب در طول موج 425 نانومتر به‌مدت 60 ثانیه در 25 درجۀ سانتی‌گراد با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد.
سنجش میزان پرولین با استفاده از روش Bates و همکاران (1973) انجام شد؛ به این منظور، مقدار 1/0 گرم از ریشه‌های مویین در ازت مایع پودر و سپس 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک‌اسید 3/3 درصد به آن اضافه و به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ و محلول رویی به میکروتیوب جدا‌گانه‌ای منتقل شد؛ سپس مقدار 1 میلی‌لیتر از معرف نین‌هیدرین و 1 میلی‌لیتر استیک‌اسید خالص به آن اضافه و مخلوط حاصل به‌مدت یک ساعت در دمای 90 درجۀ سانتی‌گراد در حمام آب نگهداری شد؛ سپس 2 میلی‌لیتر تولوئن به آن اضافه و به‌مدت 2 دقیقه ورتکس شد و درنهایت، جذب نوری محلول رویی با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر اندازه‌گیری شد. غلظت پرولین آزاد نمونه با استفاده از منحنی استاندارد پرولین خالص تعیین شد.
میزان فلاونوئید کل با استفاده از روش Cheng و همکاران (2002) اندازه‌گیری شد؛ به این منظور، 1/0 گرم از ریشه‌های مویین با 5 میلی‌لیتر متانول اسیدی (متانول خالص و کلریدریک‌اسید خالص به نسبت حجمی 99:1) کاملاً ساییده و عصارۀ به‌دست‌آمده به‌مدت 72 ساعت در تاریکی و دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد. فلاونوئید کل نمونه‌ها براساس منحنی استاندارد کوئرسیتین (Quercetin) و با استفاده از روش Cheng و همکاران (2002) سنجیده شد؛ به‌این‌ترتیب که 250 میکرولیتر محلول کلرید‌آلومینیوم 10 درصد و 250 میکرولیتر پتاسیم‌استات 1 مولار به 1 میلی‌لیتر عصارۀ گیاهی اضافه و سپس جذب نمونه‌ها با دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 498 نانومتر خوانده شد. منحنی استاندارد کوئرستین و معادلۀ رگرسیون حاصل از آن برای کمی‌سازی مقدار فلاونوئید نمونه‌ها استفاده شد.
تحلیل آماری داده‌های بیوشیمیایی: آزمایش حاضر به‌شکل فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و در 3 تکرار زیستی انجام شد. محاسبه‌های آماری و تجزیه واریانس (ANOVA) با نرم‌افزار SPSS ver. 23 و مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شدند. نمودارها با نرم‌افزار Microsoft Offic Exel 2016 رسم شدند.
بررسی بیان ژن.
استخراج RNA و سنتز cDNA: استخراج RNA از تیمارهای شاهد، نانواکسیدآهن (60 میلیگرمبرلیتر)، متیلجاسمونات (100 میکرومولار) به اضافۀ آمینواسید L-لوسین در زمان‌های 24 و 72 ساعت پس از اِعمال تیمار (Kabita et al., 2020) و از تیمارهای نانواکسید نیکل (60 میلیگرمبرلیتر) و نانواکسید نیکل (60 میلیگرمبرلیتر) به اضافۀ آمینواسید L-لوسین 24 ساعت پس‌از اِعمال تیمار با استفاده از محلول RNXplus (شرکت سیناکلون، تهران) و طبق دستورعمل شرکت سازنده انجام شد؛ به‌این‌ترتیب که به‌ازای 1/0گرم از ریشه‌های مویین پودر‌شده در ازت مایع، 1 میلی‌لیتر از محلول RNXplus اضافه شد و پس‌از طی کامل مراحل استخراج و شستشو با اتانول 75 درصد تهیه‌شده با آب تیمارشده با DEPC، رسوب RNA در 40 میکرولیتر آب تیمارشده با DEPC حل و در دمای منفی 80 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد. ژل آگارز 1 درصد برای تعیین کیفیت RNAهای استخراج‌شده ازنظر وجود باندهای 28S و 18S استفاده شد. بهمنظور تعیین غلظت یا کمیت‌سنجی نمونه‌های RNA و همچنین بررسی احتمال وجود آلودگی پروتئینی و مواد فنلی در آن، از میزان جذب نمونه‌ها در طول موج‌های260،230 و280 نانومتر با دستگاه NanoDrop استفاده شد. بهمنظور حذف DNA ژنومی از آنزیم DNase I (شرکت سیناکلون، تهران) طبق دستورعمل شرکت سازنده استفاده شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA (شرکت Vivantis، کرۀ جنوبی) طبق دستورعمل شرکت سازنده انجام شد. محلول واکنش با حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل RNA (5/3 میکروگرم)، dNTP، الیگو dT و آب بدون نوکلئاز بود. شرایط دمایی، زمانی و چرخه‌ای واکنش نسخه‌برداری معکوس شامل دو مرحله بود که اولین مرحله در دمای 42 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 60 دقیقه برای سنتز cDNA از روی RNA و مرحلۀ دوم در دمای 85 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه برای توقف واکنش سنتز انجام شد..
