Morphophysiological and Biochemical Responses of Crocus sativus ‎During the Interaction of Melatonin and Drought Stress

Document Type : Original Article


1 Departement of Biology, Factually of science, , Loresn University, Khorramabad, Iran

2 Department of Biology, Lorestan University

3 Faculty of Biology, Department of Plant Biology (Plant Physiology) University of Murcia, 30100 Murcia, Spain

4 Department of Biology, Lorestan University, Khorramabad, Iran


Melatonin increases stress tolerance in plants. Saffron's red stigmas are the main Iran's industrial and export products. The aim of this study was to investigate the effect of melatonin on some morphophysiological and biochemical characteristics of saffron under drought-stress conditions. Drought stress was applied by polyethylene glycol 6000 at 10% and 20% levels. Root treatment of melatonin was applied at a concentration of 100 μM. Drought stress, particularly 20% stress, led to a decrease in growth parameters. Under 20% stress, the amount of chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoids, and photosynthesis rate decreased by 22.32%, 35.84%, 51.35%, and 10.05%, respectively, while the ion leakage (2.70%), proline content (15.00%), and flavonoid (1.94%) increased. Exogenous application of melatonin has a positive effect on increasing plant resistance to drought stress by affecting physiological indicators such as photosynthetic parameters and the antioxidant system.
Drought is one of the limiting and effective abiotic factors in agricultural productivity in the world. Under drought stress conditions, plant growth factors decrease (Zhang et al., 2014; Brunner et al., 2015). Drought stress leads to the accumulation of reactive oxygen species in cells. Excessive accumulation of ROS causes lipid peroxidation and ion leakage. By inactivating enzymes, proteins, and nucleic acids, ROS reduces photosynthesis and the yield of crops (Altaf et al., 2022). Plants use different strategies to respond to stress. An increase in abscisic acid levels, compatible osmolyte content, protective enzyme activities, and antioxidant levels with inhibiting energy consumption pathways are among these strategies (Li et al., 2018). Natural or synthetic growth regulators such as melatonin can affect plant physiological processes at low concentrations. Melatonin regulates the biological responses of plants by modulating various physiological, biochemical, and molecular processes and finally increases the resistance of plants against drought conditions. Saffron with the common name Saffron and the scientific name Crocus sativus is from the Iridaceae family. As the most expensive agricultural and medicinal product in the world, saffron has a special place among Iran's industrial and export products (Farooq et al., 2009). Since most of the regions of Iran are facing the problem of water shortage, studying the responses of plants to water stress is of particular importance. The aim of this study was to investigate the potential improving effects of melatonin on the antioxidant and photosynthetic responses of Crocus sativus L. under drought-stress conditions.
Materials and Methods
After disinfection, the corms were washed and transferred to pots containing perlite. Irrigation and addition of Hoagland's nutrient solution were done at one-week intervals. In order to apply drought stress, polyethylene glycol 6000 was used at two levels of 10% and 20%. Root treatment of melatonin with a concentration of 100 μM was done after applying drought stress. The fresh and dry weight of the samples, the relative water content, and the amount of photosynthetic pigments were measured according to the methods of Moradi Rikabad et al. (2019), Martı̀nez et al. (2004), and Arnon (1949), respectively. The maximum photosystem quantum efficiency (Fv/Fm) II was measured using a fluorometer apparatus (Pocket PEA) and the amount of net photosynthesis (Pn) was measured using a portable gas exchange device model CI-340. In order to measure proline content, ninhydrin was used as a reagent, and proline was used as a standard. The sugar in the samples was measured by the phenol-sulfuric acid method. The leakage of electrolytes was measured by the method of Lutts et al. (1996). The amount of H2O2 was calculated using the extinction coefficient of 0.28 mmol/cm. The measurement of phenolic and flavonoid compounds was done by colorimetric method using Folin-Ciocaltue reagent and aluminum chloride, respectively. The free radicals inhibition was measured by the DPPH method. This research was conducted as a factorial study in the form of a completely randomized design in three replications. To analyze the data, Minitab 16.0 was used, and the significance levels of differences between samples were determined using Tukey's test at the P ≤ 0.05 statistical level. Microsoft Office Excel 2013 was used to draw the graphs.
Results and Discussion
The results of the study showed that drought stress decreases the height, fresh and dry weight, and relative water content of the plant. Exogenous melatonin improves plant growth factors in these conditions. Melatonin probably stimulates plant growth factors by affecting plant metabolites and increasing the biosynthesis of phytohormones and facilitating the absorption of nutrients (Arnao, 2014; Naghizadeh et al., 2019). According to the results, drought stress causes a decrease in the content of photosynthetic pigments, Pn, and Fv/Fm. In fact, drought stress disrupts the balance between the absorption capacity and the use of light energy, causing disruption in photosynthesis, and damage to the photosynthetic apparatus (Pinheiro & Chaves, 2011). Exogenous melatonin treatment protects chlorophyll against abiotic stress by reducing lipid peroxidation and regulating the downstream genes of chlorophyll degradation (Yu et al., 2018). Exogenous treatment of melatonin by modulating the stomatal pore can also improve plant growth and increase Pn under drought stress (Liu et al., 2020). In this study, drought stress led to an increase in proline and soluble sugars, although these changes were not significant.
The Exogenous application of melatonin in these conditions decreased the content of these osmolytes. Under stressful conditions, the accumulation of compatible osmolytes improves turgor pressure, thereby preventing cell dehydration (Liang et al., 2018). The Exogenous application of melatonin may maintain the water balance in the plant through other ways and thus regulate the cell turgor pressure and reduce the content of compatible osmolytes (Ibrahim et al., 2020, Altaf et al., 2022). The results showed that drought stress leads to an increase in hydrogen peroxide content and ion leakage, although these changes were not significant, exogenous application of melatonin caused a decrease in hydrogen peroxide content and ion leakage while the content of phenol and flavonoid were increased. Drought stress often causes the accumulation of reactive oxygen species, which results in cell membrane damage. Under stressful conditions, melatonin can increase the activity of the H+-ATPase pump and contribute to the stability of the plasma membrane (Wang et al., 2019).
The results of this study showed that melatonin increases the resistance of Crocus sativus L. against drought stress by regulating the physiological and biochemical responses. In today's conditions, where water scarcity is one of the most important challenges in world agriculture, the use of new growth regulators, including melatonin, can be effective in increasing the tolerance of plants to drought stress and improving the growth and quality of agricultural products.


Main Subjects


خشکی یکی از عوامل غیرزیستی محدودکننده و اثرگذار بر بهره‌وری کشاورزی در جهان است (Shohani et al., 2022). کمبود آب در جهان به‌ویژه در ایران رو به افزایش است. هنگامی که گیاهان تحت‌تأثیر تنش خشکی قرار می‌گیرند، فرایندهای رشدی آنها متوقف می‌شوند و طول ساقه و ریشه و وزن اندام‌ها کاهش می‌یابد (Zhang et al., 2014; Brunner et al., 2015). تنش خشکی با کاهش سرعت فتوسنتز، رشد گیاه را به‌طور مستقیم کاهش می‌دهد (Liang et al., 2018). اصلی‌ترین عامل محدود‌کنندۀ سرعت فتوسنتز طی تنش خشکی، بسته‌شدن روزنه‌ها است که سبب کاهش دسترسی به CO2 می‌شود (Ghotbi-Ravandi et al., 2014). تنش خشکی، تجمع گونه‌های فعال اکسیژن ازجمله O2•- و H2O2 را در سلول افزایش می‌دهد و ازآنجایی‌که این ترکیبات با غشای اندامک‌های سلولی مهم مانند میتوکندری و کلروپلاست در ارتباط هستند، تجمع بیش از حد آنها سبب پراکسیداسیون لیپیدها و نشت یونی می‌شود؛ علاوه‌بر‌این، گونه‌های فعال اکسیژن با غیرفعال‌کردن آنزیم‌ها، پروتئین‌ها و نوکلئیک‌اسیدها، فتوسنتز و بازده محصولات زراعی را کاهش می‌دهند (Altaf et al., 2022).

