Document Type : Original Article
Authors
1 Departmant of Agronomy, Agriculture Faculty, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
2 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekod, Iran
3 Medical Plants Research Center, Shahrekord University of Medical Sciences, Sharekord, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه.
زعفران با نام علمی Crocus sativus L.، گونۀ گیاهی عقیم و تریپلوئیدی است که به خانوادۀ Iridaceae تعلق دارد و معروف‌ترین گونۀ جنس Crocus به شمار می‌آید. زعفران از دیرینه‌ترین گیاهان ادویه‌ای و دارویی است که همواره مدنظر بوده و در مطالعه‌های متعدد به آثار ضدافسردگی، ضدالتهابی و آنتی‌اکسیدانی گلبرگ آن اشاره شده است (Serrano-Díaz et al., 2014)؛ علاوهبراین، زعفران حاوی مواد معدنی، آب، موسیلاژ، چربی، موم، اسانس معطر و مواد مؤثرۀ متشکل از سه هتروزید است و گلبرگ، برگ و کورم آن، منابعی از ترکیبات زیست‌فعال با فعالیت‌های فیزیولوژیکی مختلف و کاربردهای متنوع هستند (Sanchez-Vioquea et al., 2012). ترکیبات مؤثرۀ زعفران عبارتند از: پیکروکروسین (پیش‌ساز سافرانال)، کروسین (متعلق به کاروتنوئیدها و استر گلیکوزیدی کروستین) و سافرانال (ترکیب فرّار) (Amin and Hosseinzadeh, 2012). عامل اصلی رنگ‌دهی کلاله‌های زعفران، ترکیبی به نام کروسین و مشتق آن، کروستین است؛ علاوه‌بر کروسین، زعفران حاوی کروستین به‌شکل آزاد و مقادیر کمی از رنگدانۀ آنتوسیانین است (Rajabi et al., 2015). عمده‌ترین ترکیب ایجادکنندۀ طعم تلخ در زعفران، گلیکوزید بی‌رنگی به نام پیکروکروسین است که ماده‌ای تلخ و متبلورشونده است و از طریق هیدرولیز اسید، گلوکز و آلدئیدی به نام سافرانال تولید می‌شود (Moratalla-López et al., 2019).
طی چند دهۀ گذشته، استفادۀ دارویی زعفران به‌علت کاربردهای گستردۀ آن به‌شکل ادویه و عامل رنگ‌دهنده به‌شدت کاهش یافته است؛ باوجوداین، مشخص‌شدن نقش زیستی برخی از فراورده‌های طبیعی زعفران در کاهش ابتلا به سرطان سبب شده است مطالعه‌ها در زمینۀ ویژگیهای دارویی زعفران از سر گرفته شوند (Tajik et al., 2013). کیفیت و قدرت رنگ‌دهی زعفران به کمک کمیت آنالوگ‌های کروسین آن به روشهای مختلف مانند رنگ‌سنجی، روشهای کروماتوگرافی مانند GC-MS و HPLC تعیین می‌شود. کیفیت ترکیبات فعال تعدادی از نمونه‌های تجاری زعفران کشورهای مختلف به روش HPLC تعیین شده است. مطالعۀ ترکیبات شیمیایی زعفران کشورهای مختلف همچون اسپانیا، یونان، چین، هند و ایران مشخص کرده مقادیر ترکیبات تخمین‌زده‌شده به روشهای بهکاررفته در مراحل خشک‌کردن، استخراج، جداسازی و تعیین کمیت وابسته است (Abdullave and Ortega, 2007; Vahedi et al., 2018). در بررسی Lozano و همکاران (1999)، 10 ترکیب فعال زعفران در سه منطقۀ مختلف اسپانیا به روش HPLC و به‌طور کمّی مطالعه شده‌اند.
امروزه، روشهای مختلفی برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی استفاده می‌شوند که استفاده از الیسیتورها، یکی از پرکاربردترین آنهاست (Luciano et al., 2017). الیسیتورها، مولکول‌هایی با منشأ زیستی و غیرزیستی هستند که از طریق تحریک سیگنال‌های سلولی و برهم‌کنش‌های مولکولی میان گیرنده‌های گیاهی در سطح غشای سلولی و الیسیتور شناسایی می‌شوند و در نتیجۀ سیگنال‌هایی که سلول دریافت می‌کند، بیان ژن‌های مرتبط در مسیر افزایش می‌یابد و متابولیت‌های ثانویه در گیاهان سنتز می‌شوند (Bayraktar et al., 2016). الیسیتورها ممکن است ژن‌های جدیدی را فعال کنند که آنزیم‌ها و درنهایت، مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راه‌اندازی می‌کنند و سبب سنتز متابولیت‌های ثانویه می‌شوند (Patel and Krishnamurthy, 2013). بهطورکلی، استفاده از الیسیتورها در مطالعه‌های زیست‌فناوری متابولیت‌های گیاهی با هدف کسب اطلاعات در زمینۀ مسیرهای بیوسنتزی منجر به تشکیل و تنظیم متابولیت‌های ثانویه به‌منظور کاربرد تجاری آنها انجام می‌شود (Isah, 2019). باتوجهبه شرایط اقلیمی کشور ما که آب یکی از عوامل عمدۀ محدود‌کنندۀ توسعۀ کشاورزی است، زعفران، گیاهی کم‌توقع است که بازده اقتصادی زیادی دارد (Kheirandish and Sriramapa, 2010).