.طراحی آغازگرها و واکنش Real-time PCR: توالی ژن‌های VoTPS1 و VoTPS6 به‌ترتیب با شماره دسترسی JX 494699.1 و JX 494704.1 از سایت NCBI گرفته شد و سپس طراحی با استفاده از نرم‌افزازهای تحت‌وب Primer3web (www.embnet.sk/cgi-bin/primer3) و Primer blast (www.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) و با رعایت تمام اصول اساسی در طراحی آغازگر ازجمله اینکه پنج باز ناحیۀ 5 انتهایی نباید حاوی بیش از دو گوانین و دو سیتوزین باشند، درصد گوانین و سیتوزین باید حدود 40 تا 60 درصد باشد و انتهای 5 آغازگرها نباید حاوی توالی تکراری معکوس باشد (Gopesh and George, 2012; Hashemi and Naghavi, 2016)، انجام شد؛ علاوهبراین، اندازۀ قطعۀ تکثیری بین 100 تا 200 جفت باز انتخاب شد؛ در نهایت، ویژگی‌های آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار Oligo analyser بررسی شدند. شرکت BIONEER (کرۀ جنوبی) سنتز آغازگر را انجام داد (جدول 1). بهمنظور بهینه‌سازی تکثیر و دمای اتصال آغازگرها، PCR در شیب دمایی 5/55 تا 63 درجۀ سانتی‌گراد (باتوجهبه دمای ذوب آغازگرها) انجام و از دستگاه ترموسایکلر (PCR) (مدل T100، شرکت BIO RAD، آمریکا) به این منظور استفاده شد؛ درنتیجه، دمای اتصال برای انجام Real-time PCR برای VoTPS6 و 18S rRNA برابر 61 درجۀ سانتی‌گراد و برای VoTPS1 برابر 60 درجۀ سانتی‌گراد انتخاب شد. ژن مرجع باتوجهبه پژوهش Gopesh و George (2012)، 18S rRNAانتخاب شد که بیان ثابت این ژن را در گیاه نخود فرنگی (Pisum sativum L.) در معرض تنش‌های زیستی و غیرزیستی گزارش کرده‌اند. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی برای هر دو ژن هدف و ژن خانه‌دار 18s rRNA در3 تکرار زیستی و 3 تکرار تکنیکی با استفاده از دستگاه Real-time PCR (مدل Light cycler 96، شرکت ROCHE، آلمان) (مطابق جدول 2) و در حجم نهایی 20 میکرولیتر در میکروپلیت‌های 96 چاهکی و در 40 چرخه با استفاده از معرف ISYBR green I (شرکت سیناکلون، تهران) انجام شد. بهمنظور بررسی نمودار منحنی ذوب، میزان جذب فلورسنس آمپلیکون‌ها در دامنۀ دمایی 66 تا 97 درجۀ سانتی‌گراد بررسی شد. میانگین چرخه‌های آستانه (CT) برای هر ژن محاسبه شد و نرمال‌سازی داده‌های CT مربوط به نمونه‌های مختلف و نمونۀ شاهد با استفاده از CT ژن مرجع (18S rRNA) انجام شد (CTΔ)؛ سپس CTΔ هر نمونه با CTΔ نمونۀ شاهد کالیبره و تغییر بیان ژن به‌شکل CTΔΔ گزارش و بیان نسبی ژن‌ها از طریق روش فافل (Pfaffl, 2001) محاسبه شد؛ درنهایت، تجزیهوتحلیل داده‌های بیان نسبی ژن با نرم‌افزار SPSS ver. 23 در قالب طرح کاملاً تصادفی و باتوجهبه اینکه در تعداد کمی از تیمارها، یکی از تکرارهای زیستی دردسترس نبود، به‌طور نامتعادل انجام شد.
جدول 1- آغازگرهای استفاده‌شده برای ارزیابی بیان ژن‌های VoTPS1 و VoTPS6 در ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب
|
ژن |
)5´→3´ (´ توالی 5 به´3 |
طول محصول |
دمای ذوب (درجۀ سانتی‌گراد) |
دمای اتصال (درجۀ سانتی‌گراد) |
|
VoTPS1 |
|
|
|
|
|
آغازگر رفت |
GTAGGCATGGGAGTAACTACAG |
119 |
68/57 |
60 |
|
آغازگر برگشت |
TCGTGTCCAACCTTATCATCC |
|
46/57 |
60 |
|
VoTPS6 |
|
|
|
|
|
آغازگر رفت |
CGTCAAGGTGGTGGAAGAGT |
138 |
61/59 |
61 |
|
آغازگر برگشت |
CCTTTGTGTTGACTCTCCTGCT |
|
49/60 |
61 |
جدول 2- اجزای تشکیل‌دهندۀ مخلوط واکنش Real-time PCR
|
محلول پایه واکنش |
حجم در یک واکنش |
|
مخلوط پایه SYBR GREEN |
10 µl |
|
آغازگر رفت |
5/0 µl |
|
آغازگر برگشت |
5/0 µl |
|
آب بدون نوکلئاز |
8 µl |
|
cDNA |
1 µl |
|
حجم نهایی واکنش |
20 µl |
نتایج.
القا و تأیید مولکولی ریشه‌های مویین: پس‌از گذشت دو تا سه هفته از تلقیح ریزنمونه‌های برگ و دمبرگ گیاه سنبل‌الطیب با Agrobacterium rhizogenesis سویۀ A4، ریشه‌های مویین ظاهر شدند. باتوجهبه قابلیت رشد زیاد ریشه‌های مویین حاصل از ریزنمونۀ برگی، این ریزنمونه برای ادامۀ کار استفاده شد. نمونه‌ای از ریشه‌های مویین تولید‌شده و رشدکرده در محیط‌کشت‌های MS جامد و مایع در شکل 2 دیده می‌شود.