گیاهان راهبردهای مختلفی ازجمله افزایش موقتی سطوح آبسیزیک‌اسید، افزایش اسمولیت‌های سازگار، افزایش آنزیم‌های حفاظتی، افزایش سطح آنتی‌اکسیدان‎‌ها و مهار مسیرهای مصرف انرژی را برای پاسخ به تنش به کار می‌برند (Li et al., 2018) که در بین آنها، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی و تنظیم اسمزی در افزایش تحمل به تنش خشکی اهمیت ویژه‌ای دارند (Hatzig et al., 2014; Blum, 2017).

Noori et al. (2022) اثر روش‌های مختلف آبیاری در شرایط تنش آبی را بر ویژگی‌های بنه دختری و سطح فتوسنتزی گیاه زعفران بررسی کردند. نتایج پژوهش آنها نشان دادند کاهش مقدار آبیاری به‌منظور ایجاد تنش خشکی سبب کاهش معنادار تعداد برگ، طول برگ، وزن تر و خشک برگ، قطر بنه دختری، تعداد، وزن تر و وزن خشک بنه دختری می‌شود. بر اساس نتایج یادشده، دسترسی به آب کافی اهمیت ویژه‌ای دارد. Tavakoli et al. (2020) نشان دادند استفاده از پلی‌اتیلن‌گلایکول 12 درصد، تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاه زعفران را افزایش می‌دهد و در این شرایط، درصد مهار رادیکال‌های آزاد و فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی افزایش می‌یابد.

تنظیم‌کننده‌های رشد طبیعی یا مصنوعی مانند ملاتونین یکی از مهم‌ترین گروه‌های ترکیبات آلی هستند که در غلظت‌های کم نیز فرایندهای فیزیولوژیکی گیاه را تحت‌تأثیر قرار می‌دهند؛ این مولکول‌های علامت‌رسان از مهم‌ترین عوامل پاسخ‌دهنده به تنش‌ هستند. غلظت استفاده‌شده، شرایط فیزیولوژیکی گیاه و عوامل محیطی مؤثر بر جذب، سه عامل مهم و اثرگذار بر توانایی تنظیم‌کنندۀ رشد در مقاومت گیاهان به شرایط تنشی هستند (Quamruzzaman et al., 2021).

ملاتونین (N-acetyl-5-methoxytryptamine) از مشتقات تریپتوفان است که در موجودات زنده وجود دارد و برای نخستین بار در سال 1995، هاتوری آن را در گیاهان شناسایی کرد. این تنظیم‌کنندۀ رشد، نقش شبه‌هورمونی در گیاهان دارد (Zhang et al., 2019). ملاتونین، پاسخ‌های زیستی گیاهان را با تعدیل فرایندهای مختلف فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی تنظیم می‌کند و در نهایت، مقاومت گیاهان را برای تحمل شرایط خشکسالی افزایش می‌دهد (Cui et al., 2017; Campos et al., 2019; Sharma & Zheng, 2019). تنظیم دستگاه فتوسنتزی و سیستم دفاع ضداکسیداتیو، فرایندهای فیزیولوژیکی اصلی هستند که ملاتونین آنها را در شرایط کمبود آب کنترل می‌کند (Wang et al., 2013; Liang et al., 2019; Sharma & Zheng 2019). به‌تازگی، پژوهش‌های بسیاری به‌منظور کشف آثار این مولکول چندمنظوره در گیاهان در معرض تنش‌های غیرزیستی انجام شده‌اند؛ باوجوداین، تنش خشکی در مقایسه با تنش‌های دیگر کمتر مطالعه شده و به دانش جامعی در زمینۀ سازوکارهای دقیق تنظیم‌کنندۀ تحمل به خشکی با واسطۀ ملاتونین نیاز است (Sharma & Zheng, 2019). Imran et al. (2021) نشان دادند کاربرد خارجی ملاتونین به‌ویژه تیمار ریشه‌ای در غلظت 100 میکرومولار با ممانعت از تجمع پراکسیدهیدروژن و آسیب به غشا سبب محافظت از ویژگی‌های رشدی و رنگدانه‌های فتوسنتزی در گیاه سویا می‌شود. آنها بیان کردند این آثار احتمالاً با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز، آسکوربات‌پراکسیداز و گلوتاتیون‌پراکسیداز ارتباط دارند. گزارش‌ها نشان می‌دهند اسپری‌کردن آبسیزیک‌اسید و ملاتونین، وضعیت آب و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی برگ‌های در معرض تنش خشکی را در گیاه پنبه ارتقا می‌دهد و به حذف گونه‌های فعال اکسیژن و افزایش عملکرد الیاف پنبه منجر می‌شود (Hu et al., 2021).

زعفران با نام عمومی Saffron و نام علمی Crocus sativus از خانوادۀ زنبق (Iridaceae)، گیاهی است ژئوفیت و چندساله که در پاییز گل می‌دهد (Molina et al., 2005). کلالۀ قرمزرنگ این گیاه که حاوی سه متابولیت ثانویۀ اصلی به نام‌های کروسین )رنگیزه‌های کاروتنوئیدی محلول در آب و مسئول رنگ(، پیکروکروسین )گلیکوزید تلخ مزه و مسئول طعم زعفران) و سافرانال (جزء اصلی مواد فرار و مسئول طعم و مزه( است، به‌شکل ادویۀ غذا استفاده می‌شود (Vahedi et al., 2018). زعفران گران‌ترین محصول کشاورزی و دارویی جهان است و جایگاه ویژه‌ای بین محصولات صنعتی و صادراتی ایران دارد (Farooq et al., 2009).

ازآنجایی‌که ایران کشوری کم‌آب است، مطالعه در زمینۀ پاسخ‌های گیاهان به تنش کم‌آبی اهمیت ویژه‌ای دارد تا زمینۀ کشت وسیع‌تر محصولات مهمی مانند زعفران فراهم شود. هدف مطالعۀ حاضر، بررسی آثار احتمالی بهبوددهندۀ ملاتونین بر پاسخ‌‌های آنتی‌اکسیدانی و فتوسنتزی گیاه Crocus sativus L. در شرایط تنش خشکی است.