طی تنش اکسیداتیو، افزایش تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) مانند سوپراکسید، پراکسیدهیدروژن و رادیکال هیدروکسیل رخ می‌دهد. انواع مختلف اکسیژن فعال می‌توانند به ترکیبات حیاتی سلول مانند اسیدهای چرب غیراشباع، پروتئین‌ها و نوکلئیک‌اسیدها حمله کنند و این واکنش‌ها، ویژگی‌هایی مانند سیالیت غشا، انتقال یونی، فعالیت آنزیمی و سنتز پروتئین‌ها را به‌طور طبیعی کاهش می‌دهند و سبب تخریب DNA هسته‌ای و میتوکندریایی و درنهایت، مرگ سلول می‌شوند. گونه‌های رادیکال آزاد به‌علت جفت‌نشدن الکترون در لایۀ خارجی اوربیتال اتمی یا مولکولی و گونه‌هایی که رادیکال آزاد نیستند، ولی امکان حمله از سوی رادیکال‌های آزاد و درنتیجه جداشدن الکترون را دارند، در ترویج واکنش‌های اکسیداسیون نقش دارند (Mhamdi and Van Breusegem, 2018). در طول فرایندهای اکسیداتیو، اکسیژن غیررادیکالی همراه با رادیکال (OH◦) نقش ترویج‌دهندگی واکنش‌های اکسیداتیو را دارند. در لایۀ خارجی اکسیژن، بیشتر الکترون‌ها تحرک زیادی دارند و به‌همین‌علت، واکنش‌پذیری زیادی را در واکنش‌های زیستی نشان می‌دهند. در شرایط عادی، سیستم زنده به‌طور مداوم رادیکال اکسیژن را به‌واسطۀ کاهش یک‌ظرفیتی مولکول اکسیژن تولید می‌کند (Kawarazaki et al., 2013)؛ همچنین ممکن است رادیکال‌های آزاد در سیستم‌های زنده و غیرزنده به‌واسطۀ تعامل با مولکول اکسیژن و در حضور فلزاتی مانند آهن و مس تولید شوند. باوجود واکنش‌پذیری کم اکسیژن، رادیکال آزاد به‌شدت تحت‌تأثیر دیسموتاسیون واکنش‌های غیرآنزیمی مانند واکنش‌های کاتالیز‌شده به‌وسیلۀ سوپراکسیددیسموتاز قرار می‌گیرد که به تولید پراکسیدهیدروژن منجر می‌شود (Liu et al., 2017).
گیاهان سازوکارهای حفاظتی مختلفی برای حذف یا کاهش گونه‌های فعال اکسیژن دارند که در سطوح مختلف تنش یا شرایط نامساعد محیطی مؤثر هستند؛ یکی از سازوکارهای حفاظتی یادشده، سیستم‌های آنزیمی آنتی‌اکسیدان هستند. گیاهانی که سطوح بالاتری از آنتی‌اکسیدان‌ها را دارند، مقاومت بیشتری در برابر آسیب‌های اکسیداتیو نشان می‌دهند. دو آنزیم کاتالاز و آسکوربات‌پراکسیداز از مهم‌ترین آنتی‌اکسیدان‌ها هستند که سبب شکسته‌شدن پراکسیدهیدروژن به آب و مولکول اکسیژن می‌شوند (Sarker and Oba, 2018). آنزیم کاتالاز، آنزیم پاک‌سازی‌کنندۀ پراکسیدهیدروژن است؛ درنتیجه، افزایش فعالیت این آنزیم سبب شکسته‌شدن پراکسیدهیدروژن به آب و اکسیژن و حذف آن می‌شود. در شرایط طبیعی، وجود آنزیم کاتالاز برای سلول ضروری است و نقش مهمی در کسب مقاومت در برابر تنش اکسایشی ایفا می‌کند. آسکوربات‌پراکسیداز یکی دیگر از آنتی‌اکسیدان‌هاست که در غلظت‌های زیاد درون کلروپلاست، سیتوسل، واکوئل و همچنین فضاهای آپوپلاستی سلول‌های برگ یافت می‌شود (Goli et al., 2012; Choudhury et al., 2013). پژوهشگران معتقدند آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز یکی از مهم‌ترین آنتی‌اکسیدان‌ها در گیاه است که نقش مهمی در احیای بسیاری از رادیکال‌های آزاد و به‌ویژه پراکسیدهیدروژن طی فرایندهای مورفوفیزیولوژیکی گیاه ایفا می‌کند (Impa et al., 2012). آسکوربات‌پراکسیداز وابستگی زیادی به پراکسیدهیدروژن و آسکوربات دارد؛ به‌گونه‌ای که پیش‌بینی شده است آسکوربات نه‌تنها سم‌زدایی پراکسیدهیدروژن را به عهده دارد، میزان پراکسیدهیدروژن را در علامت‌دهی هدف کنترل می‌کند (Sekmen et al., 2014).
پلی‌اتیلن‌گلایکول (PEG)، پلیمری انعطاف‌پذیر و غیرسمی است که سبب فشار اسمزی منفی می‌شود؛ همچنین تمایل به واکنش با مواد شیمیایی و زیستی ندارد و این ویژگی، آن را به یکی از مفیدترین مولکول‌ها برای ایجاد فشار اسمزی منفی در آزمایش‌های بیوشیمیایی تبدیل می‌کند (Hellal et al., 2018). در بسیاری از گیاهان برای ایجاد تنش از نمک پلی‌اتیلن‌گلایکول استفاده می‌شود که به‌علت نداشتن تحرک، غیریونی و غیرسمی‌بودن و نداشتن قابلیت نفوذ، اسمولیت مؤثر و مناسبی در مقایسه با دیگر اسمولیت‌ها ازجمله مانیتول، شکر و نمک به شمار می‌آید و به‌علت داشتن توانایی ایجاد شرایطی شبیه به تنش‌های محیط‌های طبیعی، کاربرد زیادی دارد. شدت تغییرپذیری گونه‌ها و حتی رقم‌های مختلف نسبت به پلی‌اتیلن‌گلایکول متفاوت است و لازم است پژوهش‌های لازم به‌منظور انتخاب رقم‌های مقاوم یا متحمل هر گیاه انجام شوند (Robin et al., 2015).
اگرچه تاکنون مطالعه‌هایی در زمینۀ ویژگیهای آنتی‌اکسیدانی و بیوشیمیایی برخی از اندام‌های زعفران در مناطق مختلف انجام شده‌اند، تاکنون هیچ‌گونه مطالعه‌ای دربارۀ متابولیت‌های ثانویه، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و ویژگیهای بیوشیمیایی گیاه زعفران تحت‌تأثیر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول انجام نشده است؛ علاوهبراین، باتوجهبه اینکه ارزش اقتصادی و کیفیت زعفران به تعیین کمّی ترکیبات کروسین، پیکروکروسین و کروستین آن وابسته است و کاربرد روش HPLC که روش بسیار دقیقی برای تعیین مقدار این ترکیبات است، کمتر بررسی شده است، در مطالعۀ حاضر به تعیین میزان ترکیبات یادشده به کمک دستگاه HPLC پرداخته و زعفران منطقۀ خراسان رضوی تعیین کیفیت شد.