شکل 2- القا و کشت ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب؛ الف. گیاهچه‌های درون‌شیشه‌ای استفاده‌شده برای تهیۀ ریزنمونه، ب و ج. به‌ترتیب ریشه‌های مویین القاشده در ریزنمونه‌های برگ و ساقه، د. تکثیر ریشۀ مویین در محیط مایع بدون تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی
شکل 3- بررسی تراریختی ریشه‌های مویین گیاه سنبل‌الطیب از طریق PCR با آغازگر اختصاصی ژن rol B؛ ستون 1: نشانگر Ladder 1 kb DNA، ستون 5-2 و 7. ریشه‌های مویین تراریخته، ستون 6. ریشه‌های غیرتراریخت، ستون 8. شاهد منفی
بهمنظور تأیید تراریختی ریشه‌های مویین از روش PCR با استفاده از آغازگر اختصاصی ژن rol B استفاده شد. ژن rol B از ژن‌های موجود در ناحیۀ T-DNA پلاسمید Ri Agrobacterium rhizogenesisاست (Christey and Braun, 2005). همان‌طورکه در شکل 3 ملاحظه می‌شود، تکثیر DNA مربوط به ژن rol B (تکثیر قطعه‌ای به اندازۀ 320 جفت باز از این ژن) در DNA ریشه‌های مویین بیانکنندۀ تلفیق موفق T-DNA در ژنوم و تراریخت‌بودن این ریشه‌هاست.
ارزیابی بیوشیمیایی ریشه‌های مویین تحت‌تأثیر تیمار محرک
فعالیت آنزیم کاتالاز: فعالیت آنزیم کاتالاز به‌طور معناداری تحت‌تأثیر تیمار محرک و اثر متقابل تیمار محرک و دوره‌های زمانی پس‌از اِعمال تیمار قرار گرفت؛ اما تأثیر دوره‌های زمانی پس‌از اِعمال تیمار بر این صفت ازنظر آماری معنادار نبود. مقایسۀ میانگین تیمارها نشان داد بیشترین فعالیت این آنزیم در تیمار ترکیبی 100 میکرومولار متیلجاسمونات همراه با 1 میلی‌مولار L-لوسین و تیمار غلظت 30 میلیگرمبرلیتر نانواکسید نیکل همراه با 1 میلی‌مولار L-لوسین به دست می‌آید که تفاوت معناداری نسبت به شاهد و سایر تیمارها دارد (شکل 4)؛ اما اختلاف معناداری بین سایر تیمارها ازنظر فعالیت آنزیم کاتالاز مشاهده نشد.
شکل 4- تأثیر تیمار غلظت‌های مختلف متیلجاسمونات، آمینواسید L-لوسین و نانواکسیدآهن و نیکل بر فعالیت آنزیم کاتالاز در کشت ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب؛ :Fe2O3 نانواکسید آهن، NiO2: نانواکسید نیکل، :MjA متیلجاسمونات، Leu: آمینواسید L-لوسین. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانکنندۀ عدم اختلاف معنادار با استفاده ازآزمون چنددامنه‌ای دانکن (DMRT) در سطح احتمال 5 درصد است.
فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز: فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز به‌طور معناداری تحت‌تأثیر تیمار محرک، اثر متقابل تیمار محرک و دوره‌های زمانی پس‌از اِعمال تیمار قرار گرفت. مقایسۀ میانگین ترکیب‌های تیماری نشان داد آنزیم پراکسیداز با اِعمال تیمار 1 میلی‌مولار L-لوسین همراه با 30 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدنیکل بیشترین فعالیت را دارد و این در حالیست که کمترین فعالیت این آنزیم در غلظت 60 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدنیکل مشاهده می‌شود. در بین غلظت‌های نانواکسیدآهن، غلظت 30 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدآهن بیشترین فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز را داشت؛ همچنین غلظت 200 میکرومولار متیلجاسمونات همراه با 1 میلی‌مولار L-لوسین در زمان 72 ساعت، بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز را نشان داد (شکل 5).
شکل 5- تأثیر تیمار غلظت‌های مختلف متیلجاسمونات، آمینواسید L-لوسین و نانواکسیدآهن و نیکل بر فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز در کشت ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب؛ :Fe2O3 نانواکسیدآهن، NiO2: نانواکسید نیکل، :MjA متیلجاسمونات، Leu: آمینواسید L-لوسین. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانکنندۀ عدم اختلاف معنادار با استفاده ازآزمون چنددامنه‌ای دانکن (DMRT) در سطح احتمال 5 درصد است.
میزان پروتئین کل: محتوای پروتئین کل ریشه‌های مویین به‌طور معناداری تحت‌تأثیر تیمارهای محرک و اثر متقابل تیمار محرک و دوره‌های زمانی پس‌از اِعمال تیمار قرار گرفت. تیمار60 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدنیکل و تیمار60 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدآهن با 1 میلی‌مولار L-لوسین بیشترین میزان پروتئین کل را در مقایسه با شاهد نشان داد؛ درحالیکه کمترین میزان پروتئین کل در تیمار 90 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدنیکل مشاهده شد (شکل 6).
میزان پرولین: میزان پرولین ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب به‌طور معناداری تحت‌تأثیر تیمارهای محرک و اثر متقابل تیمار محرک و زمان پس‌از اِعمال محرک قرار گرفت. ترکیب تیمار 100 میکرومولار متیلجاسمونات و 90 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدآهن با 1 میلی‌مولار L-لوسین بیشترین غلظت پرولین و تیمار شاهد کمترین غلظت پرولین را داشت (شکل 7).