مواد و روش‌ها

آماده‌سازی و کاشت

بنه‌های جمعیت سرایان گیاه زعفران از شرکت مهتو خریداری و با محلول هیپوکلریت‌سدیم 5 درصد و سپس آب مقطر شستشو و به گلدان‌های حاوی پرلیت منتقل شدند. گلدان‌ها به اتاقک رشد (با دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد و دورۀ نوری 10 ساعت روشنایی و 14 ساعت تاریکی) منتقل شدند. آبیاری و اضافه‌کردن محلول غذایی هوگلند با فواصل یک‌هفته‌ای انجام شد؛ گفتنی است تا زمان بیرون‌آمدن جوانه‌ها از سطح پرلیت، گلدان‌ها تنها آب مقطر دریافت کردند. در هفتۀ ششم، به‌منظور اعمال تنش خشکی از پلی‌اتیلن‌گلایکول 6000 در دو سطح 10 درصد و 20 درصد که به‌ترتیب معادل منفی 48/1 و منفی 91/4 بار است، استفاده شد. تیمار ریشه‌ای ملاتونین با غلظت 100 میکرومولار به‌مدت 6 هفته پس از اعمال تنش خشکی انجام شد. گلدان‌ها به شش گروه تقسیم شدند؛ به این ترتیب که گروه اول هیچ‌گونه تنش یا تیمار ملاتونین دریافت نکردند، گروه دوم تنها در معرض تنش 10 درصد خشکی قرار گرفتند، گروه سوم تنها در معرض تنش 20 درصد خشکی قرار گرفتند، گروه چهارم تنها تیمار ریشه‌ای ملاتونین را دریافت کردند، گروه پنجم تنش خشکی 10 درصد و تیمار ریشه‌ای ملاتونین را دریافت کردند و گروه ششم تنش خشکی20 درصد و تیمار ریشه‌ای ملاتونین را دریافت کردند. برداشت نمونه‌ها در هفتۀ دوازدهم انجام و از نمونه‌های فریزرشده برای انجام سنجش‌های مدنظر استفاده شد.


اندازه‌گیری وزن تر، وزن خشک، ارتفاع گیاه و محتوای آب نسبی (RWC)

وزن تر نمونه‌ها هنگام برداشت اندازه‌گیری شد. نمونه‌ها به‌مدت 72 ساعت در آون با دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفتند و سپس وزن خشک آنها اندازه‌گیری شد (Moradi Rikabad et al., 2019). به‌منظور اندازه‌گیری محتوای آب نسبی، وزن تر برگ بی‌درنگ پس از برداشت اندازه‌گیری شد و سپس نمونه‌‌ها به‌مدت 24 ساعت در آب مقطر قرار گرفتند؛ در ادامه، آب سطحی آنها با دستمال کاغذی گرفته و وزن آنها (وزن آماس) دوباره یادداشت شد. سپس نمونه‌ها به‌مدت 48 ساعت در آون با دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفتند و سپس وزن خشک آنها اندازه‌گیری شد. محتوای آب نسبی از رابطۀ 1 محاسبه شد (Martı̀nez et al., 2004).

RWC (%)=(FW-DW/TW-DW)×100      (رابطۀ 1)

در این رابطه، FW: وزن تر،DW: وزن خشک و TW: وزن تورژسانس است.


اندازه‌گیری رنگدانه‌های فتوسنتزی (کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید)

محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی مطابق روش Arnon (1949) اندازه‌گیری شد. به این منظور، 06/0 گرم از بافت تازۀ برگ با 1 میلی‌لیتر استون (V/V) 80 درصد ساییده شد. عصارۀ استخراج‌شده به‌مدت 10 دقیقه در 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. حجم نهایی عصاره با استون به 1 میلی‌لیتر رسانده و جذب محلول رویی در سه طول موج 645، 663 و 470 نانومتر خوانده و میزان رنگدانه‌ها از رابطه‌های 2، 3 و 4 محاسبه شد (Arnon, 1949).


(رابطۀ 2)


(رابطۀ 3)


(رابطۀ 4)

که در آن، A663، A645 و A470 به‌ترتیب مقادیر جذب رنگدانه‌ها در طول موج‌های 645، 663 و 470 نانومتر را نشان می‌دهند. V و W به‌ترتیب حجم عصاره پس از فیلتراسیون و وزن تر نمونۀ برگ را نشان می‌دهند.


حداکثر کارایی کوانتومی فتوسیستم ‌(FV/Fm) II

میزان فلورسانس کلروفیل برگ‌ها با دستگاه فلورومتر (مدل Pocket PEA، ساخت کشور انگلیس) اندازه‌گیری شد. به‌این‌ترتیب که پس از اعمال تنش و تیمار ملاتونین، برگ‌ها به‌مدت 20 دقیقه با گیره‌های مخصوص در تاریکی قرار گرفتند و میزان فلورسانس آنها ثبت شد.


میزان فتوسنتز خالص (Pn)

میزان فتوسنتز خالص با دسـتگاه تبـادلات گازی قابـل‌حمـل (مدل CI-340، ساخت CID آمریکا) انــدازه‌گیــری شد. اساس کار ایــن دســتگاه بــر میــزان کربــن‌دی‌اکســید مصرفــی است. میزان فتوســنتز بــر اســاس میکرومــول )کربــن‌دی‌اکســید( بــر متــرمربــع در ثانیــه انــدازه‌گیــری شـد.


سنجش پرولین

به‌منظور سنجش محتوای پرولین از نین‌هیدرین به‌عنوان معرف و از پرولین به‌عنوان استاندارد استفاده شد. مقدار 3/0 گرم از بافت تازۀ برگ با 1 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک‌اسید 3 درصد ساییده شد. نمونه‌ها به‌مدت 20 دقیقه در 14000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. مقدار 200 میکرولیتر نین‌هیدرین و 200 میکرولیتر استیک‌اسید گلاسیال به 200 میکرولیتر از محلول رویی اضافه شد و نمونه‌ها به‌مدت 1 ساعت در دمای 100 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از خنک‌شدن، 200 میکرولیتر تولوئن اضافه و نمونه‌ها به‌مدت 10 تا 15 ثانیه ورتکس شدند و در نهایت، جذب آنها در طول موج‌ 520 نانومتر خوانده شد. میزان پرولین نمونه‌ها از رابطۀ حاصل از نمودار استاندارد و برحسب میلی‌گرم پرولین بر میلی‌گرم وزن تر گیاه گزارش شد (Bates et al., 1973).


قند کل

مقدار 1/0 گرم از بافت تازۀ برگ با نیتروژن مایع پودر و در 1 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار ساییده شد. نمونه‌ها به‌مدت 20 دقیقه در 13000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند و سپس محلول رویی جدا شد. مقدار 100 میکرولیتر از عصاره به 300 میکرولیتر سولفوریک‌اسید اضافه و به‌مدت 30 ثانیه ورتکس شد؛ در ادامه، نمونه‌ها در حمام یخ قرار گرفتند و سپس جذب آنها در طول موج 315 نانومتر خوانده شد. میزان قند نمونه‌ها از نمودار استاندارد گلوکز و با واحد میلی‌گرم گلوکز بر گرم وزن تر گیاه محاسبه شد (Albalasmeh et al., 2013).


نشت یونی

به‌منظور تعیین میزان نشت الکترولیت‌های سلول‌های برگ، مقدار 2/0 گرم از بافت برگ جدا و با آب مقطر شستشو شد. سپس نمونه‌ها به‌مدت 24 ساعت در لوله‌های شیشه‌ای حاوی 10 میلی‌لیتر آب مقطر قرار گرفتند و پس از آن، هدایت الکتریکـی محلول با دستگاه سنجش هدایت الکتریکی تعیین شد (EC1). در ادامه، ظروف حاوی نمونـه بـه‌مـدت 20 دقیقه در دستگاه اتوکلاو با دمای 120 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفتند و پس از کاهش دما، هدایت الکتریکی آنها دوباره اندازه‌گیری شد (EC2). درصد نشت الکترولیت از رابطۀ 5 محاسبه شد (Lutts et al., 1996):

EC (%) = (EC1/ EC2) ×100             (رابطۀ 5)


سنجش H2O2.