مواد و روش‌ها
به‌منظور بررسی تأثیر پلی‌اتیلن‌گلایکول بر ویژگیهای بیوشیمیایی گیاه زعفران، پژوهشی به‌شکل گلدانی در قالب طرح کاملاً تصادفی و در پنج تکرار طی سال 1397 در گلخانۀ دانشگاه شهرکرد اجرا شد؛ به این منظور، پیازهای گیاه زعفران از استان خراسان رضوی تهیه شدند. پیازها پیش از کشت به‌مدت 30 تا 60 ثانیه در محلول هیپوکلریت‌سدیم 1 درصد و اتانول 70 درصد ضدعفونی سطحی و سپس سه مرتبه با آب مقطر آب‌کشی و در گلدان‌هایی به عمق 20 سانتی‌متر و حاوی بستر کشت خاکی لمون رسی شنی با اسیدیتۀ 7 تا 8 کاشته شدند. پیش از کشت، بستر کشت با اتوکلاو استریل شد (جدول 1). پیازها در عمق 5 تا 6 سانتی‌متری گلدان‌ها کشت و سپس گلدان‌ها در گلخانه‌ای با دمای 18 تا 22 درجۀ سانتی‌گراد و دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند.
به‌منظور بررسی تأثیر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول روی ویژگیهای مورفوفیزیولوژیک گیاه زعفران، غلظت‌های 8، 12 و 16 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول در آزمایش مقدماتی استفاده شدند و نتایج، تفاوت معناداری بین غلظت‌های 12 و 16 درصد نشان ندادند؛ در‌حالی‌که تفاوت معناداری بین غلظت‌های 8 و 12 درصد مشاهده شد و غلظت 12 درصد تأثیر معناداری بر افزایش ویژگیهای بیوشیمیایی در مقایسه با غلظت 8 درصد داشت؛ بنابراین، غلظت 12 درصد انتخاب شد. دو هفته پیش از گل‌دهی، غلظت مدنظر از الیسیتور پلی‌اتیلن‌گلایکول تهیه و در اوایل صبح روزهای آبیاری، میزان 300 میلیلیتر ازآن در شرایط کنترل‌شدۀ گلخانه روی هرکدام از گلدان‌ها اِعمال و در قالب طرح کاملاً تصادفی و در پنج تکرار به بسترهای کشت اضافه شد. پساز دو هفته از اِعمال تنش، بافت گل و برگ گیاهان از هر تیمار برداشت و به‌منظور بررسی ویژگی‌ها به آزمایشگاه منتقل شد.
جدول 1- وضعیت خاک استفاده‌شده برای کشت گیاه زعفران
|
بافت |
شوری (ds.m-1) |
pH |
|
کربن آلی |
نیتروژن کل |
|
پتاسیم |
فسف |
روی |
منگنز |
آهن |
مس |
بور |
|
|
(%) |
|
(mg.kg-1) |
||||||||||
|
Clay loam |
659/0 |
76/7 |
|
916/0 |
086/0 |
|
211 |
1/8 |
63/0 |
18/9 |
51/3 |
49/1 |
18/2 |
صفت‌های ارزیابی‌شده.
پراکسیدهیدروژن (H2O2): به‌منظور اندازهگیری پراکسیدهیدروژن، مقدار 3/0 گرم از نمونۀ گیاهی در 3 میلیلیتر کلرواستیک‌اسید 1 درصد هموژن شد؛ سپس نمونه‌ها به لوله‌های سانتریفیوژ منتقل و به‌مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد و با سرعت 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند و پس‌ازآن، مقدار 75/0 میلیلیتر بافر فسفات‌پتاسیم 10 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 7 و 5/1 میلیلیتر یدیدپتاسیم 1 مولار به 75/0 میلیلیتر از محلول رویی اضافه شد. غلظت پراکسیدهیدروژن نمونه‌ها از طریق مقایسۀ جذب آنها در طول موج 390 نانومتر با منحنی استاندارد آن در طیفی از 100 تا 1000 میکرومول‌بر‌میلی‌لیتر محاسبه شد؛ درنهایت، غلظت پراکسیدهیدروژن باتوجهبه محتوای آب نمونه‌ها و درصد مادۀ خشک به‌شکل میکرومول بر گرم وزن خشک بیان شد (Loreto and Velikova, 2001).
پرولین: پرولین آزاد برگ به روش اسپکتروفتومتری (Bates et al., 1973) در طول موج 515 نانومتر اندازهگیری شد. مطابق روش یادشده، ابتدا 3/0 گرم از بافت گیاهان وزن و 10 میلیلیتر سولفوسالیسیلیک‌اسید 3 درصد به آن اضافه و بافت گیاهی در هاون چینی کاملاً کوبیده شد و سپس عصارۀ بافت با استفاده از کاغذ صافی واتمن شمارۀ 2 جداسازی شد. عصارۀ حاصل به‌مدت 24 ساعت در دمای یخچال نگهداری شد تا پرولین موجود در آن آزاد شود و سپس به‌مدت 20 دقیقه با سرعت g1500 در سانتریفیوژ سیگما همگن شد. مقدار 2 میلیلیتر از عصاره برداشته و 2 میلیلیتر محلول نین‌هیدرین و 2 میلیلیتر محلول استیک‌اسید گلاسیال به آن اضافه شد و به‌مدت 1 ساعت در بنماری با دمای جوش حرارت داده شد. پساز گذشت یک ساعت، لوله‌ها از آب جوش خارج و بی‌درنگ درون یخ‌ساز قرار داده شدند تا واکنش حرارتی تثبیت شود. پساز سردشدن لوله‌ها، مقدار 4 میلیلیتر تولوئن به هر لولۀ آزمایش اضافه و محتویات لوله به‌مدت 5 تا 20 ثانیه به‌شدت با هم‌زن هم زده شد؛ درنتیجه، دو فاز در هر لوله تشکیل شد که فاز رویی آن دارای تولوئن حاوی کمپلکس رنگی قرمز بود و از آن برای اندازهگیری پرولین استفاده شد. میزان جذب نور در طول موج 515 نانومتر اندازهگیری و میزان پرولین بر حسب میلی‌گرم بر میلیلیتر وزن تر به دست آمد.