شکل 6- تأثیر تیمارهای نانواکسیدآهن و نیکل و متیلجاسمونات و L-لوسین بر میزان پروتئین کل در کشت‌های ریشه‌مویین سنبل‌الطیب؛ :Fe2O3 نانواکسید آهن، NiO2: نانواکسید نیکل، :MjA متیل جاسمونات، Leu: آمینواسید L-لوسین. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانکنندۀ عدم اختلاف معنادار با استفاده ازآزمون چنددامنه‌ای دانکن (DMRT) در سطح احتمال 5 درصد است.
شکل 7- تأثیر تیمارهای نانوذرات آهن و نیکل و متیلجاسمونات و L-لوسین بر میزان پرولین در کشت ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب؛ :Fe2O3 نانواکسیدآهن، NiO2: نانواکسیدنیکل، :MjA متیلجاسمونات، L-Lucine: آمینواسید L-لوسین. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانکنندۀ عدم اختلاف معنادار با استفاده ازآزمون چنددامنه‌ای دانکن (DMRT) در سطح احتمال 5 درصد است.
میزان فلاونوئیدکل: مقدار فلاونوئیدها در ریشه‌های مویین به‌طور معناداری تحت‌تأثیر تیمارهای محرک و اثر متقابل تیمار محرک و زمان پس‌از اِعمال تیمار قرار گرفت؛ بهطوریکه بیشترین و کمترین میزان فلاونوئید کل به‌ترتیب با اِعمال غلظت‌های 30 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدآهن و 60 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدنیکل همراه با 1 میلی‌مولار L-لوسین به‌دست آمد (شکل 8).
شکل 8- تأثیر تیمارهای نانوذرات آهن و نیکل و متیلجاسمونات و L-لوسین بر میزان فلاونوئید در کشت ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب؛ :Fe2O3 نانواکسیدآهن، NiO2: نانواکسیدنیکل، :MjA متیلجاسمونات، L-Lucine: آمینواسید L-لوسین. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانکنندۀ عدم اختلاف معنادار با استفاده ازآزمون چنددامنه‌ای دانکن (DMRT) در سطح احتمال 5 درصد است.
ارزیابی بیان ژن‌های مسیر بیوسنتز سزکوئی‌ترپنوئیدها.
.استخراج RNA و تعیین کیفیت و کمیت آن: استخراج RNA و ارزیابی بیان ژن در تیمارهای شاهد، نانواکسیدآهن (60 میلیگرمبرلیتر)، نانواکسیدنیکل (60 میلیگرمبرلیتر)، نانواکسیدنیکل (60 میلیگرمبرلیتر) به اضافۀ L-لوسین و متیلجاسمونات (100 میکرومولار) به اضافۀ آمینواسید L-لوسین ارزیابی انجام شد. ارزیابی کیفی و کمی RNA استخراج‌شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد و نانودراپ نشان داد RNAهای استخراج‌شده کیفیت خوبی دارند؛ بهطوریکه RNAهای بدون خردشدگی، بدون آلودگی و باندهای28S و 18S مشاهده شدند. همان‌طور که شکل 9 نشان می‌دهد وجود باندهای مربوط به rRNAهای 28S و 18S، وجود یکدستی در RNAهای استخراج‌شده را به‌وضوح نشان می‌دهند. نوار (باند) بالاتر از 28s rRNA احتمالاً بیانکنندۀ وجود آلودگی DNA در RNA استخراج‌شده است؛ بنابراین، پیش از سنتز cDNA از تیمار آنزیم DNase I استفاده شد. بر اساس نتایج نانودراپ نیز جذب نوری در 230 و 280 نانومتر، حداقل و در طول موج 260 نانومتر، حداکثر بود که نشان‌دهندۀ خلوص مناسب RNA استخراج‌شده است (شکل 10)؛ علاوهبراین، نسبت 280/260 و 230/260 در نمونه‌های RNA استخراج‌شده در محدودۀ 8/1 تا 2 قرار داشت که وجودنداشتن آلودگی پروتئینی یا فنلی در نمونه‌های RNA را نشان می‌دهد.
شکل 9- ارزیابی کیفیت استخراج RNA به‌ویژه ازنظر وجودنداشتن خردشدگی در RNA از طریق الکتروفورز ژل آگارز 1درصد
شکل 10- منحنی جذب نوری دو نمونه از RNA استخراج‌شده در طول موج‌های مختلف
واکنش PCR در زمان واقعی: باتوجهبه نمودارهای تکثیر به‌دست‌آمده از واکنش PCR در زمان واقعی می‌توان نتیجه گرفت آغازگرها در دمای اتصال تعیین‌شده به‌شکل مناسبی به قطعه‌های هدف اتصال یافته‌اند و موجب تکثیر آنها شده‌اند. تکثیر هر قطعۀ الگو طی چهار فاز خط پایه، نمایی، خطی و کفه رخ داده است.
بهمنظور اطمینان‌یافتن از وجودنداشتن محصولات غیراختصاصی طی واکنش، یک مرحله افزایش تدریجی دما در انتهای واکنش بهمنظور ترسیم منحنی‌های نقطۀ ذوب اجرا شد. تحلیل منحنی ذوب (Melting Curve Analysis)، تکثیر اختصاصی هریک از ژن‌ها با نقطۀ ذوب مشخص را نشان داد. باتوجهبه وجود یک پیک در تمام محصولات PCR ژن‌های VoTPS1، VoTPS6 و 18S rRNA می‌توان گفت تکثیر تمام قطعه‌ها به‌طور اختصاصی و بدون محصولات غیراختصاصی مانند آغازگر دایمر انجام شده است.