مقدار 3/0 گرم از بافت تازۀ برگ با 1 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک‌اسید 1/0 درصد ساییده و به‌مدت 20 دقیقه در 14000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی جدا شد. مقدار 200 میکرولیتر از عصاره با 50 میکرولیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار مخلوط و سپس 200 میکرولیتر پتاسیم‌یدید 1 مولار به آن اضافه شد و به مدت 1 ساعت در تاریکی قرار گرفت و درنهایت، جذب نمونه‌ها در طول موج 390 نانومتر خوانده شد. میزان H2O2 با استفاده از ضریب خاموشی 28/0 میلی‌مولار‌بر‌سانتی‌متر محاسبه شد (Imran et al., 2021).


سنجش محتوای فنل و فلاونوئید

مقدار 3/0 گرم از بافت تازۀ برگ پودر و در 2 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد ساییده شد. سپس نمونه‌ها به‌مدت 20 دقیقه در 14000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. به‌منظور سنجش ترکیبات فنلی، 300 میکرولیتر معرف فولین-سیو کالچو 1/0 رقیق‌شده در آب مقطر و 200 میکرولیتر آب مقطر به 20 میکرولیتر از محلول رویی اضافه شد و پس از گذشت 60 ثانیه، مقدار 300 میکرولیتر کربنات‌سدیم 20 درصد اضافه شد. نمونه‌ها به‌مدت 2 ساعت به مکانی تاریک با دمای اتاق منتقل شدند و سپس جذب آنها در طول موج 760 نانومتر خوانده شد. میزان فنل عصاره‌ها از رابطۀ حاصل از نمودار استاندارد (رابطۀ 6) و برحسب میکروگرم گالیک‌اسید در میلی‌گرم وزن تر گیاه گزارش شد (Hemmati Hassan Gavyar & Amiri, 2018).

Absorbance :0.0016 Gallic acid (μg) +0.0488 (r2 = 0.9802)                     (رابطۀ 6)

به‌منظور سنجش محتوای فلاونوئید، 300 میکرولیتر متانول، 20 میکرولیتر کلرید‌آلومینیوم 10 درصد،20 میکرولیتر استات‌پتاسیم 1 مولار و 560 میکرولیتر آب مقطر به 100 میکرولیتر محلول رویی اضافه و پس از گذشت 40 دقیقه، جذب آنها در طول موج 420 نانومتر خوانده شد. درنهایت، میزان فلاونوئید عصاره‌ها از رابطۀ حاصل از نمودار استاندارد (رابطۀ 7) و برحسب میکروگرم کوئرستین در میلی‌گرم وزن تر گیاه گزارش شد (Hemmati Hassan Gavyar & Amiri, 2018).

Absorbance: 0.0091quercetin (μg) +0.0206 (r2 = 0.995)                                     (رابطۀ 7)


بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی با روش DPPH

مقدار 3/0 گرم از بافت تازۀ برگ در 2 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد ساییده شد و سپس نمونه‌ها به‌مدت 20 دقیقه در 14000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. مقدار 50 میکرولیتر از محلول رویی به 1 میلی‌لیتر از محلول 004/0 درصد وزنی- حجمی DPPH حل‌شده در متانول اضافه شد. پس از نیم ساعت که نمونه‌ها در تاریکی و دمای اتاق قرار داشتند، جذب آنها در طول موج 517 نانومتر خوانده شد. درصد مهار رادیکال‌های آزاد از رابطۀ 8 محاسبه شد (Hemmati Hassan Gavyar & Amiri, 2018).

I%= (Ablank-Asample/Ablank)                (رابطۀ 8)

در این رابطه، Ablank: جذب واکنش شاهد منفی و Asample: جذب نمونه مدنظر در مخلوط واکنشی است.


مطالعه‌های آماری.

مطالعۀ حاضر به‌شکل فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و در سه تکرار انجام شد. تمام داده‌ها به‌طور میانگین و مقادیر انحراف از استاندارد آنها در سه تکرار گزارش شدند. به‌منظور تجزیه‌وتحلیل داده‌ها از نرم‌افزار مینی‌تب 16 استفاده و سطوح معناداری تفاوت بین نمونه‌ها با آزمون توکی در سطح احتمال 5 درصد تعیین شد. نرم‌افزار Excel 2013 برای رسم نمودارها استفاده شد.





شاخص‌های رشد

نتایج مطالعۀ حاضر نشان دادند تنش خشکی به کاهش وزن تر، وزن خشک، ارتفاع و محتوای آب نسبی گیاه در مقایسه با گروه شاهد منجر می‌شود؛ به‌طوری‌که تغییرات کاهشی نسبت به گروه شاهد در تنش‌های 10 و 20 درصد خشکی برای وزن تر به‌ترتیب 34/9 و 48/23 درصد، وزن خشک به‌ترتیب 18/14 و 40/39 درصد، ارتفاع به‌ترتیب 16/10 و 06/19 درصد و محتوای آب نسبی به‌ترتیب 193/13 و 98/25 درصد بود؛ از سوی دیگر تیمار ملاتونین، شاخص‌های ‌یادشده را در شرایط تنش افزایش داد و این افزایش در سطح 20 درصد چشمگیرتر از 10 درصد بود. در شرایط تنش 20 درصد، ملاتونین 09/17 درصد وزن تر، 12/15 درصد وزن خشک، 57/21 درصد ارتفاع و 61/8 درصد محتوای آب نسبی را در مقایسه با گروه‌های شاهد مربوطه افزایش داد (جدول 1).


جدول 1- مقایسه میانگین صفت‌های وزن تر (FW)، وزن خشک (DW)، ارتفاع (SH) و محتوای آب نسبی (RWC) گیاه زعفران در شرایط تنش خشکی (10 و 20 درصد) و ملاتونین (100 میکرومولار). مقادیر، میانگین‌ 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حـروف یکسـان، وجودنداشتن اخـتلاف معنـا‌دار در سـطح P<0.05 با آزمون توکی را نشان می‌دهند. گروه کنترل (C)، ملاتونین (Mel)

Table1- Effect of drought stress (10% and 20%) and melatonin (100 µM) on FW, DW, SH, and RWC. The values presented are mean ±SE (n=3). The same letters indicate no significant difference at the p < 0.05. C: Control; Mel: Melatonin. FW: Fresh weight; DW: Dry weight; SH: Shoot height; RWC: Relative water content.


FW (g)

DW (g)

SH (cm)