محتوای نسبی آب (RWC): به‌منظور اندازهگیری محتوای نسبی آب، ابتدا برگ‌های تر برداشت و به قطعه‌های یک سانتی‌متری تقسیم شدند و وزن آنها اندازهگیری شد (Wi)؛ سپس قطعه‌های برگ در آب با دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد غوطه‌ور و به‌مدت 24 ساعت در محیط تاریک نگهداری شدند و پساز گذشت زمان یادشده، وزن آنها تعیین شد (Wf). پساز خشک‌شدن قطعه‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای 80 درجۀ سانتی‌گراد (Wd)، وزن خشک آنها اندازهگیری و درنهایت، محتوای نسبی آب از رابطۀ زیر محاسبه شد (Mohsenzadeh et al., 2006):
رنگدانه‌های فتوسنتزی: غلظت رنگیزه‌های مختلف شامل کلروفیل‌های a، b و کل در پایان دورۀ آزمایش با اسپکتروفتومتر و طبق روش Mousa و همکاران (2007) تعیین شد؛ به این منظور، 5/0 گرم از بافت تازۀ برگ با 10 میلیلیتر استون 80 درصد به‌تدریج ساییده شد تا کلروفیل وارد محلول استونی شود و درنهایت، حجم محلول با استون 80 درصد به 20 میلیلیتر رسانده شد. جذب نوری محلول رویی در طول موج‌های 663 و 645 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل D 6320، شرکت eppendorf ، آلمان) که قبلاً با استون 80 درصد تنظیم شده بود، اندازهگیری شد و سپس روابط زیر برای محاسبۀ مقدار کلروفیل‌های a، b و کلروفیل کل (بر حسب میلی‌گرم در گرم بافت تازۀ برگ) استفاده شدند.
Chl.a (mg.g-1) = [(12.7*Abs 663) - (2.6*Abs 645)] * V/W × 1000
Chl.b (mg.g-1) = [(22.9*Abs 645) - (4.68*Abs 663)] * V/W × 1000
Chl.total (mg.g-1) = Chl.a + Chl.b
متابولیت‌های ثانویه:به‌منظور انجام پژوهش حاضر، دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (مدل Knauer، ساخت کشور آلمان) استفاده شد که دارای آشکارساز با طیف‌سنج UV-Vis (DAD) و طول موج 254 نانومتر، مدل 2800، نوع مادۀ پرکننده Knauer Eurospher Reversed Phase C18، طول ستون 25 سانتی‌متر و اندازۀ ذرات پایۀ 5 میکرومتر بود. حجم تزریق در هر بار برابر 20 میکرولیتر بود. آزمایش در دمای اتاق (25 درجۀ سانتی‌گراد) انجام شد. ترکیب فاز متحرک بهکاررفته شامل مخلوطی از استونیتریل (A) و آب (B) بود. شیب خطی سیستم مایع استفاده‌شده از 90 درصد استونیتریل به‌مدت 5 دقیقه به 20 درصد در 20 دقیقه کاهش یافت. سرعت جریان برابر 1 میلی‌لیتر‌در‌دقیقه تنظیم شد (Kabiri et al., 2017). این ردیاب در حداکثر طول موج‌ها ازجمله 250، 308 و 440 نانومتر به‌ترتیب برای مطالعۀ سافرانال، پیکروکروسین و کروسین‌ها تنظیم شد. نوع ترکیبات ضدالتهابی در عصارۀ گل گیاه زعفران از طریق مقایسۀ زمان بازداری پیک‌های نمونه (شکل‌های 2 تا 4) با استانداردهای ترکیبات کروسین، پیکروکروسین، سافرانال و کروستین (شکل 1) تعیین شد و مقدار هریک از ترکیبات با محاسبۀ سطح زیر پیک به دست آمد.
|
|
||
|
|
شکل 1- کروماتوگرام‌های استاندارد ترکیبات مطالعه‌شده؛ الف. کروسین ثبت‌شده در طول موج 440 نانومتر، ب. پیکروکروسین ثبت‌شده در طول موج 250 نانومتر، ج. سافرانال ثبت‌شده در طول موج 308 نانومتر، د. کروستین ثبت‌شده در طول موج 440 نانومتر
قدرت مهارکنندگی IC50:به‌منظور تعیین درصد مهار رادیکال DPPH به‌وسیلۀ عصاره از رابطۀ زیر استفاده شد:
(DPPH= (ODc/(ODc-ODs)-ODc)×100)
در این رابطه، ODc و ODs به‌ترتیب جذب شاهد و میزان جذب نمونه را نشان می‌دهند. IC50، غلظتی از عصاره است که توانایی مهار 50 درصد از رادیکال‌های آزاد موجود در محیط را دارد؛ بنابراین، هرچه میزان IC50 کمتر باشد، عصاره دارای ترکیب آنتی‌اکسیدان مؤثرتری است (Madhumitha and Saral, 2009).
عصاره‌گیری برای سنجش فعالیت آنزیمی: به‌منظور تهیۀ عصارۀ آنزیمی از روش تغییریافتۀ Elavarthi و Martin (2010) استفاده شد. نمونه‌های بافت برگ گیاهان شاهد و تیمارشده تهیه شدند. مقدار 2/0 گرم از بافت گیاهی تازه‌منجمدشده در نیتروژن مایع در بافر فسفات‌پتاسیم 2/1 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 8/6 و حاوی 1/0 میلی‌مولار EDTA در دمای صفر تا 4 درجۀ سانتی‌گراد ساییده و عصاره‌گیری شد. ترکیب به‌دست‌آمده به‌مدت 15 دقیقه در 12000 دوردردقیقه و دمای 2 تا 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ و محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی استفاده شد. عصارۀ آنزیمی حاصل تا زمان اندازهگیری آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در فریزر منفی 80 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد.
سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز: مقدار 20 میکرولیتر عصارۀ آنزیمی به 2 میلیلیتر بافر فسفات‌پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 8/7 شامل EDTA 2 میلی‌مولار، ال- متیونین 9/9 میلی‌مولار، نیتروبلوتترازولیوم 55 میکرومولار و 025/0 درصد ترییتون X 100- اضافه و درنهایت، 20 میکرولیتر ریبوفلاوین 1 میلی‌مولار در تاریکی به آن اضافه و مخلوط واکنش به‌مدت 15 دقیقه در اتاقک نور قرار داده شد. میزان جذب نور در طول موج 560 ناتومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده و مقدار فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز بر اساس واحدهای SOD در یک گرم برگ تازه بیان شد (Dhindsa et al., 1982).
سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز:مقدار 25 میکرولیتر عصارۀ آنزیمی به 1 میلیلیتر بافر فسفات‌پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 7 و حاوی آسکوربات 5/0 میلی‌مولار اضافه و درنهایت، پراکسیدهیدروژن 5/0 میلی‌مولار برای آغاز واکنش افزوده و کاهش آسکوربات به‌مدت یک دقیقه ثبت شد. ضریب خاموشی mM-1cm-18/2 برای محاسبۀ آسکوربات‌پراکسیداز استفاده و میزان آن بر اساس کاهش آسکوربات بر حسب میلی‌مولار در یک گرم برگ تازه در مدت زمان یک دقیقه بیان شد (Asada and Nakano, 1978).
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: حدود 25 تا 50 میکرولیتر عصارۀ آنزیمی به 3 میلیلیتر بافر فسفات‌پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 7 و حاوی پراکسیدهیدروژن 20 میلی‌مولار اضافه و کاهش جذب نور در طول موج 240 نانومتر به‌مدت یک دقیقه ثبت شد. ضریب خاموشی mM-1cm-13-10×36 برای محاسبۀ کاتالاز استفاده و مقدار آن بر حسب میلی‌مولار پراکسیدهیدروژن اکسیدشده در گرم وزن تازۀ برگ در مدت یک دقیقه بیان شد (Havir and McHale, 1987).
تجزیه‌و‌تحلیل آماری داده‌ها: تجزیه واریانس داده‌ها با نرم‌افزار SAS، مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد و 1 درصد و رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel (نسخۀ 2013) انجام شد.
نتایج.
پراکسیدهیدروژن: نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان دادند اثر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول بر میزان پراکسیدهیدروژن گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنادار است؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان پراکسیدهیدروژن (85/17 میکرومول‌بر‌گرم) در تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و کمترین میزان آن (38/14 میکرومول‌بر‌گرم) در تیمار شاهد مشاهده می‌شود (جدول 2).
پرولین: نتایج پژوهش حاضر نشان دادند محتوای پرولین در سطح احتمال 5 درصد تحت‌تأثیر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول قرار می‌گیرد؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان (umol/g2/53) و کمترین میزان (umol/g48) پرولین به‌ترتیب در تیمارهای 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و شاهد مشاهده می‌شود (جدول 2).
محتوای نسبی آب: نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان دادند اثر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول بر محتوای نسبی آب گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنادار است. نتایج مقایسۀ میانگین داده‌ها نشان دادند اثر تیمارهای بررسی‌شده بر محتوای نسبی آب گیاه زعفران در سطح 5 درصد (آزمون LSD) معنادار است؛ به‌طوری‌که بیشترین محتوای نسبی آب (7/51 درصد) در تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و کمترین میزان (86/41 درصد) در تیمار شاهد مشاهده می‌شود (جدول 2).
جدول 2- مقایسۀ میانگین اثر پلی‌اتیلن‌گلایکول بر برخی ویژگیهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیک گیاه زعفران
|
تیمار |
پراکسید هیدروژن (µmol/g) |
پرولین (umol/g) |
محتوای نسبی آب (%) |
|
شاهد |
38/14b |
48b |
86/41b |
|
پلی‌اتیلن گلایکول (12 درصد) |
85/17a |
2/53a |
7/51a |
در هر ستون، میانگین‌هایی که دارای حرف مشترک هستند، تفاوت معناداری با یکدیگر ندارند (آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد)
رنگدانه‌های فتوسنتزی: نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان دادند اثر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول بر میزان کلروفیل‌های a، b و کل گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنادار است. بیشترین میزان کلروفیل a (8/8 میلی‌گرم‌در‌گرم) در تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و کمترین میزان آن (85/6 میلی‌گرم‌در‌گرم) در تیمار شاهد به دست آمد (جدول 3)؛ همچنین بیشترین میزان کلروفیل b (65/2 میلی‌گرم‌در‌گرم) و کمترین میزان آن (96/1 میلی‌گرم‌در‌گرم) به‌ترتیب در تیمارهای 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و شاهد مشاهده شد (جدول 3). بیشترین میزان کلروفیل کل (88/11 میلی‌گرم‌در‌گرم) در تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و کمترین میزان آن (45/9 میلی‌گرم‌در‌گرم) در تیمار شاهد مشاهده شد (جدول 3).
جدول 3- نتایج مقایسۀ میانگین اثر پلی‌اتیلن‌گلایکول رنگدانه‌های فتوسنتزی کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل گیاه زعفران
|
تیمار |
کلروفیل a (mg/l) |
کلروفیل b (mg/l) |
کلروفیل کل (mg/l) |
|
شاهد |
85/6b |
96/1b |
45/9b |
|
پلی‌اتیلن گلایکول (12 درصد) |
8/8a |
65/2a |
88/11a |
در هر ستون، میانگین‌هایی که دارای حرف مشترک هستند، تفاوت معناداری با یکدیگر ندارند (آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد).
متابولیت‌های ثانویه:باتوجهبه نتایج تجزیه واریانس داده‌ها، اثر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول بر میزان متابولیت‌های ثانویۀ گیاه زعفران شامل کروسین، پیکروکروسین و کروستین در سطح 1 درصد معنادار است. اِعمال غلظت 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول سبب افزایش متابولیت‌های ثانویۀ گیاه زعفران در مقایسه با شاهد شد؛ به‌طوری‌که بیشترین (04/29 درصد) و کمترین (48/22 درصد) میزان کروسین کل به‌ترتیب در تیمارهای 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و شاهد حاصل شد. ترکیب پیکروکروسین در تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول 12 درصد دارای بیشترین میزان (17/24 درصد) و در تیمار شاهد دارای کمترین میزان (58/14 درصد) بود. در میان ترکیب‌های بررسی‌شده، کروستین کمترین متابولیت ثانویه درگیاه زعفران بود؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان آن (04/0 درصد) در تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و کمترین میزان آن (03/0 درصد) در تیمار شاهد حاصل شد (شکل 5).