تأثیر تیمارهای محرک بر بیان نسبی ژن‌های VoTPS1 و VoTPS6: اختلاف معناداری بین محرک‌های مختلف ازنظر میزان بیان نسبی ژن‌های VoTPS1 و VoTPS6 وجود داشت. باتوجهبه شکل 11، تیمار60 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدآهن در زمان 24 ساعت پس‌از اِعمال تیمار و تیمار متیلجاسمونات با غلظت 100 میکرومولار در زمان 72 ساعت پس‌از اعمال تیمار بیشترین میزان افزایش بیان نسبی ژن VoTPS1 را نسبت به شاهد نشان دادند که به‌طور معناداری بیشتر از سایر تیمارها بود؛ کمترین میزان بیان نسبی این ژن در تیمار 100 میکرومولار متیل‌جاسونات به اضافۀ 1 میلی‌مولار L-لوسین در زمان 24 ساعت پس‌از اعمال تیمار مشاهده شد.
شکل 11- تأثیر تیمارهای محرک بر بیان نسبی ژن VoTPS1 در کشت‌های ریشه‌مویین سنبل‌الطیب؛ Fe2O3. نانواکسید آهن، NiO2. نانواکسیدنیکل، MjA. متیلجاسمونات، L-Lucine. آمینواسید L-لوسین. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانکنندۀ عدم اختلاف معنادار با استفاده ازآزمون چنددامنه‌ای دانکن (DMRT) در سطح احتمال 5 درصد است.
شکل 12- تأثیر تیمارهای محرک بر بیان نسبی ژن VoTPS6 در کشت‌های ریشه‌مویین سنبل‌الطیب؛ Fe2O3. نانواکسیدآهن، NiO2. نانواکسیدنیکل، MjA. متیلجاسمونات، L-Lucine. آمینواسید L-لوسین. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± انحراف معیار است. حروف یکسان بیانکنندۀ عدم اختلاف معنادار با استفاده ازآزمون چنددامنه‌ای دانکن (DMRT) در سطح احتمال 5 درصد است.
باتوجهبه شکل 12، بیشترین میزان بیان نسبی ژن VoTPS6 در ریشه‌های مویین تیمارشده با غلظت 100 میکرومولار متیلجاسمونات به همراه 1 میلی‌مولار L-لوسین در زمان 72 ساعت پس‌از اعمال تیمار و تیمار نانواکسیدآهن در زمان 24 ساعت پس‌از تیمار مشاهده شد؛ بهطوریکه میزان بیان نسبی ژن VoTPS6، 94/10 تا 12 برابر نسبت به شاهد افزایش داشت. کمترین میزان بیان نسبی ژن نسبت به شاهد در تیمار 100 میکرومولار متیلجاسمونات به همراه 1 میلی‌مولار L-لوسین در 24 ساعت پس‌از اعمال تیمار و تیمار نانواکسیدنیکل مشاهده شد. در بین محرک‌های نانواکسید آهن و نیکل، نانواکسیدآهن در زمان 24 ساعت پس‌از اعمال تیمار و نانواکسیدنیکل به همراه L-لوسین در زمان 24 ساعت پس‌از اعمال تیمار به‌ترتیب 38/10 و 16/2 برابر افزایش بیان نسبی ژن را نسبت به شاهد نشان دادند.
بحث.
طی سال‌های اخیر، کشت ریشه‌های مویین برای مطالعۀ مسیر بیوسنتز متابولیت‌ها کمک درخور توجهی به بهبود و تقویت پژوهش در زمینۀ بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه کرده است. باکتری Agrobacterium rhizogenesisبا انتقال قطعۀ T-DNA حاوی ژن‌های القا‌کنندۀ ریشه (Rol A، rol B، rol C و rol D) به سلول‌های گیاهی، آنها را تراریخت می‌کند؛ این ژن‌ها تغییرات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی چشمگیری را در سلول‌ها ایجاد می‌کنند، فرایندهای رشد و نموی سلول را تغییر می‌دهند و به القای ریشه‌زایی مویین منجر می‌شوند (Christy and Braun, 2005). در مطالعۀ حاضر بر اساس پژوهش‌های قبلی (Soltani, 2015)، تراریختی ریزنمونه‌های برگ و دمبرگ گیاه سنبل‌الطیب و ایجاد ریشه‌های مویین با Agrobacterium rhizogenesisسویۀ A4 انجام شد. بررسی ماهیت تراریختگی آنها به روش PCR انجام شد و تکثیر قطعۀ مربوط به ژن rol B بیانکنندۀ تراریخته‌شدن گیاه مدنظر توسط Agrobacterium rhizogenesisسویۀ A4 بود. Khelifi و همکاران (2011) در بررسی‌های خود گزارش کردند در بین سویه‌های مختلف Agrobacterium، سویۀ A4 بیشترین درصد تراریختگی را در گیاه Datura innoxia ایجاد می‌کند؛ همچنین در مطالعه‌ای، تلقیح ریزنمونه‌های مختلف با سۀ سویه A7، A4 و 9435 نشان داده است سویۀ A4 و ریزنمونۀ برگ مناسب‌ترین سویۀ باکتریایی و ریزنمونۀ گیاهی بهمنظور القای ریشه‌های مویین در گیاه گل مکزیکی (Agastache foeniculum) هستند (Noruozi, 2013).