None Drought






4.634 ± 0.04a

0.7833 ± 0.01a

20.67 ± 0.33a

81.18 ± 2.47a

Mel 100 µM

4.297 ± 0.04ab

0.675 ±0.00ab

23.57 ± 0.47a

78.6 ± 3.23bab







3.977 ± 0.06b

0.666 ± 0.01b

18.57 ± 0.35cd

70.47 ± 2.37bc

Mel 100

4.193 ±0.04b

0.6704 ± 0.03ab

21.93 ± 1.03ab

72.88 ± 0.080abc







2.808 ± 0.10d

0.525 ± 0.05c

16.73 ± 0.27d

60.09 ± 3.84d

Mel 100

3.387 ± 0.09c

0.6185 ± 0.03bc

21.33 ± 0.44abc

65.75 ± 1.19cd








شاخص‌های فتوسنتزی گیاه

تنش خشکی به کاهش میزان کلروفیل‌ها و کاروتنوئید در مقایسه با گروه شاهد منجر شد. در شرایط تنش 10 و 20 درصد، میزان کلروفیل a به‌ترتیب 01/10 و 32/22 درصد، کلروفیل b به‌ترتیب 81/5 و 84/35 درصد و کاروتنوئیدها به‌ترتیب 05/10 و 60/15 درصد در مقایسه با گروه شاهد کاهش نشان دادند (شکل‌های 1A, B ,C)؛ این کاهش در کلروفیل a و کلروفیل b طی تنش 10 درصد معنادار نبود. اثر کاهشی یادشده در حضور ملاتونین به افزایشی تبدیل شد؛ به‌طوری‌که در مقایسه با گروه‌های مربوطۀ در معرض تنش، کلروفیل a 62/5 و 36/13 درصد، کلروفیل b 11/1 و 10/31 درصد و کاروتنوئیدها 85/25 و 28/29 درصد به‌ترتیب برای تنش‌های 10 و 20 درصد افزایش نشان دادند. میزان فتوسنتز (Pn) در شرایط تنش و به‌ویژه تنش 20 درصد در مقایسه با گروه شاهد به‌طور معناداری کاهش یافت (شکل 1D)؛ این کاهش در تنش 10 و 20 درصد در مقایسه با گروه شاهد به‌ترتیب 10/30 و 35/51 درصد بود. بیشترین میزان فتوسنتز ( 7/28 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه) در گروه چهارم، یعنی گروهی که تنها ملاتونین دریافت کرده بودند، مشاهده شد. گروه‌های دریافت‌کنندۀ ملاتونین در شرایط تنش 10 و 20 درصد به‌ترتیب 33/70 و 74/65 درصد در مقایسه با گروه‌های شاهد در معرض تنش، افزایش میزان فتوسنتز نشان دادند. همان‌طور که انتظار می‌رفت کارایی فتوسیستم II (Fv/Fm) در شرایط تنش کاهش یافت و بیشترین مقدار این مؤلفه (8393/0)در غیاب تنش و در گروه دریافت‌کنندۀ ملاتونین و کمترین مقدار آن (826/0) در گروهی که تنها تنش 20 درصد را دریافت کرده بود، مشاهده شد (شکل 1E). به‌طور‌کلی تنش خشکی سبب کاهش شاخص‌های فتوسنتزی شد و در این شرایط، ملاتونین اثر مثبت و بهبوددهنده داشت (شکل 1).


اسمولیت‌های سازگار

تنش خشکی، میزان اسمولیت‌های سازگار (پرولین و قند) را به‌طور غیرمعناداری افزایش داد؛ درحالی‌که ملاتونین اثر کاهشی بر آنها داشت (شکل 2A, B). گروه‌های شاهد دریافت‌کنندۀ تنش 20 درصد، بیشترین میزان پرولین (123/0میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر) و قند (16/104میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر) را داشتند. کمترین میزان پرولین (097/0میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر) و قند (02/87 میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر) در گروه پنجم، یعنی گروه در معرض تنش 10 درصد و دریافت‌کنندۀ ملاتونین، مشاهده شد. میزان پرولین و قند در تنش‌ 20 درصد و در حضور ملاتونین به‌ترتیب 98/10 میلی‌گرم بر گرم وزن تر و 36/99 میلی‌گرم بر گرم وزن تر بود.


نشت یونی و پراکسید هیدروژن.

افزایش نشت یونی و تولید H2O2 در سلول‌های در معرض تنش خشکی اعمال‌شده معنادار نبود. گروه دریافت‌کنندۀ تنش 20 درصد، بیشترین میزان نشت یونی (22/46 درصد) را نشان داد (شکل3A, B)؛ بیشترین میزان H2O2 (23/9 میکرومول بر گرم وزن تر) نیز در این گروه مشاهده شد. حضور ملاتونین سبب ثبات و پایداری غشای سلولی گیاه می‌شود؛ به‌طوری‌که گروه شاهد دریافت‌کنندۀ ملاتونین، میزان نشت یونی و  H2O2را به‌ترتیب 69/3 و 37/47 درصد در مقایسه با گروه شاهد کاهش داد. میزان کاهش نشت یونی در گروه‌های در معرض تنش 10 و 20 درصد و دریافت‌کنندۀ ملاتونین در مقایسه با گروه شاهد (گروه اول) به‌ترتیب 38/10 و 57/5 درصد بود؛ میزان کاهش H2O2 در این گروه‌ها به‌ترتیب 51/22 و 56/10 درصد بود (شکل 3).








شکل 1- مقایسه میانگین کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کاروتنوئیدها (C)، میزان فتوسنتز (Pn)  (D)و کارایی فتوسیستم II (Fv/Fm) (E) گیاه زعفران در شرایط تنش خشکی (10 و 20 درصد) و ملاتونین (100 میکرومولار). مقادیر، میانگین‌ 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حـروف یکسـان، وجودنداشتن اخـتلاف معنـا‌دار در سـطح P<0.05 با آزمون توکی را نشان می‌دهند.

Figure 1- The effect of drought stress (10% and 20%) and melatonin (100 µM) on Chl a (A), Chl b (B), Car (C), Pn (D), Fv/Fm (E). The values presented are mean ±SE (n=3). The same letters indicate no significant difference at the p < 0.05. Mel: Melatonin, Pn: Net photosynthesis; Fv/Fm: Maximum quantum efficiency of photosystem II; Car: Carotenoid; Ch a: Chlorophyll a; Chl b: Chlorophyll b.




شکل 2- مقایسه میانگین پرولین (A) و قندهای محلول (B) گیاه زعفران در شرایط تنش خشکی (10 و 20 درصد) و ملاتونین (100 میکرومولار). مقادیر، میانگین‌ 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حـروف یکسـان، وجودنداشتن اخـتلاف معنـا‌دار در سـطح P<0.05 با آزمون توکی را نشان می‌دهند.

Figure 2- The effect of drought stress (10% and 20%) and melatonin (100 µM)  on proline content (A) and soluble sugars (B). The values presented are mean ±SE (n=3). The same letters indicate no significant difference at the p < 0.05. Mel: Melatonin.




شکل3- مقایسه میانگین نشت یونی (A) و پراکسید هیدروژن (B) گیاه زعفران در شرایط تنش خشکی (10% و 20%) و ملاتونین (100 میکرومولار) مقادیر، مقادیر، میانگین‌ 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حـروف یکسـان، وجودنداشتن اخـتلاف معنـا‌دار در سـطح P<0.05 با آزمون توکی را نشان می‌دهند.

Figure 3- The effect of drought stress (10% and 20%) and melatonin (100 µM) on the EL% (A) and H2O2 content (B). The values presented are mean ±SE (n=3). The same letters indicate no significant difference at the p < 0.05. Mel: Melatonin, EL: Electrolyte leakage.



آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی

تنش خشکی محتوای فنل و فلاونوئید را در گیاه زعفران افزایش داد. تفاوت افزایش محتوای فنل بین تیمارهای 10 و 20 درصد معنادار نبود؛ درحالی‌که افزایش محتوای فلاونوئید طی اعمال تنش‌های یادشده تفاوت معناداری را نشان داد (شکل4A, B). ملاتونین سبب افزایش محتوای فنل و فلاونوئید شد؛ به‌طوری‌که گروه چهارم، یعنی گروهی که تنها ملاتونین را دریافت کرده بودند، بیشترین میزان فنل و فلاونوئید (افزایش 55/14 و 59/16 درصدی در مقایسه با گروه شاهد به‌ترتیب برای فنل و فلاونوئید) را داشتند؛ افزایش یادشده در گروه‌های پنجم و ششم طی تنش‌های 10 و 20 درصد (20/2 و 18/5 درصد) و (77/5 و 60/3 درصد) به‌ترتیب برای فنل و فلاونوئید بود. کمترین مقدار فنل (58/64 میکروگرم گالیک‌اسید بر میلی‌گرم وزن تر) و فلاونوئید (12/13 میکروگرم کوئرستین بر میلی‌گرم وزن تر) نیز در گروه شاهد مشاهده شد (شکل4A, B). درصد مهار رادیکال‌های آزاد DPPH در عصاره‌های گیاهی با محتوای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی ارتباط مستقیم دارد. نتایج حاضر نشان دادند با افزایش شدت تنش (میزان فنل و فلاونوئید در این شرایط افزایش یافت)، درصد مهار رادیکال‌های آزاد DPPH افزایش می‌یابد. افزایش یادشده در تنش‌های 10 و 20 درصد به‌ترتیب 86/12 و 57/18 در مقایسه با گروه شاهد بود. حضور ملاتونین سبب افزایش مهار رادیکال‌های آزاد DPPH شد و گروه چهارم، یعنی گروهی که تنها ملاتونین دریافت کرده بود، بیشترین درصد مهار (69/18 درصد) را در مقایسه با گروه شاهد نشان داد (شکل4C).