شکل 2- کروماتوگرام نمونۀ زعفران (کروسین و کروستین) تیمارشده پلی‌اتیلن‌گلایکول ثبت‌شده در طول موج 440 نانومتر
شکل 3- کروماتوگرام نمونۀ زعفران (پیکروکروسین) تیمارشده با پلی‌اتیلن‌گلایکول ثبت‌شده در طول موج 250 نانومتر
شکل 4- کروماتوگرام نمونۀ زعفران (سافرانال) تیمارشده با پلی‌اتیلن‌گلایکول ثبت‌شده در طول موج 310 نانومتر
شکل 5- مقایسۀ میانگین اثر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول (p) وتیمار شاهد (c) بر متابولیت‌های ثانویۀ کروسین، پیکروکروسین و کروستین گیاه زعفران؛ در هر تیمار، میانگین‌هایی که دارای حرف مشترک هستند، تفاوت معناداری با یکدیگر ندارند (آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد)
قدرت مهارکنندگی IC50: اثر تیمارهای شاهد و پلی‌اتیلن گلایکول بر قدرت مهارکنندگی IC50 در سطح 1 درصد معنادار بود. نتایج مقایسۀ میانگین‌ها نشان دادند بیشترین و کمترین قدرت مهارکنندگی IC50 به‌ترتیب به تیمارهای 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول (Units/mg54/0) و شاهد (Units/mg42/0) مربوط هستند (شکل 6).
آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی: نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان دادند اثر تیمارهای شاهد و پلی‌اتیلن‌گلایکول بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنادار است. نتایج مقایسۀ میانگین داده‌ها گویای معناداربودن اثر تیمارهای پلی‌اتیلن‌گلایکول و شاهد بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در سطح 5 درصد با آزمون LSD بودند. فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول با مقدار Units/mg 37/0 دارای بیشترین میزان و در تیمار شاهد با Units/mg28/0 دارای کمترین مقدار بود (شکل 6)؛ همچنین بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز با میزان Units/mg12/8 در تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول و کمترین فعالیت آن با مقدار Units/mg96/5 در تیمار شاهد مشاهده شد (شکل 6). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند تیمار 12 درصد پلی‌اتیلن‌گلایکول بیشترین فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز (Units/mg 4/7) را در پی دارد و کمترین فعالیت این آنزیم با مقدار Units/mg45/2 در شاهد مشاهده می‌شود (شکل 6).
شکل 6- مقایسۀ میانگین اثر تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول (p) وتیمار شاهد (c) بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی سوپراکسیددیسموتاز،کاتالاز و آسکوربات‌پراکسیداز گیاه زعفران؛ در هر تیمار، میانگین‌هایی که دارای حرف مشترک هستند، تفاوت معناداری با یکدیگر ندارند (آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد)
بحث
افزایش سطوح ترکیبات فنلی ازجمله سازوکارهای آنتی‌اکسیدانی گیاهان در معرض شرایط نامساعد است (Rebey et al., 2011)؛ زیرا این ترکیبات همچون پالاینده‌های گونه‌های واکنشگر اکسیژن عمل می‌کنند و سبب ثبات غشاهای سلولی و مانع پراکسیداسیون لیپیدها می‌شوند (Ashraf et al., 2014). فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی فنل‌ها از تمایل آنها به کلاته‌کردن فلزات ناشی می‌شوند و می‌توانند یون‌های آهن را کلاته و مشتقات سوپراکسید را به کمک واکنش فنتون غیرفعال کنند؛ واکنش فنتون از مهم‌ترین منابع تولید گونه‌های فعال ROS است (Das and Roychoudhury, 2014). پلی‌اتیلن‌گلایکول از طریق تقویت مسیرهای درگیر در تولید متابولیت‌های ثانویه سبب افزایش ترکیبات مؤثرۀ گیاه زعفران می‌شود و با تأثیر بر ساختمان آنزیم‌های درگیر در مسیرهای بیوشیمیایی سنتز متابولیت‌های ثانویه، تولید این ترکیبات را بهبود می‌بخشد (Purbajanti et al., 2019).
در شرایط عادی رشد، فرایندهای متابولیکی بسیاری سبب تولید گونه‌های فعال اکسیژن در گیاهان می‌شوند و در مقابل، گیاهان سازوکارهای آنتی‌اکسیدانی کارآمدی برای از‌بین‌بردن گونه‌های فعال اکسیژن دارند (Huang et al., 2019). در شرایط نامساعد، تعادل یادشده بر هم می‌خورد و مقدار گونه‌های فعال اکسیژن افزایش می‌یابد. احتمالاً افزایش مقدار پراکسیدهیدروژن در شرایط نامساعد از اختلال در تعادل یادشده ناشی می‌شود و آسیب‌های اکسیداتیو به گیاه را در پی دارد. یکی از آسیب‌های جدی تنش، خسارت به غشا و رهاشدن یون‌ها از سلول به فضای بین‌سلولی است (Abass and Mohamed, 2011)؛ این پدیده نتیجۀ تجمع رادیکال‌های آزاد اکسیژن است که به پراکسیداسیون لیپید، نفوذپذیری غشا و خسارت به سلول منجر می‌شود (Labudda, 2013). اندازهگیری محصولات پراکسیداسیون لیپید یکی از معمول‌ترین روشهای اندازهگیری آسیب‌های اکسیداتیو به غشا محسوب و به‌طور وسیع در گیاهان استفاده می‌شود (Anjum et al., 2012).