زمانی که گیاه با تنش‌های محیطی مواجه شود، مسیر اصلی انتقال الکترون مسدود می‌شود و انتقال الکترون در مسیر فرعی جریان می‌یابد و سبب احیای ناقص اکسیژن و تولید انواع اکسیژن فعال (ROS) می‌شود. طی تیمار با محرک‌ها، گیاهان مقدار بیشتری ROS تولید می‌کنند که سبب ایجاد تنش اکسیداتیو می‌شود (Andrea and Ricardo, 2007).گیاهان با استفاده از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت مانند کاتالاز و گایاکول‌پراکسیداز از خود در برابر تنش دفاع می‌کنند. گزارش شده است تنش‌های محیطی سبب افزایش یا کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز (بسته به شدت، مدت و نوع تنش) می‌شوند (Andrea and Ricardo, 2007). در پژوهش حاضر، تیمار 100 میکرومولار متیلجاسمونات در ترکیب با 1 میلی‌مولار L-لوسین از بین ترکیبات تیماری مختلف، تأثیر بیشتری بر فعالیت آنزیم کاتالاز داشت و فعالیت این آنزیم را به‌طور معناداری در مقایسه با تیمار شاهد افزایش داد (شکل 4). به نظر می‌رسد متیلجاسمونات تولید ROS را در گیاهان القا می‌کند؛ بنابراین، وجود دستگاه آنتی‌اکسیدانی مؤثر برای حفظ عملکردهای متابولیسمی در شرایط القا ضروریست تا از آسیب بیشتر جلوگیری شود. Nafie و همکاران (2011) بیان کردند در کشت سلول‌های سوسپانسیون خربزه، کاربرد تیمار متیلجاسمونات سبب افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به شاهد می‌شود. گزارش شده است در میوۀ تمشک و توت‌های تیمارشده با متیلجاسمونات، قدرت و فعالیت آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها افزایش می یابد (Ghasemnezhad and Javaherdashti, 2008). در بین تیمارهای نانوذرات، نانواکسید نیکل با غلظت 30 میلیگرمبرلیتر به‌طور ترکیب با 1 میلی‌مولار L-لوسین بیشترین تأثیر را بر فعالیت آنزیم کاتالاز داشت و فعالیت این آنزیم را در مقایسه با سایر تیمارهای نانوذرات و تیمار شاهد به‌طور معناداری افزایش داد (شکل 4)؛ یکی از دلایل این امر را می‌توان حضور یون‌های فلزی همچون نیکل، آهن، روی، مس، منگنز و منیزیم به‌عنوان کوفاکتور در ساختمان بسیاری از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی دانست؛ همچنین در شرایط کمبود ریزمغذی‌ها، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت کاهش می‌یابد و همین امر به افزایش حساسیت گیاهان به تنش‌های محیطی می‌انجامد. کاتالاز یکی از آنزیم‌هایی است که در فرایند سم‌زدایی رادیکال‌های آزاد شرکت دارد و پراکسیدهیدروژن را به آب و اکسیژن تبدیل می‌کند. احتمالاً افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز برای غلبه بر افزایش پراکسیدهیدروژن است که به سیستم مهارکنندۀ گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) برای خنثی‌کردن آثار نامطلوب آن در پایداری غشای سلولی نیاز دارد. در اِعمال تیمارهایی نظیر متیلجاسمونات، افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت و محتوای زیاد آنتی‌اکسیدانت‌های غیرآنزیمی برای تحمل گیاه به تنش بسیار مهم است تا گیاه را از آثار مضر آنها در امان نگه دارد (Cacmak, 2000; Nasibi, 2010).
در ارزیابی فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز، نانواکسیدنیکل در غلظت30 میلیگرمبرلیتر به‌طور ترکیبی با 1 میلی‌مولار L-لوسین و متیلجاسمونات در غلظت 200 میکرومولار با 1 میلی‌مولار L-لوسین و نانواکسیدآهن با غلظت30 میلیگرمبرلیتر سبب افزایش فعالیت آنزیم شد (شکل 5). Sinha و Saxena (2006) با بررسی اثر تیمار آهن روی نوعی گیاه دارویی به نام Bacopa monnieri دریافتند با کاربرد آهن، فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشه، افزایش و در برگ، کاهش یافت. گایاکول‌پراکسیداز از اکسیداسیون ترکیبات فنلی نظیر گایاکول برای سم‌زدایی و تجزیه آب‌اکسیژنه استفاده می‌کند و در سیتوسل، دیوارۀ سلولی و واکوئل نیز دیده می‌شود. ترکیبات فنلی مانند گایاکول به‌عنوان دهندۀ الکترون به پراکسیدهیدروژن عمل می‌کنند. مطالعه‌های گذشته نشان داده‌اند واکنش آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی به فلزات مبهم است و بین گونه‌های گیاهی و حتی بافت‌های مختلف یک گیاه متفاوت است (Mazhoudi et al., 1997).