شکل 4- مقایسه میانگین محتوای فنل (A)، محتوای فلاونوئید (B) و درصد مهار رادیکال‌های آزاد DPPH (C) گیاه زعفران در شرایط تنش خشکی (10 و 20 درصد) و ملاتونین (100 میکرومولار). مقادیر، میانگین‌ 3 تکرار ± انحراف معیار هستند. حـروف یکسـان، وجودنداشتن اخـتلاف معنـا‌دار در سـطح P<0.05 با آزمون توکی را نشان می‌دهند.

Figure 4- The effect of drought stress and melatonin on the content of Phenol (A), Flavonoid (B) and Antioxidant activity% (C). The values presented are mean ±SE (n=3). The same letters indicate no significant difference at the p < 0.05. Mel: Melatonin.




تنش خشکی با تأثیر بر فرایندهای فیزیولوژیک، بیوشیمیایی و متابولیکی به کاهش رشد در گیاهان منجر می‌شود. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند تنش خشکی سبب کاهش ارتفاع، وزن تر، وزن خشک و محتوای آب نسبی گیاه می‌شود و کاربرد بیرونی ملاتونین در این شرایط سبب بهبود رشد گیاه می‌شود. همسو با نتایج حاضر، Aslezaeem et al. (2018) بیان کردند تنش خشکی به کاهش وزن ﺗﺮ و وزن خشک ﺑﺮگ ﺟﻤﻌﻴت‌های ﻣﺨﺘﻠﻒ زﻋﻔﺮان زراعی )دیهوک، نطنز و آریانشهر) منجر می‌شود. نتایج پژوهش Noori et al. (2022) نشان دادند کاهش مقدار آب آبیاری از 100 درصد به 70 و 40 درصد به‌علت ایجاد تنش خشکی سبب کاهش معنادار وزن تر و وزن خشک برگ زعفران می‌شود. اثر بهبوددهندۀ ملاتونین بر شاخص‌های رشدی گوجه‌فرنگی و کلزا در شرایط تنش خشکی گزارش شده است (Li et al., 2018; Altaf et al., 2022). احتمالاً ملاتونین با تأثیر بر متابولیت‌های گیاهی و افزایش میزان بیوسنتز فیتوهورمون‌ها ازجمله اکسین و سیتوکینین و تسهیل جذب مواد غذایی، رشد گیاه را تحریک می‌کند (Arnao, 2014; Naghizadeh et al., 2019). ملاتونین با افزایش فشار تورگور و محتوای آب نسبی برگ سبب بهبود رشد در شرایط تنش می‌شود  .(Naghizadeh et al., 2019)

باتوجه‌به نتایج حاضر، تنش خشکی سبب کاهش محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی (کلروفیل‌ها و کاروتنوئید)، Pn و Fv/Fm می‌شود. نتایج حاضر مشابه با پژوهش‌های سایر پژوهشگران ازجمله Sheikhalipour et al. (2022)، Altaf et al. (2022) و Liu et al. (2020) روی گیاهان استویا، گوجه‌فرنگی و تنباکو نشان می‌دهند تنش خشکی با ایجاد اختلال در فعالیت‌های فتوسنتزی سبب کاهش شاخص‌های فتوسنتزی ازجمله محتوای کلروفیل‌ها، کاروتنوئید، Pn و Fv/Fm می‌شود. نتایج مطالعه‌های یادشده همسو با نتایج پژوهش حاضر، اثر بهبوددهنده و افزایشی ملاتونین بر شاخص‌های فتوسنتزی را تأیید می‌کنند. مطالعه‌های پیشین بیان می‌کنند ملاتونین آثار منفی ناشی از تنش خشکی بر شاخص‌های فتوسنتزی را کاهش می‌دهد. در واقع تنش خشکی با برهم‌زدن تعادل بین ظرفیت جذب و استفاده از انرژی نورانی سبب اختلال در فتوسنتز می‌شود و به دستگاه فتوسنتزی آسیب‌ها می‌زند .(Pinheiro & Chaves, 2011) بسته‌شدن روزنه و کاهش غلظت CO2 درونی در شرایط کمبود آب، تقاضا برای NADPH در چرخۀ کالوین را کاهش می‌دهد و این امر سبب داکسیداسیون و مسدودشدن زنجیرۀ انتقال الکترون می‌شود؛ در نتیجه، زنجیرۀ انتقال الکترون فتوسنتزی از اکسیژن به‌عنوان پذیرندۀ الکترون استفاده و اشکال اکسیژن یکتایی را تولید می‌کند (Liang et al., 2018). انرژی نورانی اضافی سبب تحریک واکنش مهلر می‌شود که نتیجۀ آن، تولید آنیون سوپراکسید (Driever & Baker, 2011) و رادیکال آزاد پراکسید هیدروژن است که لیپیدهای غشایی را اکسید می‌کنند. تخریب غشاهای لیپیدی ازجمله ساختارهای لیپیدی کلروپلاست به آسیب رنگیزه‌های فتوسنتزی ازجمله کلروفیل منجر می‌شود و از این طریق بر کاهش میزان فتوسنتز تأثیر می‌گذارد. تیمار خارجی ملاتونین از طریق کاهش پراکسیداسیون لیپیدها و حفاظت از غشاهای سلولی از یک سو و تنظیم ژن‌های پایین‌دست تجزیه‌کنندۀ کلروفیل (فئوفیتیناز و کلروفیلاز) از سوی دیگر سبب محافظت از کلروفیل در برابر تنش ‌می‌شود (Yu et al., 2018). تیمار خارجی ملاتونین با تنظیم اندازۀ روزنه‌ها می‌تواند سبب بهبود رشد گیاه و افزایش Pn در شرایط تنش خشکی شود (Liu et al., 2020). کاربرد خارجی ملاتونین به افزایش تجمع ملاتونین در کلروپلاست‌ها منجر می‌شود و ازآنجایی‌که خود ملاتونین دارای ویژگی آنتی‌اکسیدانی است، سبب بهبود نسبت Fv/Fm می‌شود و به‌این‌ترتیب از ایجاد آسیب به کلروپلاست‌ها و خسارت به دستگاه فتوسنتزی جلوگیری می‌کند .(Fleta‐Soriano et al., 2017; Imran et al., 2021)