در شرایط غیرتنش، تعادل بین میزان تولید گونه‌های فعال اکسیژن و ظرفیت جاروکردن این ترکیبات از طریق سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی (آنزیمی و غیرآنزیمی) وجود دارد؛ اما در شرایط تنش که مقدار جذب و ترکیب دی‌اکسید‌کربن به‌علت منع باز‌شدن روزنه‌ها کاهش می‌یابد، انرژی داخلی افزایش می‌یابد، ظرفیت انتقال الکترون فتوسنتزی به‌سوی سطوح بالاتر می‌رود و در پی آن، غلظت گونه‌های فعال اکسیژن افزایش می‌یابد که این امر سبب پراکسیداسیون لیپیدها، تخریب پروتئین‌ها و اکسیداسیون DNA می‌شود؛ در ادامه، میزان تولید گونه‌های فعال اکسیژن بیشتر از ظرفیت جارو‌شدن آنها از طریق سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی می‌شود و درنتیجه، تنش اکسیداتیو رخ می‌دهد؛ بنابراین، تغییر ظرفیت سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی برای مقابله با تنش اکسیداتیو ضروری است و در این زمان، گلوتاتیون‌پراکسیداز، پراکسیداز، پلی‌فنل‌اکسیداز، کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز به‌شکل آنزیم‌های اکسیداتیو فعال‌تر می‌شوند (Amirjani et al., 2014). اگرچه آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در خط مقدم دفاع علیه گونه‌های فعال اکسیژن عمل می‌کند، محصول عمل آن (H2O2) همچنان برای سلول سمی است و باید از سلول حذف شود (Mhamdi and Van Breusegem, 2018). برخی از آنزیم‌ها نظیر کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات‌پراکسیداز در حذف H2O2 از سلول نقش دارند (Laxa et al., 2019). کاتالاز مولکول H2O2 را به‌طور مستقیم حذف می‌کند و آن را به مولکول آب و اکسیژن تبدیل می‌کند؛ از‌این‌رو، آنزیم یادشده به قدرت کاهندگی نیاز ندارد و درنتیجه، سرعت فعالیت زیادی دارد؛ ولی چون تمایل آن به مولکول H2O2 کم است، تنها غلظت‌های زیاد H2O2 را حذف می‌کند و نمی‌تواند در غلظت‌های کم H2O2 به‌خوبی عمل کند. آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز با تمایل زیادی که نسبت به H2O2 دارد، این مولکول را در غلظت‌های کم (تنش‌های ملایم) که برای کاتالاز شناسایی نمی‌شوند، حذف می‌کند (Sofo et al., 2015)؛ علاوهبراین، محصول فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در کلروپلاست، H2O2 است که آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز نقش کلیدی در حذف آن دارد. آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز از آسکوربات به‌عنوان دهندۀ الکترون برای احیای مولکول H2O2 استفاده می‌کند (Matsuo et al., 2015) و نسبت به آنزیم کاتالاز در برابر تنش اکسیداتیو حساس‌تر است؛ از‌این‌رو، آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز تنها در تنش‌های ملایم و از طریق سیکل آسکوربات- گلوتاتیون عملکرد مناسبی در حذف H2O2 دارد. کاتالاز تمایل کمتری به مولکول H2O2 دارد و بنابراین، در غلظت‌های زیاد H2O2 (تنش شدید)، کمترآسیب می‌بیند و فعال‌تر از آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز عمل می‌کند. مولکول H2O2 در غلظت زیاد شدیداً به آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز حمله می‌کند و سبب بازدارندگی فعالیت آن می‌شود (De Carvalho, 2008). احیای نوری اکسیژن به رادیکال سوپراکسید که در کلروپلاست و به‌واسطۀ فتوسیستم I انجام می‌شود، واکنش مهلر (Mehler Reaction) نامیده می‌شود. آنزیم سوپراکسیددیسموتاز با دیسموتاسیون رادیکال سوپراکسید به پراکسیدهیدروژن و اکسیژن، نقش مهمی در حفاظت دستگاه فتوسنتزی در برابر تنش اکسیداتیو ایفا می‌کند (Mangano et al., 2017). در پژوهش حاضر، اِعمال تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول سبب افزایش سطح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی شد.
پلی‌اتیلن‌گلایکول با افزایش‌دادن بیان آنزیم‌های بیوسنتز‌کنندۀ پرولین و کاهش‌دادن فعالیت آنزیم‌های مخرب پرولین سبب افزایش میزان پرولین در گیاه زعفران می‌شود (Kafi and Rahimi, 2011)؛ علاوهبراین، پلی‌اتیلن‌گلایکول نوعی مادۀ محافظ اسمزی است که در حفظ تعادل آب، حفظ ثبات پروتئین‌ها، حفظ ساختار سه‌بعدی پروتئین‌ها و آنزیم‌ها، تثبیت‌کردن غشاها و دستگاه سنتز پروتئین، منبعی برای ذخیرۀ کربن و نیتروژن برای رشد پساز رفع تنش، کاهش‌دادن خطرهای ناشی از تولید ROS، جاروکردن رادیکال‌های هیدروکسیل، خاموش‌کردن اکسیژن یکتایی، تنظیم اسیدیتۀ سلولی و تنظیم نسبت NADP+/NADPH نقش دارد. گزارش شده است پرولین با پیوستن به فسفولیپیدهای غشایی و ایجاد تغییر در لایۀ هیدراتۀ اطراف ماکرومولکول‌های زیستی سبب حفظ و ثبات غشاها می‌شود (Chun et al., 2018). پرولین با جاروکردن یا کاهش‌دادن تولید اکسیژن یکتایی در کاهش آسیب نوری غشای تیلاکوئید‌ها مؤثر است (Wang et al., 2015). به نظر میرسد افزایش مقدار پرولین در تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول از ویژگیهای اسمولیتی و آنتی‌اکسیدانی آن ناشی می‌شود؛ همچنین افزایش محتوای پرولین را می‌توان به عوامل گوناگونی ازجمله کاهش استفاده از پرولین در سنتز پروتئین‌های سلولی، کاهش فعالیت پرولین‌اکسیداز، افزایش بیوسنتز پرولین از گلوتامات و تمایل به تجزیۀ پروتئین‌های سلولی به نفع تولید بیشتر آمینواسیدهایی مانند پرولین که به‌شکل مؤثری در تنظیم اسمزی عمل می‌کنند، مربوط دانست (Wu et al., 2017). انباشت مولکول‌های سازگاری مانند آمینواسیدهای پرولین در شرایط کم‌آبی از مهم‌ترین راهکارهای گیاهان برای تنظیم فشار اسمزی سلول و به‌تبع آن، حفظ تورژسانس سلول است؛ از سویی، افزایش پرولین به حفظ ساختارهای مولکولی، سم‌زدایی و پاک‌سازی گونه‌های فعال اکسیژن در سلول کمک می‌کند (Yooyongwech et al., 2013).
کلروفیل یکی از رنگیزه‌های اصلی کلروپلاست است که در فرایند فتوسنتز دخیل است. محتوای نسبی کلروفیل برگ‌های گیاه با میزان فتوسنتز آن ارتباط دارد و احتمالاً حفظ محتوای کلروفیل زیاد سبب حفظ عملکرد در شرایط تنش می‌شود. در شرایط تنش ناشی از پلی‌اتیلن‌گلایکول، سبزماندن برگ‌های گیاه به کارایی بیشتر مصرف آب و عملکرد بیشتر محصولات کشاورزی منجر می‌شود (Jangpromma et al., 2010).