در ارزیابی میزان پروتئین کل، بیشترین میزان پروتئین ریشه‌های مویین در تیمار نانواکسیدنیکل با غلظت60 میلیگرمبرلیتر و نانواکسیدآهن با غلظت‌های 60 و 90 میلیگرمبرلیتر در ترکیب با 1 میلی‌مولارL-لوسین مشاهده شد (شکل 6). در غلظت 90 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدنیکل، کمترین مقدار پروتئین نسبت به شاهد مشاهده شد (شکل6). علت کاهش میزان پروتئین در شرایط تنش ممکن است بازداشته‌شدن فعالیت آنزیم‌های نیترات‌ردوکتاز، گلوتامین‌سنتتاز، گلوتامات‌سنتتاز باشد که حساسیت بیشتری به تنش دارند (Khan et al. 2003). تیمار با نانوذرات در کشت سوسپانسیون گیاه Artemisia absinthium، افزایش تولید متابولیت ثانویه، محتوای فنلی کل، مقدار کل فلاونوئید و فعالیت آنتی‌اکسیدانی، فعالیت سوپراکسیددیسموتاز (SOD) و محتوای کل پروتئین را در پی داشته است. این پژوهشگران افزایش میزان پروتئین کل را به تجمع پروتئین‌های پاسخ‌دهنده به محرک نسبت داده‌اند که بسته به غلظت و اندازۀ محرک متفاوت است (Hussain et al., 2017).
ارزیابی سطوح تیماری مختلف بر میزان پرولین ریشه‌های مویین نشان داد تیمار 100 میکرومولار متیلجاسمونات به همراه 1 میلی‌مولارL-لوسین بیشترین غلظت پرولین و تیمار شاهد کمترین غلظت پرولین را در نمونه‌ها القا می‌کند (شکل 7). به نظر می‌رسد افزایش پرولین نسبت به شاهد از فعال‌سازی بیوسنتز و غیرفعال‌شدن مسیرهای تجزیۀ آن در طول تنش ناشی می‌شود؛ علاوهبراین، تبدیل برخی آمینواسیدها مانند اورنیتین، آرژنین و گلوتامین به پرولین در افزایش پرولین نقش دارد (Abdalla and El-khoshiban, 2007). در بین نانواکسیدهای آهن و نیکل، غلظت 90 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدآهن به همراه 1 میلی‌مولار L-لوسین و غلظت 90 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدنیکل به همراه 1 میلی‌مولار L-لوسین، میزان پرولین بیشتری را در نمونه‌ها القا کردند. تمام تیمارها به افزایش پرولین منجر شدند؛ بنابراین، به نظر می‌رسد این تیمارها به‌عنوان محرک سبب افزایش قدرت سیستم آنتی‌اکسیدانی و کاهش تنش اکسیداتیو می‌شوند و سنتز پرولین را افزایش می‌دهند (شکل 7). پرولین نقش بسیار مهمی در حفاظت از سلول‌های گیاهی در برابر تنش‌های غیرزیستی دارد. برخی پژوهشگران بیان کرده‌اند تجمع پرولین در گیاهان عالی، واکنشی عمومی به تنش است و نقش اساسی در پایداری ساختارهای زیرسلولی (غشاها و پروتئین‌ها) و خنثی‌سازی رادیکال‌های آزاد در شرایط تنش دارد (Sanchez et al., 2003).
همان‌طور که شکل 8 نشان می‌دهد بیشترین میزان فلاونوئید کل در ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب با اِعمال تیمار غلظت 30 میلیگرمبرلیتر نانواکسیدآهن مشاهده می‌شود. کوچک‌بودن اندازۀ نانوذرات و سطح مقطع و واکنش‌پذیری زیاد آنها سبب افزایش جذب این ذرات توسط گیاه می‌شود. گزارش شده است کاربرد نانوذرات دی‌اکسید‌تیتانیوم (TiO2) در گیاه مریم گلی (Salvia officinalis) سبب افزایش محتوای فنل و فلاونوئید کل می‌شود (Ghorbanpour et al., 2014)؛ بهطوریکه غلظت 200 میلیگرمبرلیتر از این نانوذره فعالیت آنتی‌اکسیدانی بیشتری در مقایسه با سایر غلظت‌ها نشان داد. در مطالعه‌ای دیگر گزارش شده است نانوذرات اکسیدمس (CuO) و اکسیدروی (ZnO) بر محتوای متابولیت‌های ثانویه ازجمله ترکیبات فنلی در گیاه شیرین‌بیان اثر مثبت دارند (Mazhoudi et al., 1997). فلاونوئیدها یکی از گسترده‌ترین و متنوع‌ترین ترکیبات طبیعی هستند که همانند سایر ترکیبات فنولی توانایی جذب رادیکال‌های آزاد را دارند. در تنش‌های اکسیداتیو، ترکیبات فنلی به‌ویژه فلاونوئیدها می‌توانند با فسفولیپیدهای غشا از طریق پیوند هیدروژنی با سرهای قطبی فسفولیپیدها ارتباط برقرار کنند؛ درنتیجه، این ترکیبات در سطح داخل و خارج غشا تجمع می‌یابند و با جلوگیری از دستیابی مولکول‌های آسیب‌رسان به ناحیۀ هیدروفوبی دوقطبی به حفظ سیالیت و تمامیت غشا کمک می‌کنند (Michalak, 2006).