یکی از سازوکارهایی که گیاهان برای رویارویی با تنش خشکی به کار می‌برند، افزایش محتوای اسمولیت‌های سازگار است. در مطالعۀ حاضر، تنش خشکی به افزایش پرولین و قندهای محلول منجر شد؛ هرچند این تغییرات معنادار نبود. کاربرد بیرونی ملاتونین در شرایط تنش یادشده سبب کاهش محتوای اسمولیت‌های سازگار می‌شود. در شرایط تنشی، تجمع اسمولیت‌های سازگار سبب بهبود فشار تورگور می‌شود و از دهیدراتاسیون سلول‌ها جلوگیری می‌کند (Liang et al., 2018)؛ از دیگر نقش‌های مهم این ترکیبات می‌توان به نقش آنها در حفاظت از ساختار آنزیم‌ها، هورمون‌های گیاهی، غشاهای سلولی و سایر اجزای سلولی اشاره کرد. حضور این اسمولیت‌ها در تعادل کربن-نیتروژن، انتقال سیگنال، پتانسیل ردوکس و اسیدیته بسیار مهم است (Namvar et al., 2017). هم‌راستا با نتایج مطالعۀ حاضر، نتایج سایر پژوهشگران نشان می‌دهند تنش خشکی به افزایش محتوای اسمولیت‌های سازگار منجر می‌شود؛ در‌حالی‌که در این شرایط، کاربرد خارجی ملاتونین ممکن است دیگر مسیرهای تعادل آبی در گیاه را حفظ کند و به‌این‌ترتیب سبب تنظیم فشار تورگور سلولی و کاهش محتوای اسمولیت‌های سازگار شود  .(Ibrahim et al., 2020, Altaf et al., 2022)

تنش خشکی سبب افزایش محتوای پراکسید‌هیدروژن و نشت یونی شد و اگرچه این تغییرات معنادار نبودند، کاربرد خارجی تنظیم‌کنندۀ رشد ملاتونین سبب کاهش محتوای پراکسید‌هیدروژن و نشت یونی شد؛ در‌حالی‌که محتوای آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی فنل و فلاونوئید افزایش یافت. مطالعه‌های Sharifi et al. (2020)، Altaf et al. (2022) و Sheikhalipour et al. (2022) همسو با نتایج حاضر نشان دادند تنش خشکی در گیاهان زعفران، گوجه‌فرنگی و استویا سبب افزایش H2O2 و نشت یونی می‌شود و در این شرایط، ترکیبات فنلی افزایش می‌یابند. کاربرد خارجی ملاتونین مشابه با داده‌های پژوهش حاضر سبب کاهش محتوای پراکسیدهیدروژن، افزایش میزان فنل و افزایش درصد مهار رادیکال‌های آزاد شد. اغلب تنش خشکی سبب تجمع گونه‌های فعال اکسیژن می‌شود و نتیجۀ آن، ایجاد تنش‌های اکسیداتیو و آسیب به غشای سلولی است(Cruz de Carvalho, 2008). هنگام ایجاد آسیب اکسیداتیو، گیاهان سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی خود مانند سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی را فعال می‌کنند. در شرایط تنشی، ملاتونین فعالیت پمپ H+-ATPase را افزایش می‌دهد و در واقع طی شرایط تنش، ملاتونین به 5-متوکسی‌تریپتامین تبدیل می‌شود که این ترکیب تحریک‌کنندۀ فعالیت پمپ H+-ATPase در گیاهان است و از این طریق می‌تواند به ثبات غشای پلاسمایی کمک کند (Wang et al., 2019). گروه‌های هیدروکسیل موجود در ساختار فنل‌ها و فلاونوئیدها سبب مهار رادیکال‌های آزاد می‌شوند و به‌این‌ترتیب از آسیب به غشاهای سلولی جلوگیری می‌کنند (Naghizadeh et al., 2019; Sheikhalipour et al., 2022) .



نتایج مطالعۀ حاضر نشان دادند ملاتونین با تنظیم پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه زعفران سبب افزایش مقاومت این گیاه در برابر تنش خشکی می‌شود. نتایج نشان می‌دهند در شرایط امروزی که کشاورزی جهان با بحران کم‌آبی روبه‌رو است، کاربرد تنظیم‌کننده‌های رشد نوین ازجمله ملاتونین در افزایش تحمل گیاهان به خشکی و بهبود رشد و کیفیت محصولات کشاورزی مؤثر است.