بهطورکلی، سنتز متابولیت‌های ثانویه در گیاه متأثر از متابولیت‌های اولیه است و هر عاملی که سبب تقویت فتوسنتز و متابولیت‌های اولیه شود، افزایش مقادیر متابولیت‌های ثانویۀ گیاه را در پی دارد؛ نتایج پژوهش حاضر در زمینۀ افزایش بازده متابولیت‌های ثانویه در اثر پلی‌اتیلن‌گلایکول مطلب یادشده را تأیید می‌کنند. ترکیبات ثانویۀ شیمیایی در گیاهان تحت‌تأثیر چند ژن که بر اثر شرایط محیطی و تنش‌ها تغییر می‌کنند، سنتز می‌شوند و به نظر میرسد نقش مهمی در سازوکار دفاعی گیاهان دارویی در شرایط تنش دارند؛ در پژوهش حاضر نیز کاربرد پلی‌اتیلن‌گلایکول تأثیر معناداری بر تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاه زعفران داشت. پلی‌اتیلن‌گلایکول ممکن است از طریق تقویت مسیرهای درگیر در تولید متابولیت‌های ثانویه سبب افزایش ترکیبات مؤثرۀ گیاه زعفران شود و با تأثیر بر ساختمان آنزیم‌هایی که در مسیرهای بیوشیمیایی سنتز متابولیت‌های ثانویۀ گیاهی درگیر هستند، تولید این ترکیبات را بهبود بخشد (Purbajanti et al., 2019)؛ همچنین پلی‌اتیلن‌گلایکول از طریق القای پاسخ‌های دفاعی سبب بیوسنتز و انباشت متابولیت‌های ثانویه می‌شود. کروسین از روش غیرموالونیک‌اسید در پلاستیدها که مواد اولیۀ کاروتنوئیدها را به وجود می‌آورد و روش موالونیک‌اسید در سیتوپلاسم بیوسنتز می‌شود. مسیر موالونیک‌اسید با سنتز موالونات از سه مولکول استیل‌کوآنزیم A آغاز می‌شود و با تولید مولکول‌های ایزوپنتیل‌دی‌فسفات و ژرانیل‌پیروفسفات از طریق واکنش حلقوی‌شدن لیکوپن به‌واسطۀ آنزیم لیکوپن‌بتا‌سیکلاز، ترکیبات لیکوپن رنگی، بتاکاروتن و فیتوئن بی‌رنگ تولید می‌شوند. آنزیم بتاکاروتنوئیدهیدروکسیلاز هیدروکسیله‌شدن بتاکاروتن در مسیر موالونیک‌اسید را کاتالیز می‌کند که به تولید زئازانتین منجر می‌شود. عوامل رنگ (کروسین‌آلدهید) در زعفران از طریق شکست اکسایشی زئازانتین به‌وسیلۀ آنزیم 7 و 8 زئازانتین‌کلیواژ‌داکسیژناز به وجود می‌آیند. در زعفران، محصولات شکست اکسایشی زئازانتین به‌واسطۀ آنزیم گلوکوزیل‌ترانسفراز 2 در کروموپلاست کلاله گلوکزیله و سپس در واکوئل مرکزی کلاله ذخیره می‌شوند. واکنش حلقوی‌شدن لیکوپن را ژن لکوپن بتاسیکلاز CsLYC کد می‌کند. هیدروکسیل‌دارشدن بتاکاروتن را ژن CsBCH کد می‌کند و به تولید زئازانتین منجر می‌شود. ژن CsUGT2 در کروموپلاست کلاله آنزیم گلوکوزیل‌ترانسفراز 2 را کد می‌کند. مطالعۀ تغییرات کمّی و کیفی متابولیت‌های ثانویه در زعفران نشان داده است ژن‌های CsUGT2، CsLYC و CsBCH در تنظیم تغییرات رونویسی درگیر هستند (Mir et al., 2012; Ahrazem et al., 2010). تنظیم و رونویسی بیان ژن‌های کاروتنوئید، سازوکار مهمی است که با استفاده از آن، بیوسنتز و انباشت کاروتنوئیدهای خاص یا مشتقات آنها طی رشد گل و رسیدگی زعفران تنظیم می‌شود. بیوسنتز مشتقات کاروتنوئیدی اصلی زعفران شامل کروسین، پیکروکروسین و کروستین از طریق تجزیۀ اکسیداتیو زئازانتین و بتاکاروتن رخ می‌دهد. تجمع این کاروتنوئیدها در زعفران در سطح رونویسی ژن‌های PSY، BCHو β-LYC2 کنترل می‌شود. به نظر میرسد اعمال تیمار پلی‌اتیلن‌گلایکول با تأثیر بر بیان ژن‌های کروسین، کروستین و پیکروکروسین سبب افزایش محتوای این ترکیبات در گیاه زعفران می‌شود.
نتیجه‌گیری
تنش ناشی از کاربرد پلی‌اتیلن‌گلایکول سبب افزایش معنادار میزان پرولین آزاد گیاه و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی آن شد؛ بنابراین، به نظر میرسد میزان پرولین آزاد و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نشانگرهای مناسبی برای تنش هستند. کاربرد پلی‌اتیلن‌گلایکول محتوای متابولیت‌های ثانویۀ گیاه زعفران را به‌طور معناداری افزایش داد. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند افزایش رشد با افزایش فتوسنتز و تخصیص کربن بیشتر، علاوه‌بر اینکه سبب افزایش سنتز متابولیت‌های اولیه می‌شود، بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه را افزایش می‌دهد؛ درنتیجه، ازآنجاکه بسیاری از ترکیبات ثانویه در واکنش گیاهان نسبت به تنش‌ها و محرک‌های زیستی و غیرزیستی دخالت دارند، اهمیت مطالعۀ محتوای این ترکیبات در گیاه زعفران اهمیت دارد و این امر علاوه‌بر تعیین الگوی رشد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌های ثانویۀ این گیاه ایفا می‌کند؛ بنابراین می‌توان استفاده از این تیمار را به‌ویژه در شرایط نامساعد محیطی به تولیدکنندگان و بهره‌برداران این گیاه پیشنهاد کرد.
)