دست‌ورزی ژنتیکی در راستای افزایش متابولیت‌های ثانویه گیاهی یکی از روش‌های مهم و کاربردی در عصر جدید است که در این زمینه، شناسایی و دست‌کاری ژنتیکی ژن‌های مؤثر در سنتز متابولیت‌های ثانویه مانند سزکوئی‌ترپنوئیدها ارزش زیادی دارد؛ بنابراین، اولین گام برای به‌کارگیری روش مهندسی ژنتیک و افزایش بیان نسبی ژن‌ها در مسیر بیوسنتزی، مطالعۀ بیان ژن‌ها به‌ویژه ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه است و در این راستا، بیان نسبی دو ژن VoTPS1 و VoTPS6 در ریشه‌های مویین گیاه دارویی سنبل‌الطیب و تحت‌تأثیر محرک‌های مختلف به‌تنهایی یا در ترکیب با آمینواسید L-لوسین بررسی شد. نتایج بررسی اثر تیمارهای محرک بر افزایش بیان نسبی ژن‌های VoTPS1 و VoTPS6 نشان دادند با افزودن محرک به محیط‌کشت ریشه‌مویین، میزان بیان نسبی این ژن‌ها افزایش می‌یابد (شکل‌های 11 و 12). بیشترین افزایش بیان نسبی ژن VoTPS1 نسبت به شاهد در غلظت 60 میلیگرمبرلیتر نانواکسید آهن در زمان 24 ساعت پس‌از اعمال تیمار مشاهده شد؛ بهطوریکه میزان بیان نسبی این ژن 74/19 برابر نسبت به شاهد افزایش داشت (شکل 11). این نتایج نشان دادند تیمار نانواکسیدآهن می‌تواند سطح رونوشت ژن VoTPS1 را که در مسیر بیوسنتز والرنیکاسید نقش دارد، به میزان درخور توجهی در ریشه‌های مویین افزایش دهد. به نظر می‌رسد اندازۀ کوچک و سطح مقطع زیاد نانوذرات، نفوذپذیری آنها به درون سلول‌ها را تسهیل می‌کند و واکنش‌پذیری زیاد این ذرات سبب پاسخ فیزیولوژیکی مانند تغییر بیان ژن‌ها در سلول‌های گیاهی می‌شود. فلزاتی مانند آهن، نیکل، کبالت و نقره سبب تحریک تولید دامنۀ وسیعی از متابولیت‌های ثانویه در گیاهان می‌شوند. در گزارش دیگری مشخص شده است فلزاتی مانندNi2+، Fe2+، Co2+ و Ag2+ تولید گسترۀ وسیعی از متابولیت‌های ثانویه را در گونه‌های مختلف گیاهان تحریک می‌کنند (Zhao et al., 2005).
همان‌طور که در شکل 12 مشاهده می‌شود بیشترین میزان بیان نسبی ژن VoTPS6 در تیمار 100 میکرومولار متیلجاسمونات به همراه 1 میلی‌مولار L-لوسین در زمان 72 ساعت پس‌از اعمال تیمار است؛ بهطوریکه میزان بیان نسبی ژن 94/12 برابر در مقایسه با شاهد افزایش می‌یابد. در بررسی بیان برخی از ژن‌های درگیر در بیوسنتز آلکالوئید موروفین در کشت ریشه‌های مویین گیاه Papaver orientale L. با استفاده از محرک‌های غیرزیستی نشان داده شده است بیان ژن‌های SalR، Salsyn، SaLAT، T6ODM و CODM تحت‌تأثیر متیلجاسمونات طی 48 ساعت افزایش می‌یابد (Hashemi and Naghavi, 2016). در پژوهشی گزارش شده است بیان نسبی زیاد ژن‌های سزکوئی‌ترپن‌سنتاز برنج با نام OsTPS3 ((E)- β-caryophyllene) سبب تولید مقدار زیادی بتاکاریوفیلن پس‌از تیمار با متیلجاسمونات می‌شود (Cheng et al., 2007). در پژوهش حاضر، افزایش بیان نسبی VoTPS6 در ریشه‌های مویین سنبل‌الطیب پس‌از 24 ساعت از اِعمال تیمار نانواکسیدآهن مشاهده شد (شکل 12). مطالعۀ Cheng و همکاران (2013) در ریشۀ مویین Salvia miltiorrhiza نشان داده است بیان نسبی ژن SmCPS تحت‌تأثیر محرک‌های عصارۀ مخمر، متیلجاسمونات و یون فلز نقره به‌طور درخور توجهی افزایش می‌یابد. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند استفاده از محرک‌های خارجی در کشت‌های ریشه‌مویین گیاه سنبل‌الطیب می‌تواند سبب فعال‌شدن واکنش‌های دفاعی در گیاه شود و درنتیجه، افزایش بیان ژن‌های درگیر در متابولیسم ثانویه و احتمالاً افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه را در پی داشته باشد؛ بنابراین با انتخاب محرک‌های مناسب و اِعمال آنها در زمان‌های مناسب می‌توان بیان نسبی ژن‌های مؤثر در مسیر بیوسنتز ترکیبات ثانویه و درنهایت، تولید آنها را افزایش داد.
نتیجه‌گیری
در پژوهش حاضر، استفاده از متیلجاسمونات، آمینواسید L-لوسین و نانواکسیدهای آهن و نیکل سبب القای تولید آنتی‌اکسیدان‌ها و عوامل مقابله‌کننده با تنش شد و درنهایت، این عوامل توانستند سبب کاهش آثار تخریبی تنش در گیاه شوند؛ همچنین بیان نسبی ژن‌های VOTPS1 و VOTPS6 به‌عنوان ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتز سزکوئی‌ترپن‌ها در سنبل‌الطیب تحت‌تأثیر محرک‌های یادشده قرار گرفت. بیان نسبی ژن VOTPS1 در تیمار ترکیبی نانواکسیدآهن و 1 میلی‌مولارL-لوسین بیشتر از سایر تیمارها بود؛ همچنین بیان نسبی ژن VOTPS6 در تیمار ترکیبی متیلجاسمونات 100 میکرومولار و 1 میلی‌مولار L-لوسین افزایش بیشتری نسبت به سایر تیمارها نشان داد.
)