Albalasmeh, A. A, Berhe, A. A., & Ghezzehei, T. A. (2013). A new method for rapid determination of carbohydrate and total carbon concentrations using UV spectrophotometry. Carbohydrate Polymers, 97(2), 253-261.‏
Altaf, M. A., Shahid, R., Ren, M. X., Naz, S., Altaf, M. M., Khan, L. U., ... & Ahmad, P. (2022). Melatonin improves drought stress tolerance of tomato by modulating plant growth, root architecture, photosynthesis, and antioxidant defense system. Antioxidants, 11(2), 309.
Arnao, M. B., & Hernandez-Ruiz, J. (2014). Melatonin: plant growthregulator and/or biostimulator during stress? Trends in Plant Science, 19, 789–797.
Arnon, D. I. (1949). Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgarisPlant Physiology24(1), 1-15‏.
Aslezaeem, F., Niknam, V., Ebrahimzadeh, H., & Sharifi, G. (2018). Comparative study of drought stress and salicylic acid effects on different accessions of saffron (Crocus Sativus L.). Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology), 31(3), 483-498 [In Persian].
Bates, L. S., Waldren, R. A., & Teare, I. D. (1973). Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39, 205-207.
Blum, A. (2017). Osmotic adjustment is a prime drought stress adaptive engine in support of plant production. Plant Cell & Environment, 40(1), 4-10.‏
Brunner, I., Herzog, C., Dawes, M. A., Arend, M., & Sperisen, C. (2015). How tree roots respond to drought. Frontiers in Plant Science, 6, 547.‏
Campos, C. N., Ávila, R. G., de Souza, K. R. D., Azevedo, L. M., & Alves, J. D. (2019). Melatonin reduces oxidative stress and promotes drought tolerance in young Coffea arabica L. Plants Agricultural Water Management, 211, 37-47.
Cruz de Carvalho, M. H. (2008). Drought stress and reactive oxygen species: production, scavenging and signaling. Plant Signaling & Behavior, 3(3), 156-165.‏
Cui, G., Zhao, X., Liu, S., Sun, F., Zhang, C., & Xi, Y. (2017). Beneficial effects of melatonin in overcoming drought stress in wheat seedlings. Plant Physiology and Biochemistry, 118, 138-149.
Driever, S. M., & Baker, N. R. (2011). The water–water cycle in leaves is not a major alternative electron sink for dissipation of excess excitation energy when CO2 assimilation is restricted. Plant, Cell & Environment, 34(5), 837-846.‏
Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N. S. M. A., Fujita, D. B. S. M. A., & Basra, S. M. A. (2009). Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Sustainable agriculture, 153-188.‏
Fleta‐Soriano, E., Díaz, L., Bonet, E., & Munné‐Bosch, S. (2017). Melatonin may exert a protective role against drought stress in maize. Journal of Agronomy and Crop Science 203(4), 286-294.
Ghotbi‐Ravandi, A. A., Shahbazi, M., Shariati, M., & Mulo, P. (2014). Effects of mild and severe drought stress on photosynthetic efficiency in tolerant and susceptible barley (Hordeum vulgare L.) genotypes. Journal of Agronomy and Crop Science, 200(6), 403-415.‏
Hatzig, S., Zaharia, L. I., Abrams, S., Hohmann, M., Legoahec, L., Bouchereau, A., ... & Snowdon, R. J. (2014). Early osmotic adjustment responses in drought‐resistant and drought‐sensitive oilseed rape. Journal of Integrative Plant Biology, 56(8), 797-809.‏
Hemmati Hassan Gavyar, P., & Amiri, H. (2018). Chemical composition of essential oil and antioxidant activity of leaves and stems of Phlomis lurestanicaInternational Journal of Food Properties, 21(1), 1414-1422.‏
Hu, W., Zhang, J., Yan, K., Zhou, Z., Zhao, W., Zhang, X., ... & Yu, R. (2021). Beneficial effects of abscisic acid and melatonin in overcoming drought stress in cotton (Gossypium hirsutum L.). Physiologia Plantarum, 173(4), 2041-2054.‏
Ibrahim, M. F., Elbar, O. H. A., Farag, R., Hikal, M., El-Kelish, A., El-Yazied, A. A., ... & El-Gawad, H. G. A. (2020). Melatonin counteracts drought induced oxidative damage and stimulates growth, productivity and fruit quality properties of tomato plants. Plants9(10), 1276.
Imran, M., Latif Khan, A., Shahzad, R., Aaqil Khan, M., Bilal, S., Khan, A., ... & Lee, I. J. (2021). Exogenous melatonin induces drought stress tolerance by promoting plant growth and antioxidant defence system of soybean plants. AoB Plants 13(4), 26.‏
Li, J., Zeng, L., Cheng, Y., Lu, G., Fu, G., Ma, H., ... & Li, C. (2018). Exogenous melatonin alleviates damage from drought stress in Brassica napus L.(rapeseed) seedlings. Acta Physiologiae Plantarum, 40, 1-11.‏
Liang, D., Ni, Z., Xia, H., Xie, Y., Lv, X., Wang, J., ... & Luo, X. (2019). Exogenous melatonin promotes biomass accumulation and photosynthesis of kiwifruit seedlings under drought stress. Scientia Horticulturae, 246, 34-43.
Liang, G., Bu, J., Zhang, S., Jing, G., Zhang, G., & Liu, X. (2018). Effects of drought stress on the photosynthetic physiological parameters of Populus× euramericana “Neva”. Journal of Forestry Research, 30, 409-416.‏
Liu, L., Li, D., Ma, Y., Shen, H., Zhao, S., & Wang, Y. (2020). Combined application of arbuscular mycorrhizal fungi and exogenous melatonin alleviates drought stress and improves plant growth in tobacco seedlings. Journal of Plant Growth Regulation40(3), 1074-1087.‏
Lutts, S., Kinet, J. M., & Bouharmont, J. (1996). NaCl-induced senescence inleaves of rice (Oryza sativa L.) cultivars differing in salinitary resistance. Annals of Botany, 78(3), 389-398.
Martı̀nez, J. P, Lutts, S, Schanck, A., Bajji, M., & Kinet, J. M. (2004). Is osmotic adjustment required for water stress resistance in the Mediterranean shrub. Atriplex halimus L?. Journal of Plant Physiology, 161(9), 1041-1051.‏
Molina, R. V., Valero, M., Navarro, Y., Guardiola, J. L., & García-Luis, A. J. S. H. (2005). Temperature effects on flower formation in saffron (Crocus sativus L.). Scientia Horticulturae, 103(3), 361-379.
Moradi Rikabad, M., Pourakbar, L., Moghaddam, S. S., & Popović-Djordjević J. (2019). Agrobiological, chemical and antioxidant properties of saffron (Crocus sativus L.) exposed to TiO2 nanoparticles and ultraviolet-B stress. Industrial Crops and Products, 137, 137-143.‏
Naghizadeh, M., Kabiri, R., Hatami, A., Oloumi, H., Nasibi, F., & Tahmasei, Z. (2019). Exogenous application of melatonin mitigates the adverse effects of drought stress on morpho-physiological traits and secondary metabolites in Moldavian balm (Dracocephalum moldavica). Physiology and Molecular Biology of Plants, 25, 881-894.‏
Namvar, A., Hadi, H., & Seyed Sharifi, R. (2017). Role of exogenous phytoprotectants in mitigation of adverse effects of abiotic stresses. Journal of Plant Environmental Physiology12(48), 103-128. [In Persian].
Noori, A. M., Banejad, H., & Ferezgh, M. K. (2022). The effect of irrigation different methods under the deficit-irrigation conditions on characteristics of replacement corm and photosynthesis level of saffron (Crocus sativus L.). Journal of Water Management in Agriculture, 8(2), 15-26. [In Persian].
Pinheiro, C., & Chaves, M. M. (2011). Photosynthesis and drought: can we make metabolic connections from available data?. Journal of Experimental Botany, 62(3), 869-882.‏
Quamruzzaman, M., Manik, S. N., Shabala, S., & Zhou M. (2021). Improving performance of salt-grown crops by exogenous application of plant growth regulators. Biomolecules, 11(6), 788.‏
Sharifi, G., Niknam, V., Sedighi, F., & Seifi Kalhor, M. (2020). Investigation of GABA effect on drought stress tolerance improvement in cultivated saffron (Crocus sativus L.). Plant Process and Function, 9(39), 29-50. [In Persian].
Sharma, A., & Zheng, B. (2019). Melatonin mediated regulation of drought stress: Physiological and molecular aspects. Plants, 8(7), 190.
Sheikhalipour, M., Gohari G., Esmaielpour B., Panahirad S., Milani M. H., Kulak M., & Janda, T. (2022). Melatonin and TiO2 NPs application-induced changes in growth, photosynthesis, antioxidant enzymes activities and secondary metabolites in stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) Under Drought Stress Conditions. Journal of Plant Growth Regulation, 42(3), 2023-2040.
Shohani, F., Fazeli, A., & Hosseini, S. (2022). The effects of using salicylic acid and Silicon on some physiological‎ and anatomical indices in two ecotypes of Scrophularia striata L.‎ Medicinal Plant under drought stress. Iranian Journal of Plant Biology, 14(2), 33-54.‏ [In Persian].
Tavakoli, F., Rafieiolhossaini, M., Ravash, R., & Rafieian-kopaei, M. (2020). Study of secondary metabolites and morphophysiological characters of saffron under poly ethylene glycol elicitor. Iranian Journal of Plant Biology12(3), 23-42.‏ [In Persian].
Vahedi, M., Kabiri, M., Salami, S. A., Rezadoost, H., Mirzaie, M., & Kanani, M. R. (2018). Quantitative HPLC-based metabolomics of some Iranian saffron (Crocus sativus L.) accessions. Industrial Crops and Products, 118, 26-29.‏
Wang, M., Duan, S., Zhou, Z., Chen, S., & Wang, D. (2019). Foliar spraying of melatonin confers cadmium tolerance in Nicotiana tabacum L. Ecotoxicology and Environmental Safety, 170, 68-76.‏
Wang, P., Sun, X., Li, C., Wei, Z., Liang, D., & Ma, F. (2013). Long‐term exogenous application of melatonin delays drought‐induced leaf senescence in apple. Journal of Pineal Research, 54(3), 292-302.
Yu, Y., Lv, Y., Shi, Y., Li, T., Chen, Y., Zhao, D., & Zhao, Z. (2018). The role of phyto-melatonin and related metabolites in response to stress. Molecules, 23(8), 1887.‏
Zhang, M., He, S., Zhan, Y., Qin, B., Jin, X., Wang, M. ...  & Wu, Y. (2019). Exogenous melatonin reduces the inhibitory effect of osmotic stress on photosynthesis in soybean. PloS One 14(12), e0226542.‏
Zhang, X., Lu, G., Long, W., Zou, X., Li, F., & Nishio, T. (2014). Recent progress in drought and salt tolerance studies in Brassica crops. Breeding Science, 64(1), 60-73.‏